CN117887857B - 一种检测ikzf基因缺失的方法及装置和应用 - Google Patents
一种检测ikzf基因缺失的方法及装置和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种检测IKZF基因缺失的方法及装置和应用，装置包括：基因扩增单元，对IKZF1 mRNA和IKZF1 DNA分别进行扩增，所述扩增引物包括：对IKZF基因mRNA反转录的cDNA进行扩增的引物，和对IKZF DNA进行扩增的引物；基因检测单元，对扩增产物进行荧光分析和测序，根据扩增产物的长度和片段颜色组成，判断待测样本来自于IKZF基因正常个体或IKZF基因缺失个体，并判断缺失类型。本发明的检测方法可以从DNA和RNA水平对IKZF基因缺失突变进行检测，避免2种以上基因片段缺失造成的MLPA或RNA‑SEQ无法直接判断缺失类型或造成错判的情况。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种检测IKZF基因缺失的方法及装置和应用。
背景技术
人类IKZF1（Ikaros zinc finger 1）基因定位于7p12，DNA序列全长125 kb，共有8个外显子，其编码蛋白ikaros是一种极为重要的造血转录调控因子，属锌指蛋白家族成员，尤其在淋巴系造血方面发挥着关键性调控作用。IKZF1突变主要见于ALL（急性淋巴细胞白血病，acute lymphoblastic leukemia，ALL），约20%的儿童B-ALL、30%的成人B-ALL和5%的T-ALL患者有IKZF1突变。约63.0-83.7%的BCR-ABL1阳性B-ALL患者伴IKZF1基因突变，MLL相关融合基因阳性的ALL患者也常伴IKZF1突变，约20%染色体核型正常的ALL患者中可检测到IKZF1基因突变。IKZF1突变是ALL发病的一个重要促进因素，也是ALL患者独立的预后不良因素。IKZF1突变很少发生于髓性白血病，但约86%的慢性粒细胞白血病（chronicmyelocytic leukemia，CML）患者急淋变时可检测到发生IKZF1突变，是CML患者急变的重要促进因素。
IKZF1突变提供了一个潜在的MRD（微小残留病变，Minimal Residual Disease，MRD）监测靶点，其特异性和检测灵敏度都优于IG（IG基因重排检测）、TCR克隆性检测的方法。但目前主要的检测方法缺乏进行具体缺失类型的判断方法，无法为后续的MRD监测提供检测依据。
目前IKZF的主要检测方法包括多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）和RNA-SEQ（RNA sequencing，转录组测序技术）技术，虽然能通过外显子片段的比例情况来确定IKZF基因是否发生缺失，但无法准确判断IKZF基因的缺失类型，并存在因存在2种以上基因缺失类型，出现错判的结果，造成后续的MDR监测的困难。因此，提供一套通过片段长度分析，直观且准确判断IKZF基因缺失类型的检测方法具有重要的应用价值，能为后续的MDR监测提供重要的技术支持。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种检测IKZF基因缺失的方法及装置和应用，能准确判断IKZF基因缺失的类型，为后续MDR监测提供准确的检测目标。本发明提供了一套通过片段长度分析，直观判断IKZF基因缺失类型的检测方法，在检测中能直接通过片段的有无、颜色和长度位置判断是否存在特定的缺失类型。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种检测IKZF基因缺失的装置，所述装置包括：
基因扩增单元，对IKZF1 mRNA和IKZF1 DNA分别进行扩增，所述扩增引物包括：对IKZF基因mRNA反转录的cDNA进行扩增的引物，和对IKZF DNA进行扩增的引物；
基因检测单元，对扩增产物进行荧光分析和测序，根据扩增产物的长度和片段颜色组成，判断待测样本来自于IKZF基因正常个体或IKZF基因缺失个体，并判断缺失类型。
本发明提供了一种用于IKZF基因缺失的引物和检测策略和结果判定方法，包括对IKZF基因mRNA反转录的cDNA进行扩增，和对IKZF DNA进行扩增。本发明可以通过PCR扩增获得IKZF mRNA的主要转录本的比例情况，和IKZF基因区域DNA片段缺失后截短基因片段的有无，从而判断是否存在IKZF基因的缺失和具体的缺失类型，为后续IKZF基因突变残留检测提供检测依据，弥补MLPA和RNA-Seq无法准确判断IKZF基因片段缺失类型的不足。
