CN111518879A - 一种提高多重pcr扩增文库质量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提高多重PCR扩增文库质量的方法，属于PCR扩增技术领域。该方法是根据多重PCR中每个扩增子的扩增靶标序列来设计、合成两端含有与扩增子对应引物结合位点的多重PCR扩增差异靶标，该差异靶标和理论的扩增靶标序列具有编辑距离大于5bp的差异，构建人工合成差异核苷酸序列集合IAC。将IAC加入PCR反应体系中进行多重PCR扩增反应，引物可以结合到IAC集合上，大大减少多重PCR扩增中非靶标引物形成引物二聚体和产生非特异性扩增的可能，从而提高多重PCR扩增文库的质量，为后续检测出待检靶标提供较好的基础。
Description
技术领域
本发明属于PCR扩增技术领域，具体涉及一种提高多重PCR扩增文库质量的方法。
背景技术
多重PCR是指在一个反应管中加入多对引物，同时进行PCR反应；加入引物的数量少则十几对，多则成百上千对引物。为此，如何避免多对引物间形成二聚体或非特异扩增成了一个提高扩增文库质量的一个关键技术点。
除了在引物设计、评估上减少引物3'端碱基的互补配对，引物两两间比对位置避开比对到多个基因组位置，仍然需要其它方法来避免多重PCR引物间形成二聚体或者非特异扩增，提高文库质量。
在某些特定环境，比如在待检测环境只存在多重PCR引物中的部分靶标的情况。例如，在一个多重PCR引物mix中包含了上百种微生物特异扩增的引物，但是某个检测样本中，实际只含有这上百种微生物中的某一两种。在这种环境下，上百种引物只有某几对引物实际会发生扩增，其它大量的引物会因为没有扩增靶标消耗，而形成大量的二聚体或者非特异扩增，导致扩增文库质量较差。即便后续通过常规的磁珠纯化也不能达到好的效果。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种提高多重PCR扩增文库质量的方法，来减少多重PCR扩增产物的二聚体产生和非特异扩增，从而提高重PCR扩增文库质量。
本发明提供了一种提高多重PCR扩增文库质量的方法，包括以下步骤：
1)根据多重PCR中每个扩增子的扩增靶标序列，人工合成若干条两端包含与所述扩增子的引物互补配对片段的差异靶标序列，但所述差异靶标序列与所述扩增靶标序列具有编辑距离大于5bp的差异序列；人工合成的差异靶标序列在测序读长范围内至少被检测到5bp以上的差异序列；
2)将步骤1)中若干条人工合成的差异靶标序列中，不少于总数量的10％进行混合，构建得到多重PCR人工合成带差异的序列集合；
3)以待测样本为反应模版，将所述多重PCR人工合成带差异的序列集合加入反应体系中进行多重PCR扩增反应，得到高质量的多重PCR扩增文库。
优选的，步骤1)中多重PCR中扩增子是候选检测生物分别经多重PCR引物扩增得到的扩增产物。
优选的，步骤1)中多重PCR中扩增子的数量根据候选检测生物的数量而决定。
优选的，步骤1)中所述差异序列中，以4种碱基数比例之和为100％计，4种碱基数量的比例均不大于70％。
优选的，步骤1)中所述差异序列由插入、缺失或错配形式。
优选的，步骤1)中所述差异序列包括插入一段20bp如序列表SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。
优选的，步骤1)中所述测序读长为35～600bp。
优选的，步骤2)中在多重PCR人工合成带差异的序列集合中，各带差异序列的靶标序列的拷贝数不大于108拷贝/mL。
优选的，步骤2)中所述多重PCR人工合成差异的序列集合包括序列表中SEQ IDNo.2～SEQ ID No.16所示的15条序列和/或SEQ ID No.111～SEQ ID No.126所示的16条序列。
优选的，步骤3)中所述多重PCR扩增反应的程序为预变性95℃，3min；变性95℃，20s；退火63℃，2min；延伸72℃，2min；45个循环；终延伸72℃，5min；
步骤3)中所述多重PCR扩增反应的体系为多重PCR的引物集合4μl，ddH2O 6μl，3×TEnzyme mix10μl，人工合成差异的序列集合2μl，样本模板8μl。
本发明提供的提高多重PCR扩增文库质量的方法，根据多重PCR中每个扩增子的扩增靶标序列来设计、合成两端含有与扩增子对应引物结合位点的多重PCR扩增差异靶标序列，该差异靶标序列和理论的扩增靶标序列具有编辑距离大于5bp的差异，将不少于总数量的10％的人工合成差异靶标序列构建成人工合成带差异的序列集合(IAC集合)。将IAC加入PCR反应体系中进行多重PCR扩增反应，引物可以结合到IAC集合上，大大减少多重PCR扩增中非靶标引物形成引物二聚体和产生非特异性扩增的可能，从而提高多重PCR扩增文库的质量，为后续检测出待检靶标提供较好的基础。实验表明，以不加入IAC集合制备的多重PCR扩增文库为对照(Q30质量值比例只有3.73％，二聚体的比例高达95.31％，71316条reads最后的有效reads只有290条，仅仅0.41％)，加入IAC集合的制备的多重PCR扩增文库中Q30质量值聚在95％以上，二聚体比例只有0.5％以下，有效reads数高达89％，文库质量远远高于对照。由此可见，在样本中只存在部分或者少部分扩增靶标情况下，加入了人工合成的IAC集合后，多重PCR扩增文库的二聚体和非特异扩增明显的减少，对提高多重PCR的文库质量具有非常明显的改善作用，同时还可以让多重PCR引物进行富集和扩增，增加文库浓度。
附图说明
图1为构建人工合成带差异的序列集合(IAC集合)示意图；
图2为人工合成带差异的序列集合(IAC集合)参与多重PCR反应的示意图；
图3为人工合成差异靶标序列的核苷酸序列上机测序情况示意图；
图4为扩增靶标序列与IAC集合中序列的比对结果例图。
具体实施方式
本发明提供了一种提高多重PCR扩增文库质量的方法，包括以下步骤：
1)根据多重PCR中每个扩增子的扩增靶标序列，人工合成若干条两端包含与所述扩增子的引物互补配对片段的差异靶标序列，但所述差异靶标序列与所述扩增靶标序列具有编辑距离大于5bp的差异序列；人工合成的差异靶标序列在测序读长范围内至少被检测到5bp以上的差异序列；
2)将步骤1)中若干条人工合成的差异靶标序列中，不少于总数量的10％进行混合，构建得到多重PCR人工合成带差异的序列集合；
3)以待测样本为反应模版，将所述多重PCR人工合成带差异的序列集合加入反应体系中进行多重PCR扩增反应，得到高质量的多重PCR扩增文库。
本发明根据多重PCR中每个扩增子的扩增靶标序列，人工合成若干条两端包含与所述扩增子的引物互补配对片段的差异靶标序列，但所述差异靶标序列与所述扩增靶标序列具有编辑距离大于5bp的差异序列；人工合成的差异靶标序列在测序读长范围内至少被检测到5bp以上的差异序列。
构建人工合成带差异的序列集合(IA集合)的示意图见图1。根据多重PCR引物集合primer_cluster，P1，P2…Pi…Pn所对应扩增子target区域(如果是设计一个目标病毒，那么这个区域就是这对引物，所能扩增到的病毒区域的序列)T1，T2，Ti...Tn，每个target合成一段与之相似(只要具有引物结合区域即可)的核苷酸序列(也可以几个target合并合成一段人工序列)A1，A2，…Ai，…An。将人工合成的差异靶标序列A1，A2，…Ai，…An，经过富集，定量，稀释之后按照一定的比例混合在一起，构建成IAC集合。IAC集合可以被多重引物集合P扩增。
在本发明中，所述多重PCR中扩增子是候选检测生物分别经多重PCR引物扩增得到的扩增产物。所述候选检测样本包括各种类型的病原体，例如病毒、细菌或真菌等。所述多重PCR中扩增子的数量优选根据候选检测生物的数量而决定，每种待检测生物可以使用一个或多个引物对进行扩展，优选为一种生物使用一个引物扩展。在所述方法不受多重PCR中扩增子数量的限制，即本发明提供的方法不受多重PCR人工合成带差异的序列集合中引物种类和差异靶标序列的数量的限制，但是扩增子数量越多得到的多重PCR扩增文库的质量就越好。为了举例说明多重PCR扩增子的扩增靶标序列，采用15种多重PCR引物集合(核苷酸序列为SEQ ID No.17～SEQ ID No.51)扩增得到的扩增子的扩增靶标序列为SEQ ID No.47～SEQ ID No.61。
在本发明中，所述差异序列中，以4种碱基数量比之和为100％计，4种碱基数量的比例均不大于70％，更优选为20％～40％，最优选为25％。所述差异序列优选由插入、缺失或错配中的一种或几种形式组合得到。当所述人工合成靶标序列的长度短于所述扩增靶标序列的长度时，将扩增靶标序列的核苷酸序列经过删除部分内部碱基得到，保留两端的与所述扩增子的引物互补配对片段即可。
在本发明中，在人工合成差异靶标序列的两端包含与所述扩增子的引物互补配对片段是通过人工合成的方式在靶标序列两端提供多重PCR引物的结合位点，以便在多重PCR反应过程中，可以被多重PCR引物池中的引物扩增，引物结合到人工合成差异序列的核苷酸序列上，减少引物形成引物二聚体及非特异性扩增的机会，同时实现多重PCR引物进行富集和扩增，增加文库浓度。
在本发明中，在每段人工合成差异靶标序列与理论的扩增靶标序列具有编辑距离大于5bp的差异，这些差异序列在测序读长范围内至少被检测到5bp以上。所述读长优选为35～600bp，更优选为60～300bp。例如，选择双端读长60bp测序，在60bp内能读到5bp的差异即可。本发明对所述差异序列的核苷酸序列没有特殊要求，主要能够实现区分人工合成序列及样本扩增序列即可。所述编辑距离是指两段核苷酸序列进行比对时，将序列完全比对上所需的编辑次数。例如在本发明实施例中，所述差异序列的核苷酸序列与理论的扩增子序列相比，是插入了aactggaagtcagaggtgag(SEQ ID No.1)20bp长的差异序列，但这并不能限制理解为对差异序列的限制。
得到若干条带差异靶标序列，本发明将所述若干条差异靶标序列中不少于总数量的10％的序列混合，构建得到人工合成差异的序列集合(IAC集合)。
在IAC集合中，各带有差异序列的靶标序列的拷贝数不高于108拷贝/ml。为了举例说明构建的IAC集合的情况，本发明实施例中，所述人工合成差异靶标序列优选为序列表中SEQ ID No.2～SEQ ID No.16所示的15条序列或SEQ ID No.111～SEQ ID No.126所示的16条序列，但是不能理解为对本发明所述方法中涉及的多重PCR人工合成带差异序列的集合的限制。
