ES2896058T3

ES2896058T3 - Métodos para detectar la metilación de CpG y para el diagnóstico del cáncer

Info

Publication number: ES2896058T3
Application number: ES19163504T
Authority: ES
Inventors: Denise Kottwitz; Jörn Lewin; Anne Schlegel; Reimo Tetzner
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2014-12-19
Filing date: 2015-12-18
Publication date: 2022-02-23
Anticipated expiration: 2035-12-18
Also published as: US12054786B2; HK1245845B; JP6731942B2; US20180202006A1; WO2016097319A1; EP3540075A1; ES2724367T3; EP3234184B1; US20170233820A1; DK3234184T3; SI3234184T1; CN107406874B; HRP20190787T1; EP3540075B1; CN107406874A; US20220372579A1; JP2018500933A; US9957575B2; LT3234184T; EP3234184A1

Abstract

Un método para detectar la presencia o ausencia de ADN diana hipermetilado en una muestra que comprende ADN genómico, en donde dicho ADN diana es ADN SHOX2 humano genómico, que incluye la respectiva región promotora, y ADN dentro de 5 kb corriente arriba y corriente abajo del mismo, y en donde dicho ADN genómico está fragmentado al menos parcialmente, comprendiendo el método las etapas: (a) convertir, en el ADN, citosina no metilada en la posición 5 en uracilo u otra base que no hibrida con guanina; (b) amplificar una región del ADN diana convertido usando oligonucleótidos cebadores inespecíficos de metilación y al menos un bloqueador específico de metilación que bloquea la amplificación de una manera específica de metilación, en donde dicha región tiene menos de 100 pares de bases (pb) de longitud y comprende al menos 3 sitios CpG del ADN genómico no cubiertos por un cebador, y en donde al menos un oligonucleótido cebador cubre (1) al menos un sitio CpG con un error de apareamiento inespecífico de metilación o un espaciador con respecto a la posición de la base de citosina del sitio CpG y/o (2) al menos un sitio SNP con un error de apareamiento inespecífico de SNP o un espaciador, en donde el al menos un error de apareamiento o espaciador está/están en el tercio medio o en el tercio 3' del oligonucleótido cebador; y (c) detectar la presencia o ausencia de ADN amplificado en la etapa (b), en donde la presencia o ausencia de ADN amplificado refleja la presencia o ausencia, respectivamente, de ADN diana hipermetilado en la muestra.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para detectar la metilación de CpG y para el diagnóstico del cáncer

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la farmacogenómica y en particular a detectar la presencia o ausencia del ADN hipermetilado. La detección de la metilación de CpG en el ADN marcador es útil para el diagnóstico de cánceres y subtipos de cáncer y la invención proporciona métodos mejorados para este propósito. Estos métodos mejorados permiten, en particular, una detección más sensible del ADN marcador metilado con altos fondos de ADN marcador no metilado.

Antecedentes de la invención

Hace más de 65 años, Mandel y Metais describieron por primera vez su observación de la presencia de ácidos nucleicos extracelulares en humanos (Mandel P, Metais P. Les acides nucleiques du plasma sanguin chez l'homme. C.R.Acad.Sci.Paris 142,241-243. 1948) y más de cuatro décadas después, pudo demostrarse claramente que en los ácidos nucleicos libres de células aislados de plasma, suero y otros fluidos corporales pueden encontrarse alteraciones genéticas asociadas a tumores (Fleischhacker M, Schmidt B. (2007) Circulating nucleic acids (CNAs) and cancer--a survey. Biochim Biophys Acta 1775: 181-232; Jung K, Fleischhacker M, Rabien A. (2010) Cell-free DNA in the blood as a solid tumor biomarker-a critical appraisal of the literature. Clin Chim Acta 411: 1611-1624). Esto incluye alteraciones epigenéticas observadas en diferentes formas de tumores malignos. Una característica distintiva de la cromatina de mamíferos es la metilación del ADN y se conoce que la metilación de la citosina en el contexto de un dinucleótido CpG desempeña un papel en la regulación del desarrollo y es importante en procesos biológicos básicos como la embriogénesis y la diferenciación celular (Smith ZD, Meissner A. (2013) DNA methylation: roles in mammalian development. Nat Rev Genet 14: 204-220; Gibney ER, Nolan CM. (2010) Epigenetics and gene expression. Heredity (Edinb) 105: 4-13). Como tal, la metilación no solo regula la transcripción de genes, sino que además desempeña un papel en el mantenimiento de la estabilidad del genoma, la impronta y la inactivación del cromosoma X. Las alteraciones epigenéticas en oncogenes y genes supresores de tumores son de importancia clave en el desarrollo del cáncer (Suva ML, Riggi N, Bernstein BE. (2013) Epigenetic reprogramming in cancer. Science 339: 1567-1570). Los patrones de metilación del ADN se modifican en gran medida en las células cancerosas y, por lo tanto, pueden usarse para distinguir las células cancerosas de los tejidos normales. Como tal, los patrones de metilación del ADN se usan para diagnosticar todos los tipos de cánceres. Un concepto relativamente reciente es el uso del ADN tumoral libre circulante que se libera del tumor, por ejemplo, en la sangre, para el análisis de la metilación como un indicador de la carga tumoral en el cuerpo del paciente. Esta capacidad de aislar y caracterizar los ácidos nucleicos extracelulares de los tumores de pacientes, mediante el uso de métodos muy sensibles y altamente específicos, condujo al término de "biopsia líquida". Como un resultado, los médicos ya no dependen exclusivamente de un examen único de biopsias de tejidos y exploraciones corporales. La detección de pequeñas cantidades de ADN tumoral metilado con altos fondos de ADN no tumoral no metilado en tal una biopsia líquida, desafía en gran medida la sensibilidad de los métodos de detección. Se han logrado resultados muy buenos mediante el uso de tecnologías basadas en una amplificación selectiva del ADN tumoral metilado después de la conversión con bisulfito, tales como la PCR específica para metilación (MSP) y especialmente la tecnología HeavyMethyl™ (HM) (Cottrell y otros, A real-time PCR assay for DNA-methylation using methylation-specific blockers. Nucleic Acids Res. 2004 Jan 13;32(1):e10).

Cuanto menos avanzado es el cáncer, mejores son las opciones de tratamiento y las posibilidades de curar al paciente. Por lo tanto, es altamente conveniente diagnosticar un cáncer tan pronto como sea posible. Sin embargo, un cáncer menos avanzado, que significa un tamaño tumoral más pequeño y menos células cancerosas, libera menos ADN tumoral libre circulante. Esto se ve agravado por el hecho de que la vida media de los ácidos nucleicos extracelulares es bastante corta, por ejemplo, menos de seis horas en plasma (Rago C, Huso DL, Diehl F, Karim B, Liu G, y otros (2007) Serial assessment of human tumor burdens in mice by the analysis of circulating DNA. Cancer Res 67: 9364 9370). Por lo tanto, cuanto más sensible sea un método de detección, más temprano puede diagnosticarse el cáncer de cualquier tipo o diagnosticarse de manera confiable. En consecuencia, existe una necesidad en la técnica de métodos para detectar la metilación del ADN con una sensibilidad aumentada.

Para la detección sensible, HeavyMethyl™ o HM (los cebadores se unen de manera no específica en los sitios de metilación, pero se bloquean específicamente en los sitios de metilación y, por lo tanto, se volverán a bloquear, incluso si un molde no deseado se produce a niveles mínimos cuando el bloqueo falla en ciclos de amplificación anteriores) se considera como la primera opción cuando se compara con MSP (cuyos cebadores se unen específicamente en los sitios de metilación y, por lo tanto, introduce un molde de apareamiento perfecto en caso de que ocurra una unión inespecífica de los cebadores que después se amplificará exponencialmente). Las ventajas de HM parecen ser un trueque a cambio con una desventaja: La teoría ampliamente aceptada fue que las partes ricas en CpG para los bloqueadores deben estar lado a lado con los sitios de iniciación sin CpG. Esto limita en gran medida la elección del sitio o región que se analizará, solamente porque hay grandes cantidades de sitios o regiones adecuados en un ADN diana determinado.

Debido a las constricciones de diseño (sitios CpG no deseados, SNP, etcétera), los ensayos de metilación en el pasado usaban amplicones con tamaños de hasta 150 pb para HM, que los inventores consideraron generalmente aplicables, además, para tratar la fragmentación del ADN en el ADN tumoral circulante. Se conocían tamaños más cortos para HM, pero estos evitaban los sitios CpG y los SNP no deseados, o los CpG no deseados se limitaron a los extremos 5' del cebador para minimizar un efecto sobre la amplificación (documento WO 2008/149237 A2). Años de experiencia y comparación de resultados mostraron a los inventores que los ensayos de marcadores de cáncer con tal longitud fueron muy útiles en especímenes que contienen células cancerosas (ADN genómico tumoral de alto peso molecular) y son útiles, además, (aunque con una sensibilidad algo disminuida) cuando se aplican a biopsias líquidas/fluidos corporales, en los que la diana es el ADN libre circulante (se espera que tal ADN esté al menos parcialmente fragmentado).

Los inventores han encontrado ahora que, sorprendentemente, una disminución adicional en el tamaño del amplificado conduce a una amplificación mucho mejor (incluso independiente de la fragmentación del ADN que se encuentra en el ADN tumoral circulante), lo que proporciona una señal significativamente mejorada que es especialmente útil cuando el molde original, es decir, el ADN tumoral metilado, es escaso entre un alto fondo de ADN no tumoral no metilado. La disminución del tamaño del amplicón como objetivo principal del diseño que prevalece sobre otras consideraciones (tales como los sitios CpG no deseados, los s Np , etcétera) tiene, al alcance del conocimiento de los inventores, que no se ha hecho antes, ya que un tamaño pequeño limita en gran medida la elección de sitios o regiones para analizarse: hay mucho menos sitios o regiones adecuados debido a la presencia de sitios CpG que estarían cubiertos por los cebadores, que deben ser inespecíficos de la metilación para una detección sensible mediante el uso de HeavyMethyl™. Además, los cebadores no deben cubrir los sitios de SNP, ya que sesga la sensibilidad si los cebadores son específicos para un nucleótido particular del SNP.

Además, los inventores encontraron, sorprendentemente, que la introducción de errores de apareamientos en los sitios CpG (o en sitios SNP) en los cebadores para HM (metilación no específica mediante la introducción, por ejemplo, de un error de apareamientos C=C, T=C, C=T o T=T con la primera base en el cebador y la segunda en el molde de ADN sentido sintetizado con bisulfito- o error de apareamiento A=G, G=G, A=A o G=A - con la primera base en el cebador y la segunda en la hebra inversa complementaria sintetizada con bisulfito - para las posiciones de citosina en los sitios CpG) no introduce un bloqueo peor o una unión inespecífica del cebador, incluso si una posición de un error de apareamiento se ubica en la mitad del cebador (y no se limitó a las posiciones próximas del extremo 5' de un cebador donde se esperaría una pequeña influencia negativa), no solo cuando la entalpía global de unión del cebador se ajustó mediante diseño (por ejemplo, extensión). De hecho, hubo evidencia de que tales construcciones podrían incluso bloquearse mejor. Los inventores creen que esto podría deberse a que la inestabilidad de los cebadores bloqueados sea incluso más alta en comparación con los cebadores no bloqueados que aún hibridan bien.

Los métodos para detectar el cáncer que se adaptan de acuerdo con estos hallazgos permitirán una mejor atención para los pacientes con cáncer porque proporcionan la posibilidad de la ventana de tiempo más promisoria para el tratamiento.

Resumen de la invención

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para detectar la presencia o ausencia de ADN diana hipermetilado en una muestra que comprende ADN genómico, en donde dicho ADN diana es ADN SHOX2 humano genómico, incluida la región promotora respectiva, y el ADN dentro de 5 kb corriente arriba y corriente abajo del mismo, y en donde dicho ADN genómico está al menos parcialmente fragmentado, comprendiendo el método las etapas:

(a) convertir, en el ADN, la citosina no metilada en la posición 5 en uracilo u otra base que no hibrida con guanina; (b) amplificar una región del ADN diana convertido mediante el uso de oligonucleótidos cebadores no específicos de metilación y al menos un bloqueador específico de metilación que bloquea la amplificación de una manera específica de metilación, en donde dicha región es menor que 100 pares de bases (pb) de longitud y comprende al menos 3 sitios CpG del ADN genómico no cubierto por un cebador, y en donde al menos un oligonucleótido cebador cubre (1) al menos un sitio CpG con un error de apareamiento o un separador no específico de metilación con respecto a la posición de la base citosina del sitio CpG y/o (2) al menos un sitio SNP con un error de apareamiento o un separador no específico del SNP; en donde el al menos un error de apareamiento o separador está/están en el tercio medio o en el tercio 3' del oligonucleótido cebador y

(c) detectar la presencia o ausencia del ADN amplificado en la etapa (b),

en donde la presencia o ausencia del ADN amplificado refleja la presencia o ausencia, respectivamente, del ADN diana hipermetilado en la muestra.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un método para detectar la presencia o ausencia de cáncer en un sujeto, que comprende el método para detectar la presencia o ausencia del ADN diana hipermetilado en una muestra que comprende el ADN genómico de acuerdo con el primer aspecto, en donde

- dicha muestra es una muestra derivada del sujeto que comprende, en un sujeto que tiene dicho cáncer, el ADN tumoral de una célula cancerosa,

- dicho ADN diana está hipermetilado en las células cancerosas de un paciente que tiene dicho cáncer, y - la presencia o ausencia del ADN diana hipermetilado en la muestra es indicativa de la presencia o ausencia, respectivamente, del cáncer en el sujeto.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un kit adecuado para realizar el método del primer aspecto. El kit comprende

(i) al menos un par de oligonucleótidos cebadores no específicos de la metilación que consiste de un cebador directo e inverso, en donde dicho par de cebadores es adecuado para generar un amplicón a partir de una hebra única de ADN SHOX2 humano genómico, incluida la región promotora respectiva, y ADN dentro de los 5 kb corriente arriba y corriente abajo del mismo, en la que la citosina no metilada en la posición 5 se convirtió a uracilo u otra base que no hibrida con guanina, en donde dicho ADN genómico está al menos parcialmente fragmentado, en donde al menos un oligonucleótido cebador cubre (1) al menos un sitio CpG con un error de apareamiento o un separador no específico de la metilación con respecto a la posición de la base citosina del sitio CpG y/o (2) al menos un sitio SNP con un error de apareamiento o un separador no específico del SNP, en donde el al menos un error de apareamiento o separador está/están en el tercio medio o en el tercio 3' del oligonucleótido cebador, y en donde dicho amplicón es menor de 100 pb de longitud y comprende al menos 3 sitios CpG del ADN genómico no cubierto por un cebador; y

(ii) al menos un bloqueador específico de metilación capaz de bloquear la amplificación en una manera específica de la metilación.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere al uso del kit del tercer aspecto para detectar la presencia o ausencia de cáncer en un sujeto.

Leyenda para las figuras

Figura 1: Mapa de las regiones diana. A: SHOX2, B: PTGer4, C: FOXL2. Véase la Tabla 1 para una explicación de las SEQ ID NOs.