优选地，所述对IKZF基因mRNA反转录的cDNA进行扩增的引物基于IKZF1 mRNA NM_006060.6进行设计；上游引物序列与mRNA的第160-180位碱基序列一致，位于外显子1；下游引物与mRNA的第1090-1108位碱基序列互补配对，位于外显子8。
优选地，所述上游引物或下游引物上连接有荧光基团。
优选地，所述荧光基团选自FAM、ROX或HEX中任意一种。
优选地，所述上游引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述下游引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示。
优选地，所述对IKZF DNA进行扩增的引物基于IKZF1大片段缺失常见断裂点进行设计；正向引物1和2分别与内含子1和3上常见上游断裂点区域的上游序列一致；反向引物1和2分别与3’UTR上常见下游断裂点区域的下游序列互补配对；反向引物3与内含子7上常见下游断裂点区域的下游序列互补配对。
优选地，所述正向引物1上连接有第一荧光基团。
优选地，所述反向引物1和2上连接有第二荧光基团。
优选地，所述反向引物3上连接有第三荧光基团。
优选地，所述荧光基团选自FAM、ROX或HEX中任意一种。
优选地，所述正向引物1的核苷酸序列包括SEQ ID NO:3所示。
优选地，所述正向引物2的核苷酸序列包括SEQ ID NO:4所示。
优选地，所述反向引物1的核苷酸序列包括SEQ ID NO:6所示。
优选地，所述反向引物2的核苷酸序列包括SEQ ID NO:7所示。
优选地，所述反向引物3的核苷酸序列包括SEQ ID NO:5所示。
优选地，基于IKZF基因mRNA反转录的cDNA进行扩增的结果进行判断的标准包括：
（A）待测样本来自于IKZF基因正常个体，检测结果为：产物第一高峰位于670-690bp范围，代表转录本IK2，理论产物长度687 bp；第二高峰位于550-570 bp范围，代表转录本IK4，理产物长度561 bp；其他产物峰明显低于第一，第二高峰；其他产物峰包括：位于250-270 bp范围，代表转录本IK6，理论产物长度258 bp；位于70-90 bp范围，代表转录本IK10，理论产物长度84 bp；
（B）待测样本来自于IKZF基因缺失个体，检测结果包括：
（I）外显子4-7大片段缺失个体，第一高峰位于250-270 bp范围，代表转录本IK6，理论产物长度258 bp；
（II）外显子2-7大片段缺失个体，第一产物峰位于70-90 bp范围，代表转录本IK10，理论产物长度84 bp；
（III）其他单一或多个外显子缺失个体，第一产物和第二产物峰缺少对应外显子而使产物长度变短，变短幅度与缺失外显子长度一致，包括但不限于：
（i）外显子2缺失个体，第一、第二产物峰分别位于620-630 bp范围和500-510 bp范围，理论长度为633 bp、507 bp；
（ii）外显子2-3缺失个体，第一、第二产物峰分别位于500-520 bp范围和370-390bp范围，理论长度为513 bp、387 bp。
本发明在设计检测方案时，根据IKZF1 mRNA（NM_006060.6）进行设计，上游引物序列与mRNA 160-180序列一致，位于外显子1，下游引物与mRNA 1090-1108序列互补配对，位于外显子8。由于IKZF1可转录成多种长度不同的mRNA，其中NM_006060.6为最长的一个转录本，包含全部外显子，其余mRNA与之相比，缺少一个或多个外显子，但都具有外显子1和外显子8，使用这对引物针对不同转录本可以扩增出不同长度的产物，使用片段长度分析可对各种转录本的转录情况进行分析，产物峰的高低则代表了转录水平的高低，正常人以长型转录本为主，如IK2、IK4，短型转录本表达较低。当患者外周血中存在发生IKZF缺失的肿瘤细胞时，由于DNA水平的片段缺失，无法表达长型转录本，短型转录本水平升高，成为主要扩增产物。此方案只能检测外显子2-7之间片段的缺失，对于包含外显子1和外显子8的缺失，由于无mRNA的表达，故无法进行扩增检测。
优选地，基于对IKZF DNA进行扩增的结果进行判断的标准包括：
外显子2-7大片段缺失个体，扩增产物长度范围为210-310 bp，荧光组合为第一荧光基团和第三荧光基团；
外显子4-7大片段缺失个体，扩增产物长度范围为420-560 bp，荧光组合为第三荧光基团；
外显子2-8大片段缺失个体，扩增产物长度范围为140-280 bp，荧光组合为第一荧光基团和第二荧光基团；
外显子4-8大片段缺失个体，扩增产物长度范围为360-500 bp，荧光组合为第二荧光基团。
在正常标本中，由于各引物区域之间距离过长，不会扩增出产物，当发生大范围片段缺失后，引物区域间距离变短，能进行有效扩增，产物可通过毛细管电泳进行检测。