以待测样本为反应模版，本发明将所述多重PCR人工合成带差异的序列集合(IAC集合)加入反应体系中进行多重PCR扩增反应，得到高质量的多重PCR扩增文库。
IAC集合加入PCR反应体系中扩增反应的示意图见图2。在配制PCR反应体系时，加入待检测核酸、酶、多重PCR引物mix和IAC集合；多重PCR引物mix可以同时扩增IAC集合，如果待检测样本核酸里面存在被扩增靶标，该靶标也会被多重PCR引物集合中对应的靶标扩增。
在本发明中，所述多重PCR扩增反应的体系和程序根据不同多重PCR引物集合的种类而变化，所述多重PCR引物集合与人工合成带差异的序列集合中差异靶标序列存在扩增对应关系。例如，上述记载的SEQ ID No.2～SEQ ID No.16所示的人工合成带差异的序列集合，对应的多重PCR引物集合的核苷酸序列如SEQ ID No.17～SEQ ID No.46所示。SEQ IDNo.2～SEQ ID No.16所示对应的多重PCR扩增反应的程序为预变性95℃，3min；变性95℃，20s；退火63℃，2min；延伸72℃，2min；45个循环；终延伸72℃，5min。所述多重PCR扩增反应的体系为多重PCR的引物集合4μl，ddH2O 6μl，3×TEnzyme mix10μl，人工合成带差异的序列集合2μl，样本模板8μl。所述人工合成带差异的序列集合中每条人工合成的差异靶标序列的浓度优选不高于108拷贝/ml，更优选为500～4000拷贝/ml。
在本发明中，得到高质量的多重PCR扩增文库后，还包括对所述多重PCR扩增文库检测目标片段，依次包括扩增产物纯化、测序接头连接、扩增产物纯化和上机测序，识别人工序列与样本真实扩增序列。本发明对所述多重PCR扩增文库中检测目标片段的具体步骤没有特殊限制，采用本领域所熟知的方案即可。将纯化后的多重PCR扩增文库进行测序，剔除测序结果为含有所述差异序列的靶标序列；筛选和分析出测序结果不含所述差异序列的扩增靶标序列。但本方法需要测序长度能够覆盖IAC集合上的差异序列，以便区分检测结果来自IAC序列还是真实检测序列；如图3所示，测序至少有一端的reads(读长)覆盖IAC上的差异序列。将筛选得到的不含有差异片段(tag)的reads再和扩增子的扩增靶标序列进行比对，判断是否为来自靶标的reads，从而统计该检测样本中目标靶标的数目，从而实现高效检测目标病原体。
下面结合实施例对本发明提供的一种提高多重PCR扩增文库质量的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、构建人工合成差异的序列集合(IAC集合)。
采用一个包含15种病原体的多重PCR检测panel对脑脊液样本(样品标号201907190008，采集日期2019年7月19日，采集地点为河北省第二人民医院)进行测试，该多重PCR引物集合及病原体种类见表1。测试一共进行了3组测试，测试1是不加入IAC集合，测试2和测试3均加入相同的IAC集合，为两个重复，靶标序列(target区域)信息见表2，IAC集合信息见表3，其中采用primer_01引物对得到的扩增子为Target_01，在Target_01基础上人工合成的带差异序列的靶标序列为IAC_01，其他引物与集合中差异靶标序列的对应关系以此类推。
表1多重PCR引物集合及其对应的病原体种类
上述15种对引物对应的扩增子的扩增靶序列见表2。
表2 15种扩增子的扩增靶序列的核苷酸序列信息
| Target序列ID | Target序列编号 |
| Target_01 | SEQ ID No.47 |
| Target_02 | SEQ ID No.48 |
| Target_03 | SEQ ID No.49 |
| Target_04 | SEQ ID No.50 |
| Target_05 | SEQ ID No.51 |
| Target_06 | SEQ ID No.52 |
| Target_07 | SEQ ID No.53 |
| Target_08 | SEQ ID No.54 |
| Target_09 | SEQ ID No.55 |
| Target_10 | SEQ ID No.56 |
| Target_11 | SEQ ID No.57 |
| Target_12 | SEQ ID No.58 |
| Target_13 | SEQ ID No.59 |
| Target_14 | SEQ ID No.60) |
| Target_15 | SEQ ID No.61 |
表3 IAC集合信息
注：序列中小写字母的与理论扩增子具有差异的碱基。
扩增靶标序列与IAC集合中存在的差异序列用如图4举例说明：Target_02和IAC_02均能够被primer_02的序列扩增，图中灰色区域为primer_02序列。第一行为Target_02的序列，第二行序列为对应的IAC序列。通过方框区域的差异序列可以区分序列是IAC人工合成的序列还是由样本真实扩增的序列。
2、反应体系混合
将制备好的IAC集合、待检测样本核酸、引物集合panel Amix，加入反应体系中，具体见表4。
表4多重PCR扩增体系
| 组分名称 | 吸取体积(μl) |
| *Panel A mix(总浓度3μM) | 4 |
| *Nuclease-Free Water | 6 |
| *3×TEnzyme mix | 10 |
| IAC(15×500拷贝/ml) | 2 |
| 模板(样本核酸) | 8 |
| 总体积 | 30 |
3、多重PCR反应
在多重PCR反应中，如果待检测样本中含有panel A mix中候选检测病原体的扩增靶标，则会被引物扩增；若不含有panel A mix里面的扩增靶标序列，则不会被扩增；但是，无论待检测样本核酸里面是否含有panel A mix中候选检测病原体的扩增靶标，IAC集合都会被panel A mix中的引物扩增。通过扩增消化引物，使得二聚体大量减少，提高PCR扩增产物质量。
多重PCR扩增反应的程序见表5。
表5多重PCR扩增反应的程序
4、多重PCR扩增产物的纯化
在完成多重PCR扩增反应后，采用磁珠对扩增产物进行纯化，去掉过剩的引物，二聚体非特异等杂片段。具体纯化方法如下：
ⅰ、向PCR反应液中加入0.5倍原始PCR体积的DNA纯化磁珠(如PCR体系为30μl，则加15μl磁珠)；用移液器50μl量程上下吹打10～15次，以使扩增产物与磁珠充分混匀。室温静置2min。该步骤的目的是去除体系中的大片段。
ⅱ、用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止(大约需要2min)。用移液器转移上清至新的EP管中，避免吸到磁珠，弃磁珠。
ⅲ、向上清液中加入0.7倍原始PCR体积的DNA纯化磁珠(如PCR体系为30μl，则加21μl磁珠)；用移液器50μl量程上下吹打10～15次，以使扩增产物与磁珠充分混匀。室温静置2min。该步骤的目的是吸附目的片段，上清中残留的是二聚体。
ⅳ、用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止。用移液器小心去除上清，避免吸到磁珠。
ⅴ、向磁珠中加入40ul BW11(通用测序接头)，重悬磁珠，室温静置2min。
ⅵ、用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止(大约需要2min)。用移液器去除上清，避免吸到磁珠。
ⅶ、向磁珠中加入100μl体积浓度80％乙醇，用磁力架反复在不同的两面来回吸附磁珠以充分悬浮洗涤磁珠，用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止(大约需要2min)。用移液器小心去除上清，避免吸到磁珠。
5、第二轮PCR反应
在获得多重PCR扩增文库之后，根据测序平台选择的连接接头进行PCR扩增，连接接头的核苷酸为AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(SEQ ID No.62)，PCR反应的条件见表6。
表6 PCR反应程序
6、第二轮PCR纯化
在连接完测序接头之后，需要对文库进行纯化，去掉部分多余的引物和非特异性扩增。操作流程如下：
ⅰ、向PCR反应液中加入0.9倍体积的DNA纯化磁珠(如PCR体系为30μl，则加27μl磁珠)用移液器50μl量程上下吹打，以使回收产物与磁珠充分混匀。室温静置2min。
ⅱ、用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止(大约需要2min)。
ⅲ、用移液器小心去除上清，避免吸到磁珠。
这一步删掉ⅴ、用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止(大约需要2min)。用移液器去除上清。
ⅵ、加入100μl 80％乙醇水溶液，用磁力架反复在不同的两面来回吸附磁珠以充分悬浮洗涤磁珠，用移液器小心去除上清，避免吸到磁珠。
6、上机测序
上机测序选择illumina平台测序。需要测序的读长为PE60测序，以覆盖IAC上的差异序列，以便区分检测结果来自IAC序列还是真实检测序列。
7、数据分析
在获得测序数据之后，需要对测序数据进行区分，通过比对软件，利用有差异的碱基来区分来自IAC人工合成的reads，将没有含有tag的reads再和扩增靶标进行比对，判断是否为来自靶标的reads，从而统计该检测样本中目标靶标的数目。
结果及分析
1)采用同样一套多重PCR引物集合，同样一份核酸，在加入人工合成的模拟靶标核苷酸序列IAC集合和不加入模拟靶标核苷酸序列的多重PCR扩增文库质量对比，结果见表7。
表7多重PCR扩增文库结果
从表7中可以看出，测试1中的Q30质量值比例(表示测序错误小于10的负三次方)只有3.73％，二聚体的比例高达95.31％，71316条reads最后的有效reads只有290条，仅仅0.41％。而加入IAC集合的两个重复，Q30质量值聚在95％以上，二聚体比例只有0.5％以下，最后的有效reads高达89％。加入了IAC集合后，多重PCR扩增文库的二聚体和非特异扩增明显的减少。由此可见，本方法对减少多重PCR扩增的文库，提高多重PCR的文库质量具有非常明显的改善作用。