Figura 2: Ejemplos de los ensayos. Las secuencias del ADN de referencia y de ensayo están en la orientación sentido del genoma construido de GRCh38. Los ensayos y sus elementos se alinean con la secuencia genómica de referencia, en el medio (de la secuencia genómica, se muestran ambas hebras). De esta manera, la hebra que no está tachada proporciona la hebra convertida con bisulfito que es relevante como molde para el ensayo. La cadena genómica complementaria inversa tachada es irrelevante para el ensayo, pero se muestra en aras de la complementariedad. En la parte superior e inferior de la secuencia de referencia genómica se muestran dos secuencias derivadas: la hebra de bisulfito que es el molde inicial para la amplificación (bis.) y su hebra complementaria inversa que no está disponible hasta que se sintetiza mediante la amplificación (sint). Cuál de estas secuencias está en la parte superior o en la parte inferior, está en dependencia de la orientación de la secuencia en el genoma construido. Todas las secuencias de las hebras únicas de ADN se anotan con 3' y 5' en ambos extremos de acuerdo con su orientación. La nomenclatura usa las bases IUPAC: Y significa C o T (en dependencia del estado de metilación desconocido de una citosina en el contexto CpG), R significa G o A (base inversa complementaria de una citosina en la posición CpG de la cual se desconoce el estado de metilación). Las secuencias de los cebadores se muestran mediante secuencias subrayadas. Otros oligómeros, como los bloqueadores y las sondas, se muestran alineados con las secuencias de ensayo y de referencia - en los casos donde se necesita la secuencia inversa (apareamiento en la hebra inversa del ensayo) esta se muestra, adicionalmente, en texto de color gris. La citosina en el contexto de CpG, sus contrapartes en la hebra opuesta y/o cualquier base en la sonda o el bloqueador que los interrogue de forma indirecta o directa se muestran como caracteres en negrita con fondo gris (por ejemplo Y o c ). Las letras mayúsculas se usan en un contexto diferente: Para todas las secuencias genómicas de referencia, para las bases de la hebra inversa sintetizada complementaria al molde de bisulfito (que excluye el cebador) y para las posiciones relevantes de las mediciones de la metilación del ADN en el producto de bisulfito. Las bases en las regiones del cebador que son cualquiera de las citosinas en el contexto de CpG o SNP, que se excluyen de influir en la PCR mediante la introducción de errores de apareamientos en el cebador para todos los estados posibles, se resaltan mediante una fuente blanca sobre fondo negro (por ejemplo, Y). Las timidinas en la hebra molde de bisulfito que se derivan de citosinas fuera del contexto CpG (primero por desaminación a uracilo, después por reemplazo con timidina en la PCR) se muestran en cursiva (por ejemplo, t).

Figura 3: Comparación de un ensayo de la PCR en tiempo real de 90 pb para FOXL2 sin un error de apareamiento en el medio del cebador y uno de 68 pb para FOXL2 con un error de apareamiento no específico de metilación en el medio de un cebador que cubre y evalúa los mismos CpG con sus bloqueadores y sondas mediante el uso de muestras técnicas.

Figura 4: Comparación de un ensayo de la PCR en tiempo real de 90 pb para FOXL2 sin un error de apareamiento en el medio del cebador y uno de 68 pb para FOXL2 con un error de apareamiento no específico de metilación en el medio de un cebador que cubre y evalúa los mismos CpG con sus bloqueadores y sondas mediante el uso de muestras de plasma negativas (que contienen FOXL2 no metilado) ligeramente positivas (que contienen FOXL2 metilado al nivel de aproximadamente 50 pg) para el marcador no enriquecido y enriquecido con 50 pg del ADN metilado.

Figura 5: Rendimiento del FOXL2 de 68 pb con un error de apareamiento no específico de la metilación en el medio de un cebador mediante el uso de muestras técnicas (arriba a la izquierda), plasma no enriquecido y con plasma enriquecido a diferentes niveles (arriba a la derecha) y muestras de plasma de pacientes con cáncer de pulmón y saludables (abajo). Las PCR para muestras técnicas y de plasma enriquecido se realizaron por triplicado. La figura en la parte inferior muestra un punto de corte del ciclo umbral (Ct) de señal 1.3 HEX en la cual se requieren las curvas para determinar el Ct. En este punto de corte, solo pudo evaluarse al paciente con cáncer, las señales de los pacientes saludables estaban más abajo del umbral.

Figura 6: Metilación de SHOX2 en muestras de plasma sanguíneo de pacientes con cáncer de pulmón en comparación con controles de plasma sanguíneo de individuos saludables evaluados mediante la PCR en tiempo real en una reacción doble con ACTB como referencia. Se compararon 59 muestras de pacientes con cáncer de pulmón y 92 controles saludables. AUC Calculada=0,871. Los puntos marcados son los umbrales para la sensibilidad del 95 % o bien para la especificidad del 95 %.

Figura 7: Metilación de SHOX2 en muestras de plasma sanguíneo de pacientes con cáncer de pulmón en comparación con controles de plasma sanguíneo de individuos saludables evaluados mediante la PCR en tiempo real en una reacción triple con otro marcador de metilación y ACTB como referencia. Se compararon 48 muestras de pacientes con cáncer de pulmón y 100 controles saludables. AUC Calculada=0,893 (para SHOX2 evaluado independientemente del otro marcador de metilación usado). Los puntos marcados son los umbrales para la sensibilidad del 95 % o bien para la especificidad del 95 %.

Figura 8: Metilación de SHOX2 en plasma sanguíneo de pacientes con cáncer de pulmón en comparación con plasma sanguíneo de controles que tienen diversas enfermedades pulmonares mediante la PCR en tiempo real en una reacción triple con otro marcador de metilación y ACTB como referencia. Se compararon 50 muestras de plasma sanguíneo de pacientes con cáncer de pulmón y 50 controles de plasma sanguíneo de individuos con enfermedades pulmonares benignas. AUC Calculada=0,834 (para SHOX2 evaluado independientemente del otro marcador de metilación usado). Los puntos marcados son los umbrales para la sensibilidad del 95 % o bien para la especificidad del 95 %.

Descripción detallada de la invención

Antes de que la presente invención se describa en detalle más abajo, debe entenderse que esta invención no se limita a las metodologías, protocolos y reactivos particulares que se describen en la presente descripción, ya que estos pueden variar. Debe entenderse, también, que la terminología utilizada en la presente descripción es para el propósito de describir realizaciones particulares solamente, y no pretende limitar el alcance de la presente invención la cual se limitará solamente por las reivindicaciones anexas. A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos que se usan en la presente descripción tienen el mismo significado que el que se entiende comúnmente por un experto en la técnica.

Preferentemente, los términos que se usan en la presente descripción se definen como se describe en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. Ed. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Suiza).

Numerosos documentos se citan a lo largo del texto de esta descripción.

A continuación, se describirán los elementos de la presente invención. Estos elementos se enumeran con realizaciones específicas, sin embargo, debe entenderse que pueden combinarse de cualquier manera y en cualquier número para crear realizaciones adicionales. Los ejemplos descritos de diversas maneras y las realizaciones preferidas no deben interpretarse para limitar la presente invención a solamente las realizaciones descritas explícitamente. Debe entenderse que esta descripción sustenta y abarca realizaciones que combinan las realizaciones descritas explícitamente con cualquier cantidad de elementos descritos y/o preferidos. Además, cualquiera de las permutaciones y combinaciones de todos los elementos descritos en esta solicitud deben considerarse descritas por la descripción de la presente solicitud a menos que el contexto lo indique de cualquier otra manera.

A lo largo de esta descripción y de las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto lo requiera de cualquier otra manera, la palabra "comprender", y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", se entenderán que implican la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas indicadas pero no a la exclusión de cualquier otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas. Como se usa en esta descripción y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", y "el/la" incluyen las referencias en plural a menos que el contenido del texto lo dicte claramente de cualquier otra manera.

Aspectos de la invención y realizaciones particulares de esta

La invención se refiere a diversos aspectos como se expuso anteriormente en el resumen de la invención. Estos aspectos comprenden realizaciones alternativas y realizaciones preferidas, que se describen más abajo.

(a) convertir, en el ADN, la citosina no metilada en la posición 5 en uracilo u otra base que no hibrida con guanina; (b) amplificar una región del ADN diana convertido mediante el uso de oligonucleótidos cebadores no específicos de metilación y al menos un bloqueador específico de metilación que bloquea la amplificación de una manera específica de metilación, en donde dicha región es menor que 100 pares de bases (pb) de longitud y comprende al menos 3 sitios CpG del ADN genómico no cubierto por un cebador, y en donde al menos un oligonucleótido cebador cubre (1) al menos un sitio CpG con un error de apareamiento o un separador no específico de metilación con respecto a la posición de la base citosina del sitio CpG y/o (2) al menos un sitio SNP con un error de apareamiento o un separador no específico del SNP; en donde el al menos un error de apareamiento o separador está/están en el tercio medio o en el tercio 3' del oligonucleótido cebador; y

(c) detectar la presencia o ausencia del ADN amplificado en la etapa (b),

A continuación, se describen las realizaciones preferidas del primer aspecto:

En una realización preferida, dicha región es menor que 100, 99, 98, 97, 96, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61 o 60 pb de longitud, preferentemente, menor que 97, 92, 84, 73, 72, 69 o 67 pb de longitud. Los intervalos preferidos para la región son de 50 a 99 pb, con mayor preferencia de 60 a 99 pb y con la máxima preferencia de 60 o 66 a 96 pb, 60 o 66 a 91, 60 o 66 a 83, 60 o 66 a 72, 60 o 66 a 71 o 60 o 66 a 68. En particular (e independientemente de una longitud general para otros marcadores), la región es menor que 92 pb de longitud, preferentemente 60 o 66 a 91. En el caso de cada una de las longitudes anteriormente mencionadas, dicha región comprende al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 sitios CpG del ADN genómico, preferentemente no cubierto por un cebador. Preferentemente, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 (pero no necesariamente todos, en particular los sitios CpG cubiertos por un separador o un error de apareamiento no específico de la metilación) de esos sitios CpG deben estar metilados en el ADN diana hipermetilado para que se genere un amplicón y/o para ser detectable.

En una realización preferida, el número total de errores de apareamientos y separadores (que incluye los errores de apareamientos y separadores relacionados con el sitio CpG y el sitio s Np ) por cebador es 1, 2 o 3, con mayor preferencia 1 o 2 y con la máxima preferencia 1. Se prevé que solo uno de los cebadores o que ambos cebadores comprendan errores de apareamientos. Si ambos cebadores comprenden errores de apareamientos, el número de errores de apareamientos en un cebador es independiente del número de errores de apareamientos en el otro cebador.

En una realización preferida, el al menos un error de apareamiento o separador, preferentemente todos los errores de apareamientos y separadores, está/están dentro de los diez nucleótidos del extremo 3' del oligonucleótido cebador y/o no dentro de los cinco nucleótidos del extremo 5' del oligonucleótido cebador. Más bien, el al menos un error de apareamiento o separador, preferentemente, todos los errores de apareamientos y separadores, esté/estén en el tercio medio o en el tercio 3' del oligonucleótido cebador.

En una realización preferida, en la etapa (b), el al menos un bloqueador específico de la metilación que bloquea la amplificación en una manera específica de la metilación bloquea la amplificación de la región del ADN diana en caso de que los sitios CpG de dicha región, preferentemente, los sitios CpG que el bloqueador cubre, no estén metilados. Por lo tanto, solo se amplifica el ADN diana hipermetilado.

En una realización preferida, en la etapa (c), la presencia o ausencia del ADN amplificado en la etapa (b) se detecta mediante el uso de una sonda, preferentemente, un oligonucleótido sonda.

En una realización preferida, el error de apareamiento no específico de la metilación es, con respecto a la posición de la base citosina del sitio CpG (que es una C o U/T debido a la conversión y amplificación posterior), una T o C en vez de un apareamiento con A o G, respectivamente, para el ADN que resulta de la etapa (a) o una A o G en vez de un apareamiento con C o T, respectivamente, para la hebra generada en el primer ciclo de amplificación directamente a partir del ADN que resulta de la etapa (a).

Dicho ADN diana es el ADN genómico humano de SHOX2, que incluye la región del promotor respectiva, y el ADN dentro de 5, 4, 3, 2 o 1 kb corriente arriba y corriente abajo de este. Preferentemente, es el ADN genómico humano de SHOX2. El ADN diana, preferentemente, tiene una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 101, con mayor preferencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 106, aún con mayor preferencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 111 y con la máxima preferencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 116. (todo antes de la conversión; un mapa que muestra la relación de las regiones diana preferidas para SHOX2 se muestran en la Figura 1).

En una realización preferida, el cáncer es un cáncer seleccionado a partir del grupo que se especifica más abajo (ver la sección sobre definiciones). Preferentemente, es un cáncer que comprende células cancerosas en las que la región asociada a SHOX2 está hipermetilada. Con mayor preferencia, es cáncer de pulmón. El cáncer puede ser cualquier subtipo de cáncer de pulmón especificado a continuación. En una realización más preferida, el estadio del cáncer de pulmón es hasta cualquier estadio III. Con mayor preferencia, está en el estadio 0, IA, IB, IIA o IIB para cáncer de pulmón (preferentemente, uno o más de los estadios 0, IA y/o IB).

En una realización preferida, la presencia indicada del cáncer se confirma con una prueba de imagen (por ejemplo, PET, CT, MRI, rayos X o ultrasonido), endoscopía y/o una evaluación microscópica de una biopsia de tejido.

El método del segundo aspecto permite remitir a un sujeto que tiene cáncer a un tratamiento contra el cáncer, que comprende detectar la presencia o ausencia de cáncer en un sujeto de acuerdo con el segundo aspecto y remitir al sujeto al tratamiento contra el cáncer si se detecta una presencia de cáncer.

El método del segundo aspecto permite, además, tratar a un sujeto que tiene cáncer, que comprende detectar la presencia de cáncer en un sujeto de acuerdo con el segundo aspecto y tratar al sujeto con uno o más tratamientos para el cáncer como se especifica anteriormente.

El método del segundo aspecto permite, además, atender a un sujeto sospechoso de tener cáncer, que comprende detectar la presencia o ausencia de cáncer en un sujeto de acuerdo con el segundo aspecto y remitir o tratar al sujeto de acuerdo con lo anterior, respectivamente, si se detecta una presencia de cáncer.

Con respecto al tercer aspecto detallado más abajo, se describe un oligonucleótido cebador no específico de metilación, que es adecuado, junto con otro oligonucleótido cebador, para generar un amplicón a partir de una hebra única de ADN genómico en la que la citosina no metilada en la posición 5 se convirtió a uracilo u otra base que no hibrida con guanina, en donde el al menos un oligonucleótido cebador cubre (1) al menos un sitio CpG con un error de apareamiento o un separador no específico de metilación con respecto a la posición de la base citosina del sitio CpG y/o (2) al menos un sitio SNP con un error de apareamiento o un separador no específico de SNP.

Preferentemente, el oligonucleótido cebador tiene una longitud de 15-30, con mayor preferencia 19-25 nucleótidos.

En una realización preferida, dicha hebra única de ADN genómico es ADN humano de SHOX2, que incluye la región del promotor respectiva, y el ADN dentro de 5, 4, 3, 2, o 1 kb corriente arriba y corriente abajo de este (referido, además, en la presente descripción como la región asociada a SHOX2 humano). Preferentemente, es de ADN genómico humano SHOX2. La hebra única de ADN genómico, preferentemente, tiene una secuencia (antes de la conversión) de acuerdo con la SEQ ID NO: 101, con mayor preferencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 106, aún con mayor preferencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 111 y con la máxima preferencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 116; o, respectivamente, una secuencia inversa complementaria a ella. (todo antes de la conversión; un mapa que muestra la relación de las regiones diana preferidas para SHOX2 se muestran en la Figura 1).

