CN114645087B

CN114645087B - 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物或其组合和应用

Info

Publication number: CN114645087B
Application number: CN202111509796.XA
Authority: CN
Inventors: 叶竹佳; 杨昊; 陈思宇; 陈志伟; 范建兵
Original assignee: AnchorDx Medical Co Ltd
Current assignee: AnchorDx Medical Co Ltd
Priority date: 2020-12-17
Filing date: 2021-12-10
Publication date: 2023-03-24
Anticipated expiration: 2041-12-10
Also published as: WO2022127717A1; CN114645087A

Abstract

本发明提供了用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物或其组合，所述DNA甲基化分子标记物或其组合为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.19所示序列或其全长的至少55％的连续片段中的任意一种或两种以上的组合；或为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.19所示序列的完全互补序列或其全长的至少55％的连续片段中的任意一种或两种以上的组合。其中特别是其中的SEQ ID NO.9具有对肺结节良恶性检测的较高特异性。本发明还提供了上述DNA甲基化分子标记物的检测试剂盒和检测方法。所述DNA甲基化分子标记物与肺癌高度相关，尤其是组合使用，可以进一步提高对肺结节良恶性的检测的灵敏度和特异性，提高恶性肺结节的检出率，降低检出的假阳性率。所述试剂盒中的引物和探针克服了多个引物和探针在进行多重PCR扩增和检测时存在相互干扰的缺点，定量性能与单个区域定量等同。

Description

用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物或其组合和应用

本发明要求2020年12月17日提交的名称为《检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物及其组合和应用》的中国专利申请CN2020114961847的优先权，该发明的全部说明书和公开内容通过援引合并于此；本发明还要求2021年04月13日提交的名称为《检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物及其组合和应用》的PCT/CN2021/086902的PCT申请的优先权，该发明的关于甲基化分子标记物组合M、N、0的公开内容通过援引合并于此。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物及其组合和应用，所述应用包括检测试剂盒及检测方法。

背景技术

肺结节，即孤立性肺结节(solitary pulmonary nodule)是指影像为类圆形阴影、单一的、边界清楚的、直径小于或等于3cm、周围为含气肺组织所包绕的高低密度的实性或者亚实性病变，不伴肺不张、肺门肿大或胸腔积液。其常侵犯肺、双侧肺门淋巴结、眼、皮肤等器官，其胸部受侵率高达80％～90％。相当多的肺结节不能排除早期恶性肿瘤的可能性。

肺结节分为良恶性两类，常无明显症状，良性结节需要针对病因治疗，恶性需要早期手术。良性的病因常与自身性免疫疾病或各种感染相关，恶性的病因常与肺癌相关。

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。然而，在肺癌发生早期对病人进行治疗，是能够有效的提高其五年生存率。统计研究数据发现，I期肺癌患者在接受有效的治疗后，其五年生存率可达到60％～90％以上，而晚期肺癌患者的五年生存率却不足20％。因此，对早期癌症患者的诊断和治疗，显得尤为重要。目前，临床上使用的肺癌检测方法有：影像学检测、细胞学检测和分子标记物检测。

其中，肺癌分子标记物检测的检测样本主要来源于组织活检和液体活检，两者各具特点。。组织样本主要通过外科手术或纤维支气管镜刷片直接从肿瘤部位取得，因此其检测的准确性更高，然而因组织活检具有一定的侵入性，肿瘤异质性的存在及由于种种原因而无法取得组织标本或者组织标本量不足以完成分子检测，使得组织活检在肺癌的早期诊断、预测转移以及预后等方面的作用存在一定的局限性。相对于组织活检，液体活检具有操作简便、非侵入性、重复性强和利于疾病的动态监测等优势。

DNA甲基化与癌症的发生密切相关，尤其是CpG岛区的启动子超甲基化可能会导致抑癌基因转录沉默，从而影响肿瘤发生的进程，由于DNA甲基化几乎在所有癌症中均有发现，并且发生在癌前或者癌症早期阶段，因而是癌症诊断的理想标志物。

通过寻找基于肺癌呼吸道样本特异性DNA甲基化生物分子标记物，特别是寻找一些可能与早期肺癌比较相关的甲基化生物分子标记物，并且进一步还可以联合多个与肺癌相关的分子标记物进行检测，可增强肺癌的检出率，这对检测肺结节良恶性起到了关键作用。

本发明的发明人，一直致力于寻找能很好实现检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物，在逐步加深的研究中，进一步寻找一些能很好地适用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物，以实现能能高灵敏度和特异性对肺结节良恶性的检测，从而为肺癌特别是早期肺癌的诊断提供技术支持。

发明内容

基于此，本发明的目的之一是提供一种用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物，所述DNA甲基化分子标记物对肺结节良恶性的检测具有非常好的灵敏度和特异性，能有效提高恶性肺结节的检出率。

实现上述目的的技术方案包括以下。

一种可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物或其组合，所述DNA甲基化分子标记物为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.19所示序列中的任意一种或两种以上的组合；或为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.19所示序列的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合；或为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.19所示序列全长的至少55％的连续片段中的任意一种或两种以上的组合；或为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.19所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物或其组合包括SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.17所示序列，或包括SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.17的完全互补序列，或包括SEQID NO.9和SEQ ID NO.17所示序列全长的至少55％的连续片段，或包括SEQ ID NO.9和SEQID NO.17所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物或其组合包括SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.17所示序列，或包括SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.17的完全互补序列，或包括SEQID NO.9和SEQ ID NO.17所示序列全长的至少55％的连续片段，或包括SEQ ID NO.9和SEQID NO.17所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列；和选自

SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.18-SEQID NO.19所示序列或其互补序列中的至少一种，或SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.10～SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.18-SEQ ID NO.19所示序列全长的至少55％的连续片段中至少一种，或SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.16和SEQ IDNO.18-SEQ ID NO.19所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列中至少一种。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物或其组合包括SEQ ID NO.9、SEQID NO.13和SEQ ID NO.17所示序列，或包括SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.17的完全互补序列，或包括SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.17所示序列全长的至少55％的连续片段，或包括SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.17所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物或其组合包括SEQ ID NO.9、SEQID NO.13和SEQ ID NO.17所示序列，或包括SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.17的完全互补序列，或包括SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.17所示序列全长的至少55％的连续片段，或包括SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.17所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列；和选自

SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14～SEQID NO.16、和SEQ ID NO.18-SEQ ID NO.19所示序列或其互补序列中的至少一种，或SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14～SEQ ID NO.16、和SEQID NO.18-SEQ ID NO.19所示序列全长的至少55％的连续片段中至少一种，或SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14～SEQ ID NO.16、和SEQ IDNO.18-SEQ ID NO.19所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列中至少一种。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物的组合还包括SEQ ID NO.7、SEQID NO.13所示序列；或还包括SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.13所示序列的完全互补序列；或包括SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.13所示序列全长的至少55％的连续片段，或包括SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.13所示序列全长的至少55％的连续片段。

在其中一些实施例中，或所述DNA甲基化分子标记物的组合还包括SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.17所示序列；或还包括SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.17所示序列的完全互补序列；或包括SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.17所示序列全长的至少55％的连续片段，或包括选自SEQID NO.7和SEQ ID NO.13所示序列完全互补序列的至少55％的连续片段。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物的组合包括SEQ ID NO.3、SEQID NO.9、SEQ ID NO.13、和SEQ ID NO.17所示序列，或包括SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.9、SEQID NO.13、和SEQ ID NO.17的完全互补序列，或包括SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.13、和SEQ ID NO.17所示序列全长的至少55％的连续片段，或包括SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.13、和SEQ ID NO.17所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物的组合包括SEQ ID NO.1、SEQID NO.3、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.13、和SEQ ID NO.17所示序列，或包括SEQ ID NO.1、SEQID NO.3、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.13、和SEQ ID NO.17的完全互补序列，或包括SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.13、和SEQ ID NO.17所示序列全长的至少55％的连续片段，或包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.13、和SEQID NO.17所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物的组合包括SEQ ID NO.3、SEQID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.16、和SEQID NO.17所示序列，或包括SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.16、和SEQ ID NO.17的完全互补序列，或包括SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.16、和SEQ ID NO.17所示序列全长的至少55％的连续片段，或包括SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.16、和SEQ IDNO.17所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物的组合还包括SEQ ID NO.7、SEQID NO.8、SEQ ID NO.10、和SEQ ID NO.16所示序列；或还包括SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、和SEQ ID NO.16所示序列的完全互补序列；或还包括SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.10、和SEQ ID NO.16所示序列全长的至少55％的连续片段，或还包括选自SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、和SEQ ID NO.16所示序列完全互补序列的至少55％的连续片段。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物的组合还包括SEQ ID NO.1、SEQID NO.6、SEQ ID NO.11、和SEQ ID NO.13所示序列；或还包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.11、和SEQ ID NO.13所示序列的完全互补序列；或包括SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.11、和SEQ ID NO.13所示序列全长的至少55％的连续片段，或包括选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.11、和SEQ ID NO.13所示序列完全互补序列的至少55％的连续片段。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物的组合包括SEQ ID NO.3、SEQID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.16和SEQ ID NO.17所示序列，或包括SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17的完全互补序列，或包括SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示序列全长的至少55％的连续片段，或包括SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物的组合为SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.11,和SEQ ID NO.13至-SEQ ID NO.19所示序列；或为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.11,和SEQ ID NO.13至-SEQ ID NO.19所示序列所示序列的完全互补序列；或为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.11,和SEQ ID NO.13至-SEQ ID NO.19所示序列所示序列全长的至少55％的连续片段，或为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.11,和SEQ ID NO.13至-SEQ ID NO.19所示序列所示序列完全互补序列的至少55％的连续片段。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物的组合为SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.19所示序列；或为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.19所示序列的完全互补序列；或为所述DNA甲基化分子标记物为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.19所示序列全长的至少55％的连续片段；或为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.19所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列。