本发明中，在常见DNA断裂位点前后设计相应的引物，并携带不同的荧光，可根据产物的长度和片段颜色组成，判读产物的引物组合及缺失类型。本发明能直接通过片段的有无、颜色和长度位置判断是否存在特定的缺失类型。
具体地，由于4种常见断裂类型的长度范围有交叉，且断裂位置如果发生在常见区域外，会造成产物长度超出预估范围，所以难以实现通过产物长度进行缺失类型快速分型，无法进行后续的肿瘤细胞微小残留的检测工作，所以对不同位置的引物分表标记不同颜色荧光，根据产物荧光的组合实现快速的缺失类型的分型。
第二方面，本发明提供一种检测IKZF基因缺失的试剂盒，所述试剂盒中包括：对IKZF基因mRNA反转录的cDNA进行扩增的引物，和/或对IKZF DNA进行扩增的引物。
优选地，所述对IKZF基因mRNA反转录的cDNA进行扩增的引物基于IKZF1 mRNA NM_006060.6进行设计；上游引物序列与mRNA的第160-180位碱基序列一致，位于外显子1；下游引物与mRNA的第1090-1108位碱基序列互补配对，位于外显子8。
优选地，所述对IKZF DNA进行扩增的引物基于IKZF1大片段缺失常见断裂点进行设计；正向引物1和2分别与内含子1和3上常见上游断裂点区域的上游序列一致；反向引物1和2分别与3’UTR上常见下游断裂点区域的下游序列互补配对；反向引物3与内含子7上常见下游断裂点区域的下游序列互补配对。
优选地，所述上游引物或下游引物上连接有荧光基团。
优选地，所述荧光基团选自FAM、ROX或HEX中任意一种。
优选地，所述上游引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述下游引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示。
优选地，所述正向引物1上连接有第一荧光基团。
优选地，所述反向引物1和2上连接有第二荧光基团。
优选地，所述反向引物3上连接有第三荧光基团。
优选地，所述荧光基团选自FAM、ROX或HEX中任意一种。
优选地，所述正向引物1的核苷酸序列包括SEQ ID NO:3所示。
优选地，所述正向引物2的核苷酸序列包括SEQ ID NO:4所示。
优选地，所述反向引物1的核苷酸序列包括SEQ ID NO:6所示。
优选地，所述反向引物2的核苷酸序列包括SEQ ID NO:7所示。
优选地，所述反向引物3的核苷酸序列包括SEQ ID NO:5所示。
优选地，所述试剂盒还包括：基因扩增试剂、核酸提取试剂或反转录试剂中任意一种或至少两种的组合。
第三方面，本发明提供一种以非疾病诊断或治疗为目的的检测IKZF基因缺失的方法，所述方法包括：
基因扩增：对IKZF1 mRNA和IKZF1 DNA分别进行扩增，所述扩增引物包括：对IKZF基因mRNA反转录的cDNA进行扩增的引物，和对IKZF DNA进行扩增的引物；
基因检测：对扩增产物进行荧光分析和测序，根据扩增产物的长度和片段颜色组成，判断待测样本来自于IKZF基因正常个体或IKZF基因缺失个体，并判断缺失类型。
优选地，所述对IKZF基因mRNA反转录的cDNA进行扩增的引物基于IKZF1 mRNA NM_006060.6进行设计；上游引物序列与mRNA的第160-180位碱基序列一致，位于外显子1；下游引物与mRNA的第1090-1108位碱基序列互补配对，位于外显子8。
优选地，所述上游引物或下游引物上连接有荧光基团。
优选地，所述荧光基团选自FAM、ROX或HEX中任意一种。
优选地，所述上游引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述下游引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示。
优选地，所述对IKZF DNA进行扩增的引物基于IKZF1大片段缺失常见断裂点进行设计；正向引物1和2分别与内含子1和3上常见上游断裂点区域的上游序列一致；反向引物1和2分别与3’UTR上常见下游断裂点区域的下游序列互补配对；反向引物3与内含子7上常见下游断裂点区域的下游序列互补配对。
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优选地，所述反向引物3的核苷酸序列包括SEQ ID NO:5所示。
优选地，基于IKZF基因mRNA反转录的cDNA进行扩增的结果进行判断的标准包括：
（A）待测样本来自于IKZF基因正常个体，检测结果为：产物第一高峰位于670-690bp范围，代表转录本IK2，理论产物长度687 bp；第二高峰位于550-570 bp范围，代表转录本IK4，理产物长度561 bp；其他产物峰明显低于第一，第二高峰；其他产物峰包括：位于250-270 bp范围，代表转录本IK6，理论产物长度258 bp；位于70-90 bp范围，代表转录本IK10，理论产物长度84 bp。