En una realización preferida, el oligonucleótido cebador tiene una secuencia que es sustancialmente idéntica a un segmento de 15-30 nucleótidos de longitud de la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO: 102, 103, 104 o 105;

en donde una secuencia sustancialmente idéntica comprende al menos un error de apareamiento o separador no específico de metilación con respecto a la posición de la base citosina de un sitio CpG con respecto al ADN genómico (es decir, el ADN no convertido a partir del que se deriva la SEQ ID respectiva, ver Tabla 1).

El oligonucleótido cebador tiene una secuencia que es sustancialmente idéntica a un segmento de 15-30 nucleótidos de longitud de la secuencia de acuerdo con la s Eq ID NO: (107, 108, 109 o 110), con mayor preferencia de acuerdo con la SEQ ID NO: (112, 113, 114 o 115), con la máxima preferencia de acuerdo con la SEQ ID NO: (117, 118, 119 o 120) (un mapa que muestra la relación de las regiones diana preferidas para SHOX2 se muestran en la Figura 1).

Preferentemente, el error de apareamiento se debe a cualquier sustitución de una C por una A o G en la SEQ ID NO: 102, 105, 107, 110, 112, 115, 117 o 120, o se debe a una sustitución de una G por una T o C en la SEQ ID NO: 103, 104, 108, 109, 113, 114, 118 o 119.

Preferentemente, el segmento es de 19-25 nucleótidos de longitud.

En una realización preferida, el número total de errores de apareamientos y separadores (que incluyen tanto los errores de apareamientos y separadores relacionados con los sitios CpG y SNP) es 1, 2 o 3, con mayor preferencia 1 o 2 y con la máxima preferencia 1.

En una realización preferida, el al menos un error de apareamiento o separador, preferentemente todos los errores de apareamientos y separadores, está/están dentro de los diez nucleótidos del extremo 3', y/o no dentro de los cinco nucleótidos del extremo 5' del oligonucleótido cebador. Más bien, el al menos un error de apareamiento o separador, preferentemente, todos los errores de apareamientos y separadores, esté/estén en el tercio medio o en el tercio 3' del oligonucleótido cebador.

En una realización particularmente preferida, el oligonucleótido cebador tiene una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 121 o 122 o una variante de esta. En este respecto, una variante, es una secuencia que se deriva de hasta 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1, preferentemente, hasta 5, con mayor preferencia hasta 3 nucleótidos corriente arriba y corriente abajo (con respecto a la secuencia diana respectiva) y/o es hasta 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1, preferentemente, hasta 5, con mayor preferencia hasta 3 nucleótidos más larga o más corta (con respecto a la secuencia diana respectiva, es decir, mientras que aún hibrida con la secuencia diana respectiva).

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un kit que comprende

En una realización preferida, el kit comprende:

(i) un par de cebadores A que consiste en un oligonucleótido cebador directo con una secuencia que es idéntica o sustancialmente idéntica a un segmento de 15-30 nucleótidos de longitud de la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 102 y un oligonucleótido cebador inverso con una secuencia que es idéntica o sustancialmente idéntica a un segmento de 15-30 nucleótidos de longitud de la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 103; y/o un par de cebadores B que consiste en un oligonucleótido cebador directo con una secuencia que es idéntica o sustancialmente idéntica a un segmento de 15-30 nucleótidos de longitud de la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 104 y un oligonucleótido cebador inverso con una secuencia que es idéntica o sustancialmente idéntica a un segmento de 15 30 nucleótidos de longitud de la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 105;

en donde una secuencia sustancialmente idéntica comprende al menos un error de apareamiento o separador no específico de la metilación, en donde el al menos un error de apareamiento no específico de la metilación en un cebador directo A o un cebador inverso B se debe a la sustitución de C por A o G, y en un cebador directo B o un cebador inverso A se debe a una sustitución de G por T o C, y el separador no específico de la metilación es un separador en lugar de una C en un cebador directo A o un cebador inverso B, y un separador en lugar de una G en un cebador directo B o un cebador inverso A,

y en donde en cada caso el amplicón se produce mediante el uso del par de cebadores A o B con el ADN molde de acuerdo con (a) SEQ ID NO: 101 es menor de 100 pares de bases (pb) de longitud; y

(ii) al menos un oligonucleótido bloqueador con una longitud de 20 a 40 nucleótidos para un par de cebadores A, en donde el al menos un oligonucleótido bloqueador tiene una secuencia idéntica a un segmento de la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 102, en donde en dicho segmento todas las C se sustituyen por las T o en donde el al menos un oligonucleótido bloqueador tiene una secuencia idéntica a un segmento de la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 103, en donde en dicho segmento todas las G se sustituyen por las A; o para un par de cebadores B en donde el al menos un oligonucleótido bloqueador tiene una secuencia idéntica a un segmento de la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 104, en donde en dicho segmento todas las G se sustituyen por las A o en donde el al menos un oligonucleótido bloqueador tiene una secuencia idéntica a un segmento de la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 105, en donde en dicho segmento todas las C se sustituyen por las T;

en donde cualquiera de dichos segmentos de oligonucleótidos bloqueadores está al menos parcialmente corriente abajo en la dirección 5'->3' del extremo 5' de un cebador directo o inverso del par de cebadores A o B y se solapa o no se solapa (preferentemente se solapa) con la secuencia del cebador (independientemente de las sustituciones de dicho oligonucleótido bloqueador) y en donde un segmento no solapado no se solapa o no se solapa sustancialmente con la secuencia complementaria inversa del cebador opuesto del par de cebadores (independientemente de las sustituciones de dicho oligonucleótido bloqueador) ("no se solapa sustancialmente" significa que puede solaparse con hasta 5, 4, 3, 2 o 1 nucleótidos siempre y cuando el solapamiento no sea lo suficientemente grande de manera que sirva de molde para dicho cebador opuesto, es decir, de manera que el cebador opuesto se una al bloqueador y la polimerasa extiende el cebador); y opcionalmente

(iii) un oligonucleótido sonda A con una secuencia que es idéntica a un segmento de 10-25 nucleótidos de longitud de la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 102 o 103; y/o un oligonucleótido sonda B con una secuencia que es idéntica a un segmento de 10-25 nucleótidos de longitud de la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 104 o 105;

en donde los oligonucleótidos sondas son específicos de la metilación e hibridan con una hebra única del amplicón que se produce de acuerdo con (i) donde ninguno de dichos oligonucleótidos cebadores hibrida.

Al menos un oligonucleótido cebador, con mayor preferencia al menos un oligonucleótido cebador de cada uno de los pares de cebadores A y/o B, comprende al menos un error de apareamiento o separador no específico de la metilación. El al menos un error de apareamiento o separador, preferentemente, todos los errores de apareamientos y separadores, esté/estén en el tercio medio o en el tercio 3' del oligonucleótido cebador.

El amplicón se produce mediante el uso del par de cebadores A o B con el molde de ADN de acuerdo con la SEQ ID NO: 101, es menor que 100 pares de bases (pb) de longitud.

A continuación, se describen las realizaciones preferidas del tercer aspecto:

Dicha hebra única de ADN genómico es el ADN humano de SHOX2, que incluye la región del promotor respectiva, y el ADN dentro de 5, 4, 3, 2 o 1 kb corriente arriba y corriente abajo de este. Preferentemente, es de ADN genómico humano SHOX2. La hebra única de ADN genómico, preferentemente, tiene una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 101, con mayor preferencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 106, aún con mayor preferencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 111 y con la máxima preferencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 116; o, respectivamente, una secuencia inversa complementaria a ella. (todo antes de la conversión; un mapa que muestra la relación de las regiones diana preferidas para SHOX2 se muestran en la Figura 1). En una realización preferida, dicho amplicón es menor que 100, 99, 98, 97, 96, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61 o 60 pb de longitud, preferentemente, menor que 97, 92, 84, 73, 72, 69 o 67 pb de longitud. Los intervalos preferidos para la región son de 50 a 99 pb, con mayor preferencia de 60 a 99 pb y con la máxima preferencia de 60 o 66 a 96 pb, 60 o 66 a 91,60 o 66 a 83, 60 o 66 a 72, 60 o 66 a 71 o 60 o 66 a 68. En particular, la región es menor que 92 pb de longitud (los intervalos se aplican de manera correspondiente a los mismos, es decir, 50, preferentemente, 60 o 66 a 91. En el caso de cada una de las longitudes anteriormente mencionadas, dicho amplicón comprende al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 sitios CpG del ADN genómico, preferentemente no cubiertos por un cebador. Preferentemente, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 (pero no necesariamente todos, en particular los sitios CpG cubiertos por un separador o un error de apareamiento no específico de la metilación) de esos sitios CpG deben estar metilados en el ADN diana hipermetilado para que se genere un amplicón.

En una realización preferida, el número total de errores de apareamientos y separadores por cebador (que incluye los errores de apareamientos y separadores relacionados con el sitio CpG y el sitio SNP) es 1,2 o 3, con mayor preferencia 1 o 2 y con la máxima preferencia 1. Se prevé que solo uno de los cebadores o que ambos cebadores comprendan errores de apareamientos. Si ambos cebadores comprenden errores de apareamientos, el número de errores de apareamientos en un cebador es independiente del número de errores de apareamientos en el otro cebador.

En una realización preferida, el al menos un error de apareamiento o separador, preferentemente todos los errores de apareamientos y separadores, está/están dentro de los diez nucleótidos del extremo 3' y/o no dentro de los cinco nucleótidos del extremo 5' del oligonucleótido cebador. Más bien, el al menos un error de apareamiento o separador, preferentemente, todos los errores de apareamientos y separadores, esté/estén en el tercio medio o en el tercio 3' del oligonucleótido cebador.

En una realización preferida, el kit comprende, además, (iii) al menos una sonda específica de la metilación, preferentemente un oligonucleótido sonda.

Con respecto a (i), (ii) y (iii), el segmento es, preferentemente, de la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: (107, 108, 109 o 110, respectivamente), con mayor preferencia de acuerdo con la SEQ ID NO: (112, 113, 114 o 115, respectivamente), respectivamente, y con la máxima preferencia de acuerdo con la SEQ ID NO: (117, 118, 119 o 120, respectivamente)

(mapa que muestra la relación de las regiones diana preferidas para SHOX2 se muestran en la Figura 1).

En una realización preferida, el kit comprende, además, un reactivo capaz de convertir una citosina no metilada en uracilo o en otra base que se detecta de manera diferente a la citosina en términos de propiedades de hibridación y/o reactivos tales como tampones, nucleótidos y/o la polimerasa para realizar una reacción de PCR.

En una realización particularmente preferida, el kit comprende

- un cebador directo con una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 121 o una variante de esta, un cebador inverso con una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 122 o una variante de esta, uno o dos bloqueadores con una secuencia seleccionada a partir de la SEQ ID NO: 123 y 124 y variantes de estas, y opcionalmente una sonda con una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 122, la inversa complementaria de esta, o una variante de cualquiera de estas;

En este respecto, una variante, es una secuencia que se deriva de hasta 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1, preferentemente, hasta 5, con mayor preferencia hasta 3 nucleótidos corriente arriba y corriente abajo (con respecto a la secuencia diana respectiva) y/o es hasta 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1, preferentemente, hasta 5, con mayor preferencia hasta 3 nucleótidos más larga o más corta (con respecto a la secuencia diana respectiva, es decir, mientras que aún hibrida con la secuencia diana respectiva).

El uso es, en particular, para el método del primer o segundo aspecto de la invención.

Definiciones y realizaciones adicionales de la invención.

La descripción usa una diversidad de términos y frases, que tienen determinados significados como se definen más abajo. Los significados preferidos deben interpretarse como realizaciones preferidas de los aspectos de la invención descritos en la presente descripción. Como tales, ellos y además otras realizaciones descritas a continuación pueden combinarse con cualquier realización de los aspectos de la invención y, en particular, cualquier realización preferida de los aspectos de la invención descritos anteriormente.

El término "detección" como se usa en la presente descripción se refiere a analizar, al menos cualitativamente, la presencia o ausencia de ADN diana hipermetilado. La hipermetilación se determina, preferentemente, en 1 o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 10 o más, 15 o más o 30 o más sitios CpG del ADN diana. Por lo general, los sitios CpG analizados se metilan de manera conjunta en el cáncer, de manera que, además, los sitios CpG del ADN circundante están metilados y pueden analizarse adicionalmente o en su lugar. "Al menos cualitativamente" significa que, además, puede realizarse una determinación cuantitativa del ADN diana hipermetilado, si está presente. Tal "determinación de la cantidad" puede realizarse como se describe en la presente descripción. Generalmente, la cuantificación puede ser absoluta, por ejemplo, en pg por mL o ng por mL de muestra, copias por mL de muestra, número de ciclos de la PCR, etcétera, o puede ser relativa, por ejemplo, 10 veces más alta que en una muestra de control o como porcentaje de metilación de un control de referencia. La determinación de la cantidad de ADN diana hipermetilado en la muestra puede comprender la normalización de la cantidad de ADN total en la muestra. La normalización de la cantidad del ADN total en la muestra de prueba, preferentemente, comprende calcular la relación de la cantidad del ADN diana hipermetilado y la cantidad del ADN genómico de un sitio de referencia. El sitio de referencia puede ser cualquier sitio genómico y no tiene que ser un gen. Un ejemplo es un sitio que comprende repeticiones cortas del ADN. En el caso de un gen de referencia, el gen es, preferentemente, un gen constitutivo.

Un gen constitutivo es un gen que se expresa constitutivamente involucrado o requerido para el mantenimiento de la función celular básica y se expresa en todas las células de un organismo en condiciones normales y fisiopatológicas y, por lo tanto, se espera que esté disponible incluso si un genoma está parcialmente afectado por inestabilidad cromosómica y deleciones. Solo en humanos, hay más de 2000 genes constitutivos (ver Chang y otros, PLoS ONE 6(7): e22859. doi:10.1371/journal.pone.0022859), de los cuales todos pueden usarse de acuerdo con la invención. Los ejemplos no limitantes son la proteína ribosómica acídica humana (HuPO), la p-Actina (BA), la Ciclofilina (CYC), el Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), la fosfogliceroquinasa (PGK), la p-Microglobulina (B2M), la p-Glucuronidasa (GUS), la Hipoxantina fosforribosiltransferasa (HPRT), el factor de transcripción IID de la proteína de unión a TATA (TBP), el receptor de Transferrina (TfR), el factor de Elongación 1-a (EF-1-a), el ganglio linfático metastásico 51 (MLN51) y la enzima de conjugación a Ubiquitina (UbcH5B).

La cantidad del ADN diana hipermetilado en la muestra es la proporción del ADN diana hipermetilado con relación a la cantidad del ADN diana hipermetilado en una muestra de referencia que comprende sustancialmente el ADN genómico metilado en su totalidad. Preferentemente, determinar la proporción de ADN diana hipermetilado comprende determinar la cantidad de ADN hipermetilado de la misma diana en una muestra de referencia, la normalización entre muestras del ADN metilado total, preferentemente, mediante el uso de la medición de la metilación no específica de un sitio de referencia, y dividir la relación derivada de la muestra de prueba por la relación correspondiente derivada de la muestra de referencia. La proporción puede expresarse como un porcentaje o PMR como se define más abajo mediante la multiplicación del resultado de la división por 100.