以上所示序列全长的至少55％的连续片段，可以是序列全长至少55％的，也可以至少是58％、至少是60％、至少是65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％等的连续片段。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.19所示序列全长的至少55％的连续片段分别为：

以引物为SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、SEQ IDNO.26和SEQ ID NO.27中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.1中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.2中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.3中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50和SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.4中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.56和SEQ ID NO.57、EQ ID NO.59和SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62和SEQ ID NO.63中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.5中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.68和SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.6中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.74和SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77和SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80和SEQ ID NO.81中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.7中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.83和SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.86和SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.89和SEQ ID NO.90中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.8中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.92和SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.95和SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.98和SEQ ID NO.99中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.9中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.101和SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.104和SEQ IDNO.105、SEQ ID NO.107和SEQ ID NO.108中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.10中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.110和SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.113和SEQ IDNO.114、SEQ ID NO.116和SEQ ID NO.117中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.11中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.119和SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.122和SEQ IDNO.123、SEQ ID NO.125和SEQ ID NO.126中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.12中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.128和SEQ ID NO.129、SEQ ID NO.131和SEQ IDNO.132、SEQ ID NO.134和SEQ ID NO.135中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.13中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.137和SEQ ID NO.138、SEQ ID NO.140和SEQ IDNO.141、SEQ ID NO.143和SEQ ID NO.144中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.14中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.146和SEQ ID NO.147、SEQ ID NO.149和SEQ IDNO.150、SEQ ID NO.152和SEQ ID NO.153中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.15中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.155和SEQ ID NO.156、SEQ ID NO.158和SEQ IDNO.159、SEQ ID NO.161和SEQ ID NO.162中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.16中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.164和SEQ ID NO.165、SEQ ID NO.167和SEQ IDNO.168、SEQ ID NO.170和SEQ ID NO.171中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.17中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.173和SEQ ID NO.174、SEQ ID NO.176和SEQ IDNO.177、SEQ ID NO.179和SEQ ID NO.180中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.18中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.182和SEQ ID NO.183、SEQ ID NO.185和SEQ IDNO.186、SEQ ID NO.188和SEQ ID NO.189中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.19中所对应的序列；

以引物为SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所扩增的片段在SEQ ID NO.1中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36所扩增的片段在SEQ ID NO.2中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39所扩增的片段在SEQ ID NO.3中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48所扩增的片段在SEQ ID NO.4中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60所扩增的片段在SEQ ID NO.5中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72所扩增的片段在SEQ ID NO.6中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.80和SEQ ID NO.81所扩增的片段在SEQ ID NO.7中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.89和SEQ ID NO.90所扩增的片段在SEQ ID NO.8中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.92和SEQ ID NO.93所扩增的片段在SEQ ID NO.9中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.104和SEQ ID NO.105所扩增的片段在SEQ ID NO.10中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.110和SEQ ID NO.111所扩增的片段在SEQ ID NO.11中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.125和SEQ ID NO.126所扩增的片段在SEQ ID NO.12中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.128和SEQ ID NO.129所扩增的片段在SEQ ID NO.13中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.143和SEQ ID NO.144所扩增的片段在SEQ ID NO.14中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.152和SEQ ID NO.153所扩增的片段在SEQ ID NO.15中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.158和SEQ ID NO.159所扩增的片段在SEQ ID NO.16中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.167和SEQ ID NO.168所扩增的片段在SEQ ID NO.17中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.179和SEQ ID NO.180所扩增的片段在SEQ ID NO.18中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.188和SEQ ID NO.189所扩增的片段在SEQ ID NO.19中所对应的序列；

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物为针对呼吸道样本的分子标记物。

在其中一些实施例中，所述呼吸道样本为肺部组织样本或呼吸道液体样本。

本发明的另一个方面，还提供了SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.19所示序列中的任意一种或两种以上的组合作为肺癌相关甲基化分子标记物在检测肺结节良恶性、和/或早期肺癌中的应用。

本发明的另一目的还提供了一种用于检测肺结节良恶性的试剂盒，所述试剂盒包含检测上述DNA甲基化分子标记物的甲基化水平的试剂。

在其中一些实施例中，所述试剂盒可以用于以下检测平台：包括采用PCR扩增法、荧光定量PCR法、数字PCR法、液相芯片法、代测序法、三代测序法二代测序法、焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、简化亚硫酸氢盐测序技术或它们的组合所使用的试剂。在一些优选的实施例中，所述检测方法为PCR扩增检测、荧光定量PCR检测、数字PCR检测、芯片检测。

在其中一些实施例中，所述试剂盒中检测上述DNA甲基化分子标记物的甲基化水平的试剂包括针对DNA甲基化分子标记物的荧光定量PCR检测的引物和探针，所述引物和探针为：

针对SEQ ID NO.1的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.20和SEQ IDNO.21所示引物，以及SEQ ID NO.22所示探针；SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示引物，以及SEQ ID NO.25所示探针；SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27所示引物，以及SEQ ID NO.28所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.2的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.29和SEQID NO.30所示引物，以及SEQ ID NO.31所示探针；SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33所示引物，以及SEQ ID NO.34所示探针；SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36所示引物，以及SEQ ID NO.37所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.3的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.38和SEQID NO.39所示引物，以及SEQ ID NO.40所示探针；SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示引物，以及SEQ ID NO.43所示探针；SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45所示引物，以及SEQ ID NO.46所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.4的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.47和SEQID NO.48所示引物，以及SEQ ID NO.49所示探针；SEQ ID NO.50和SEQ ID NO.51所示引物，以及SEQ ID NO.52所示探针；SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54所示引物，以及SEQ ID NO.55所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.5的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.56和SEQID NO.57所示引物，以及SEQ ID NO.58所示探针；EQ ID NO.59和SEQ ID NO.60所示引物，以及SEQ ID NO.61所示探针；SEQ ID NO.62和SEQ ID NO.63所示引物，以及SEQ ID NO.64所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.6的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.65和SEQID NO.66所示引物，以及SEQ ID NO.67所示探针；SEQ ID NO.68和SEQ ID NO.69所示引物，以及SEQ ID NO.70所示探针；SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72所示引物，以及SEQ ID NO.73所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.7的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.74和SEQID NO.75所示引物，以及SEQ ID NO.76所示探针；SEQ ID NO.77和SEQ ID NO.78所示引物，以及SEQ ID NO.79所示探针；SEQ ID NO.80和SEQ ID NO.81所示引物，以及SEQ ID NO.82所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.8的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.83和SEQID NO.84所示引物，以及SEQ ID NO.85所示探针；SEQ ID NO.86和SEQ ID NO.87所示引物，以及SEQ ID NO.88所示探针；SEQ ID NO.89和SEQ ID NO.90所示引物，以及SEQ ID NO.91所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.9的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.92和SEQID NO.93所示引物，以及SEQ ID NO.94所示探针；SEQ ID NO.95和SEQ ID NO.96所示引物，以及SEQ ID NO.97所示探针；SEQ ID NO.98和SEQ ID NO.99所示引物，以及SEQ ID NO.100所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.10的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.101和SEQID NO.102所示引物，以及SEQ ID NO.103所示探针；SEQ ID NO.104和SEQ ID NO.105所示引物，以及SEQ ID NO.106所示探针；SEQ ID NO.107和SEQ ID NO.108所示引物，以及SEQID NO.109所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.11的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.110和SEQID NO.111所示引物，以及SEQ ID NO.112所示探针；SEQ ID NO.113和SEQ ID NO.114所示引物，以及SEQ ID NO.115所示探针；SEQ ID NO.116和SEQ ID NO.117所示引物，以及SEQID NO.118所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.12的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.119和SEQID NO.120所示引物，以及SEQ ID NO.121所示探针；SEQ ID NO.122和SEQ ID NO.123所示引物，以及SEQ ID NO.124所示探针；SEQ ID NO.125和SEQ ID NO.126所示引物，以及SEQID NO.127所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.13的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.128和SEQID NO.129所示引物，以及SEQ ID NO.130所示探针；SEQ ID NO.131和SEQ ID NO.132所示引物，以及SEQ ID NO.133所示探针；SEQ ID NO.134和SEQ ID NO.135所示引物，以及SEQID NO.136所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.14的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.137和SEQID NO.138所示引物，以及SEQ ID NO.139所示探针；SEQ ID NO.140和SEQ ID NO.141所示引物，以及SEQ ID NO.142所示探针；SEQ ID NO.143和SEQ ID NO.144所示引物，以及SEQID NO.145所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.15的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.146和SEQID NO.147所示引物，以及SEQ IDNO.148所示探针；SEQ ID NO.149和SEQ ID NO.150所示引物，以及SEQ ID NO.151所示探针；SEQ ID NO.152和SEQ ID NO.153所示引物，以及SEQ IDNO.154所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.16的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.155和SEQID NO.156所示引物，以及SEQ ID NO.157所示探针；SEQ ID NO.158和SEQ ID NO.159所示引物，以及SEQ ID NO.160所示探针；SEQ ID NO.161和SEQ ID NO.162所示引物，以及SEQID NO.163所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.17的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.164和SEQID NO.165所示引物，以及SEQ ID NO.166所示探针；SEQ ID NO.167和SEQ ID NO.168所示引物，以及SEQ ID NO.169所示探针；SEQ ID NO.170和SEQ ID NO.171所示引物，以及SEQID NO.172所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.18的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.173和SEQID NO.174所示引物，以及SEQ ID NO.175所示探针；SEQ ID NO.176和SEQ ID NO.177所示引物，以及SEQ ID NO.178所示探针；SEQ ID NO.179和SEQ ID NO.180所示引物，以及SEQID NO.181所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.19的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.182和SEQID NO.183所示引物，以及SEQ ID NO.184所示探针；SEQ ID NO.185和SEQ ID NO.186所示引物，以及SEQ ID NO.187所示探针；SEQ ID NO.188和SEQ ID NO.189所示引物，以及SEQID NO.190所示探针；