2)病原体检测结果见表8。
表8不同实验组病原体检测结果
实施例2
采用一个包含16种病原体的多重PCR检测panel对脑脊液样本(样品标号201907190001，采集日期2019年7月19日，采集地点为河北省第二人民医院)进行测试，该多重PCR引物集合及病原体种类见表9。测试一共进行了3组测试，测试1是不加入IAC集合，测试2和测试3均加入相同的IAC集合，为两个重复，target区域信息见表10，IAC集合信息见表11。与实施例1相同的实验方法(包括扩增程序和扩增体系)进行3组测试，测试1为不加IAC内参，测试2和测试3是加相同种类的IAC内参，测试2和测试3是重复测试。
表9 16种病原体的多重PCR引物集合
| ID | 正向引物 | 反向引物 | 检测靶标 |
| P15_001 | SEQ ID No.63 | SEQ ID No.64 | 以色列放线菌 |
| P15_002 | SEQ ID No.65 | SEQ ID No.66 | 内氏放线菌 |
| P15_003 | SEQ ID No.67 | SEQ ID No.68 | 龋齿放线菌 |
| P15_004 | SEQ ID No.69 | SEQ ID No.70 | 难辨梭状芽孢杆菌 |
| P15_005 | SEQ ID No.71 | SEQ ID No.72 | 产气夹膜梭菌 |
| P15_006 | SEQ ID No.73 | SEQ ID No.74 | 纹带棒状杆菌 |
| P15_007 | SEQ ID No.75 | SEQ ID No.76) | 鸡肠球菌 |
| P15_008 | SEQ ID No.77) | SEQ ID No.78 | 粪肠球菌 |
| P15_009 | SEQ ID No.79 | SEQ ID No.80 | 屎肠球菌 |
| P15_010 | SEQ ID No.81 | SEQ ID No.82 | 单增李斯特氏菌 |
| P15_011 | SEQ ID No.83 | SEQ ID No.84 | 鸟分枝杆菌 |
| P15_012 | SEQ ID No.85 | SEQ ID No.86 | 牛分枝杆菌 |
| P15_013 | SEQ ID No.87 | SEQ ID No.88 | 龟分枝杆菌 |
| P15_014 | SEQ ID No.89 | SEQ ID No.90 | 偶发分支杆菌 |
| P15_015 | SEQ ID No.91 | SEQ ID No.92 | 浅黄分枝杆菌 |
| P15_016 | SEQ ID No.93 | SEQ ID No.94 | 戈登分枝杆菌 |
表10扩增靶标集合
表11与上述扩增靶标集合对应的IAC集合
注：序列中小写字母的碱基为插入的差异序列。
结果与分析
1)三组实验经多重PCR扩增得到的文库质量见表12。
表12三组实验得到的多重PCR扩增文库信息
从表12中可以看出，测试1中的Q30质量值比例只有14.34％，二聚体的比例高达84.06％，251条reads最后的有效reads只有22条，仅仅8.76％。而加入IAC集合的两个重复，Q30质量值聚在94％以上，二聚体比例只有0.65％以下，最后的有效reads高达88.86％。加入了IAC集合后，多重PCR扩增文库的二聚体和非特异扩增明显的减少。由此可见，本方法对减少多重PCR扩增的文库，提高多重PCR的文库质量具有非常明显的改善作用。
2)病原体检测结果见表13。
表13三组实验的病原体检测结果
由上述实施例可知，向多重PCR扩增反应体系中添加IAC集合，经多重PCR扩增，得到的扩增文库不仅能降低引物二聚体和非特异性扩增的产生，而且能够准确检测到样本中病原体的种类，大大提高了检测结果准确性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海茂槿生物技术有限公司
<120> 一种提高多重PCR扩增文库质量的方法
<160> 126
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aactggaagt cagaggtgag 20
<210> 2
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctggtcgaac gcctgatcgt gcagccgctg tacaagcggc cgctgaactg gaagtcagag 60
gtgaggacgc catcctggcc acctggggcc tgggcatcgt catcggccag ctcatcacca 120
tggccttcgg ccgcgaggtg cagttcgccg acgcgccgat ccagggcgcg gtcgcgttcc 180
tgggcaccga gtattcggcc taccggctgt ttctggtgcc gggcg 225
<210> 3
<211> 181
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cttttgcttc tttagaagca agttcacatg gtcttgaaca gggtcgatta aaactggaag 60
tcagaggtga gaaatggttg cgatattgaa attgctgttt atagcaactt aagtcgtgac 120
catctggatt atcatggcac tttagaagct tatgcagaag cgaaggcgcg tttatttcag 180
t 181
<210> 4
<211> 172
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acaaactgta gctatagcct tcttcttcag tgtcaaaggt ttcaatcaca gaactggaag 60
tcagaggtga gagccacagc ttcaggttcc gcgaatccgg ttaaatagaa gaaactgctg 120
tctgcacggt atttataatc tgcatcacgg ttacgcatgg ctaccggact gg 172
<210> 5
<211> 215
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agcagtgcag gaaattctgg ttggcggtga tgacggtgcc atcggaactg gaagtcagag 60
gtgaggggct ggaagtcgat gacggccagg gatttgtcca gtgccgccag cagggcctgg 120
gtgcgctcca gggtggattg ctgctcggtg acgttggagg ccaccttggc caccttgatc 180
accttgccat cgaggaggat cgggaagtag ctggc 215
<210> 6
<211> 236
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atttttgcag ccgtcccgta ttgcatcgac ctgattggcg gaccttacaa ctggaagtca 60
gaggtgagac gcacaaacgc atgagcaggt ggtgcaagcg ttccgcccca agtcggcgcg 120
tcggagcgcc cgttaacagg ctcaaccaac aatgggctgg acacagactg tgtccagtca 180
agtttttcac ttattttagt cttcaggagg tcttctcatg gccctagttt ccatgc 236
<210> 7
<211> 220
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggcatgacca aggccagctg gtaggagaac gaatatgagc atgagcgatc ccaactggaa 60
gtcagaggtg agccatcgcc gatatgctga ctcgcattcg caatgcgcag caagttgaca 120
aaaccacggt gaccatgccc gcctcgaagc tgaaagtggc cattgccacc gtgctgaaag 180
acgaaggtta catcgatggc tattcggtca agggtaccca 220
<210> 8
<211> 232
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggttcgcgag ctgcggcgtc tggttctccg aaagaaagca tattgataac tggaagtcag 60
aggtgagatg cgctccgtgc gaaccgtaat tcgctcgagc gcggtactta ttgccgtgct 120
ttatgcaacc gtgtcggttc atgcgggcgg ccagggcggc tatggcgcgt ttaactcgga 180
tccatatggt tatccaggag atgacggaaa tagcgccacc gggatgggcg gg 232
<210> 9
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caccgccttg cgagcgcatc tggtcgatgg cgtatttatc gcagagaact ggaagtcaga 60
ggtgagataa acccccgtca ggtttatatc gatggttttc tgccatgcgg cttcgtccag 120
ttcgtcgatg ggggcatcgg ctgcaatgcc tgcatttgcg aacatgatgt cgagccgccc 180
atagttttcc actgtccttg caatcagcgc ctgcacggcc ctggt 225
<210> 10
<211> 215