Alternativamente, en particular si la cantidad del ADN diana hipermetilado se determina mediante PCR en tiempo real, puede calcularse mediante el uso de los valores de ciclo umbral (Ct) para la diana y un sitio de referencia, preferentemente, en un gen constitutivo (hkg) de muestras de sujetos y la muestra de referencia (ref) (metilada al menos en el locus diana) como sigue: cantidad = 100 * x-((Ctdiana - Cthkg) - (Ctdianaref - Cthkgref)), en donde x es la eficiencia de la PCR asumida, que preferentemente, está entre 1 a 3 y con mayor preferencia es 2.

El término "muestra de referencia" se refiere a una muestra que comprende el ADN de control con una concentración de ADN conocida y un estado de metilación diana conocido. El ADN de control es, preferentemente, pero no necesariamente, a Dn humano que está metilado artificialmente, preferentemente, sustancialmente metilado en su totalidad. En una realización preferida, la metilación artificial se logra mediante el uso de las ADN-metiltransferasas. El ADN en sí mismo puede ser, por ejemplo, ADN de una línea celular, ADN plasmídico, ADN artificial o combinaciones/mezclas de estos.

El ADN metilado en el locus diana es, preferentemente, ADN de una línea celular de una o más líneas celulares, preferentemente, de aquellas que están bien caracterizadas y de las cuales se conoce el estado de metilación de la diana genómica y/o de las cuales se conoce que la diana es totalmente metilada sustancialmente. El ADN genómico totalmente metilado sustancialmente es, preferentemente ADN, particularmente ADN genómico, que tiene todos o sustancialmente todos los sitios CpG metilados. "Sustancialmente todos" en este respecto significa al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 99,9 %. En una realización preferida, la metilación de todos o sustancialmente todos los sitios CpG se logra mediante el tratamiento del ADN con una metiltransferasa CpG en una manera que proporciona la metilación de todos o sustancialmente todos los sitios CpG.

Preferentemente, la cantidad de ADN diana hipermetilado se expresa como un valor de PMR. El término "PMR", "Porcentaje de Referencia Metilada", o "Porcentaje de Referencia totalmente Metilada" describe el grado de metilación y generalmente se calcula mediante la división del gen para la relación de referencia por el gen para la relación de referencia completamente metilada (que se obtiene, por ejemplo, mediante la metiltransferasa CpG, por ejemplo el tratamiento con Sss/ de la referencia normalmente no metilada) y mediante la multiplicación por 100. La determinación del PMR se describe en detalle en Ogino y otros, (JMD May 2006, Vol. 8, No. 2). El PMR puede calcularse alternativamente con el método P l (IdACt) mediante el uso de los valores de ciclo umbral de la ^{P C R}en tiempo real ^{( C t )}para shox2 y un sitio de referencia, por ejemplo, en un gen constitutivo (hkg) a partir de las muestras de pacientes y la muestra de referencia (ref) (metilada en el locus diana) como sigue: C O c t = ^{( ( C td ia n a - C W g ) - (C td ia n a re f - C th k g r e f ) )}PMR 100 * en ¿onde x es |a eficiencia de la PCR asumida. Generalmente, la eficiencia de la PCR se asume que está entre 1-3, preferentemente, es 2 o casi 2. Preferentemente, los PMR son la mediana del PMR por más de al menos 3, con mayor preferencia 4-8, con la máxima preferencia 6 repeticiones experimentales o experimentos paralelos.

El término "hipermetilado" como se usa en la presente descripción se refiere a la "metilación" o "metilación del ADN", que se refiere a un proceso bioquímico que implica la adición de un grupo metilo a los nucleótidos del ADN citosina o adenina. La metilación del ADN en la posición 5 de la citosina, especialmente en las regiones del promotor, puede tener el efecto de disminuir la expresión génica y se ha encontrado en cada vertebrado examinado. En células adultas que no son gametos, la metilación del ADN ocurre, típicamente, en un sitio CpG. El término "sitio CpG" o "dinucleótido CpG", como se usa en la presente descripción se refiere a las regiones del ADN donde un nucleótido citosina se encuentra a continuación de un nucleótido guanina en la secuencia lineal de bases a lo largo de su longitud. "CpG" es una abreviatura de "C-fosfato-G", lo que es, citosina y guanina separadas por un solo fosfato; el fosfato enlaza cualquiera de dos nucleósidos juntos en el ADN. La notación "CpG" se usa para distinguir esta secuencia lineal del par de bases CG de citosina y guanina. Las citosinas en los dinucleótidos CpG pueden metilarse para formar 5-metilcitosina. El término "sitio CpG" o "sitio CpG de ADN genómico" se usa, además, con respecto al sitio de un sitio CpG anterior (no metilado) en el ADN en el que la C no metilada del sitio CpG se convirtió en otro como se describe en la presente descripción (por ejemplo, mediante bisulfito a uracilo). La solicitud proporciona la secuencia genómica de cada región del ADN relevante, así como también las secuencias convertidas de bisulfito de cada hebra convertida. Los sitios CpG a los que se hace referencia son siempre los sitios CpG de la secuencia genómica, incluso si la secuencia convertida ya no contiene estos sitios CpG debido a la conversión. El término "hipermetilación" se refiere a un patrón o estado de metilación aberrante (es decir, la presencia o ausencia de la metilación de uno o más nucleótidos), en donde uno o más nucleótidos, preferentemente las C(s) de un sitio(s) CpG, están metilados comparados al mismo ADN genómico de una célula no cancerosa del paciente o de un sujeto que no padece o que ha padecido el cáncer para el que se trata al paciente, preferentemente, cualquier cáncer (control saludable). En particular, se refiere a una presencia aumentada de 5-mCyt en uno o en una pluralidad de dinucleótidos CpG dentro de una secuencia de ADN de una muestra de ADN de prueba, con relación a la cantidad de 5-mCyt encontrada en los dinucleótidos CpG correspondientes dentro de una muestra de ADN de control saludable. La hipermetilación como un estado/patrón de metilación puede determinarse en uno o más sitios CpG. Si se usa más de un sitio CpG, la hipermetilación puede determinarse en cada sitio por separado o como un promedio de los sitios CpG tomados juntos. Alternativamente, todos los sitios CpG evaluados deben estar metilados de manera que se cumpla con el requisito de hipermetilación.

El término "ADN diana" como se usa en la presente descripción se refiere a una secuencia de nucleótidos genómica en una localización cromosómica específica. En el contexto de la presente invención, esto es típicamente, un marcador genético que es conocido por estar hipermetilado en el estado de enfermedad (por ejemplo en células cancerosas versus células no cancerosas). Un marcador genético puede ser una región codificante o no codificante del ADN genómico.

El término "región del ADN diana", como se usa en la presente descripción, se refiere a una parte del ADN diana que se analizará. Generalmente la región es al menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, o 200 o 300 pares de bases (pb) de longitud y/o no más larga que 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 pb (a menos que se limite aún más como se define en la presente descripción, por ejemplo, por "menos de 100 pb de longitud"). En particular, es una región que comprende ^{al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 sitios CpG del}AdN ^{genómico. Preferentemente, estos sitios no}están cubiertos por un cebador usado para la amplificación de la región. Preferentemente, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 (pero no necesariamente todos, en particular los sitios CpG cubiertos por un separador o error de apareamiento no específico de la metilación, por ejemplo, en un cebador) de estos sitios CpG están metilados en ^elaDn ^{diana hipermetilado.}

El ADN diana de la invención es el ADN genómico asociado con SHOX2. El término "SHOX2" como se usa en la presente descripción se refiere al gen shox2 (caja homeótica de baja estatura 2, gen humano NCBI ID 6474, localización genómica 3q25.32), designado, además, como proteína de la caja homeótica Og12X o proteína de caja homeótica relacionada en pares SHOT. Es un miembro de la familia de genes de caja homeótica que codifican proteínas que contienen un motivo de 60 residuos de aminoácidos que representa un dominio de unión al ADN. Las proteínas de caja homeótica se caracterizaron ampliamente como reguladores de la transcripción implicadas en la formación de patrones tanto en las especies de invertebrados como en vertebrados. La secuencia de ADN genómico asociada con SHOX2 humano (cromosoma 3 posición 158090954-158111503 en el genoma construido de GRCh38) se proporciona en la presente descripción (ver Tabla 1).

El término "muestra" como se usa en la presente descripción se refiere al material biológico que se obtiene de un sujeto y comprende ADN genómico de todos los cromosomas, preferentemente, ADN genómico que cubre todo el genoma. La muestra comprende, si un sujeto tiene cáncer, las células del cáncer o el ADN genómico libre (que incluye el ADN diana) de las células cancerosas, preferentemente el ADN genómico circulante de las células cancerosas. Puede derivarse de cualquier tejido o líquido biológico adecuado, tal como sangre, saliva, plasma, suero, orina, líquido cefalorraquídeo (CSF), heces fecales, un hisopo bucal o bucal-faríngeo, un espécimen quirúrgico, un espécimen obtenido de una biopsia, o una muestra de tejido embebida en parafina. Los métodos para obtener muestras de un sujeto se conocen bien por los expertos en la técnica. Preferentemente, la muestra es una biopsia de tumor o una muestra líquida. La muestra líquida es, preferentemente, sangre, suero sanguíneo, plasma sanguíneo, u orina. En caso de que el cáncer sea cáncer de pulmón, se prevé, además, que la muestra comprenda materia derivada de la broncoscopía, que incluye el lavado bronquial, el lavado bronquial alveolar, el cepillado bronquial o la abrasión bronquial, o de esputo o saliva. Típicamente, en las muestras que comprenden el ADN diana, especialmente el ADN diana extracelular, a partir de células cancerosas, además, hay ADN diana de células no cancerosas que no está hipermetilado al contrario del ADN diana de células cancerosas. Usualmente, dicho ADN diana de células no cancerosas excede la cantidad del de células enfermas al menos 10 veces, al menos 100 veces, al menos 1000 veces o al menos 10000 veces. Generalmente, el ADN genómico comprendido en la muestra está al menos parcialmente fragmentado. "Al menos parcialmente fragmentado" significa que al menos el ADN extracelular, en particular al menos el ADN diana extracelular, de células cancerosas, está fragmentado. El término "ADN genómico fragmentado" se refiere a las piezas de ADN del genoma de una célula, en particular una célula cancerosa, que son el resultado de una ruptura parcial física, química y/o biológica del ADN extenso en segmentos discretos de longitud más corta. Particularmente, "fragmentado" significa la fragmentación de al menos parte del ADN genómico, preferentemente, el ADN diana, en fragmentos más cortos que 1.500 pb, 1.300 pb, 1.100 pb, 1.000 pb, 900 pb, 800 pb, 700 pb, 600 pb, 500 pb, 400 pb, 300 pb, 200 pb o 100 pb. "Al menos parte" en este respecto significa al menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % o 75 %.

El término "ADN genómico" como se usa en la presente descripción al ADN cromosómico y se usa para distinguir del ADN codificante. Como tal, incluye exones, intrones así como también secuencias reguladoras, en particular promotores, que pertenecen a un gen.

La frase "que convierte, en el ADN, la citosina no metilada en la posición 5 a uracilo u otra base que no hibrida con guanina" como se usa en la presente descripción se refiere a un proceso de tratamiento químico del ADN de tal manera que todo o sustancialmente todas las bases de citosina no metiladas se convierten en bases de uracilo, u otra base que es diferente a la citosina en términos de comportamiento de apareamiento de bases, mientras que las bases de 5-metilcitosina permanecen sin cambios. La conversión de bases de citosina no metiladas, pero no las metiladas, dentro de la muestra de ADN se realiza con un agente de conversión. El término "agente de conversión" como se usa en la presente descripción se refiere a un reactivo capaz de convertir una citosina no metilada en uracilo o en otra base que es de forma detectable diferente a la citosina en términos de propiedades de hibridación. El agente de conversión es, preferentemente, un bisulfito tal como disulfito, o sulfito de hidrógeno. La reacción se realiza de acuerdo con los procedimientos estándar (Frommer y otros, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:1827-31; Olek, 1996, Nucleic Acids Res 24:5064-6; EP 1394172). Es posible, además, realizar la conversión enzimáticamente, por ejemplo, mediante el uso de citidina desaminasas específicas de la metilación. Con la máxima preferencia, el agente de conversión es bisulfito de sodio o bisulfito.

El término "amplificar" o "generar un amplicón" como se usa en la presente descripción se refiere a un aumento en el número de copias del ácido nucleico diana y su secuencia complementaria, o particularmente una región de este. La amplificación puede realizarse mediante el uso de cualquier método conocido en la técnica. La amplificación del ácido nucleico incluye métodos que requieren múltiples ciclos durante el proceso de amplificación o métodos que se realizan a una temperatura única. Las técnicas de ciclos se ejemplifican mediante los métodos que requieren termociclado. Los métodos que requieren termociclado incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que es bien conocida en la técnica. La PCR incluye desnaturalizar un ADN de doble hebra en ADN de una sola hebra mediante desnaturalización térmica, la hibridación de un cebador en los ADN de una sola hebra; y sintetizar una hebra complementaria a partir del cebador. La amplificación isotérmica es una amplificación que se realiza a una sola temperatura o donde el aspecto principal del proceso de amplificación se realiza a una sola temperatura. En el proceso de la PCR, el producto de la reacción se calienta para separar las dos hebras de manera que otro cebador pueda unirse al molde. A la inversa, las técnicas isotérmicas se basan en una hebra que desplaza a la polimerasa para separar las dos hebras de una doble hebra y volver a copiar el molde. Las técnicas isotérmicas pueden clasificarse en métodos que dependen de la sustitución de un cebador para iniciar una copia reiterada del molde y aquellos que dependen de la reutilización continua o la nueva síntesis de una única molécula de cebador. Los métodos que se basan en la sustitución del cebador incluyen la amplificación dependiente de helicasa (HDA), la amplificación dependiente de exonucleasa, la amplificación de polimerasa recombinasa (RPA), y la amplificación mediada por lazo (LAMP). Los métodos que se basan en la reutilización continua o la nueva síntesis de una molécula de cebador única incluyen la amplificación por desplazamiento de hebra (SDA) o la amplificación basada en ácido nucleico (NASBA y TMA).

La amplificación se realiza, preferentemente, mediante la PCR específica de metilación (es decir, se produce un amplicón en dependencia de si uno o más sitios CpG se convierten o no) mediante el uso de cebadores que son no específicos de la metilación, pero son específicos para el ADN convertido con bisulfito (es decir, hibridan solamente con el ADN convertido mediante la cobertura de al menos una C convertida). La especificidad de la metilación se logra mediante el uso de oligonucleótidos bloqueadores específicos de la metilación, que hibridan específicamente con los sitios CpG convertidos o no convertidos y, de esta manera, terminan la polimerización por la PCR. En una realización con la máxima preferencia, la etapa de amplificación comprende una PCR en tiempo real, en particular HeavyMethyl™ o HeavyMethyl™-MethyLight™.

El término "Heavymetil™" como se usa en la presente descripción, se refiere a un ensayo, en donde las sondas que bloquean la metilación específica (además, referidas en la presente descripción como bloqueadores) que cubren las posiciones entre los CpG, o recubiertas por los cebadores de la amplificación, permiten la amplificación selectiva específica de la metilación del ADN diana o una región de este.