或选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。

其中一些实施例中，所述引物和探针为：

针对SEQ ID NO.1的引物和探针为：SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示引物，以及SEQ ID NO.25所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.2的引物和探针为：SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36所示引物，以及SEQ ID NO.37所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.3的引物和探针为：SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39所示引物，以及SEQ ID NO.40所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.4的引物和探针为：SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48所示引物，以及SEQ ID NO.49所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.5的引物和探针为：SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60所示引物，以及SEQ ID NO.61所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.6的引物和探针为：SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72所示引物，以及SEQ ID NO.73所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.7的引物和探针为：SEQ ID NO.80和SEQ ID NO.81所示引物，以及SEQ ID NO.82所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.8的引物和探针为：SEQ ID NO.89和SEQ ID NO.90所示引物，以及SEQ ID NO.91所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.9的引物和探针为：SEQ ID NO.92和SEQ ID NO.93所示引物，以及SEQ ID NO.94所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.10的引物和探针为：SEQ ID NO.104和SEQ ID NO.105所示引物，以及SEQ ID NO.106所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.11的引物和探针为：SEQ ID NO.110和SEQ ID NO.111所示引物，以及SEQ ID NO.112所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.12的引物和探针为：SEQ ID NO.125和SEQ ID NO.126所示引物，以及SEQ ID NO.127所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.13的引物和探针为：SEQ ID NO.128和SEQ ID NO.129所示引物，以及SEQ ID NO.130所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.14的引物和探针为：SEQ ID NO.143和SEQ ID NO.144所示引物，以及SEQ ID NO.145所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.15的引物和探针为：SEQ ID NO.152和SEQ ID NO.153所示引物，以及SEQ ID NO.154所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.16的引物和探针为：SEQ ID NO.158和SEQ ID NO.159所示引物，以及SEQ ID NO.160所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.17的引物和探针为：SEQ ID NO.167和SEQ ID NO.168所示引物，以及SEQ ID NO.169所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.18的引物和探针为：SEQ ID NO.179和SEQ ID NO.180所示引物，以及SEQ ID NO.181所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.19的引物和探针为：SEQ ID NO.188和SEQ ID NO.189所示引物，以及SEQ ID NO.190所示探针；

在其中一些实施例中，所述试剂盒还包含针对内参基因ACTB的荧光定量PCR检测的引物和探针，优选地，所述引物和探针为：SEQ ID NO.191和SEQ ID NO.192所示引物，以及SEQ ID NO.193所示探针。

在其中一些实施例中，所述试剂盒的检测样本为呼吸道样本。

本发明还提供了上述DNA甲基化分子标记物或其组合的甲基化水平检测方法，包括以下步骤：

(1)从待测样本中提取基因组DNA；

(2)对提取获得的基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理，得到转化后的DNA；

(3)用针对上述DNA甲基化分子标记物的扩增引物对转化后的DNA进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物；

(4)步骤(3)获得的多重PCR产物用针对上述DNA甲基化分子标记物的探针进行多重荧光定量PCR检测。

在其中一些实施例中，所述多重PCR反应条件如下：98℃ 30s；15-35个循环：98℃15s，58℃～66℃ 15～30s；72℃ 15～30s；72℃ 5min；和/或，所述荧光定量PCR反应条件如下：95℃ 30s；35～50个循环：95℃ 10s；60℃～64℃ 30s。

在其中一些实施例中，利用上述试剂盒中的引物和探针进行检测。

本发明还提供了一种检测肺结节良恶性的方法，包括以下步骤：

(1)利用上述检测方法对上述DNA甲基化分子标记物的甲基化水平进行检测；

(2)通过内参基因C_T值判断样本是否有效，然后用内参基因C_T值对有效样本中检测的每个分子标记物的C_T值进行校正；

(3)将校正后的数据进行模型分析，最后进行肺结节良恶性的判断。

在其中一些实施例中，所述步骤(2)中若内参基因的C_T值在10-25之间，则该样本判断为有效样本；反之，则为无效样本；然后用内参基因C_T值对有效样本中的每个DNA甲基化分子标记物的C_T值进行校正；若目标DNA甲基化分子标物C_T值<40判断该DNA甲基化分子标记物被检出，得到该目标DNA甲基化分子标记物的相对循环数ΔC_T：ΔC_T＝目标DNA甲基化分子标记物C_T值-内参基因C_T值；若目标DNA甲基化分子标物C_T值为“Undertermined”则判断该DNA甲基化分子标记物未被检出，则赋予其ΔC_T＝30。

在其中一些实施例中，所述步骤(3)中根据校正后的ΔC_T值进行数据分析后，采用逻辑回归(Logistic Regression)算法建立肺结节良恶性预测模型。在模型构建过程中，使用交叉验证方法(Cross-validation)，将数据集随机分成3等份，并取其中任意2份合并作为训练集，剩余的1份作为测试集，则对于任意一个3等分的划分，根据组合原理可以得到3个不同的训练-测试集组合，然后针对训练集里含有不同DNA甲基化分子标记物的组合采用逻辑回归算法建立良恶性预测模型，并在含有特定的DNA甲基化分子标记物组合的测试集中评估模型的分类能力。按照上述步骤进行100次随机且相互独立的试验，最终含有特定DNA甲基化分子标记物的模型的分类能力，由100个模型的平均分类能力决定。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明找到了与肺癌高度相关的DNA甲基化特异性的分子标记物，通过检测这些DNA甲基化分子标记物的甲基化水平可以检测肺结节良恶性，具有很好的灵敏度和特异性。其中单独的分子标记物SEQ ID NO.9在肺部组织样本中都具有较高的特异性，其与SEQ IDNO.7，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.16和SEQ IDNO.17分子标记物的任意组合具有较高的灵敏度和特异性，特别是SEQ ID NO.9，和SEQ IDNO.17对应Marker的组合，或者是包括其他marker的进一步组合，可以很好地提高对肺结节良恶性的检测的灵敏度和特异性，有效提高早期恶性肺结节的检出率，及早进行治疗和干预，提高患者生存率；同时降低检出的假阳性率，避免良性肺结节的过度诊疗。

本发明提供的DNA甲基化分子标记物尤其适用于呼吸道样本，包括通过外科手术获取的肺部组织样本，以及通过微创或无创手段获取的呼吸道液体样本等。

本发明试剂盒提供的针对所述DNA甲基化分子标记物的荧光定量PCR检测引物和探针克服了多个引物和探针在进行多重PCR扩增和检测时存在相互干扰的缺点，利用所述引物对经过亚硫酸氢盐处理的DNA进行多重PCR时，每个DNA甲基化分子标记物均能得到有效扩增和富集；后续对多重PCR产物进行多重荧光定量PCR检测时，相应DNA甲基化分子标记物在多重荧光定量PCR检测中获得的C_T值与该DNA甲基化分子标记物单独进行荧光定量PCR反应的C_T值没有显著差异，定量性能与单个区域定量等同。所述试剂盒经过优化，针对不同DNA甲基化分子标记物的引物和探针相互之间没有干扰，可成功实现多重PCR扩增和多重荧光定量PCR检测，有效提高检测效率。