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gctgttgccc tgggcgtgat gccgttcctc attggcggcg tcatcaaact ggaagtcaga 60
ggtgagagtc ggctctcggc gcggctatcc tcaaggcaac cgcccgcgac ggcaaggcgt 120
gaagccggcc gcatgacggt acgcctgcgc ggccatcatc ttctctgtat gctgacctat 180
atcggcaaag gctataagcc cggctttcgt ggaaa 215
<210> 11
<211> 189
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cacccgcccg gaatttattt ccgcaaacag cccagccagg cgcttaactg gaagtcagag 60
gtgagagaaa cggaaatgcg agaacgcgcg gttggcttct gccatgcggt gaacttcgtc 120
gcgcttcttc atcgcgccgc cacggccttc ggccgcttcg gagagttcac ctgccaggcg 180
cagagccat 189
<210> 12
<211> 228
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggatgatatc atcttctctt tgatcgacat caggaccagc catctgagta actggaagtc 60
agaggtgagt tgctgttttt gcaaaatttg ctctaatttt tcattactca tattcttatc 120
ctagtttcaa attttttcta actacatttt ccaagtattc tggagaataa ggtttagtga 180
tatattcagt catacccact tcaacacctc ttaagcggtc agttttac 228
<210> 13
<211> 177
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaagagaaag aaaaacaaga gcaacaaatt gtaaccgatg taattgtaga taactggaag 60
tcagaggtga gaaaatacaa gagcgtgtaa atcagttaca agtgtcagaa ccacaaacgg 120
ttagagcggg ttcggtagtg cacttgtgtt ctcacataga agcaacgctc aaagagg 177
<210> 14
<211> 199
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cagctggcgt ttcgtcagtg ctttctgcag caggagcttc aggagcaact ggaagtcaga 60
ggtgagttca gcagcaggag tttcttctac tgcaggagca gcttcttcag cctgagcttc 120
tacagtttca gatttgtttt gaagagcaga aacaactctt tggattggag actgaagtaa 180
tccgatgatt tcaccgatc 199
<210> 15
<211> 186
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
catcgggcag cgtgccggtt gccattcagc agtctcctga aaagtgaact ggaagtcaga 60
ggtgagttgc accaatttag tgcattatag ctttttacat caaaaaagcg cgagaaagca 120
ggttgttagt ggagaaaaaa gcccatcctg ggatgggcta cagatgactg gcaaacgcag 180
atgccg 186
<210> 16
<211> 191
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttcgctcgcg tgagctcgga gaccacaata aacgcgcgct ggacttaact ggaagtcaga 60
ggtgagcact ccacaccagc cggtaactgc aattaagact tctcttcata ttgatgccct 120
cgaaacccgc tcagacgccg ttatgcggca tgctgatttg ggtctgccaa tgctgttgtt 180
ttgatgtcga a 191
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atcgtgcagc cgctgtaca 19
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
acagccggta ggccgaatac 20
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aagcaagttc acatggtctt gaac 24
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccttcgcttc tgcataagct tc 22
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
agccttcttc ttcagtgtca aagg 24
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tgcgtaaccg tgatgcag 18
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tctggttggc ggtgatga 18
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atcctcctcg atggcaaggt 20
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ccgtattgca tcgacctgat t 21
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ccatgagaag acctcctgaa gac 23
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
agctggtagg agaacgaata tgagc 25
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gaatagccat cgatgtaacc ttcgt 25
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcgtctggtt ctccgaaaga a 21
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ggcgctattt ccgtcatctc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcatctggtc gatggcgtat 20
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gcgctgattg caaggaca 18
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gtgatgccgt tcctcattgg 20
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ggcttatagc ctttgccgat atag 24
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tatttccgca aacagccca 19
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gcaggtgaac tctccgaagc 20
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ctctttgatc gacatcagga cca 23
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
taagaggtgt tgaagtgggt atgac 25
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
caagagcaac aaattgtaac cgatg 25
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cttctatgtg agaacacaag tgcac 25
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
cagtgctttc tgcagcagga 20
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
cggattactt cagtctccaa tcca 24
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
cggttgccat tcagcagtct 20
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
ccagtcatct gtagcccatc c 21
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tcggagacca caataaacgc 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