El término "MethyLight™" se refiere a un ensayo de metilación cuantitativo de alto rendimiento que utiliza tecnología de PCR en tiempo real basada en fluorescencia que no requiere manipulaciones adicionales después de la etapa de la PCR (Eads y otros, Cancer Res. 59:2302-2306, 1999). Brevemente, el proceso MethyLight™ comienza con una muestra mezclada de ADN genómico que se convierte, por ejemplo, en una reacción de bisulfito de sodio, en un conjunto mezclado de diferentes secuencias dependientes de la metilación de acuerdo con procedimientos estándar (el proceso de bisulfito convierte los residuos de citosina no metiladas a uracilo). Después se realiza la PCR basada en fluorescencia en una reacción "sesgada" (con cebadores de la PCR que solapan los dinucleótidos CpG conocidos). La discriminación de secuencia puede ocurrir a nivel del proceso de amplificación y a nivel del proceso de la detección de fluorescencia. Esto puede usarse como una prueba cuantitativa de los patrones de metilación en la muestra de ADN genómico, en donde la discriminación de secuencia ocurre a nivel de la hibridación de la sonda. En esta versión cuantitativa, la reacción de la PCR se proporciona para la amplificación específica de la metilación en presencia de una sonda fluorescente que solapa un sitio potencial de metilación en particular. Se proporciona un control no-sesgado para la cantidad de ADN de entrada por una reacción en la que ni los cebadores, ni la sonda cubren ninguno de los dinucleótidos CpG. El término ensayo "HeavyMethyl™ MethyLight™" se refiere a un ensayo HeavyMethyl™ MethyLight™, que es una variante del ensayo MethyLight™, en donde el ensayo MethyLight™ se combina con la sonda que bloquea la metilación específica que cubren las posiciones CpG entre los cebadores de amplificación.

El término "hibridación", cuando se usa con respecto a un oligonucleótido, debe entenderse como un enlace de un oligonucleótido con al menos una secuencia sustancialmente complementaria a lo largo de las líneas de apareamientos de bases de Watson-Crick en la muestra de ADN, lo que forma una estructura doble, en condiciones de hibridación moderadas o rigurosas. Cuando se usa con respecto a un simple nucleótido o base, esto se refiere a la unión de acuerdo con los apareamientos de bases de Watson-Crick, por ejemplo, C-G, A-T y A-U. "Sustancialmente complementario" significa que un oligonucleótido no necesita reflejar la secuencia exacta del molde y puede comprender errores de apareamientos y/o separadores como se define en la presente descripción. Condiciones rigurosas de hibridación implican hibridar a 68 °C en solución de SSC5x/Denhardt 5x/SDS 1,0 %, y lavar en SSC 0,2x/SDS 0,1 % a temperatura ambiente, o implican el equivalente de estas reconocidas en la técnica (por ejemplo, condiciones en las que una hibridación se realiza a 60 °C en tampón SSC 2,5 x, seguido por numerosas etapas de lavado a 37 °C en un tampón a baja concentración, y permanece estable). Condiciones moderadas implican lavar en SSC 3x a 42 °C, o el equivalente de estas reconocidas en la técnica. Los parámetros de concentración de sal y la temperatura pueden variarse para alcanzar el nivel óptimo de identidad entre la sonda y el ácido nucleico diana. Las orientaciones con respecto a tales condiciones están disponibles en la técnica, por ejemplo, en Sambrook y otros, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; y Ausubel y otros, (Eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.) en la Unidad 2.10.

El término "oligonucleótido" como se usa en la presente descripción se refiere a un oligómero lineal de 5 a 50 ribonucleótidos o, preferentemente, desoxirribonucleótidos. Preferentemente, este tiene la estructura de un fragmento de ADN de una hebra única.

El término "oligonucleótido cebador" como se usa en la presente descripción se refiere a una secuencia de oligonucleótido de una hebra única sustancialmente complementaria a una secuencia de ácido nucleico que se pretende copiar (el molde) y sirve como punto de partida para la síntesis de un producto de extensión del cebador. "Sustancialmente complementaria" significa que un oligonucleótido cebador no necesita reflejar la secuencia exacta del molde y puede comprender errores de apareamientos y/o separadores como se define en la presente descripción, siempre y cuando aún sea capaz de hibridar y servir como un punto de partida para la extensión en las condiciones de hibridación y extensión escogidas (por ejemplo, de un ciclo de PCR). Preferentemente, un oligonucleótido cebador es de 10 a 40 nucleótidos, con mayor preferencia de 15-30 nucleótidos y con la máxima preferencia de 19 a 25 nucleótidos de longitud.

El término "bloqueador" como se usa en la presente descripción se refiere a una molécula que se une a una hebra única de ADN en una manera específica a la metilación (es decir, es específico al ADN metilado convertido o, preferentemente, al ADN no metilado convertido o al ADN amplificado derivado de este) y evita la amplificación del ADN mediante la unión a este, por ejemplo, porque evita la unión de un cebador o porque evita la extensión del cebador donde este se une. Los ejemplos no limitantes para los bloqueadores son los anticuerpos específicos de secuencia y/o de metilación (que bloquean, por ejemplo, la unión del cebador o la polimerasa) y en particular los oligonucleótidos bloqueadores.

Un "oligonucleótido bloqueador" puede ser un bloqueador que evita la extensión del cebador ubicado corriente arriba del oligonucleótido bloqueador. Comprende nucleósidos/nucleótidos que tienen una cadena principal resistente a la actividad nucleasa 5' de la polimerasa. Esto puede lograrse, por ejemplo, porque comprende ácido nucleico peptídico (PNA), ácido nucleico bloqueado (LNA), Morfolino, ácido nucleico glicol (GNA), ácido nucleico treosa (TNA), ácidos nucleico puente (BNA), N3'-P5' oligómeros fosforamidato (NP), oligonucleótidos ligados al aglutinante de la curvatura menor (MGB- oligonucleótidos ligados), oligómeros fosforotioato (PS), oligómeros C_1-C4alquilfosfonato, fosforamidatos, oligonucleótidos p-fosfodiéster, oligonucleótidos a-fosfodiéster o una combinación de estos. Alternativamente, puede ser un oligonucleótido no extensible con un sitio de unión en la hebra única de ADN que se solapa con el sitio de unión de un oligonucleótido cebador. Cuando el bloqueador se une, el cebador no puede unirse y, por lo tanto, no se genera el amplicón. Cuando el bloqueador no se une, el sitio de unión del cebador es accesible y se genera el amplicón. Para tal un bloqueador de solapamiento, es preferible que la afinidad del bloqueador sea mayor que la afinidad del cebador por el ADN. Un oligonucleótido bloqueador es, típicamente, de 15 a 50, preferentemente de 20 a 40 y con mayor preferencia de 25 a 35 nucleótidos de longitud. "Al menos un bloqueador" se refiere en particular a un número de 1, 2, 3, 4 o 5 bloqueadores, más particularmente a 1-2 o 1-3 bloqueadores. Además, un oligonucleótido bloqueador no puede por sí mismo actuar como un cebador (es decir, no puede extenderse por una polimerasa) debido a un extremo 3' no extensible.

El término "oligonucleótido sonda" o "sonda" como se usa en la presente descripción se refiere a un oligonucleótido que se usa para detectar un amplicón mediante la hibridación a una hebra del amplicón, usualmente no donde se unen cualquiera de los oligonucleótidos cebadores (es decir, no a un segmento de secuencia de la hebra única que se solapa con un segmento de secuencia al que hibrida un oligonucleótido cebador). Preferentemente, este hibrida sin un error de apareamiento, en otras palabras, este es, preferentemente, complementario a una hebra del amplicón. Un oligonucleótido sonda, es preferentemente, de 5-40 nucleótidos, con mayor preferencia de 10 a 25 y con la máxima preferencia de 25 a 20 nucleótidos de longitud. Usualmente, la sonda se une, preferentemente, de manera covalente, a al menos un marcador detectable que permite la detección del amplicón. El término "marcador detectable" como se usa en la presente descripción no presenta ninguna limitación particular. El marcador detectable puede seleccionarse a partir del grupo que consiste en marcadores radiactivos, marcadores luminiscentes, colorantes fluorescentes, compuestos que tienen una actividad enzimática, marcadores magnéticos, antígenos y compuestos que tienen una alta afinidad de unión por un marcador detectable. Por ejemplo, los colorantes fluorescentes unidos a una sonda pueden servir como un marcador de detección, por ejemplo, en una PCR en tiempo real. Los marcadores radioactivos adecuados son P-32, S-35, 1-125, y H-3, los marcadores luminiscentes adecuados son compuestos quimioluminiscentes, preferentemente, luminol, y los marcadores fluorescentes adecuados son, preferentemente, cloruro de dansilo, fluorceína-5-isotiocianato, y 4-fluor-7-nitrobenz-2-aza-1,3 diazol, en particular 6-Carboxifluoresceína (FAM), 6-Hexaclorofluoresceína (HEX), 5(6)-Carboxitetrametilrodamina (TAMRA), 5(6)-Carboxi-X-Rodamina (ROX), Cianin-5-Fluorofor (Cy5) y derivados de estos; los marcadores de enzimas adecuados son la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina, la a-galactosidasa, la acetilcolinesterasa, o la biotina.

El término "que cubre un sitio CpG" como se usa en la presente descripción con respecto a un oligonucleótido se refiere a la hibridación de un oligonucleótido con una región del ADN que comprende este sitio CpG, antes o después de la conversión de la C del sitio (es decir, el sitio CpG del ADN genómico correspondiente cuando este es referido como una secuencia convertida con bisulfito). La hibridación puede ser, con respecto al sitio CpG (o al sitio CpG anterior si la C fue convertida), específica de la metilación o no específica de la metilación como se describe más abajo.

El término "específico de metilación", como se usa en la presente descripción se refiere generalmente a la dependencia de la presencia o ausencia de metilación de CpG.

El término "específico de metilación", como se usa en la presente descripción con respecto a un oligonucleótido significa que el oligonucleótido hibrida o no hibrida con una hebra única de ADN (en la que la citosina no metilada en la posición 5 se convirtió en uracilo u otra base que no hibrida con guanina, y donde esta comprende al menos un sitio CpG antes de la conversión) sin un error de apareamiento con respecto a la posición de la C en el al menos un sitio CpG, en dependencia de si la C de el al menos un sitio CpG estaba metilada o no metilada antes de la conversión, es decir, de si la C se convirtió o no. La especificidad de la metilación puede ser positiva (el oligonucleótido hibrida sin dicho error de apareamiento si la C no fue convertida) o negativa (el oligonucleótido hibrida sin dicho error de apareamiento si la C fue convertida). Para evitar la hibridación del oligonucleótido en contra de su especificidad, preferentemente, este cubre al menos 2, 3, 4, 5 o 6 y preferentemente de 3 a 6 sitios CpG antes de la conversión.

El término "no específico de la metilación", como se usa en la presente descripción se refiere generalmente a la independencia de la presencia o ausencia de la metilación de CpG.

El término "no específico de la metilación", como se usa en la presente descripción con respecto a un oligonucleótido, significa que el oligonucleótido hibrida a una hebra única de ADN (en la que la citosina no metilada en la posición 5 se convirtió en uracilo u otra base que no hibrida con guanina, y donde esta puede comprender o no al menos un sitio CpG antes de la conversión) independientemente de si la C de el al menos un sitio CpG estaba metilada o no metilada antes de la conversión, es decir, de si la C se convirtió o no. En un caso, la región de la hebra única de ADN a la que el oligonucleótido hibrida no comprende ningún sitio CpG (antes y después de la conversión) y el oligonucleótido es no específico de la metilación únicamente por esta razón. En otro caso, la región de la hebra única del ADN a la que el oligonucleótido hibrida comprende 1 a 3, es decir, 1, 2 o 3 errores de apareamientos y/o separadores, preferentemente, un error de apareamiento o separador, con respecto a la posición de la C del sitio(s) CpG antes y después de la conversión, de manera que la hibridación no depende de si la C de el al menos uno de los sitios CpG estaba metilada o no metilada antes de la conversión, es decir, de si la C se convirtió o no. Para permitir la hibridación a pesar de los errores de apareamientos y/o separadores, se prefiere que el oligonucleótido no comprenda más de 1 error de apareamiento por cada 10 nucleótidos (redondeado hacia arriba si el primer decimal es 5 o superior, de cualquier otra manera redondeado hacia abajo) del oligonucleótido.

El término "error de apareamiento" como se usa en la presente descripción se refiere al error de apareamiento del par de bases en el ADN, más específicamente un par de bases que es incapaz de formar las interacciones normales del apareamiento de bases (es decir, diferente de "A" con "T" o "U", o "G" con "C").

El término "sitio SNP" como se usa en la presente descripción se refiere al sitio de un "SNP", es decir un polimorfismo de nucleótido simple en una posición particular en el genoma, preferentemente, humano, que varía entre una población de individuos. Los SNP del ADN genómico a los que hace referencia la presente solicitud son conocidos en la técnica y pueden encontrarse en las bases de datos en línea tal como dbSNP del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp).

El término "error de apareamiento no específico de SNP" como se usa en la presente descripción se refiere a un error de apareamiento que se debe a una sustitución de nucleótido que no sustituye el nucleótido con uno que corresponde a un nucleótido que se encuentra en la misma posición en el genoma de otro individuo de la misma población.

El término "separador" como se usa en la presente descripción se refiere a una molécula separadora no nucleotídica que, cuando se unen dos nucleótidos, aumenta la distancia entre los dos nucleótidos a aproximadamente la distancia de un nucleótido (es decir, la distancia entre los dos nucleótidos estaría separada si estuvieran unidos por un tercer nucleótido). Los ejemplos no limitantes para separadores son Inosina, d-Uracilo, bases halogenadas, Amino-dT, C3, C12, Separador 9, Separador 18, y dSpacer)

El término "refleja" como se usa en la presente descripción debe entenderse como "es un resultado de" o "muestra".

La frase "método para detectar la presencia o ausencia de cáncer en un sujeto" como se usa en la presente descripción se refiere al diagnóstico de cáncer del sujeto, es decir, una determinación de si el sujeto tiene cáncer o no. Como entenderán los expertos en la técnica, tal evaluación normalmente puede no ser correcta para el 100 % de los pacientes, aunque preferentemente es correcta. El término, sin embargo, requiere que pueda hacerse una indicación correcta para una parte estadísticamente significativa de los sujetos. El experto en la técnica puede determinar fácilmente si una parte es estadísticamente significativa mediante el uso de diversas herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, la determinación de los intervalos de confianza, la determinación de los valores de p, la prueba t de Student, la prueba de Mann-Whitney, etcétera. Los detalles se proporcionan en Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York 1983. Los intervalos de confianza preferidos son al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %. Los valores de p son, preferentemente, 0,05, 0,01, o 0,005.

El término "cáncer" como se usa en la presente descripción se refiere a una gran familia de enfermedades que implican el crecimiento anormal de células con el potencial de invadir o diseminarse a otras partes del cuerpo. Las células forman un subconjunto de neoplasmas o tumores. Un neoplasma o tumor es un grupo de células que experimentaron un crecimiento no regulado, y con frecuencia formarán una masa o bulto, pero pueden distribuirse de manera difusa. Preferentemente, el término "cáncer" se define por una o más de las siguientes características:

- autosuficiencia en la señalización para el crecimiento,

- insensibilidad a las señales anticrecimiento,

- evasión de apoptosis,

- habilitación de un potencial replicativo ilimitado,

- inducción y soporte de la angiogénesis, y/o

- activación de metástasis e invasión de tejidos.