本发明提供的针对所述DNA甲基化分子标记物的检测方法通过引入多重PCR扩增，能有效对目标分子进行富集，克服了检测样本获取量低的限制，在放大检测信号的同时也能进行多个分子标记物的联合检测，提高检测灵敏度和检测效率，能增强对肺癌的检出率以及肺结节良恶性检测的准确率。

附图说明

图1是实施例3中其中一个甲基化分子标记物(Marker17)荧光定量PCR反应检测扩增曲线。

图2是实施例5中各甲基化分子标记物组合的ROC曲线图。

具体实施方式

本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

本发明提供的用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物为针对10个检测基因CDO1、DAPK、GHSR、HOXA11、HOXB4、LHX9、MIR196A1、PTGER4、SHOX2和TBX15中的19个甲基化区域，所述DNA甲基化分子标记物为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.19所示序列中的任意一种或两种以上的组合；或为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.19所示序列的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合；或为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.19所示序列全长的至少55％的连续片段中的任意一种或两种以上的组合，或为选自SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.19所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合。

在以下实施例中，SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.19所述DNA甲基化分子标记物相应记载的Marker，以及相应引物扩增的对应的Marker。

本发明的一个实施方式中，涉及了适用于呼吸道样本检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物，其中，包括19个甲基化检测区域的任意一种或者两种以上的组合。在其中一些实施例中，这些DNA甲基化分子标记物可以任意组合，以实现对检测样本进行肺结节良恶性的检测。

本发明的一个实施方式中，涉及了上述DNA甲基化分子标记物在制备检测肺结节良恶性的试剂盒中的用途。

本发明的一个实施方式中，涉及了一种检测肺结节良恶性的试剂盒，所述试剂盒包含检测上述DNA甲基化分子标记物的甲基化水平的试剂。所述试剂盒可以适用于PCR扩增、荧光定量PCR诊断、数字PCR(digital PCR)或者检测芯片等检测平台，最好是能实现高通量检测的平台。

本发明针对上述特定甲基化区域的DNA甲基化分子标记物进行了引物与探针设计，利用所述的DNA甲基化分子标记物组合的扩增引物，对从呼吸道样本中提取的并经过亚硫酸氢盐处理后的基因组DNA(gDNA)进行多重PCR扩增；再利用该DNA甲基化分子标记物的特异性探针对此检测区域的甲基化信号进行荧光定量PCR检测，然后采用朴素贝叶斯算法建立良恶性预测模型，最后通过建立的模型对肺结节的良恶性进行诊断。

实施例1

一个用于呼吸道样本检测肺结节良恶性的试剂盒，包含了10个检测基因CDO1、DAPK、GHSR、HOXA11、HOXB4、LHX9、MIR196A1、PTGER4、SHOX2和TBX15中的19个甲基化区域的DNA甲基化分子标记物Marker1至Marker19的检测引物和探针，各DNA甲基化分子标记物的检测区域序列及序列编号具体如表1所示(其中每个区域下划线部分为本发明以下实施例中优选所用引物扩增的片段的对应序列的Marker)：

表1.分子标记物检测区域序列

/>

/>

所述试剂盒针对19个用于呼吸道样本检测肺结节良恶性的分子标记物Marker1至Marker19中的特异性甲基化位点各设计了三对引物和三条探针(探针荧光标记可采用FAM、VIC及NED等荧光基团标记)，并分别标记为组合1、2、3。其中，每个分子标记物中被选择的引物和探针组合，可任意选择与其他分子标记物中的引物和探针的组合1、2、3进行组合并在同一平台进行检测。具体的各分子标记物对应的引物和探针序列如表2所示：

表2相关分子标记物的引物和探针序列

/>

/>

/>

/>

本实施例和以下实施例中，优选所用的引物和探针组合都为如下所示：Marker1的引物和探针组合2，Marker2的引物和探针组合3，Marker3的引物和探针组合1，Marker4的引物和探针组合1，Marker5的引物和探针组合2，Marker6的引物和探针组合3，Marker7的引物和探针组合3，Marker8的引物和探针组合3，Marker9的引物和探针组合1，Marker10的引物和探针组合2，Marker11的引物和探针组合1，Marker12的引物和探针组合3，Marker13的引物和探针组合1，Marker14的引物和探针组合3，Marker15的引物和探针组合3，Marker16的引物和探针组合2，Marker17的引物和探针组合2，Marker18的引物和探针组合3，Marker19的引物和探针组合3。

在其他实际应用中，将根据甲基化分子标记物的不同组合进行选择相应的引物和探针。

所述试剂盒还包含内参基因ACTB的引物和探针，其序列具体如表3所示：

表3.内参基因ACTB引物和探针

实施例2

本实施例利用实施例1所述试剂盒对呼吸道样本中Marker1至Marker19的甲基化水平进行检测。

所述DNA甲基化分子标记物的甲基化水平检测方法，包括以下步骤：

1、呼吸道样本中gDNA的提取：

1)对肺组织石蜡切片样本gDNA提取：石蜡组织gDNA提取具体操作步骤按照Qiagen公司的ALLPrep DNA/RNA FFPE Kit说明书进行；

2)对呼吸道液体样本gDNA提取：先将呼吸道液体样本进行低速离心处理，4℃，5000g，5min；去上清，收集沉淀；然后按照Qiagen公司的

Blood&Tissue Kit说明书进行操作提取gDNA。

2、对提取的gDNA进行亚硫酸盐转化

将提取的gDNA进行亚硫酸氢盐转化，投入50-100ng gDNA，本实施例优选在75ng,按照Zymo DNA Methylation-Direct MagPrep说明书进行操作,使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。经过亚硫酸氢盐转化后的DNA产物全部用于进行多重PCR扩增。

3、对转化后的DNA进行多重PCR扩增

转化后的DNA产物全部进行多重PCR扩增，其中的反应组分为：特定组合的分子标记物及1个内参基因的引物混合液，其中每条引物浓度在200nM-300nM，本实施例优选300nM；镁离子的浓度在1-3mM，本实施例优选在1.5mM；dNTP混合液浓度在200-600uM，本实施例优选在400uM；反应酶为

Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase(NEB,Cat#M0515)，一个反应的单位数为1-3U，本实施例优选2U。多重PCR反应体系配制如表4：

表4.多重PCR反应体系

组分	体积(ul)	终浓度
			Q5U Buffer	10	1X
dNTP mix(10mM/dNTP)	2	400uM/dNTP
			引物混合液(75uM/引物)	8.4	300nM/引物
MgCl<sub>2</sub>(25mM)	3	1.5mM
			Q5U	0.75	2U
DNA模板	18-22
			DEPC H<sub>2</sub>O	up to 50

具体反应条件为：预变性，98℃，30s；5-10个循环反应1，本实施例优选5个循环：变性，98℃，15s；退火，58-66℃，15-30s，本实施例优选58℃，15s；延伸68℃，15-30s，本实施例优选15s。10-15个循环反应2，本实施例优选13个循环：变性，98℃，15s；退火，58-66℃，15-30s，本实施例优选62℃，15s；延伸68℃，15-30s，本实施例优选15s。

4、对多重PCR扩增产物进行荧光定量PCR测定

对多重PCR产物进行1-5倍稀释，本实施例优选5倍稀释。荧光定量PCR反应组分为：引物探针混合液，其中各引物浓度在200-900nM，本实施例优选400nM；探针浓度在100-200nM，本实施例优选200nM。采用的反应酶混合液为1倍的

Universal qPCR MasterMix(NEB,Cat#M3003)，一个反应为10ul体系。

具体反应条件为：预变性，95℃，5min；40-50个循环，本实施例优选40个循环：变性，95℃ 15s；退火，60-64℃，本实施例优选62℃，30s，信号收集。qPCR荧光定量反应体系配制如表6：

表6.qPCR荧光定量反应体系

本实施例进一步提供一种检测肺结节良恶性的方法，还包括以下步骤：

5、根据荧光定量PCR反应测定的内参基因在样本中的C_T值判断该检测样本是否为有效样品，若检测样本内参基因的C_T值在10-25之间，则该样本判断为有效样品；若检测样本内参基因的C_T值<10，则样本初始投入量过剩；若检测样本内参基因的C_T值>25,则初始样本投入量不足。对于初始投入量过剩或不足的样本，均判定为无效样本，不纳入检测和分析。

6、在样品判断为有效样品的前提下，若目标DNA甲基化分子标物C_T值<40判断该DNA甲基化分子标记物被检出，得到该目标DNA甲基化分子标记物的相对循环数ΔC_T：ΔC_T＝目标DNA甲基化分子标记物C_T值-内参基因C_T值；若目标DNA甲基化分子标物C_T值为“Undetermined”则判断该DNA甲基化分子标记物未被检出，则赋予其ΔC_T＝30。

7、根据校正后的ΔCT值进行数据分析，采用逻辑回归(Logistic Regression)算法建立肺结节良恶性预测模型。在模型构建过程中，使用交叉验证方法(Cross-validation)，将数据集随机分成3等份，并取其中任意2份合并作为训练集，剩余的1份作为测试集，则对于任意一个3等分的划分，根据组合原理可以得到3个不同的训练-测试集组合，然后针对训练集里含有不同DNA甲基化分子标记物的组合采用逻辑回归算法建立良恶性预测模型，并在含有特定的DNA甲基化分子标记物组合的测试集中评估模型的分类能力。按照上述步骤进行100次随机且相互独立的试验，最终含有特定DNA甲基化分子标记物的模型的分类能力，由100个模型的平均分类能力决定。