acagcattgg cagacccaaa 20
<210> 47
<211> 205
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ctggtcgaac gcctgatcgt gcagccgctg tacaagcggc cgctggacgc catcctggcc 60
acctggggcc tgggcatcgt catcggccag ctcatcacca tggccttcgg ccgcgaggtg 120
cagttcgccg acgcgccgat ccagggcgcg gtcgcgttcc tgggcaccga gtattcggcc 180
taccggctgt ttctggtgcc gggcg 205
<210> 48
<211> 161
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
cttttgcttc tttagaagca agttcacatg gtcttgaaca gggtcgatta aaaatggttg 60
cgatattgaa attgctgttt atagcaactt aagtcgtgac catctggatt atcatggcac 120
tttagaagct tatgcagaag cgaaggcgcg tttatttcag t 161
<210> 49
<211> 152
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
acaaactgta gctatagcct tcttcttcag tgtcaaaggt ttcaatcaca gagccacagc 60
ttcaggttcc gcgaatccgg ttaaatagaa gaaactgctg tctgcacggt atttataatc 120
tgcatcacgg ttacgcatgg ctaccggact gg 152
<210> 50
<211> 195
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
agcagtgcag gaaattctgg ttggcggtga tgacggtgcc atcgggggct ggaagtcgat 60
gacggccagg gatttgtcca gtgccgccag cagggcctgg gtgcgctcca gggtggattg 120
ctgctcggtg acgttggagg ccaccttggc caccttgatc accttgccat cgaggaggat 180
cgggaagtag ctggc 195
<210> 51
<211> 216
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
atttttgcag ccgtcccgta ttgcatcgac ctgattggcg gaccttacac gcacaaacgc 60
atgagcaggt ggtgcaagcg ttccgcccca agtcggcgcg tcggagcgcc cgttaacagg 120
ctcaaccaac aatgggctgg acacagactg tgtccagtca agtttttcac ttattttagt 180
cttcaggagg tcttctcatg gccctagttt ccatgc 216
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ggcatgacca aggccagctg gtaggagaac gaatatgagc atgagcgatc ccccatcgcc 60
gatatgctga ctcgcattcg caatgcgcag caagttgaca aaaccacggt gaccatgccc 120
gcctcgaagc tgaaagtggc cattgccacc gtgctgaaag acgaaggtta catcgatggc 180
tattcggtca agggtaccca 200
<210> 53
<211> 212
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ggttcgcgag ctgcggcgtc tggttctccg aaagaaagca tattgatatg cgctccgtgc 60
gaaccgtaat tcgctcgagc gcggtactta ttgccgtgct ttatgcaacc gtgtcggttc 120
atgcgggcgg ccagggcggc tatggcgcgt ttaactcgga tccatatggt tatccaggag 180
atgacggaaa tagcgccacc gggatgggcg gg 212
<210> 54
<211> 205
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
caccgccttg cgagcgcatc tggtcgatgg cgtatttatc gcagagataa acccccgtca 60
ggtttatatc gatggttttc tgccatgcgg cttcgtccag ttcgtcgatg ggggcatcgg 120
ctgcaatgcc tgcatttgcg aacatgatgt cgagccgccc atagttttcc actgtccttg 180
caatcagcgc ctgcacggcc ctggt 205
<210> 55
<211> 195
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
gctgttgccc tgggcgtgat gccgttcctc attggcggcg tcatcaagtc ggctctcggc 60
gcggctatcc tcaaggcaac cgcccgcgac ggcaaggcgt gaagccggcc gcatgacggt 120
acgcctgcgc ggccatcatc ttctctgtat gctgacctat atcggcaaag gctataagcc 180
cggctttcgt ggaaa 195
<210> 56
<211> 169
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
cacccgcccg gaatttattt ccgcaaacag cccagccagg cgcttagaaa cggaaatgcg 60
agaacgcgcg gttggcttct gccatgcggt gaacttcgtc gcgcttcttc atcgcgccgc 120
cacggccttc ggccgcttcg gagagttcac ctgccaggcg cagagccat 169
<210> 57
<211> 208
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
ggatgatatc atcttctctt tgatcgacat caggaccagc catctgagtt tgctgttttt 60
gcaaaatttg ctctaatttt tcattactca tattcttatc ctagtttcaa attttttcta 120
actacatttt ccaagtattc tggagaataa ggtttagtga tatattcagt catacccact 180
tcaacacctc ttaagcggtc agttttac 208
<210> 58
<211> 157
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
aaagagaaag aaaaacaaga gcaacaaatt gtaaccgatg taattgtaga taaaatacaa 60
gagcgtgtaa atcagttaca agtgtcagaa ccacaaacgg ttagagcggg ttcggtagtg 120
cacttgtgtt ctcacataga agcaacgctc aaagagg 157
<210> 59
<211> 179
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
cagctggcgt ttcgtcagtg ctttctgcag caggagcttc aggagcttca gcagcaggag 60
tttcttctac tgcaggagca gcttcttcag cctgagcttc tacagtttca gatttgtttt 120
gaagagcaga aacaactctt tggattggag actgaagtaa tccgatgatt tcaccgatc 179
<210> 60
<211> 166
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
catcgggcag cgtgccggtt gccattcagc agtctcctga aaagtgttgc accaatttag 60
tgcattatag ctttttacat caaaaaagcg cgagaaagca ggttgttagt ggagaaaaaa 120
gcccatcctg ggatgggcta cagatgactg gcaaacgcag atgccg 166
<210> 61
<211> 171
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
ttcgctcgcg tgagctcgga gaccacaata aacgcgcgct ggacttcact ccacaccagc 60
cggtaactgc aattaagact tctcttcata ttgatgccct cgaaacccgc tcagacgccg 120
ttatgcggca tgctgatttg ggtctgccaa tgctgttgtt ttgatgtcga a 171
<210> 62