（B）待测样本来自于IKZF基因缺失个体，检测结果包括：
（I）外显子4-7大片段缺失个体，第一高峰位于250-270 bp范围，代表转录本IK6，理论产物长度258 bp；
（II）外显子2-7大片段缺失个体，第一产物峰位于70-90 bp范围，代表转录本IK10，理论产物长度84 bp；
（III）其他单一或多个外显子缺失个体，第一产物和第二产物峰缺少对应外显子而使产物长度变短，变短幅度与缺失外显子长度一致，包括但不限于：
（i）外显子2缺失个体，第一、第二产物峰分别位于620-630 bp范围和500-510 bp范围，理论长度为633 bp、507 bp；
（ii）外显子2-3缺失个体，第一、第二产物峰分别位于500-520 bp范围和370-390bp范围，理论长度为513 bp、387 bp。
基于对IKZF DNA进行扩增结果进行判断的标准包括：
外显子2-7大片段缺失个体，扩增产物长度范围为210-310 bp，荧光组合为第一荧光基团和第三荧光基团；
外显子4-7大片段缺失个体，扩增产物长度范围为420-560bp，荧光组合为第三荧光基团；
外显子2-8大片段缺失个体，扩增产物长度范围为140-280 bp，荧光组合为第一荧光基团和第二荧光基团；
外显子4-8大片段缺失个体，扩增产物长度范围为360-500 bp，荧光组合为第二荧光基团。
第四方面，本发明提供第一方面所述的检测IKZF基因缺失的装置、第二方面所述的检测IKZF基因缺失的试剂盒在制备检测白血病的产品中的应用。
优选地，所述白血病包括急性淋巴细胞白血病和/或慢性粒细胞白血病。
第五方面，本发明提供第一方面所述的检测IKZF基因缺失的装置、第二方面所述的检测IKZF基因缺失的试剂盒在制备MRD监测产品中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种特异性IKZF基因缺失类型的检测方法，可以从DNA和RNA水平对IKZF基因缺失突变进行检测，避免2种以上基因片段缺失造成的MLPA或RNA-SEQ无法直接判断缺失类型或造成错判的情况。本发明无需进行高通量测序，检测成本更低，检测速度更快，检测结果直观易于分析。
附图说明
图1是根据IKZF1大片段缺失常见断裂点进行设计的示意图。
图2是引物设计位置及荧光标记示意图。
图3是样本114号样本的DNA分析结果。
图4是样本102号样本的DNA分析结果。
图5是样本102号样本的mRNA分析结果。
图6是健康人、携带外显子2-7缺失突变、携带外显子4-7缺失突变和携带外显子2缺失突变个体的mRNA扩增检测结果。
图7是携带外显子2-8缺失突变、携带外显子4-8缺失突变、携带外显子2-7缺失突变，携带外显子4-7缺失突变和健康人DNA扩增结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种检测IKZF基因缺失的装置，所述装置包括：
基因扩增单元，对IKZF1 mRNA和IKZF1 DNA分别进行扩增，所述扩增引物包括：对IKZF基因mRNA反转录的cDNA进行扩增的引物，和对IKZF DNA进行扩增的引物；
基因检测单元，对扩增产物进行荧光分析和测序，根据扩增产物的长度和片段颜色组成，判断待测样本来自于IKZF基因正常个体或IKZF基因缺失个体，并判断缺失类型。
（1）针对mRNA（cDNA）检测
1.1 使用试剂盒（QIAamp RNA Blood Minikit）提取分别提取健康人、IKZF基因缺失突变患者的mRNA，提取的RNA OD260/280为2.0。
1.2 使用SuperScript II反转录酶（Thermo 18064071）和Oligo dT反转录成cDNA。
1.3 设计对IKZF基因mRNA反转录的cDNA进行扩增的引物，配制10×引物预混物。
上游引物序列与mRNA的第160-180位碱基序列一致，位于外显子1；下游引物与mRNA的第1090-1108位碱基序列互补配对，位于外显子8；
上游引物：SEQ ID NO:1：5’-FAM-GCACCCGAGGATCAGTCTTG-3’。
下游引物：SEQ ID NO:2：5’-CTGCTGTCGTAGGGCGTGT-3’。
将合成的干粉引物彻底离心后，分别加水溶解为10 μM工作液，F：R：无酶水1：1：3混合成10×引物预混液（引物浓度为2 μM）
1.3 使用PCR预混液（NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix，NEB M0543）配制如表1所示PCR体系。
表1
1.4 扩增程序如表2所示。
表2