实施例3

本实施例提供分子标记物在标准品中的检测方法，其检测步骤如下：

1、标准品制备

1)0％甲基化标准品制备：

利用

Single Cell Kit(Qiagen,Cat#150343)和Mung Bean Nuclease(NEB,Cat#M0250L)处理NA12878 DNA以制备0％甲基化标准品；

2)100％甲基化标准品制备：

利用CpG Methyltransferase(M.SssI)处理所制备的0％的甲基化标准品，得到100％的甲基化标准品。

2、不同甲基化比例的标准品制备：

按照所需的甲基化比例梯度混合0％与100％甲基化标准品，得到0.2％，0.4％，1％甲基化比例的标准品。

3、对不同甲基化比例的标准品DNA进行亚硫酸氢盐转化：步骤如实施例2，转化投入量为50-100ng，优选75ng。

4、对转化后的标准品DNA进行多重PCR扩增，步骤如实施例2，多重PCR引物混合液为21个分子标记物以及内参基因的引物。

5、对上述多重PCR扩增产物进行荧光定量PCR测定，步骤如实施例2。

6、根据荧光定量PCR反应测定的内参基因ACTB在样本中的C_T值判断该检测样本是否为有效样品，若检测样本内参基因的C_T值在10-25之间，则该样本判断为有效样品；

7、在样品判断为有效样品的前提下，若目标DNA甲基化分子标物C_T值<40判断该DNA甲基化分子标记物被检出，若目标DNA甲基化分子标物C_T值为“Undetermined”则判断该DNA甲基化分子标记物未被检出。

本实施例及以下实施例中，各分子标记物的引物探针组合如实施例1中优选的组合。

本实施例及以下实施例中，每一次试验都会设置阴性对照，该阴性对照以水作为模板进行多重PCR，得到的阴性对照多重PCR产物再进行各特定分子标记物的荧光定量PCR测定。如阴性对照无检测信号，则判定整个实验操作无外源污染。

本实施例进行了3次完全独立重复试验，19个分子标记物在100％甲基化标准品中均有检测信号，而阴性对照和非甲基化检测标准品中都无检测信号，以其中一个分子标记物(Marker 17)扩增曲线为例，如图1所示。在甲基化比例≥0.2％的各标准品中，Marker2，Marker4，Marker5，Marker6，Marker11，Marker12，Marker13，Marker14，Marker15，Marker18和Marker19三次试验全有检测信号，说明这些分子标记物对甲基化比例≥0.2％的样品检出率达到了100％；在甲基化比例≥0.4％的各标准品中，Marker1和Marker16三次试验全有检测信号，说明这些分子标记物对甲基化比例≥0.4％的样品的检出率达到了100％；19个分子标记物在甲基化比例为1％的标准品中，三次试验全有检测信号，说明这些分子标记物都能检出甲基化比例为1％的信号，以上所述如表8：

表8.分子标记物在各甲基化比例标准品中的测试结果

/>

实施例4分子标记物与肺癌的相关性

本实施例研究本发明提供的分子标记物与肺癌的相关性，具体方法如下：

1、对肺部组织石蜡切片样本进行DNA提取，如实施例2所述。

2、对提取的DNA进行亚硫酸盐转化，投入量为50ng-100ng，本实施例优选75ng，如实施2所述。

3、对转化后的DNA通过用包含有特定分子标记物的扩增引物进行多重PCR扩增，如实施例2所述。

4、对多重PCR扩增产物进行荧光定量PCR测定，如实施例2所述。

5、根据荧光测定的结果，判断样本是否为有效样品，如实施例2所述。

6、对所检测的样本中的目标分子标记物C_T值进行校正，如实施例2所述。

7、根据对样本中校正后的目标分子标记物的ΔC_T进行数据分析，如实施例2所述。

本实施例对57例肺结节组织样本中(手术活检鉴定为良性样本有29例，恶性样本28例包含恶性结节样本包含16例I期，3例II期，8例III期和1例IV期恶性样本)的分子标记物Marker1，Marker3，Marke4，Marker5，Marker6，Marker7，Marker8,Marker9，Marker10Marker11，Marker13，Marker14，Marker15，Marker16，Marker17和Marker19进行了单分子标记物的检测。前述各分子标记物的平均AUC范围为0.88-1.00，在95％CI下，最低AUC范围在0.78-1.00，最高AUC范围达到0.98-1.00。在约登指数(YouDen Index)为最大的前提下进行切分后的灵敏性(Sensitivity)范围为79％-100％，特异性(Specificity)范围为72％-100％，这表明了这些分子标记物甲基化水平与肺癌的癌变高度相关。具体如表9所示：

表9.分子标记物与肺癌的相关性

实施例5不同分子标记物组合对肺组织样本进行肺结节良恶性检测的表现

本实施例利用19个分子标记物包含Marker1至Marker19，通过实施例2的实验方法，对实施例4中的57例肺结节组织样本进行检测分析，具体的检测试剂盒、试验方法以及数据判断处理如实施例2所述，引物和探针组合如实施例1所优选的组合。

本实施例及以下实施例选取包含了不同特定分子标记物的组合，具体分子标记物组合如表10所示，利用逻辑回归(Logistic Regression)算法建立肺结节良恶性预测模型。在模型构建过程中，使用交叉验证方法(Cross-validation)，将数据集随机分成3等份，并取其中任意2份合并作为训练集，剩余的1份作为测试集，则对于任意一个3等分的划分，根据组合原理可以得到3个不同的训练-测试集组合，然后针对训练集里含有不同DNA甲基化分子标记物的组合采用逻辑回归算法建立良恶性预测模型，并在含有特定的DNA甲基化分子标记物组合的测试集中评估模型的分类能力。按照上述步骤进行100次随机且相互独立的试验，最终含有特定DNA甲基化分子标记物的模型的分类能力，由100个模型的平均分类能力决定。

表10.不同分子标记物组合

选取表10中分子标记物组合A，B，E，F，G，H，I，J，K，L，M，N和O进行建模分析，按照上述统计分析方法，经过100次随机且相互独立的试验后，13个组合分别的100个模型的平均AUC均为1.00(特异性：100％；灵敏性：100％)，ROC如图2所示。可见所述所选分子标记的组合有极高的肺癌组织特异性以及灵敏性。该组织样本中有60％的恶性样本为肺癌早期样本，因此该分子标记物的组合对早期肺癌检测及肺结节良恶性检测也有非常好的灵敏性和特异性。

选取表10中分子标记物组合C和D进行建模分析，按照上述统计分析方法，经过100次随机且相互独立的试验后，该2个组合分别的100个模型的平均AUC为0.99(特异性：100％；灵敏性：96％)，ROC如图2所示。可见所述所选分子标记的组合有极高的肺癌组织特异性以及灵敏性。该组织样本中有60％的恶性样本为肺癌早期样本，因此该分子标记物的组合对早期肺癌检测及肺结节良恶性检测也有非常好的灵敏性和特异性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州市基准医疗有限责任公司

<120> 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物或其组合和应用

<150> 2020114961847

<151> 2020-12-17

<150> PCT/CN2021/086902

<151> 2021-04-13

<160> 193

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 134

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cggaggcggg gagaccctgc gggcacggct cacgcgcaca tccccggctt ccccgggctc 60

cgcgccttcc caagagcccc gttgtctccg gcgtcccagg gatcgcgtgg gctccgcgca 120

atctctcccc cact 134

<210> 2

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgccgccagc ccgcttgcag ggtccccatt ggccgcctgc cggccgccct ccgcccaaaa 60

ggcggcaagg agccgagagg ctgcttcgga gtgtgaggag gacagccgga ccgagccaac 120

gccggg 126

<210> 3

<211> 118

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgggggaag catcccagtc caggtcggcc agtgtgaggt tgaaccccgg ctcttcgctg 60

ggcgtcgcgt tccacatgct gccggctcag ctgaacaggc tctgggacgt gactgcgc 118

<210> 4

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

catcccagtc caggtcggcc agtgtgaggt tgaaccccgg ctcttcgctg ggcgtcgcgt 60

tccacatgct gccggctcag ctgaacaggc tctgggacgt gactgcgctg ggaggctgga 120

ccg 123

<210> 5

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctcaccgaaa gcacgtaatc gccggtgtaa ctcatgttgg ctggggggcc tcccggcgcg 60

cgcggagagg ctggggtgcg cccccatgca gcatgcttgt gctcaattgc agggtcctcg 120

ttctcgagtg tgcag 135

<210> 6

<211> 106

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctcaattgc agggtcctcg ttctcgagtg tgcagagggc ggtgagagct caactctcgt 60