El cáncer con respecto a la presente invención se selecciona, preferentemente a partir del grupo que consiste en Cáncer Suprarrenal, Cáncer Anal, Cáncer de las Vías Biliares, Cáncer de Vejiga, Cáncer de Hueso, Tumores de Cerebro/CNS, Cáncer de Mama, Cáncer Primario Desconocido, Enfermedad de Castleman, Cáncer de Cuello Uterino, Cáncer de Colon/Recto, Cáncer Endometrial, Cáncer de Esófago, Familia de tumores de Ewing, Cáncer de Ojo, Cáncer de la vesícula biliar, Tumores Carcinoides Gastrointestinales, Tumor de Estroma Gastrointestinal (GIST), Enfermedad Trofoblástica Gestacional, Enfermedad de Hodgkin, Sarcoma de Kaposi, Cáncer de Riñón, Cáncer de Laringe e Hipofaringe, Leucemia, Cáncer de Hígado, Cáncer de Pulmón, Linfoma, Linfoma Cutáneo, Mesotelioma Maligno, Mieloma Múltiple, Síndrome Mielodisplásico, Cáncer de la Cavidad Nasal y Senos Paranasales, Cáncer Nasofaríngeo, Neuroblastoma, Linfoma No Hodgkin, Cáncer de la Cavidad Oral y Orofaríngeo, Osteosarcoma, Cáncer de Ovario, Cáncer de Páncreas, Cáncer de Pene, Tumores Pituitarios, Cáncer de Próstata, Retinoblastoma, Rabdomiosarcoma, Cáncer de las Glándulas Salivares, Sarcoma - Cáncer de Tejidos Blandos del Adulto, Cáncer de Piel, Cáncer del Intestino Delgado, Cáncer de Estómago, Cáncer de Testículos, Cáncer de Timo, Cáncer de Tiroides, Sarcoma Uterino, Cáncer de la Vagina, Cáncer de Vulva, Macroglobulinemia de Waldenstrom, y Tumor de Wilms.

El término "cáncer de pulmón" incluye el cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) y el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).

El término "SCLC" o "cáncer de pulmón de células pequeñas", como se usa en la presente descripción, se refiere a un neoplasma indiferenciado, preferentemente, compuesto por células de aspecto primitivo o embrionario. Como indica su nombre, las células en los carcinomas de células pequeñas son más pequeñas que las células normales y apenas tienen espacio para ningún citoplasma.

El término "NSCLC" o "cáncer de pulmón de células no pequeñas", como se usa en la presente descripción, se refiere a un grupo de enfermedades heterogéneas agrupadas porque su pronóstico y manejo son aproximadamente idénticos e incluyen, de acuerdo con la clasificación histológica de la Organización Mundial para la Salud/Asociación Internacional para el Estudio del Cáncer de Pulmón (Travis WD y otros. Histological typing of lung and pleural tumors.

3ra Ed. Berlin: Springer-Verlag, 1999):

(i) El carcinoma de células escamosas (SCC), que representa del 30 % a 40 % de NSCLC, comienza en los tubos respiratorios más grandes, pero crece más lentamente, lo que significa que el tamaño de estos tumores varía según el momento del diagnóstico.

(ii) El adenocarcinoma es el subtipo más común de NSCLC, que representa del 50 % al 60 % de NSCLC, que comienza cerca de la superficie de intercambio de gases del pulmón y que incluye un subtipo, el carcinoma bronquioalveolar, que puede tener diferentes respuestas al tratamiento.

(iii) El carcinoma de células grandes es una forma de crecimiento rápido que crece cerca de la superficie del pulmón. Es principalmente un diagnóstico de exclusión, y cuando se investiga más detenidamente, generalmente se reclasifica a carcinoma de células escamosas o adenocarcinoma.

(iv) El carcinoma adenoescamoso es un tipo de cáncer que contiene dos tipos de células: células escamosas (células delgadas y planas que recubren determinados órganos) y células similares a glándulas.

(v) Carcinomas con elementos pleomórficos, sarcomatoides o sarcomatosos. Este es un grupo de tumores raros que reflejan un continuo en la heterogeneidad histológica, así como también la diferenciación epitelial y mesenquimatosa.

(vi) El tumor carcinoide es un tumor neuroendocrino de pulmón de crecimiento lento y comienza en las células que son capaces de liberar una hormona en respuesta a un estímulo proporcionado por el sistema nervioso.

(vii) Los carcinomas del tipo de glándula salival comienzan en las células de las glándulas salivales ubicadas dentro de las grandes vías respiratorias del pulmón.

(viii) Los carcinomas no clasificados incluyen cánceres que no se ajustan a ninguna de las categorías de cáncer de pulmón mencionadas anteriormente.

El NSCLC puede ser un carcinoma de células escamosas, un adenocarcinoma, un carcinoma de células grandes (no diferenciadas), un carcinoma adenoescamoso y un carcinoma sarcomatoide.

El SCLC o el NSCLC pueden ser un NSCLC en los estadios 0, IA, IB, IIa, IIb, IIIa, IIIb o IV.

El término "NSCLC en estadio 0", como se usa en la presente descripción, se refiere a un tumor que está presente solo en las capas superiores de células que recubren las vías aéreas. No ha invadido más profundamente en otros tejidos pulmonares y no se ha diseminado a los ganglios linfáticos o a sitios distantes. El estadio 0 corresponde a los estadios TisN0M0 de la clasificación TNM.

El término "NSCLC en estadio I" o "SCLC en estadio I", como se usa en la presente descripción, se refiere al tumor que está presente en los pulmones, pero el cáncer no se encuentra en los ganglios linfáticos del tórax o en otras localizaciones fuera del tórax. El (N)SCLC en estadio I se subdivide en estadios IA y IB, generalmente con base en el tamaño del tumor o la afectación de la pleura, que reviste a lo largo del exterior del pulmón. En el estadio IA, el tumor mide 3 centímetros (cm) o menos de tamaño y ha invadido el tejido cercano de forma mínima, si es que lo hace. El cáncer no se ha diseminado a los ganglios linfáticos o a cualquiera de los sitios distantes. En el estadio IB, el tumor mide más de 3 cm de tamaño, ha invadido el revestimiento pleural alrededor del pulmón, o ha causado el colapso de una porción del pulmón. El cáncer no se ha diseminado a los ganglios linfáticos o a cualquiera de los sitios distantes. El estadio IA corresponde a los estadios T1N0M0 de la clasificación TNM. El estadio IB corresponde a T2M0N0 de la clasificación TNM.

El término "NSCLC en Estadio II" o "SCLC en estadio I", como se usa en la presente descripción, se refiere a un cáncer que ha comenzado a afectar a los ganglios linfáticos dentro del tórax o ha invadido estructuras y tejidos del tórax más extensamente. Sin embargo, no puede encontrarse diseminación más allá del lado afectado del tórax, y el cáncer aún se considera una enfermedad local. El estadio II se subdivide en los estadios IIA y IIB. El estadio IIA se refiere a los tumores que miden 3 cm o más pequeños y que han invadido el tejido cercano mínimamente, si es que lo hacen. Uno o más ganglios linfáticos en el mismo lado del tórax están involucrados, pero no hay diseminación a los sitios distantes. El estadio IIB se asigna en dos situaciones: cuando hay un tumor mayor de 3 cm con alguna invasión de tejidos cercanos y afectación de uno o más ganglios linfáticos en el mismo lado del tórax; o para los cánceres que no tienen afectación de los ganglios linfáticos, pero que se diseminaron a estructuras del tórax fuera del pulmón o que se localizan dentro de 2 cm de la carina (el punto en el que la tráquea, o el tubo que lleva aire a los pulmones, se divide para alcanzar los pulmones derecho e izquierdo). El estadio IIA corresponde a T1N1M0 o T2N1M0 de la clasificación TNM. El estadio IIB corresponde a T3N0M0 de acuerdo con la clasificación TNM.

El término "NSCLC en Estadio III" o "SCLC en estadio I", como se usa en la presente descripción, se refiere a los tumores que invadieron los tejidos del tórax más extensamente que en el estadio II, y/o el cáncer se ha diseminado a los ganglios linfáticos en el mediastino. Sin embargo, no se detecta la diseminación (metástasis) a otras partes del cuerpo. El estadio III se divide en los estadios IIIA y IIIB. El estadio IIIA se refiere a un tumor o masa únicos que no invaden ninguno de los órganos adyacentes, e implica a uno o más ganglios linfáticos alejados del tumor, pero no fuera del tórax. El estadio IIIB se refiere a un cáncer que se ha diseminado a más de un área en el tórax, pero no fuera del tórax. El estadio IIIA corresponde a T1N2M0, T2N2M0, T3N1M0, T3N2M0, T4N0M0 o T4N1M0 de acuerdo con la clasificación TNM. El estadio IIIB corresponde a T1N3M0, T2N3M0, T3N3M0, T4N2M0 o T4N3M0 de acuerdo con la clasificación TNM.

El término "NSCLC en Estadio IV" o "SCLC en estadio I", como se usa en la presente descripción, se refiere a un cáncer que se ha diseminado, o ha hecho metástasis, a diferentes sitios del cuerpo, que pueden incluir el hígado, el cerebro u otros órganos. El estadio IV corresponde a cualquier T o cualquier N con M1.

La clasificación TNM es un sistema de estadificación para el cáncer maligno. Como se usa en la presente descripción el término "clasificación TNM" se refiere a la 6ta edición de la agrupación por estadios TNM como se define en Sobin y otros, (International Union Against Cancer (UICC), TNM Classification of Malignant tumors, 6ta Ed. Nueva York; Springer, 2002, pp. 191-203) (TNM6) y AJCC Cancer Staging Manual 6ta edición; Capítulo 19; Lung - original páginas 167-177de manera que los tumores se clasifican mediante numerosos factores, específicamente, T para tumor, N para ganglios linfáticos, M para metástasis, como sigue:

T: El tumor primario no puede evaluarse, o un tumor demostrado por la presencia de células malignas en el esputo o en los lavados bronquiales, pero no se visualiza mediante imágenes o broncoscopía:

- T0: No hay evidencia de tumor primario,

- Tis: Carcinoma in situ,

- T1: El tumor mide 3 cm o menos en su dimensión mayor, rodeado por el pulmón o pleura visceral, sin evidencia broncoscópica de invasión más proximal que el bronquio lobar (por ejemplo, no en los bronquios principales),

- T2: El tumor mide más de 3 cm, pero menos de 7 cm o un tumor con cualquiera de las siguientes características (los tumores T2 con estas características se clasifican como T2a si tienen 5 cm o menos): involucra los bronquios principales, 2 cm o más distal a la carina; invade la pleura visceral (PL1 o PL2); se asocia con atelectasia o neumonitis obstructiva que se extiende a la región hiliar pero no afecta a todo el pulmón,

- T3: El tumor mide más de 7 cm o es uno que invade directamente cualquiera de los siguientes: pleura parietal (PL3), pared torácica (que incluye los tumores del surco superior), diafragma, nervio frénico, pleura mediastínica, pericardio parietal; o un tumor en el bronquio principal a menos de 2 cm distal de la carina pero sin afectación de la carina; o se asocia con atelectasia o neumonitis obstructiva de todo el pulmón o ganglios linfáticos separados del tumor en el mismo lóbulo, y

- T4: Tumor de cualquier tamaño que invade cualquiera de los siguientes: mediastino, corazón, grandes vasos, tráquea, nervio laríngeo recurrente, esófago, cuerpo vertebral, carina, ganglios linfáticos separados del tumor en un lóbulo ipsilateral diferente.

- N (Ganglios Linfáticos Regionales):

- NX: No pueden evaluarse los ganglios linfáticos regionales

- N0: No hay metástasis en los ganglios linfáticos regionales

- N1: Metástasis en ganglios linfáticos ipsilateral peribronquial y/o ipsilateral hiliar y ganglios linfáticos intrapulmonares, que incluye la afectación por extensión directa

- N2: Metástasis en ganglios linfáticos ipsilateral mediastínicos y/o subcarinales

- N3: Metástasis en ganglios linfáticos contralateral mediastínicos, contralateral hiliar, ipsilateral o contralateral escaleno, o supraclavicular

- M: Metástasis a distancia

- M0: No hay metástasis a distancia

- M1: Metástasis a distancia

El término "célula cancerosa", como se usa en la presente descripción se refiere a una célula que, durante su desarrollo adquiere un conjunto característico de capacidades funcionales, en particular uno o más de los siguientes: la capacidad de evadir la apoptosis, la autosuficiencia en la señalización para el crecimiento, la insensibilidad a las señales anticrecimiento, invasión/metástasis a los tejidos, potencial de crecimiento significativo y/o angiogénesis sostenida. El término pretende abarcar tanto las células cancerosas premalignas como las malignas.

El término "ADN tumoral" o "ADN tumoral de una célula cancerosa" como se usa en la presente descripción se refiere simplemente al ADN de una célula cancerosa. Se usa solamente para distinguir el ADN de una célula cancerosa más claramente de otro ADN al que se hace referencia en la presente descripción. Por lo tanto, a menos que se introduzcan ambigüedades, puede usarse el término "ADN de una célula cancerosa".

El término "sujeto" como se usa en la presente descripción se refiere a un individuo, tal como un humano, un primate no humano (por ejemplo, chimpancés y otras especies de simios y monos); animales de granja, tales como aves, peces, vacas, ovejas, cerdos, cabras y caballos; mamíferos domésticos, tales como perros y gatos; animales de laboratorio, que incluye roedores, tales como ratones, ratas y cobayas. El término no denota una edad o sexo particular. En un significado particular, el sujeto es un mamífero. En un significado preferido, el sujeto es un humano.

El término "es indicativo de" o "indica" como se usa en la presente descripción se refiere a un acto de identificación o especificación del asunto que debe indicarse. Como entenderán los expertos en la técnica, tal evaluación normalmente puede no ser correcta para el 100 % de los pacientes, aunque preferentemente es correcta. El término, sin embargo, requiere que pueda hacerse una indicación correcta para una parte estadísticamente significativa de los sujetos. El experto en la técnica puede determinar fácilmente si una parte es estadísticamente significativa mediante el uso de diversas herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, la determinación de los intervalos de confianza, la determinación de los valores de p, la prueba t de Student, la prueba de Mann-Whitney, etcétera. Los detalles se proporcionan en Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York 1983. Los intervalos de confianza preferidos son al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %. Los valores de p son, preferentemente, 0,05, 0,01, o 0,005.

El término "generar un amplicón" como se usa en la presente descripción, se refiere a amplificar una región definida de un molde de ADN de doble hebra o de hebra única, típicamente, con una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Un "amplicón" es un fragmento de ADN de doble hebra de acuerdo con dicha región definida.