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
aatgatacgg cgaccaccga gatctacac 29
<210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
cccaagatga tccagaagga ga 22
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
catggagaag tagatgccgg 20
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
gtgtccttca accgcgatat c 21
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
agctgggaga tgaggacgac 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
atgatcgcca agaagttcgg 20
<210> 68
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
ggtcacgtac ttgttggcct c 21
<210> 69
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
ttctttggct tctagtgcac tcatg 25
<210> 70
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
gatacatcaa ccattaggtg gagc 24
<210> 71
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
aactacagat gcaccaacac catgt 25
<210> 72
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
gtagttgatg acggaagagg tatgc 25
<210> 73
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
aatagtggtg caagggctac taga 24
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
cgaggactta cctgtaccgg t 21
<210> 75
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
atgggtgaag aattcatgta caacg 25
<210> 76
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
tttgccgcac gttccaat 18
<210> 77
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
aattggtgtg aaggaaggag c 21
<210> 78
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
ggaccaaaga tttcttcttg gg 22
<210> 79
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
caggacggat cttatcgatg g 21
<210> 80
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
cttatgctga gaaatttgca ggtc 24
<210> 81
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
acacttcacc tagttgcaca tcttg 25
<210> 82
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
tgtaccatcc tcagtcatac gaaga 25
<210> 83
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
tcaggcagaa cgtcaggaa 19
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
cgttcgtctg gctaacctgt c 21
<210> 85
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
gaccgcattg tcgcaact 18
<210> 86
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
gttgcgtacg cagccaat 18
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
agctcgtgac gtgtcagcag 20
<210> 88
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
ggtttcgtct cgcacaaatt c 21
<210> 89
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
agttggtgtg cggatcgtt 19
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
gtgaagcagc cggatatcac 20
<210> 91
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
accctgacac gattcccga 19
<210> 92
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
agcggatgct caccaaagtt 20
<210> 93
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
aaaggcgtcc ggatcaat 18
<210> 94
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
atgttcccgg gatcaccac 19
<210> 95
<211> 159
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
tcctcaggca cgagccccaa gatgatccag aaggagaccc aggcccgcat gatcggctac 60
ggcggcatgc tcatggagtc cttcgtggcc attatggccc tggccgccgc cgtctccctg 120
agccccggca tctacttctc catgaacacc cccgttgac 159
<210> 96
<211> 160
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
tctgagaggt ggtccgtgtc cttcaaccgc gatatccaga tcgatccccc aaccgggtcc 60
agacccgttc cggcggaggc cggggagcga tgatcggcgg cggctcgatc ctgaccgtca 120
tcgccgtcgt cctcatctcc cagctcacgg gggtggacct 160
<210> 97
<211> 215
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
aaccgcaccg cgtccatgat cgccaagaag ttcggcgaga tccccacacc cccggtgagc 60
tcgaggacat cgaccgcacc ctcctggatg ccgtcgagac cgggtttgag accgtcggca 120
acctgattcg ccaccaccgc cagaaggcgg cgctgtccga ggccatgcgc ctggtcggcg 180
aggccaacaa gtacgtgacc gacaccgagc ccttc 215
<210> 98
<211> 214
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
atctattaaa ccatattctt tggcttctag tgcactcatg aagttatcac gttcagtatc 60
cattttaatt ttttctaatg gctgaccagt tctttcagat aatatctcat ttaaagtttc 120
ttttattttt aaaattctct ttgcatgaat ttctatatct gttgcttgac cttgagctcc 180
acctaatggt tgatgtatca ttatttcact attt 214
<210> 99
<211> 191
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
ttctgaaaga gcattaacta cagatgcacc aacaccatgt aatccaccag atatactttg 60
tatccgccgc ctccgaattt acctccagca tgtagaactg tcattataac ttctacagtt 120
ggttttccca tctttggatg aattcctact ggcatacctc ttccgtcatc aactacagta 180
actgaattat c 191
<210> 100
<211> 180
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