ccccacctcc cacccgcagc tccccgggtg ggtgagggat gccctg 106

<210> 7

<211> 145

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gttctgggcg cagggaggcg gcggggggct gctgctgacc gcctcgcagc gctggccggg 60

ctccgggagg agggccccgg cgggtggcgg cgcaggagcc cgaggggaca gaccgggcgg 120

tggcgggggc ggcgggggtg gtggc 145

<210> 8

<211> 182

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcgggggccc agggtcccgg caggccgcgt agcgctgcac ggtgcacgcc gcgcgccgcc 60

cgaagcccgc ctccggctgg aagctgctct ctcgcctctg gccgccggcg tagtacccgg 120

gcgagtggtc gctgggtagg taatcgctct gtgaatattc ctcgcatgga gggaacttgg 180

gg 182

<210> 9

<211> 151

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cctgtttccg aaagccctcc tacttactgt caagtgaaca aagttaggcg cccacgtgat 60

cctccgagcc aatggccgcc ccgcctgcga ttcccggata aggaaatctg ctcacccgga 120

ccccactcca gccaaagagg tttatttccc c 151

<210> 10

<211> 178

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cctccccacc cacccaccca acaccaggat ttacataggg ctcctgcggg gcgaccccct 60

ccttgcctcg ctctctccgg gatcagagag agagcgagag agagagcgcg cgcaggttgc 120

gactggaggg cctgttgggg cgctaggcag agcgcaaacc ctagatccct taagaagt 178

<210> 11

<211> 128

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccttgcggtg tgctttcttt gcagggcatg cccccgctca gcccggagaa gcccgccctg 60

tgcgccggct gcgggggcaa gatctcggac aggtactatc tgctggctgt ggacaaacag 120

tggcatct 128

<210> 12

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgcaaaaacg cagctgtgca ggccgagggc ggcggcggac ttacctgggc ggcggcggtg 60

ccggcagtgc gcggccgtcg gaaggtgcgg agccagcggc cgcggcc 107

<210> 13

<211> 139

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gaaccggccg ccaggcgcgc tcttctctcg gaggagtcgg cgctgaccca gcccgcgccc 60

ggcagagact ggaagccgcc gcctacacgg aaaatccaca gagccccgcg cagaccctat 120

gatcggctcg gcccgccgg 139

<210> 14

<211> 106

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gccccgaccg gctgaacagc ccagtgacca tcccggcggt gatgttcatc ttcggggtgg 60

tgggcaacct ggtggccatc gtggtgctgt gcaagtcgcg caagga 106

<210> 15

<211> 143

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atgtccactc ccggggtcaa ttcgtccgcc tccttgagcc ccgaccggct gaacagccca 60

gtgaccatcc cggcggtgat gttcatcttc ggggtggtgg gcaacctggt ggccatcgtg 120

gtgctgtgca agtcgcgcaa gga 143

<210> 16

<211> 174

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gctcgcggct gcagtaccca gacacctggt gcttcatcga ctggaccacc aacgtgacgg 60

cgcacgccgc ctactcctac atgtacgcgg gcttcagctc cttcctcatt ctcgccaccg 120

tcctctgcaa cgtgcttgtg tgcggcgcgc tgctccgcat gcaccgccag ttca 174

<210> 17

<211> 143

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggttgcctcc cggggccacc ccgctgcctc cccagccttg ccgcgcctca gcgactttcg 60

gcgccgccgg agcttccgcc gcatcgcggg cgccgagatc cagatggtca tcttactcat 120

tgccacctcc ctggtggtgc tca 143

<210> 18

<211> 138

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgaaattggt ccgacttcgc ctctgcttga ttttggtctg gccttcgtcc tccatccctt 60