产物检测：96孔PCR板中，每孔加入9.8 μL HiDi甲酰胺（Thermo 4401457）、0.2 μLGeneScan 500 LIZ染料片段标准品（Thermo 4322682）和0.5 μL扩增产物，混匀离心后，95℃变性5分钟后快速降温到4℃后，使用AB 3500 DX基因分析仪进行片段分析。
结果判读：产物峰范围为80 bp到700 bp。
（A）待测样本来自于IKZF基因正常个体，检测结果为：产物第一高峰位于670-690bp范围，代表转录本IK2，理论产物长度687 bp；第二高峰位于550-570 bp范围，代表转录本IK4，理产物长度561 bp；其他产物峰明显低于第一，第二高峰；其他产物峰包括：位于250-270 bp范围，代表转录本IK6，理论产物长度258 bp；位于70-90 bp范围，代表转录本IK10，理论产物长度84 bp；
（B）待测样本来自于IKZF基因缺失个体，检测结果包括：
（I）外显子4-7大片段缺失个体，当患者的肿瘤细胞发生外显子4-7大片段缺失时，肿瘤细胞无法合成长转录本IK2、IK4，第一高峰位于250-270 bp范围，代表转录本IK6，理论产物长度258 bp；
（II）外显子2-7大片段缺失个体，当患者的肿瘤细胞发生外显子2-7大片段缺失时，肿瘤细胞只能合成IK10转录本，第一产物峰位于70-90 bp范围，代表转录本IK10，理论产物长度84 bp；
（III）其他单一或多个外显子缺失个体，第一产物和第二产物峰缺少对应外显子而使产物长度变短，变短幅度与缺失外显子长度一致，包括但不限于：
（i）外显子2缺失个体，第一、第二产物峰分别位于620-630 bp范围和500-510 bp范围，理论产物长度分别缩短为633 bp、507 bp；
（ii）外显子2-3缺失个体，第一、第二产物峰分别位于500-510 bp 和370-380 bp范围，理论产物长度分别缩短为513 bp、387 bp。
（2）针对DNA检测
1.1 使用试剂盒（QIAamp DNA Mini Kit，Qiagen 51306）分别提取健康人、患者的外周血标本DNA，提取的DNA OD260/280为1.9。
1.2 根据IKZF1大片段缺失常见断裂点进行设计扩增的引物，根据IKZF1大片段缺失常见断裂点进行设计（图1），配制10×引物mix。
所述对IKZF DNA进行扩增的引物基于IKZF1大片段缺失常见断裂点进行设计；正向引物1和2分别与内含子1和3上常见上游断裂点区域的上游序列一致；反向引物1和2分别与3’UTR上常见下游断裂点区域的下游序列互补配对；反向引物3与内含子7上常见下游断裂点区域的下游序列互补配对。引物设计位置及荧光标记示意图见图2。
正向引物1如SEQ ID NO:3所示，5’端连接有第一荧光基团：
5’-ROX-GCAACAAGTGACCCATCCTTTGAAG-3’。
正向引物2如SEQ ID NO:4所示：
5’-GTTGGAATTGAAAGTCAAGAAGCAACA-3’。
反向引物1如SEQ ID NO:6所示，5’端连接有第二荧光基团：
5’-FAM-TGGAAAAGCACTATTCCACGTAGAC-3’。
反向引物2如SEQ ID NO:7所示，5’端连接有第二荧光基团：
5’-FAM-GAAACCCAAAGGGCTCAGACTCA-3’。
反向引物3如SEQ ID NO:5所示，5’端连接有第三荧光基团：
5’-HEX-TCCGAATGAATAGACCAAGATACATCCT-3’。
将合成的管干粉引物彻底离心后，分别加水溶解为10 μM工作液，等比例混合成10×引物预混液。
1.3 使用PCR预混液（NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix，NEB M0543）配制表3所示PCR体系。
表3
1.4 扩增程序如表2所示。
产物检测：96孔PCR板中，每孔加入9.8 μL HiDi甲酰胺（Thermo 4401457）、0.2uLGeneScan 500 LIZ染料片段标准品（Thermo 4322682）和1 μL扩增产物50倍稀释液，混匀离心后，95℃变性5分钟后快速降温到4℃后，使用AB 3500 DX基因分析仪进行片段分析。
结果分析：根据产物荧光组合判读断裂类型，如出现2种或以上断裂产物峰，则判断为多个肿瘤亚群。
同步采用MLPA（multiplex ligation-dependent probe amplification），中文名为多重连接探针扩增技术对待测样本进行检测，作为对照组。
表4是114号样本DNA的MLPA结果，判读为2-7缺失。使用DNA分析的结果如图3和表5所示，检测到2-7和4-7两种断裂类型，后续需要分别监测。
表4
表5
表6是102号样本DNA的MLPA结果，判读为2-7缺失。使用DNA分析的结果如图4和表7所示，检测到4-7缺失，与MLPA结果不符。