agtgtggcgt atgtgaatag tggtgcaagg gctactagag tggcggatat gtctgtcaaa 60
aacgcaccgt cacgcgcctc gcaccgtggc cgctcctcaa agggaagcgc ccgccctgcg 120
aaccgatcgc ggccgtctgg ccgtaccggt acaggtaagt cctcgagccg gggaaactcc 180
<210> 101
<211> 206
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
tacgctggaa cagcgatggg tgaagaattc atgtacaacg gcaagcacgt tttagttgtc 60
tttgatgatt tatcaaaaca agccgttgct taccgtgaac tgtcattatt actacgtcgt 120
ccgccaggtc gtgaagcgta cccaggggat gtcttttatt tgcactcacg tctattggaa 180
cgtgcggcaa aactttcaga tgaatt 206
<210> 102
<211> 177
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
tttaaaatat gtcgaaattg gtgtgaagga aggagctacg ctgattactg gtgggcaacg 60
tttaacagaa aatgggctag acaagggggc gtttttagca cctacgttat tagcgaatgg 120
tacgaatgca atgtgtgtgg cccaagaaga aatctttggt cctgttgcaa cagtgat 177
<210> 103
<211> 158
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
ccaatttacg cccgtcagga cggatcttat cgatggtgat caattcacac gtacgacatc 60
tttttcaaga tcttctgtga tttgtttaac ttctttcaac aagtgatctt catcttcatg 120
acctgcaaat ttctcagcat aagcttcgcg gatatcga 158
<210> 104
<211> 178
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
taatggtaac gttatacact tcacctagtt gcacatcttg ccgaaaagct cgcgtgcatg 60
gttggaagaa catgatatcc cttataagga aagaaacatt ttttctgagc cacttagttt 120
ggatgaaatt aaagaaattc ttcgtatgac tgaggatggt acagatgaaa ttatttcc 178
<210> 105
<211> 155
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
tgaacgccac cgaagtcagg cagaacgtca ggaacgacgc cagcgcgcca gcaggacgag 60
gtagttgagc aaccggcgcg ccagaaagcg agtcatgccc caccacagtg ccgcattggg 120
acaggttagc cagacgaacg cgaaccttcc gatcg 155
<210> 106
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
cgccgggaac acgccgaccg cattgtcgca actgtcctct ttcctgtcgc aggcagtaaa 60
ggcgccgacg ggatggccca acattctccc ggatgacttc accatccttg acggcatatt 120
ggctgcgtac gcaacggtcg gcgtgacgca 150
<210> 107
<211> 164
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
cgatagccgg tgcgcagctc gtgacgtgtc agcaggccag acgcaatggc cgtactcccc 60
gtgaccaggt tccccatgtc gcgaccatgc catgcacctc tacaggtacg cgagaccgag 120
gttgtggtga atttgtgcga gacgaaaccg ccacaacctc ggtc 164
<210> 108
<211> 201
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
ccgccgtgac cttcgagttg gtgtgcggat cgttggcgtg gccaccgcgc tggcgagcat 60
ccgaggcggg ctggtagagc tcggtgagcg ccggcagcgc ctcaccgtcg gaggcgatga 120
agagggcatc aagggtgccg ggttggctac cccaggtcac cgccacgtga tatccggctg 180
cttcaccgag ccggtacacc a 201
<210> 109
<211> 158
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
ctgatctgcc acggcaccct gacacgattc ccgaagctgc gtatcgccag cgtcgagaac 60
ggcagctcgt ggattttccc gctgttcaac gacttcgagg aactcgcgaa gaagatgccg 120
cagaactttg gtgagcatcc gctcgacgtc ttccgccg 158
<210> 110
<211> 196
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
cgggccagcc cgcgaaaagg cgtccggatc aatcccttac cgctgggcgc gtcataaccg 60
atccatgcga tcgacgcggc cgcgaggtgc gggtcctctc tgcgggtcga ttcgagatgg 120
ttcagcgcat tcgtcaggtt gatgtccagg ctggcgatgg tggtggtgat cccgggaaca 180
tgccaggaaa ccgact 196
<210> 111
<211> 179
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
tcctcaggca cgagccccaa gatgatccag aaggagaccc aggcccgcaa ctggaagtca 60
gaggtgagat gatcggctac ggcggcatgc tcatggagtc cttcgtggcc attatggccc 120
tggccgccgc cgtctccctg agccccggca tctacttctc catgaacacc cccgttgac 179
<210> 112
<211> 180
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
tctgagaggt ggtccgtgtc cttcaaccgc gatatccaga tcgatcccaa ctggaagtca 60
gaggtgagcc aaccgggtcc agacccgttc cggcggaggc cggggagcga tgatcggcgg 120
cggctcgatc ctgaccgtca tcgccgtcgt cctcatctcc cagctcacgg gggtggacct 180
<210> 113
<211> 235
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
aaccgcaccg cgtccatgat cgccaagaag ttcggcgaga tccccacaac tggaagtcag 60
aggtgagacc cccggtgagc tcgaggacat cgaccgcacc ctcctggatg ccgtcgagac 120
cgggtttgag accgtcggca acctgattcg ccaccaccgc cagaaggcgg cgctgtccga 180
ggccatgcgc ctggtcggcg aggccaacaa gtacgtgacc gacaccgagc ccttc 235
<210> 114
<211> 234
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
atctattaaa ccatattctt tggcttctag tgcactcatg aagttatcac gaactggaag 60
tcagaggtga gttcagtatc cattttaatt ttttctaatg gctgaccagt tctttcagat 120
aatatctcat ttaaagtttc ttttattttt aaaattctct ttgcatgaat ttctatatct 180
gttgcttgac cttgagctcc acctaatggt tgatgtatca ttatttcact attt 234
<210> 115
<211> 211
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
ttctgaaaga gcattaacta cagatgcacc aacaccatgt aatccaccag ataactggaa 60
gtcagaggtg agatactttg tatccgccgc ctccgaattt acctccagca tgtagaactg 120