tcgcatcctc tttgcgatct ttcagctccg gggacactgg agggggcacc ccagcggggc 120

cacacgtgca tccacacg 138

<210> 19

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

agagaaagct caaaccggca gcgaagtcgg tcctagccaa gctgaaaaaa cgtctcggat 60

ttcgcggaca gcggcctaga cacagcccga tcttccagtc ctagtgccct ggtcgagacg 120

gtt 123

<210> 20

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

accctacgaa cacgact 17

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gagattgcgc ggagtttac 19

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ccgcacatcc ccgacttccc c 21

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

aaaccctacg aacacgactc a 21

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gagattgcgc ggagtttacg 20

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cgcacatccc cgacttcccc ga 22

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

agaaacccta cgaacacgac t 21

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

agagattgcg cggagtttac g 21

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cacatccccg acttccccga ag 22

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ccgccaaccc gcttacaa 18

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gcgttggttc ggttcggt 18

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

taaccgccta ccgaccgccc tcc 23

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gccaacccgc ttacaaaatc c 21

<210> 33

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gcgttggttc ggttcggt 18

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

accgcctacc gaccgccctc c 21

<210> 35

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

cgcttacaaa atccccatta acc 23

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

cgttggttcg gttcggttg 19

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

cctaccgacc gccctccgcc 20

<210> 38

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

agtttaggtc ggttagtgtg aggttg 26

<210> 39

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

acgtcccaaa acctattcaa cta 23

<210> 40

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

acaacatata aaacgcgacg cccaacgaa 29

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

ttagtttagg tcggttagtg tgagg 25

<210> 42

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

atcacgtccc aaaacctatt caac 24

<210> 43

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

caacatataa aacgcgacgc ccaacgaaaa 30

<210> 44

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

tttagtttag gtcggttagt gtgag 25

<210> 45

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

cacgtcccaa aacctattca acta 24

<210> 46

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

cgacaacata taaaacgcga cgcccaacg 29

<210> 47

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

aaattaaacc ccgactcttc gc 22

<210> 48

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

agttttttag cgtagttacg ttttagagtt 30

<210> 49

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

gtcgcgttcc acatactacc gactcaacta a 31

<210> 50

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

catcccaatc caaatcgacc aat 23

<210> 51

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

tagttacgtt ttagagtttg tttagttga 29

<210> 52

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

aaaattaaac cccgactctt cgctaaacgt 30

<210> 53

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

aatataaaat taaaccccga ctcttcg 27

<210> 54

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

tttagcgtag ttacgtttta gagtttg 27

<210> 55

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

cgcgttccac atactaccga ctcaact 27

<210> 56

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

cgaaagtacg taatcgtcgg tgta 24

<210> 57

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

tcgaaaacga aaaccctaca atta 24

<210> 58

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

aacgcacccc aacctctccg c 21

<210> 59

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

cgtaatcgtc ggtgtaattt atgtt 25

<210> 60

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

cgaaaaccct acaattaaac acaaac 26

<210> 61

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

aaaacgcacc ccaacctctc cgc 23

<210> 62

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

atcgaaagta cgtaatcgtc ggt 23

<210> 63

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

acactcgaaa acgaaaaccc taca 24

<210> 64

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

aacgcacccc aacctctcc 19

<210> 65

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

aaaatcctcg ttctcgaata taca 24

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

tatttattcg gggagttgcg 20

<210> 67

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

aaactcaact ctcgtcccca cctcc 25

<210> 68

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

cctcgttctc gaatatacaa aa 22

<210> 69

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

ttattcgggg agttgcg 17

<210> 70

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

aaactcaact ctcgtcccca cctcc 25

<210> 71

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

aaaatcctcg ttctcgaata tacaaaa 27

<210> 72

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

ttttatttat tcggggagtt gcg 23

<210> 73

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

aaactcaact ctcgtcccca cctccca 27

<210> 74

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

tgttgttgat cgtttcgtag cg 22

<210> 75

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

tctatcccct cgaactccta cg 22

<210> 76

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

cgccacccgc cgaaaccc 18

<210> 77

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

gggttgttgt tgatcgtttc gtag 24

<210> 78

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 78

gatctatccc ctcgaactcc tacg 24

<210> 79

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 79

cgccgaaacc ctcctcccga aaccc 25

<210> 80

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 80

tgttgttgat cgtttcgtag cg 22

<210> 81

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 81

cgatctatcc cctcgaactc cta 23

<210> 82

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 82

ccgccacccg ccgaaaccc 19

<210> 83

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 83

aagttcgttt tcggttggaa gttg 24

<210> 84

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 84

aaacgattac ctacccaacg acca 24

<210> 85

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 85

cgcccgaata ctacgccgac gacca 25

<210> 86

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 86

aagttcgttt tcggttggaa gttg 24

<210> 87

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 87

aaacgattac ctacccaacg acca 24

<210> 88

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 88

cgcccgaata ctacgccgac gacca 25

<210> 89

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 89

tagcgttgta cggtgtacgt cg 22

<210> 90

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 90

acaaaacgat tacctaccca acg 23

<210> 91

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 91

cccgaatact acgccgacga ccaaa 25

<210> 92

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 92

ttaagtgaat aaagttaggc gtttacg 27

<210> 93

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 93

atccgaataa acaaatttcc ttatccg 27

<210> 94

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 94

aatcgcaaac gaaacgacca ttaactcgaa 30

<210> 95

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 95

aagtgaataa agttaggcgt ttacg 25

<210> 96

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 96

atccgaataa acaaatttcc ttatccg 27

<210> 97

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 97

aatcgcaaac gaaacgacca ttaactcgaa 30

<210> 98

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 98

gaataaagtt aggcgtttac gtgatt 26

<210> 99

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 99

atccgaataa acaaatttcc ttatccg 27

<210> 100

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 100

aatcgcaaac gaaacgacca ttaactcgaa 30

<210> 101

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 101

aatttacata aaactcctac gaaacga 27

<210> 102

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 102

cgttttgttt agcgttttaa taggttt 27

<210> 103

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 103

ccctccttac ctcgctctct ccgaaat 27

<210> 104

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 104

tttacataaa actcctacga aacgacc 27

<210> 105

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 105

gtttagcgtt ttaataggtt ttttagtcg 29

<210> 106

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 106

cctccttacc tcgctctctc cgaaatcaa 29

<210> 107

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 107

aaaatttaca taaaactcct acgaaacg 28

<210> 108

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 108

gcgttttgtt tagcgtttta atagg 25

<210> 109

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 109

ccctccttac ctcgctctct ccgaaat 27

<210> 110

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 110

gtagggtatg ttttcgttta gttcgg 26

<210> 111

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 111

cacaaccaac aaataatacc tatccg 26

<210> 112

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 112

cccgcaaccg acgcacaaaa cg 22

<210> 113

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 113

agggtatgtt ttcgtttagt tcgg 24

<210> 114

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 114

cacaaccaac aaataatacc tatccg 26

<210> 115

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 115

ccccgcaacc gacgcacaaa acga 24

<210> 116

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 116

gtagggtatg ttttcgttta gttcg 25

<210> 117

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 117

caaccaacaa ataataccta tccgaa 26

<210> 118

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 118

ccccgcaacc gacgcacaaa acga 24

<210> 119

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 119

acgtagttgt gtaggtcgag ggc 23

<210> 120

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 120

gcgaccgcta actccgcacc t 21

<210> 121

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 121

cgcactaccg acaccgcc 18

<210> 122

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 122

gtagttgtgt aggtcgaggg cg 22

<210> 123

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 123

gaccgctaac tccgcacctt 20

<210> 124

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 124

acgcgcacta ccgacaccgc c 21

<210> 125

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 125

cgtagttgtg taggtcgagg gc 22

<210> 126

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 126

accgctaact ccgcacctt 19

<210> 127

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 127

gcactaccga caccgccgcc 20

<210> 128

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 128

acgcgctctt ctctcgaaa 19

<210> 129

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 129

cgagtcgatt atagggtttg cg 22

<210> 130

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 130

taacccaacc cgcgcccgac 20

<210> 131

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 131

aaacgcgctc ttctctcgaa 20

<210> 132

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 132

cgagtcgatt atagggtttg c 21

<210> 133

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 133

ctaacccaac ccgcgcccga caa 23

<210> 134

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 134

caaacgcgct cttctctcga a 21

<210> 135

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 135

tcgtgtaggc ggcggtttt 19

<210> 136

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 136

ctaacccaac ccgcgcccga caaa 24

<210> 137

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 137

cgatcggttg aatagtttag tgattatttc 30

<210> 138

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 138

tcgcgactta cacaacacca cgataac 27

<210> 139

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 139

acccaccacc ccgaaaataa acatcacc 28

<210> 140

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 140

ggttgaatag tttagtgatt atttcg 26

<210> 141

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 141

tcgcgactta cacaacacca cgata 25

<210> 142

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 142

accaccccga aaataaacat cacc 24

<210> 143

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 143

cggttgaata gtttagtgat tatttcg 27

<210> 144

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 144

cgacttacac aacaccacga taac 24

<210> 145

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 145

tacccaccac cccgaaaata aacatcaccg 30

<210> 146

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 146

actcccgaaa tcaattcgtc cg 22

<210> 147

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 147

cgcgatttgt atagtattac gatggttatt a 31

<210> 148

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 148

aaaccccgac cgactaaaca acccaaaaac catccc 36

<210> 149

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 149

tcccgaaatc aattcgtccg 20

<210> 150

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 150

ttgcgcgatt tgtatagtat tacgatgg 28

<210> 151

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 151

cgaccgacta aacaacccaa aaaccatccc gacgat 36

<210> 152

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 152

ctcccgaaat caattcgtcc 20

<210> 153

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 153

cgatttgtat agtattacga tggttattag g 31

<210> 154

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 154

ccttaaaccc cgaccgacta aacaaccca 29

<210> 155

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 155

aatacttcat cgactaaacc accaa 25

<210> 156

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 156

gaatgaggaa ggagttgaag ttcg 24

<210> 157

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 157

taacgacgca cgccgcctac tccta 25

<210> 158

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 158

tacttcatcg actaaaccac caac 24

<210> 159

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 159

cgtatataag tacgttgtag aggacgg 27

<210> 160

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 160

taacgacgca cgccgcctac tcc 23

<210> 161

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 161

ctaatacttc atcgactaaa ccaccaa 27

<210> 162

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 162

gaatgaggaa ggagttgaag ttcg 24

<210> 163

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 163

taacgacgca cgccgcctac tccta 25

<210> 164

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 164

ttagttttgt cgcgttttag cg 22

<210> 165

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 165

ataaataaaa taaccatcta aatctcgacg 30

<210> 166

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 166

cgatacgacg aaaactccga cgacgc 26

<210> 167

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 167

ttttagtttt gtcgcgtttt agc 23

<210> 168

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 168

aaataaccat ctaaatctcg acgc 24

<210> 169

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 169

acgaaaactc cgacgacgcc gaa 23

<210> 170

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 170

attacctccc gaaaccaccc 20

<210> 171

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 171

gtaatgagta agatgattat ttggatttcg 30

<210> 172

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 172

ccaaccttac cgcgcctcaa cgact 25

<210> 173

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 173

aatccgactt cgcctctact taa 23

<210> 174

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 174

gtggatgtac gtgtggtttc g 21

<210> 175

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 175

aatctaacct tcgtcctcca tccctttcg 29

<210> 176

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 176

aattaatccg acttcgcctc tac 23

<210> 177

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 177

gtgtggatgt acgtgtggtt t 21

<210> 178

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 178

ttaatctaac cttcgtcctc catccctttc 30

<210> 179

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 179

tctacttaat tttaatctaa ccttcgtcct 30

<210> 180

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 180

atgtacgtgt ggtttcgttg g 21

<210> 181

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 181

cgcatcctct ttacgatctt tcaactccga 30

<210> 182

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 182

ttaaatcggt agcgaagtcg g 21

<210> 183

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 183

cgtctcgacc aaaacactaa aacta 25

<210> 184

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 184

atatctaaac cgctatccgc gaaatccgaa 30

<210> 185

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 185

agtttaaatc ggtagcgaag tc 22

<210> 186

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 186

ctcgaccaaa acactaaaac ta 22

<210> 187

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 187

atctaaaccg ctatccgcga aatccg 26

<210> 188

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 188

agtttaaatc ggtagcgaag tcg 23

<210> 189

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 189

gtctcgacca aaacactaaa actaaa 26

<210> 190

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 190

atatctaaac cgctatccgc gaaatccgaa 30

<210> 191

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 191

gtgatggagg aggtttagta agtt 24

<210> 192

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 192

ccaataaaac ctactcctcc cttaa 25

<210> 193

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 193

accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30

Claims

1.可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物组合为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.17所示序列，或为SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.17的完全互补序列。

2.可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物的组合为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.13、和SEQ ID NO.17所示序列，或为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.13、和SEQ ID NO.17的完全互补序列。

3.可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物的组合为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.13、和SEQ IDNO.17所示序列，或为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.13、和SEQ IDNO.17的完全互补序列。

4.可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物的组合为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.16、和SEQ ID NO.17所示序列，或为SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.16、和SEQ IDNO.17的完全互补序列。

5.可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物的组合为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.13 和SEQ ID NO.17所示序列；或为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.13 和SEQ ID NO.17所示序列的完全互补序列。

6.可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物的组合为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.13、和SEQ ID NO.17所示序列；或为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.13、和SEQ ID NO.17所示序列的完全互补序列。

7.可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物的组合为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示序列，或为SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17的完全互补序列。

8.可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物的组合为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.11, 和SEQ ID NO.13至SEQ ID NO.19所示序列；或为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.11, 和SEQ ID NO.13至SEQ ID NO.19所示序列所示序列的完全互补序列。

9.可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物的组合为SEQ ID NO.1至 SEQ ID NO.19所示序列；或为SEQ ID NO.1至 SEQID NO.19所示序列的完全互补序列。

10.可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物的组合为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4至SEQ ID NO.9, 和SEQID NO.11至SEQ ID NO.19所示序列；或为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4至SEQID NO.9, 和SEQ ID NO.11至-SEQ ID NO.19所示序列所示序列的完全互补序列。

11.可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物的组合为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.11, 和SEQ ID NO.14至SEQ ID NO.19所示序列；或为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.11, 和SEQ ID NO.14至SEQ ID NO.19所示序列所示序列的完全互补序列。