表6
表7
图5是样本102号样本的mRNA分析结果，具体分析如表8所示，检测到4-7缺失表达峰上调，同时IK2转录本扩增产物长度下降到507bp，IK4转录本扩增长度下降到381bp，与正常扩增产物 672bp、558bp相比缩短约170bp，于外显子2、3的总长度174bp相符，综合研判患者存在4-7和2-3两种缺失亚群。
表8
实施例2
本实施例采用实施例1中的检测IKZF基因缺失的装置进行检测效果验证。
实验1：对健康人、携带外显子2-7缺失突变，携带4外显子4-7缺失突变和携带外显子2缺失突变个体进行mRNA扩增检测。
实验2：对携带外显子2-8缺失、携带外显子4-8缺失、携带外显子2-7缺失，携带外显子4-7缺失和健康人进行DNA扩增检测。
表9
图6是健康人、携带外显子2-7缺失突变、携带外显子4-7缺失突变和携带外显子2缺失突变个体的mRNA扩增检测结果，具体分析见表9，从表中可知，健康人mRNA的扩增产物的第一和第二产物峰位于672 bp与558 bp处，与IK2和IK4扩增产物的理论长度（687 bp、561 bp）相近；携带外显子2-7缺失患者的mRNA扩增产物的第一高峰位于79 bp处，与IK10扩增产物的理论长度（84 bp）相近；携带外显子4-7缺失患者的mRNA扩增产物的第一高峰位于253 bp处，与IK6扩增产物的理论长度（258 bp）相近；携带外显子2缺失患者的mRNA扩增产物的第一和第二产物峰位于629 bp和500 bp，与缺失外显子2的IK2和IK4扩增产物的理论长度（633 bp、507 bp）相近。
表10
图7是携带外显子2-8缺失突变、携带外显子4-8缺失突变、携带外显子2-7缺失突变，携带外显子4-7缺失突变和健康人DNA扩增结果，具体分析见表10，从表中可知，第一张结果中，产物为红（第一荧光ROX）和蓝（第二荧光FAM）组合，且片段长度为244bp和241，位于140bp-280bp区间内，判读受检人携带外显子2-8片段缺失；第二张结果中，产物为蓝色，且片段长度为476bp，位于360-500bp区间内，判读受检人携带外显子4-8片段缺失；第三张结果中，产物为红和绿（第三荧光HEX）组合，且片段长度为284bp和281bp，位于210-310bp区间内，判读受检者携带外显子2-7片段缺失；第四张结果中，产物为绿色，片段长度为513bp，位于420-560bp区间内，判读受检者携带外显子4-7片段缺失；第五张结果为正常人扩增结果，无任何扩增产物出现。
实施例3
本实施例提供一种检测IKZF基因缺失的试剂盒，所述试剂盒中包括：对IKZF基因mRNA反转录的cDNA进行扩增的引物，和/或对IKZF DNA进行扩增的引物。
所述对IKZF基因mRNA反转录的cDNA进行扩增的引物基于IKZF1 mRNA NM_006060.6进行设计；上游引物序列与mRNA的第160-180位碱基序列一致，位于外显子1；下游引物与mRNA的第1090-1108位碱基序列互补配对，位于外显子8。
所述对IKZF DNA进行扩增的引物基于IKZF1大片段缺失常见断裂点进行设计；正向引物1和2分别与内含子1和3上常见上游断裂点区域的上游序列一致；反向引物1和2分别与3’UTR上常见下游断裂点区域的下游序列互补配对；反向引物3与内含子7上常见下游断裂点区域的下游序列互补配对。
上游引物：SEQ ID NO:1、下游引物：SEQ ID NO:2、正向引物1：SEQ ID NO:3、正向引物2：SEQ ID NO:4、反向引物1：SEQ ID NO:6、反向引物2：SEQ ID NO:7、反向引物3：SEQID NO:5。
所述试剂盒还包括：基因扩增试剂、核酸提取试剂和反转录试剂。
综上，本发明提供的检测IKZF基因缺失的方法可以从DNA和RNA水平对IKZF基因缺失突变进行检测，避免2种以上基因片段缺失造成的MLPA或RNA-SEQ无法直接判断缺失类型或造成错判的情况。相比于现有技术，本发明无需进行高通量测序，检测成本更低，检测速度更快，检测结果直观易于分析。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (8)
1.一种检测IKZF1基因缺失的装置，其特征在于，所述装置包括：
基因扩增单元，对IKZF1 mRNA和IKZF1 DNA分别进行扩增，所述扩增引物包括：对IKZF1基因mRNA反转录的cDNA进行扩增的引物，和对IKZF1 DNA进行扩增的引物；
所述对IKZF1基因mRNA反转录的cDNA进行扩增的引物基于IKZF1 mRNA NM_006060.6进行设计；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述上游引物或下游引物上连接有荧光基团；