El término "par de cebadores" como se usa en la presente descripción se refiere a dos oligonucleótidos, específicamente, un cebador directo y uno inverso, que tienen, con respecto a una molécula de ácido nucleico de doble hebra, secuencias que son (al menos sustancialmente) idénticas a una hebra, de manera que cada una de ellas hibrida con la hebra complementaria de la hebra a la que son (al menos sustancialmente) idénticas. El término "cebador directo" se refiere al cebador que es (al menos sustancialmente) idéntico a la cadena directa (como se define por la dirección de la secuencia de referencia genómica) de la molécula de ácido nucleico de doble hebra, y el término "cebador inverso" se refiere al cebador que es (al menos sustancialmente) idéntico a la hebra inversa complementaria de la hebra directa en la molécula de ácido nucleico de doble hebra. La distancia entre los sitios donde el cebador directo e inverso hibridan con su molde depende de la longitud del amplicón que se supone que los cebadores permiten generar. Típicamente, con respecto a la presente invención está entre 50 y 1000 pb. Los tamaños de amplicón preferidos se especifican en la presente descripción. En el caso de un molde de ADN de una sola hebra que va a amplificarse mediante el uso de un par de cebadores, solo uno de los cebadores hibrida con la hebra única en el primer ciclo de amplificación. Después, el otro cebador hibrida con la nueva cadena complementaria generada de manera que el resultado de la amplificación es un fragmento de ADN de doble hebra. La frase "par de cebadores adecuados para generar un amplicón a partir de una hebra única de ADN genómico en la que la citosina no metilada en la posición 5 se convirtió en uracilo u otra base que no hibrida con guanina" se refiere a un par de cebadores que toman en cuenta un cambio de base de citosinas no metiladas a uracilo, que se aparea con adenina y, por lo tanto, se reemplaza con timina en el amplicón.

El término "tratamiento" o "tratar" con respecto al cáncer como se usa en la presente descripción se refiere a un tratamiento terapéutico, en donde la meta es disminuir la progresión del cáncer. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de síntomas, disminución de la duración de la enfermedad, estado patológico estabilizado (específicamente no deteriorado), enlentecimiento de la progresión de la enfermedad, mejora del estado patológico y/o remisión (tanto parcial como total), preferentemente, detectable. Un tratamiento exitoso no necesariamente significa curación, pero puede significar, además, una supervivencia prolongada, en comparación con la supervivencia esperada si no se aplica el tratamiento. En una realización preferida, el tratamiento es un tratamiento de primera línea, es decir, el cáncer no se trató previamente. El tratamiento del cáncer implica un régimen de tratamiento.

El término "régimen de tratamiento", como se usa en la presente descripción se refiere a cómo se trata al paciente en vista de la enfermedad y de los procedimientos y medicamentos disponibles. Los ejemplos no limitantes de regímenes de tratamiento del cáncer son quimioterapia, cirugía y/o irradiación o combinaciones de estos. La detección temprana de cáncer que la presente invención facilita, permite en particular, un tratamiento quirúrgico, especialmente para una resección curativa. En particular, el término "régimen de tratamiento" se refiere a administrar uno o más agentes o terapias contra el cáncer como se define más abajo. Un cambio en el régimen de tratamiento no necesariamente significa un cambio de los fármacos o de la terapia, sino que, además, significa un cambio de la dosis del mismo fármaco o terapia. El término "agente o terapia contra el cáncer", como se usa en la presente descripción se refiere a agentes o terapias químicos, físicos o biológicos, o cirugía, que incluye combinaciones de estos, con propiedades antiproliferativas, antioncogénicas y/o carcinostáticas.

Un agente o terapia contra el cáncer químico puede seleccionarse a partir del grupo que consiste en agentes alquilantes, antimetabolitos, alcaloides y terpenoides de plantas e inhibidores de la topoisomerasa. Preferentemente, los agentes alquilantes son compuestos basados en platino. En una realización, los compuestos basados en platino se seleccionan a partir del grupo que consiste en cisplatino, oxaliplatino, eptaplatino, lobaplatino, nedaplatino, ^{carboplatino, iproplatino, tetraplatino, lobaplatino, DCP,}pLd-147, ^{JM1 18, JM216, JM335 y satraplatino.}

Puede seleccionarse un agente o terapia físico contra el cáncer a partir del grupo que consiste en radioterapia (por ejemplo, radioterapia curativa, radioterapia adyuvante, radioterapia paliativa, telerradioterapia, braquiterapia o radioterapia metabólica), fototerapia (mediante el uso de, por ejemplo, hematoporforina o fotofrina II) e hipertermia.

La cirugía puede ser una resección curativa, cirugía paliativa, cirugía preventiva o cirugía citorreductora. Típicamente, esto implica una excisión, por ejemplo, excisión intracapsular, excisión marginal, extensa o excisión radical como se describe en Baron and Valin (Rec. Med. Vet, Special Canc. 1990; 11(166):999-1007).

Un agente o terapia biológica contra el cáncer puede seleccionarse a partir del grupo que consiste en anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos que estimulan una respuesta inmunitaria que destruye las células cancerosas tales como el retuximab o el alemtuzubab, anticuerpos que estimulan una respuesta inmunitaria mediante la unión a los receptores de las células inmunitarias que inhiben las señales que impiden a las células inmunitarias atacar las "propias" células, tales como ipilimumab, anticuerpos que interfieren con la acción de proteínas necesarias para el crecimiento tumoral tales como bevacizumab, cetuximab o panitumumab, o anticuerpos conjugados a un fármaco, preferentemente a una sustancia que destruye las células, como una toxina, molécula quimioterapéutica o radioactiva, tal como Y-ibritumomab tiuxetan, I-tositumomab o ado-trastuzumab emtansine), citocinas (por ejemplo, interferones o interleucinas tales como INF-alfa e IL-2), vacunas (por ejemplo, vacunas que comprenden antígenos asociados a cáncer, tal como sipuleucel-T), virus oncolíticos (por ejemplo, virus oncolíticos de origen natural, tal como reovirus, virus de la enfermedad de Newcastle o virus de paperas, o virus modificados genéticamente tales como el virus del sarampión, adenovirus, virus de la viruela o virus del herpes que se direccionan preferentemente a las células que portan los antígenos asociados a cáncer tales como el EGFR o el HER-2), agentes de terapia génica (por ejemplo ADN o ARN que reemplazan un supresor tumoral alterado, que bloquean la expresión de un oncogén, que mejoran el sistema inmunitario de un paciente, que hacen a las células cancerosas más sensibles a la quimioterapia, radioterapia, u otros tratamientos, que inducen el suicidio celular o confieren un efecto antiangiogénico), y células T adoptivas (por ejemplo, las células T que invaden el tumor del paciente, cosechadas y seleccionadas en función de su actividad antitumoral, o células T cosechadas del paciente modificadas genéticamente para reconocer un antígeno asociado a cáncer.

En una realización, el uno o más fármaco(s) contra el cáncer se selecciona(n) a partir del grupo que consiste en ^{Acetato de Abiraterona, ABVD, ABVE,}aBVe-PC, ^{AC, AC-T, ADE, Ado-Trastuzumab Emtansina, Dimaleato de}Afatinib, Aldesleukin, Alemtuzumab, Ácido Aminolevulínico, Anastrozol, Aprepitant, Trióxido Arsénico, Asparaginasa Erwinia chrysanthemi, Axitinib, Azacitidina, BEACOPP, Belinostat, Hidrocloruro de Bendamustina, BEP, Bevacizumab, Bexaroteno, Bicalutamida, Bleomicina, Bortezomib, Bosutinib, Brentuximab Vedotin, Busulfán, Cabazitaxel, Cabozantinib-S-Malato, CAFCapecitabina, CAPOX, Carboplatino, CARBOPLATINO-TAXOL, Carfilzomib, Carmustina, Implante de Carmustina, Ceritinib, Cetuximab, Clorambucil, CLORAMBUCIL-PREDNISONA, CHOP, Cisplatino, Clofarabina, CMF, COPP, COPP-ABV, Crizotinib, CVP, Ciclofosfamida, Citarabina, Citarabina Liposomal, Dabrafenib, Dacarbazina, Dactinomicina, Dasatinib, Hidrocloruro de Daunorubicina, Decitabina, Degarelix, Denileukin Diftitox, Denosumab, Hidrocloruro de Dexrazoxano, Docetaxel, Hidrocloruro de Doxorubicina, Hidrocloruro de Doxorubicina en liposomas, Eltrombopag Olamina, Enzalutamida, Hidrocloruro de Epirubicina, EPOCH, Mesilato de Eribulin, Hidrocloruro de Erlotinib, Fosfato de Etopósido, Everolimus, Exemestano, FEC, Filgrastim, Fosfato de Fludarabina, Fluorouracilo, FU-LV, Fulvestrant, Gefitinib, Hidrocloruro de Gemcitabina, GEMCITABINA-CISPLATINO, GEMCITABINA-OXALIPLATINO, Gemtuzumab Ozogamicin, Glucarpidasa, Acetato de Goserelin, Vacuna Bivalente de HPV, Vacuna Cuadrivalente de HPV Recombinante, Hyper-CVAD, Ibritumomab Tiuxetan, Ibrutinib, ICE, Idelalisib, Ifosfamida, Imatinib, Mesilato, Imiquimod, Iodo 131 Tositumomab y Tositumomab, Ipilimumab, Hidrocloruro de Irinotecan, Ixabepilona, Lapatinib Ditosilato, Lenalidomida, Letrozol, Leucovorin Cálcico, Acetato de Leuprolida, Citarabina Liposomal, Lomustina, Hidrocloruro de Mecloretamina, Acetato de Megestrol, Mercaptopurina, Mesna, Metotrexato, Mitomicina C, Hidrocloruro de Mitoxantrona, MOPP, Nelarabina, Nilotinib, Obinutuzumab, Ofatumumab, Omacetaxina Mepesuccinato, OEPA, OFF, OPPA, Oxaliplatino, Paclitaxel, Formulación de nanopartículas de Paclitaxel estabilizada con Albúmina, PAD, Palifermina, Hidrocloruro de Palonosetron, Pamidronato Disódico, Panitumumab, Hidrocloruro de Pazopanib, Pegaspargasa, Peginterferón Alfa-2b, Pembrolizumab, Pemetrexed Disódico, Pertuzumab, Plerixafor, Pomalidomida, Hidrocloruro de Ponatinib, Pralatrexato, Prednisona, Hidrocloruro de Procarbazina, Dicloruro de Radio 223, Hidrocloruro de Raloxifeno, Ramucirumab, Rasburicasa, R-CHOP, R-CVP, Vacuna Bivalente de HPV Recombinante, Vacuna Cuadrivalente de HPV Recombinante, Interferón Alfa-2b Recombinante, Regorafenib, Rituximab, Romidepsina, Romiplostim, Fosfato de Ruxolitinib, Siltuximab, Sipuleucel-T, Sorafenib Tosilato, STANFORD V, Sunitinib Malato, TAC, Talco, Citrato de Tamoxifen, Temozolomida, Temsirolimus, Talidomida, Hidrocloruro de Topotecan, Toremifeno, Tositumomab y I Iodo 131 Tositumomab, TPF, Trametinib, Trastuzumab, Vandetanib, VAMP, VeIP, Vemurafenib, Sulfato de Vinblastina, Sulfato de Vincristina, Sulfato de Vincristina en Liposomas, Tartrato de Vinorelbina, Vismodegib, Vorinostat, XELOX, Ziv-Aflibercept, y Ácido Zoledrónico.

SEQ ID referidas en la solicitud

La presente solicitud se refiere a las SEQ ID NOs 1-151. Una descripción general y una explicación de estas SEQ ID se proporcionan en la siguiente Tabla 1:

Tabla 1: SEQ ID de la descripción r.c. significa inversa complementaria, C a T o G a A significa convertidas mediante la conversión con bisulfito de las citosinas en uracilo fuera del contexto CpG y reemplazada por timidina en la amplificación posterior. bis1 se refiere a la hebra directa convertida con bisulfito (como se enumeran en las SEQ ID del ADN genómico respectivo) y bis2 se refiere a la hebra complementaria inversa, de la hebra directa, convertida con bisulfito (complementaria inversa de la SEQ ID del ADN genómico respectivo) por lo cual la dirección de la hebra se define mediante la dirección de la secuencia genómica de referencia, como por ejemplo, la que se obtiene del genoma construido (HCGR38). Para un mapeo de las secuencias ver la Figura 2.

La invención se describe a través de los siguientes ejemplos que deben interpretarse solamente como ilustrativos y no limitantes del alcance de la invención.

Ejemplo 1 (Ejemplo comparativo)

Preparación de la muestra:

Las muestras técnicas usadas para evaluar el ensayo se prepararon como mezclas de ADN de PBL (ADN de sangre periférica), tratado con bisulfito, que se sabe que no está metilado en la región de ensayo (ADN Genómico Humano: Masculino, Promega GmbH) y ADN metilado (ADN tratado con ADN -Metiltransferasas - ADN metilado universal, Merck Chemicals GmbH) en 10 ng/mL total. Como un segundo control de referencia técnica para el ADN no metilado, del genoma, se usó ADN amplificado al azar (Phi). Los controles de ADN genómico fueron ADN de PBL sin tratar. Todos los demás ADN usados o mezclados para los controles técnicos se trataron con bisulfito con el kit EpiTect Bisulfite (Qiagen GmbH) de acuerdo con el protocolo del fabricante antes de la dilución y la mezcla. En muestras técnicas, el ADN genómico no estaba fragmentado/degradado lo opuesto al ADN tumoral circulante.

Los controles de plasma se prepararon mediante el enriquecimiento de 3,5 mL de plasma sin procesar de pacientes saludables (no cáncer) (Plasma, EDTA normal, Cliniqa Co.) con ADN metilado (ADN tratado con ADN-metiltransferasas - ADN Universal Metilado, Merck Chemicals GmbH). Las muestras de plasma de pacientes fueron de 3 - 3,5 mL sobrantes de los estudios de pacientes con cáncer de pulmón y pacientes saludables (no cáncer). El ADN de cáncer de pulmón en el plasma está fragmentado/degradado.

Muestra/procesamiento de ADN:

Las muestras técnicas/mezclas de ADN se usaron directamente. Las muestras de plasma se procesaron de manera análoga al flujo de trabajo preanalítico como se define en las instrucciones para usar (IFU) el kit Epi proColon 2.0 (Epigenomics AG).

Las reacciones de PCR usaron 10 ng de ADN total en cada reacción para muestras técnicas o el equivalente procesado de aproximadamente 1 mL de plasma para muestras de plasma. Excepto para la mezcla de PCR que contiene los oligómeros relevantes como se presenta para los ensayos en esta solicitud, la PCR en tiempo real en un LightCycler 480 (Roche Applied Sciences) se realizó de acuerdo con los protocolos de PCR del kit Epi proColon 2.0 PCR (Epigenomics AG).

Este ejemplo compara dos ensayos para FOXL2 que cubren y evalúan los CpG idénticos con sus bloqueadores y sondas: 1. Un ensayo HM establecido de 90 pb de longitud (FOXL2-long) sin errores de apareamientos en el medio de los cebadores, que se escogió a partir de una variedad de alternativas de ensayos de tales tamaños y características y se optimizó con respecto a las secuencias de cebadores/bloqueadores/sondas en muchos experimentos. 2. Un ensayo HM nuevo de 68 pb de longitud (FOXL2-short) con un error de apareamiento no específico de la metilación en el medio de un cebador. Este ensayo no se optimizó con respecto a las secuencias de cebadores/bloqueadores/sondas.