tcattataac ttctacagtt ggttttccca tctttggatg aattcctact ggcatacctc 180
ttccgtcatc aactacagta actgaattat c 211
<210> 116
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
agtgtggcgt atgtgaatag tggtgcaagg gctactagag tggcggatat aactggaagt 60
cagaggtgag gtctgtcaaa aacgcaccgt cacgcgcctc gcaccgtggc cgctcctcaa 120
agggaagcgc ccgccctgcg aaccgatcgc ggccgtctgg ccgtaccggt acaggtaagt 180
cctcgagccg gggaaactcc 200
<210> 117
<211> 226
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
tacgctggaa cagcgatggg tgaagaattc atgtacaacg gcaagcacgt taactggaag 60
tcagaggtga gttagttgtc tttgatgatt tatcaaaaca agccgttgct taccgtgaac 120
tgtcattatt actacgtcgt ccgccaggtc gtgaagcgta cccaggggat gtcttttatt 180
tgcactcacg tctattggaa cgtgcggcaa aactttcaga tgaatt 226
<210> 118
<211> 197
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
tttaaaatat gtcgaaattg gtgtgaagga aggagctacg ctgattaaac tggaagtcag 60
aggtgagctg gtgggcaacg tttaacagaa aatgggctag acaagggggc gtttttagca 120
cctacgttat tagcgaatgg tacgaatgca atgtgtgtgg cccaagaaga aatctttggt 180
cctgttgcaa cagtgat 197
<210> 119
<211> 178
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
ccaatttacg cccgtcagga cggatcttat cgatggtgat caattcacaa ctggaagtca 60
gaggtgagac gtacgacatc tttttcaaga tcttctgtga tttgtttaac ttctttcaac 120
aagtgatctt catcttcatg acctgcaaat ttctcagcat aagcttcgcg gatatcga 178
<210> 120
<211> 198
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
taatggtaac gttatacact tcacctagtt gcacatcttg ccgaaaagct cgaactggaa 60
gtcagaggtg agcgtgcatg gttggaagaa catgatatcc cttataagga aagaaacatt 120
ttttctgagc cacttagttt ggatgaaatt aaagaaattc ttcgtatgac tgaggatggt 180
acagatgaaa ttatttcc 198
<210> 121
<211> 175
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
tgaacgccac cgaagtcagg cagaacgtca ggaacgacgc cagcgcaact ggaagtcaga 60
ggtgaggcca gcaggacgag gtagttgagc aaccggcgcg ccagaaagcg agtcatgccc 120
caccacagtg ccgcattggg acaggttagc cagacgaacg cgaaccttcc gatcg 175
<210> 122
<211> 170
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
cgccgggaac acgccgaccg cattgtcgca actgtcctct ttccaactgg aagtcagagg 60
tgagtgtcgc aggcagtaaa ggcgccgacg ggatggccca acattctccc ggatgacttc 120
accatccttg acggcatatt ggctgcgtac gcaacggtcg gcgtgacgca 170
<210> 123
<211> 184
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
cgatagccgg tgcgcagctc gtgacgtgtc agcaggccag acgcaaaact ggaagtcaga 60
ggtgagtggc cgtactcccc gtgaccaggt tccccatgtc gcgaccatgc catgcacctc 120
tacaggtacg cgagaccgag gttgtggtga atttgtgcga gacgaaaccg ccacaacctc 180
ggtc 184
<210> 124
<211> 221
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
ccgccgtgac cttcgagttg gtgtgcggat cgttggcgtg gccacaactg gaagtcagag 60
gtgagcgcgc tggcgagcat ccgaggcggg ctggtagagc tcggtgagcg ccggcagcgc 120
ctcaccgtcg gaggcgatga agagggcatc aagggtgccg ggttggctac cccaggtcac 180
cgccacgtga tatccggctg cttcaccgag ccggtacacc a 221
<210> 125
<211> 178
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
ctgatctgcc acggcaccct gacacgattc ccgaagctgc gtatcaactg gaagtcagag 60
gtgaggccag cgtcgagaac ggcagctcgt ggattttccc gctgttcaac gacttcgagg 120
aactcgcgaa gaagatgccg cagaactttg gtgagcatcc gctcgacgtc ttccgccg 178
<210> 126
<211> 216
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
cgggccagcc cgcgaaaagg cgtccggatc aatcccttac cgctaactgg aagtcagagg 60
tgaggggcgc gtcataaccg atccatgcga tcgacgcggc cgcgaggtgc gggtcctctc 120
tgcgggtcga ttcgagatgg ttcagcgcat tcgtcaggtt gatgtccagg ctggcgatgg 180
tggtggtgat cccgggaaca tgccaggaaa ccgact 216
Claims (8)
1.一种提高多重PCR扩增文库质量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)根据多重PCR中每个扩增子的扩增靶标序列，人工合成若干条两端包含与所述扩增子的引物互补配对片段的差异靶标序列，但所述差异靶标序列与所述扩增靶标序列具有编辑距离大于5bp的差异序列；人工合成的差异靶标序列在测序读长范围内至少被检测到5bp以上的差异序列；
2)将步骤1)中若干条人工合成的差异靶标序列中，不少于总数量的10％进行混合，构建得到多重PCR人工合成带差异的序列集合；
3)以待测样本为反应模版，将所述多重PCR人工合成带差异的序列集合加入反应体系中进行多重PCR扩增反应，得到高质量的多重PCR扩增文库。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1)中多重PCR中扩增子是候选检测生物分别经多重PCR引物扩增得到的扩增产物。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1)中多重PCR中扩增子的数量根据候选检测生物的数量而决定。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1)中所述差异序列中，以4种碱基数比例之和为100％计，4种碱基数量的比例均不大于70％。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1)中所述差异序列的形式包括插入、缺失和错配中一种或几种形式。
6.根据权利要求1或5所述方法，其特征在于，步骤1)中所述差异序列包括插入一段20bp如序列表中SEQ ID No.1所示核苷酸序列。
7.根据权利要求1或5所述方法，其特征在于，步骤1)中所述测序读长为35～600bp。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2)中在多重PCR人工合成带差异的序列集合中，各带差异序列的靶标序列的拷贝数不大于108拷贝/mL。
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