所述对IKZF1 DNA进行扩增的引物基于IKZF1大片段缺失常见断裂点进行设计；正向引物1和2分别与内含子1和3上常见上游断裂点区域的上游序列一致；反向引物1和2分别与3’UTR上常见下游断裂点区域的下游序列互补配对；反向引物3与内含子7上常见下游断裂点区域的下游序列互补配对；所述正向引物1上连接有第一荧光基团；所述反向引物1和2上连接有第二荧光基团；所述反向引物3上连接有第三荧光基团；
所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述反向引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
所述反向引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
所述反向引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
基因检测单元，使用AB 3500 DX基因分析仪对扩增产物进行荧光分析，根据扩增产物的长度和片段颜色组成，判断待测样本来自于IKZF1基因正常个体或IKZF1基因缺失个体，并判断缺失类型；
基于IKZF1基因mRNA反转录的cDNA进行扩增的结果进行判断的标准包括：
（A）待测样本来自于IKZF1基因正常个体，检测结果为：
产物第一高峰位于670-690 bp范围，代表转录本IK2；第二高峰位于550-570 bp范围，代表转录本IK4；其他产物峰明显低于第一、第二高峰；
其他产物峰包括：位于250-270 bp范围，代表转录本IK6；位于70-90 bp范围，代表转录本IK10；
（B）待测样本来自于IKZF1基因缺失个体，检测结果包括：
（I）外显子4-7大片段缺失个体，第一高峰位于250-270 bp范围，代表转录本IK6；
（II）外显子2-7大片段缺失个体，第一高峰位于70-90 bp范围，代表转录本IK10；
（III）其他单一或多个外显子缺失个体，包括：
（i）外显子2缺失个体，第一、第二高峰分别位于620-630 bp范围和500-510 bp范围；
（ii）外显子2-3缺失个体，第一、第二高峰分别位于500-520 bp范围和370-390 bp范围；
基于对IKZF1 DNA进行扩增的结果进行判断的标准包括：
外显子2-7大片段缺失个体，扩增产物长度范围为210-310 bp，荧光组合为第一荧光基团和第三荧光基团；
外显子4-7大片段缺失个体，扩增产物长度范围为420-560 bp，荧光组合为第三荧光基团；
外显子2-8大片段缺失个体，扩增产物长度范围为140-280 bp，荧光组合为第一荧光基团和第二荧光基团；
外显子4-8大片段缺失个体，扩增产物长度范围为360-500 bp，荧光组合为第二荧光基团。
2.根据权利要求1所述的检测IKZF1基因缺失的装置，其特征在于，所述对IKZF1基因mRNA反转录的cDNA进行扩增的引物中的荧光基团选自FAM、ROX或HEX中任意一种。
3.根据权利要求1所述的检测IKZF1基因缺失的装置，其特征在于，所述对IKZF1 DNA进行扩增的引物中的荧光基团选自FAM、ROX或HEX。
4.一种检测IKZF1基因缺失的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：对IKZF1基因mRNA反转录的cDNA进行扩增的引物，和对IKZF1 DNA进行扩增的引物；
所述对IKZF1基因mRNA反转录的cDNA进行扩增的引物基于IKZF1 mRNA NM_006060.6进行设计；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述上游引物或下游引物上连接有荧光基团；
所述对IKZF1 DNA进行扩增的引物基于IKZF1大片段缺失常见断裂点进行设计；正向引物1和2分别与内含子1和3上常见上游断裂点区域的上游序列一致；反向引物1和2分别与3’UTR上常见下游断裂点区域的下游序列互补配对；反向引物3与内含子7上常见下游断裂点区域的下游序列互补配对；所述正向引物1上连接有第一荧光基团；所述反向引物1和2上连接有第二荧光基团；所述反向引物3上连接有第三荧光基团；
所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述反向引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
所述反向引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
所述反向引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