Resultados:

Los ensayos se compararon en muestras técnicas (Figura 1) y en muestras de plasma enriquecido (Figura 2) - ambas comparaciones dieron evidencias claras de que el ensayo más corto, sorprendentemente, se realizaba mejor que el ensayo más largo, aunque este no estaba optimizado y tenía un error de apareamiento justo en el medio de uno de los cebadores. Esto resultó sorprendente no solo porque el acortamiento mejoró en gran medida la sensibilidad, sino además, porque el efecto no depende de la fragmentación del ADN, que es una característica distintiva del ADN tumoral circulante (en las muestras técnicas, el ADN no estaba fragmentado).

Los resultados para el ensayo más corto se verificaron en experimentos independientes en muestras técnicas y de plasma enriquecido (Figura 3, parte superior). Se demostró repetidamente que la cantidad de ADN metilado medible es tan baja como 10 pg de ADN metilado por PCR (muestras técnicas) o 12 pg de ADN metilado por PCR (muestras de plasma enriquecido), que es el equivalente de aproximadamente 4 moléculas del molde (6 pg de ADN es aproximadamente la masa del genoma diploide de una célula).

La cantidad limitada de material de plasma del paciente prohibió una comparación directa de los dos ensayos y se usó con el ensayo corto de mejor rendimiento técnico solo para verificar su utilidad para detectar la metilación de FOXL2 en el plasma sanguíneo de pacientes con cáncer (Figura 3, parte inferior).

Ejemplo 2

Preparación y procesamiento de las muestras:

Se recolectaron muestras de plasma sanguíneo de pacientes con cáncer de pulmón, pacientes con enfermedades pulmonares benignas y controles saludables, como se define en las instrucciones para usar (IFU) el kit Epi proColon 2.0 (Epigenomics AG). Brevemente, para EDTA se preparó plasma mediante dos etapas de centrifugación. Hasta el procesamiento las muestras de plasma se almacenaron a -70 °C. Para los casos de cáncer de pulmón, se realizaron extracciones de sangre antes de cualquier tratamiento específico contra el cáncer. Todos los sujetos estaban en un intervalo de edad similar.

Las muestras de plasma se procesaron de manera análoga al flujo de trabajo preanalítico como se define en las instrucciones para usar (IFU) el kit Epi proColon 2.0 (Epigenomics AG). Las reacciones de PCR se realizaron como duplicados o triplicados técnicos mediante el uso del equivalente procesado de aproximadamente 1 mL de plasma en un volumen total de 30 pL. La PCR en tiempo real en Applied Biosystems 7500 Fast Dx (Applied Biosystems) se realizó de acuerdo con los protocolos de PCR del kit Epi proColon 2.0 PCR (Epigenomics Ag ). Además del estado de metilación de los marcadores investigados, el nivel de ACTB se midió como referencia en paralelo. Todas las muestras investigadas se definieron como válidas para el análisis en función de su valor ACTB. Para los análisis de los datos y ROC, se usó el valor mínimo de Ct de las repeticiones técnicas.

Estudio 1: En un primer estudio, se evaluó la metilación de SHOX2 en una reacción dúplex con ACTB como referencia mediante la comparación de los casos de cáncer de pulmón con controles saludables. Las reacciones de PCR se realizaron como duplicados técnicos mediante el uso de 12 pL de la elución del ADN tratado con bisulfito de Epi proColon como molde en un volumen total de 30 pL. Se investigaron 59 muestras de casos de cáncer de pulmón. 26 casos se diagnosticaron con cáncer escamoso de pulmón, 22 casos con adenocarcinoma, 5 casos con SCLc , 3 casos aparte de NSCLC, 2 casos con adenoescamoso y 1 caso con carcinoma de células grandes. Se procesaron como controles 92 muestras de plasma de individuos sin evidencia de enfermedad.

Estudio 2: En un segundo estudio, se evaluó la metilación de SHOX2 en una reacción triple con otro marcador de metilación y ACTB como referencia mediante la comparación de los casos de cáncer de pulmón con controles saludables. Las reacciones de PCR se realizaron como cuadriplicados técnicos mediante el uso de 12 pL de la elución del ADN tratado con bisulfito de Epi proColon como molde en un volumen total de 30 pL. Se investigaron 48 muestras de casos de cáncer de pulmón. 26 casos se diagnosticaron con cáncer escamoso de pulmón, 20 casos con adenocarcinoma, 1 caso aparte de NSCLC, y 1 caso con carcinoma de células grandes. Se procesaron como controles 100 muestras de plasma de individuos sin evidencia de enfermedad.

Estudio 3: En un tercer estudio, el estado de la metilación de SHOX2 se investigó en otras enfermedades pulmonares además del cáncer y se comparó con la metilación de SHOX2 en pacientes con cáncer de pulmón. La metilación de SHOX2 se evaluó en una reacción triple con otro marcador de metilación y ACTB como referencia. Las reacciones de PCR se realizaron como triplicados técnicos mediante el uso de 15 pL de la elución del ADN tratado con bisulfito de Epi proColon como molde en un volumen total de 30 pL. En este estudio, un subconjunto de las 50 muestras de plasma investigadas de pacientes con cáncer de pulmón usadas en el estudio I y el estudio II se comparó con 50 controles. Estos controles se diagnosticaron con diferentes enfermedades pulmonares: 18 casos con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), 10 casos con neumonía, 5 casos con asma, 5 casos con bronquiectasias, y 12 casos con otras enfermedades pulmonares, por ejemplo, infección por equinococo u osteocondromatosis.

Resultados:

La detección de la metilación de SHOX2 en plasma sanguíneo en estudios anteriores resultó en un desempeño clínico con un valor de área bajo la curva de 0,78 en una gráfica ROC que comparó a 288 pacientes con cáncer de pulmón y 189 controles (Kneip y otros, Journal of Thoracic Oncology, Volume 6, Number 8, August 2011). En ese estudio, se usó un ensayo SHOX2 de un amplicón de 124 pb de longitud para distinguir entre los pacientes con cáncer de pulmón y los sujetos saludables. La modificación del ensayo, como se describió en la presente descripción, usa oligonucleótidos modificados que permiten un error de apareamiento en el cebador que resulta en un amplicón más corto, de 91 pb de longitud (ver además la Figura 2, SHOX2). El ensayo de Kneip y otros, y el ensayo descrito en la presente descripción detectan la metilación en los mismos sitios CpG. Esta modificación del ensayo del inventor resultó en una inesperada detección mejorada de SHOX2 y una mejor realización clínica. Esto se demostró mediante los tres estudios separados:

El estudio I usó el ensayo nuevo de SHOX2 de 91 pb del inventor que comprende un error de apareamiento en el cebador (Figura 2) en una reacción dúplex con ACTB como un gen de referencia. En la presente, la comparación de 59 muestras de plasma sanguíneo de pacientes con cáncer de pulmón y 92 muestras de plasma sanguíneo de individuos saludables como controles resultó en un AUC mejorada de 0,871 en el análisis de la curva ROC (Figura 6).

En el segundo estudio, el nivel de metilación de SHOX2 se investigó mediante la comparación de 48 muestras de plasma sanguíneo de pacientes con cáncer de pulmón y 100 muestras de plasma sanguíneo de individuos saludables como controles, mediante el uso del mismo ensayo SHOX2 de 91 pb que comprende un error de apareamiento del cebador. A diferencia del estudio I, SHOX2 se midió en una reacción triple que mide, además de Ac Tb , un marcador de metilación adicional. A pesar de una mayor complejidad del ensayo, el rendimiento clínico es aún mejor como evidencia el AUC de 0,893 en el gráfico ROC (Figura 7).

En el tercer estudio, se investigó si la metilación de SHOX2 encontrada en el plasma sanguíneo es característica del cáncer de pulmón o podría estar relacionada con otras enfermedades de pulmón distintas del cáncer. Por lo tanto, un subconjunto de 50 muestras de plasma sanguíneo de pacientes con cáncer de pulmón del estudio I y del estudio II se midieron nuevamente y se compararon con 50 muestras de plasma sanguíneo de pacientes con enfermedades pulmonares benignas. Nuevamente, se usó el mismo ensayo SHOX2 de 91 pb que comprende un error de apareamiento del cebador. El análisis de ROC, que resultó en un AUC de 0,834 (Figura 8), mostró que la detección de la metilación de SHOX2 con el ensayo modificado más corto, como se describió en la presente descripción, puede usarse para distinguir no solo de los controles saludables sino además de los pacientes con enfermedades pulmonares benignas.

En resumen, los tres estudios demostraron que el ensayo SHOX2 de 91 pb, del inventor, que comprende un error de apareamiento del cebador, como se muestra en la Figura 2, es sorprendentemente superior en una evaluación clínica con respecto a un ensayo más largo sin un error de apareamiento, aunque ambos ensayos se basan en los mismos sitios CpG.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar la presencia o ausencia de ADN diana hipermetilado en una muestra que comprende ADN genómico, en donde dicho ADN diana es ADN SHOX2 humano genómico, que incluye la respectiva región promotora, y ADN dentro de 5 kb corriente arriba y corriente abajo del mismo, y en donde dicho ADN genómico está fragmentado al menos parcialmente, comprendiendo el método las etapas:

(a) convertir, en el ADN, citosina no metilada en la posición 5 en uracilo u otra base que no hibrida con guanina; (b) amplificar una región del ADN diana convertido usando oligonucleótidos cebadores inespecíficos de metilación y al menos un bloqueador específico de metilación que bloquea la amplificación de una manera específica de metilación, en donde dicha región tiene menos de 100 pares de bases (pb) de longitud y comprende al menos 3 sitios CpG del ADN genómico no cubiertos por un cebador, y en donde al menos un oligonucleótido cebador cubre (1) al menos un sitio CpG con un error de apareamiento inespecífico de metilación o un espaciador con respecto a la posición de la base de citosina del sitio CpG y/o (2) al menos un sitio SNP con un error de apareamiento inespecífico de SNP o un espaciador, en donde el al menos un error de apareamiento o espaciador está/están en el tercio medio o en el tercio 3' del oligonucleótido cebador; y

(c) detectar la presencia o ausencia de ADN amplificado en la etapa (b),

en donde la presencia o ausencia de ADN amplificado refleja la presencia o ausencia, respectivamente, de ADN diana hipermetilado en la muestra.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el método comprende las etapas:

(a) convertir, en el ADN, citosina no metilada en la posición 5 en uracilo u otra base que no hibrida con guanina; (b) amplificar una región del ADN de SHOX2 convertido usando oligonucleótidos cebadores inespecíficos de metilación que comprenden las secuencias de ácido nucleico de las SEQ ID NO: 121 y 122, respectivamente, o variantes de las mismas, y al menos un bloqueador específico de metilación que comprende las secuencias de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 123 o 124 o variantes de la misma que bloquean la amplificación de una manera específica de metilación, en donde las variantes se desplazan hasta 5 nucleótidos corriente arriba o corriente abajo en la secuencia de ADN de SHOX2 convertido con bisulfito de los respectivos cebadores o bloqueadores, y/o en donde las variantes son hasta 5 nucleótidos más cortas o más largas mientras aún se hibridan con la secuencia de ADN de SHOX2 convertida con bisulfito de los respectivos cebadores o bloqueadores; y

(c) detectar la presencia o ausencia de ADN amplificado en la etapa (b),

en donde la presencia o ausencia de ADN amplificado refleja la presencia o ausencia, respectivamente, de ADN SHOX2 hipermetilado en la muestra.

3. El método de la reivindicación 2, en donde la detección en la etapa (c) comprende usar una sonda que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 125, el complemento inverso de la misma, o una variante de cualquiera, en donde la variante se desplaza hasta 5 nucleótidos corriente arriba o corriente abajo en la secuencia de ADN SHOX2 convertido con bisulfito de la sonda respectiva, y/o en donde la variante es hasta 5 nucleótidos más corta o más larga mientras todavía se hibrida con la secuencia de ADN SHOX2 convertido con bisulfito de la sonda respectiva.

4. Un método para detectar la presencia o ausencia de cáncer en un sujeto, que comprende el método para detectar la presencia o ausencia de ADN diana hipermetilado en una muestra que comprende ADN genómico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde

- dicha muestra es una muestra derivada de un sujeto que comprende, en un sujeto que tiene dicho cáncer, ADN tumoral de una célula cancerosa,

- dicho ADN diana está hipermetilado en células cancerosas de un paciente que tiene dicho cáncer, y

- la presencia o ausencia de ADN diana hipermetilado en la muestra es indicativa de la presencia o ausencia, respectivamente, del cáncer en el sujeto.

5. El método de la reivindicación 4, en donde el cáncer es cáncer de pulmón.

6. Un kit adecuado para el método de la reivindicación 1, que comprende

(i) al menos un par de oligonucleótidos cebadores inespecíficos de metilación que consisten en un cebador directo y uno inverso, en donde dicho par de cebadores es adecuado para generar un amplicón a partir de una sola hebra de ADN SHOX2 humano genómico, incluida la región promotora respectiva, y ADN dentro de 5 kb corriente arriba y corriente abajo del mismo, en donde la citosina no metilada en la posición 5 se ha convertido en uracilo u otra base que no hibrida con guanina, en donde dicho ADN genómico está al menos parcialmente fragmentado, en donde al menos un oligonucleótido cebador cubre (1) al menos un sitio CpG con un error de apareamiento inespecífico de metilación o un espaciador con respecto a la posición de la base de citosina del sitio CpG y/o (2) al menos un sitio SNP con un error de apareamiento inespecífico de SNP o un espaciador, en donde al menos al menos un error de apareamiento o espaciador está/están en el tercio medio o en el tercio 3' del oligonucleótido cebador, y en donde dicho amplicón tiene menos de 100 pb de longitud y comprende al menos 3 sitios CpG del ADN genómico no cubierto por un cebador; y

(ii) al menos un bloqueador específico de metilación capaz de bloquear la amplificación de una manera específica de metilación.

7. El kit de la reivindicación 6, en donde el kit comprende

(i) un par de oligonucleótidos cebadores inespecíficos de metilación que comprenden las secuencias de ácido nucleico de las SEQ ID NO: 121 y 122 o variantes de las mismas, en donde las variantes se desplazan hasta 5 nucleótidos corriente arriba o corriente abajo en la secuencia de ADN de SHOX2 convertida con bisulfito de los respectivos cebadores, y/o en donde las variantes son hasta 5 nucleótidos más cortas mientras todavía se hibridan con la secuencia de ADN de SHOX2 convertida con bisulfito de los respectivos cebadores; y

(ii) al menos un bloqueador específico de metilación, en donde el bloqueador específico de metilación comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 123 o 124 o una variante de la misma, en donde la variante se desplaza hasta 5 nucleótidos corriente arriba o corriente abajo en la secuencia de ADN de SHOX2 convertida con bisulfito del bloqueador respectivo, y/o en donde la variante es hasta 5 nucleótidos más corta mientras todavía se hibrida con la secuencia de ADN de SHOX2 convertida con bisulfito del bloqueador respectivo.

8. El kit de la reivindicación 7, que comprende además una sonda que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 125, el complemento inverso de la misma, o una variante de cualquiera, en donde la variante se desplaza hasta 5 nucleótidos corriente arriba o corriente abajo en la secuencia de ADN de SHOX2 convertida con bisulfito de la sonda respectiva, y/o en donde la variante es hasta 5 nucleótidos más corta o más larga mientras todavía se hibrida con la secuencia de ADN de SHOX2 convertida con bisulfito de la sonda respectiva.

9. Un uso del kit de la reivindicación 8 para detectar la presencia o ausencia de cáncer en un sujeto.

10. El uso de la reivindicación 9, en donde el cáncer es cáncer de pulmón.