5.根据权利要求4所述的检测IKZF1基因缺失的试剂盒，其特征在于，所述对IKZF1基因mRNA反转录的cDNA进行扩增的引物中的荧光基团选自FAM、ROX或HEX中任意一种；
所述对IKZF1 DNA进行扩增的引物中的荧光基团选自FAM、ROX或HEX；
所述试剂盒还包括：基因扩增试剂、核酸提取试剂或反转录试剂中任意一种或至少两种的组合。
6.一种以非疾病诊断或治疗为目的的检测IKZF1基因缺失的方法，其特征在于，所述方法包括：
基因扩增：对IKZF1 mRNA和IKZF1 DNA分别进行扩增，所述扩增引物包括：对IKZF1基因mRNA反转录的cDNA进行扩增的引物，和对IKZF1 DNA进行扩增的引物；
所述对IKZF1基因mRNA反转录的cDNA进行扩增的引物基于IKZF1 mRNA NM_006060.6进行设计；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述上游引物或下游引物上连接有荧光基团；
所述对IKZF1 DNA进行扩增的引物基于IKZF1大片段缺失常见断裂点进行设计；正向引物1和2分别与内含子1和3上常见上游断裂点区域的上游序列一致；反向引物1和2分别与3’UTR上常见下游断裂点区域的下游序列互补配对；反向引物3与内含子7上常见下游断裂点区域的下游序列互补配对；所述正向引物1上连接有第一荧光基团；所述反向引物1和2上连接有第二荧光基团；所述反向引物3上连接有第三荧光基团；
所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述反向引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
所述反向引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
所述反向引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
基因检测：使用AB 3500 DX基因分析仪对扩增产物进行荧光分析，根据扩增产物的长度和片段颜色组成，判断待测样本来自于IKZF1基因正常个体或IKZF1基因缺失个体，并判断缺失类型；
基于IKZF1基因mRNA反转录的cDNA进行扩增的结果进行判断的标准包括：
（A）待测样本来自于IKZF1基因正常个体，检测结果为：
产物第一高峰位于670-690 bp范围，代表转录本IK2；第二高峰位于550-570 bp范围，代表转录本IK4；
其他产物峰包括：位于250-270 bp范围，代表转录本IK6；位于70-90 bp范围，代表转录本IK10；
（B）待测样本来自于IKZF1基因缺失个体，检测结果包括：
（I）外显子4-7大片段缺失个体，第一高峰位于250-270 bp范围，代表转录本IK6；
（II）外显子2-7大片段缺失个体，第一高峰位于70-90 bp范围，代表转录本IK10；
（III）其他单一或多个外显子缺失个体，包括：
（i）外显子2缺失个体，第一、第二高峰分别位于620-630 bp范围和500-510 bp范围；
（ii）外显子2-3缺失个体，第一、第二高峰分别位于500-520 bp范围和370-390 bp范围；
基于对IKZF1 DNA进行扩增的结果进行判断的标准包括：
外显子2-7大片段缺失个体，扩增产物长度范围为210-310 bp，荧光组合为第一荧光基团和第三荧光基团；
外显子4-7大片段缺失个体，扩增产物长度范围为420-560bp，荧光组合为第三荧光基团；
外显子2-8大片段缺失个体，扩增产物长度范围为140-280bp，荧光组合为第一荧光基团和第二荧光基团；
外显子4-8大片段缺失个体，扩增产物长度范围为360-500 bp，荧光组合为第二荧光基团。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述对IKZF1基因mRNA反转录的cDNA进行扩增的引物中的荧光基团选自FAM、ROX或HEX中任意一种；
所述对IKZF1 DNA进行扩增的引物中的荧光基团选自FAM、ROX或HEX。
8.权利要求1-3中任一项所述的检测IKZF1基因缺失的装置、权利要求4或5所述的检测IKZF1基因缺失的试剂盒在制备检测白血病的产品中的应用；
所述白血病为急性淋巴细胞白血病和/或慢性粒细胞白血病。
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| CN117604103A (zh) * | 2023-12-22 | 2024-02-27 | 上海信诺佰世医学检验有限公司 | 引物和探针组合物、试剂盒及在检测ikzf1基因缺失中的应用 |
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