12.可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物的组合为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示序列，或为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17的完全互补序列。

13.可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物的组合为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、和SEQ IDNO.17所示序列，或为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、和SEQ IDNO.17的完全互补序列。

14.权利要求1-13任一项所述DNA甲基化分子标记物组合，和/或其检测相关试剂在制备检测肺结节良恶性、和/或肺癌的试剂盒中的应用。

15.根据权利要求14所述的应用，所述肺癌为早期肺癌。

16.一种用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测权利要求1~13任一项所述的DNA甲基化分子标记物组合的甲基化水平的试剂。

17.根据权利要求16所述的用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括采用 PCR扩增法、荧光定量PCR法、数字PCR法、液相芯片法、一代测序法、三代测序法、二代测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、简化亚硫酸氢盐测序技术或它们的组合所使用的试剂。

18.根据权利要求17所述的用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括针对DNA甲基化分子标记物的荧光定量PCR检测的引物和探针，所述引物和探针选自：

针对SEQ ID NO.1的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示引物，以及SEQ ID NO.22所示探针；SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示引物，以及SEQ IDNO.25所示探针；SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27所示引物，以及SEQ ID NO.28所示探针；

针对SEQ ID NO.2的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示引物，以及SEQ ID NO.31所示探针；SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33所示引物，以及SEQ IDNO.34所示探针；SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36所示引物，以及SEQ ID NO.37所示探针；

针对SEQ ID NO.3的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39所示引物，以及SEQ ID NO.40所示探针；SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示引物，以及SEQ IDNO.43所示探针；SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45所示引物，以及SEQ ID NO.46所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.4的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.47和SEQ IDNO.48所示引物，以及SEQ ID NO.49所示探针；SEQ ID NO.50和SEQ ID NO.51所示引物，以及SEQ ID NO.52所示探针；SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54所示引物，以及SEQ ID NO.55所示探针；

针对SEQ ID NO.5的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.56和SEQ ID NO.57所示引物，以及SEQ ID NO.58所示探针；EQ ID NO.59和SEQ ID NO.60所示引物，以及SEQ IDNO.61所示探针；SEQ ID NO.62和SEQ ID NO.63所示引物，以及SEQ ID NO.64所示探针；

针对SEQ ID NO.6的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.66所示引物，以及SEQ ID NO.67所示探针；SEQ ID NO.68和SEQ ID NO.69所示引物，以及SEQ IDNO.70所示探针；SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72所示引物，以及SEQ ID NO.73所示探针；

针对SEQ ID NO.7的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.74和SEQ ID NO.75所示引物，以及SEQ ID NO.76所示探针；SEQ ID NO.77和SEQ ID NO.78所示引物，以及SEQ IDNO.79所示探针；SEQ ID NO.80和SEQ ID NO.81所示引物，以及SEQ ID NO.82所示探针；

针对SEQ ID NO.8的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.83和SEQ ID NO.84所示引物，以及SEQ ID NO.85所示探针；SEQ ID NO.86和SEQ ID NO.87所示引物，以及SEQ IDNO.88所示探针；SEQ ID NO.89和SEQ ID NO.90所示引物，以及SEQ ID NO.91所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.9的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.92和SEQ IDNO.93所示引物，以及SEQ ID NO.94所示探针；SEQ ID NO.95和SEQ ID NO.96所示引物，以及SEQ ID NO.97所示探针；SEQ ID NO.98和SEQ ID NO.99所示引物，以及SEQ ID NO.100所示探针；

针对SEQ ID NO.10的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.101和SEQ ID NO.102所示引物，以及SEQ ID NO.103所示探针；SEQ ID NO.104和SEQ ID NO.105所示引物，以及SEQ ID NO.106所示探针；SEQ ID NO.107和SEQ ID NO.108所示引物，以及SEQ ID NO.109所示探针；

针对SEQ ID NO.11的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.110和SEQ ID NO.111所示引物，以及SEQ ID NO.112所示探针；SEQ ID NO.113和SEQ ID NO.114所示引物，以及SEQ ID NO.115所示探针；SEQ ID NO.116和SEQ ID NO.117所示引物，以及SEQ ID NO.118所示探针；

针对SEQ ID NO.12的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.119和SEQ ID NO.120所示引物，以及SEQ ID NO.121所示探针；SEQ ID NO.122和SEQ ID NO.123所示引物，以及SEQ ID NO.124所示探针；SEQ ID NO.125和SEQ ID NO.126所示引物，以及SEQ ID NO.127所示探针；

针对SEQ ID NO.13的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.128和SEQ ID NO.129所示引物，以及SEQ ID NO.130所示探针；SEQ ID NO.131和SEQ ID NO.132所示引物，以及SEQ ID NO.133所示探针；SEQ ID NO.134和SEQ ID NO.135所示引物，以及SEQ ID NO.136所示探针；

针对SEQ ID NO.14的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.137和SEQ ID NO.138所示引物，以及SEQ ID NO.139所示探针；SEQ ID NO.140和SEQ ID NO.141所示引物，以及SEQ ID NO.142所示探针；SEQ ID NO.143和SEQ ID NO.144所示引物，以及SEQ ID NO.145所示探针；

针对SEQ ID NO.15的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.146和SEQ ID NO.147所示引物，以及SEQ IDNO.148所示探针；SEQ ID NO.149和SEQ ID NO.150所示引物，以及SEQ ID NO.151所示探针；SEQ ID NO.152和SEQ ID NO.153所示引物，以及SEQ ID NO. 154所示探针；

针对SEQ ID NO.16的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.155和SEQ ID NO.156所示引物，以及SEQ ID NO. 157所示探针；SEQ ID NO.158和SEQ ID NO.159所示引物，以及SEQ ID NO.160所示探针；SEQ ID NO.161和SEQ ID NO.162所示引物，以及SEQ ID NO. 163所示探针；

针对SEQ ID NO.17的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.164和SEQ ID NO.165所示引物，以及SEQ ID NO.166所示探针；SEQ ID NO.167和SEQ ID NO.168所示引物，以及SEQ ID NO.169所示探针；SEQ ID NO.170和SEQ ID NO.171所示引物，以及SEQ ID NO.172所示探针；

针对SEQ ID NO.18的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.173和SEQ ID NO.174所示引物，以及SEQ ID NO.175所示探针；SEQ ID NO.176和SEQ ID NO.177所示引物，以及SEQ ID NO.178所示探针；SEQ ID NO.179和SEQ ID NO.180所示引物，以及SEQ ID NO.181所示探针；

针对SEQ ID NO.19的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.182和SEQ ID NO.183所示引物，以及SEQ ID NO.184所示探针；SEQ ID NO.185和SEQ ID NO.186所示引物，以及SEQ ID NO.187所示探针；SEQ ID NO.188和SEQ ID NO.189所示引物，以及SEQ ID NO.190所示探针。

19.根据权利要求18所述的用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述引物和探针选自如下：

针对SEQ ID NO.1的引物和探针为：SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示引物，以及SEQID NO.25所示探针；

针对SEQ ID NO.2的引物和探针为：SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36所示引物，以及SEQID NO.37所示探针；

针对SEQ ID NO.3的引物和探针为：SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39所示引物，以及SEQID NO.40所示探针；

针对SEQ ID NO.4的引物和探针为：SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48所示引物，以及SEQID NO.49所示探针；

针对SEQ ID NO.5的引物和探针为：SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60所示引物，以及SEQID NO.61所示探针；

针对SEQ ID NO.6的引物和探针为：SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72所示引物，以及SEQID NO.73所示探针；

针对SEQ ID NO.7的引物和探针为：SEQ ID NO.80和SEQ ID NO.81所示引物，以及SEQID NO.82所示探针；

针对SEQ ID NO.8的引物和探针为：SEQ ID NO.89和SEQ ID NO.90所示引物，以及SEQID NO.91所示探针；

针对SEQ ID NO.9的引物和探针为：SEQ ID NO.92和SEQ ID NO.93所示引物，以及SEQID NO.94所示探针；

针对SEQ ID NO.10的引物和探针为：SEQ ID NO.104和SEQ ID NO.105所示引物，以及SEQ ID NO.106所示探针；

针对SEQ ID NO.11的引物和探针为：SEQ ID NO.110和SEQ ID NO.111所示引物，以及SEQ ID NO.112所示探针；

针对SEQ ID NO.12的引物和探针为：SEQ ID NO.125和SEQ ID NO.126所示引物，以及SEQ ID NO.127所示探针；

针对SEQ ID NO.13的引物和探针为：SEQ ID NO.128和SEQ ID NO.129所示引物，以及SEQ ID NO.130所示探针；

针对SEQ ID NO.14的引物和探针为：SEQ ID NO.143和SEQ ID NO.144所示引物，以及SEQ ID NO.145所示探针；

针对SEQ ID NO.15的引物和探针为：SEQ ID NO.152和SEQ ID NO.153所示引物，以及SEQ ID NO.154所示探针；

针对SEQ ID NO.16的引物和探针为：SEQ ID NO.158和SEQ ID NO.159所示引物，以及SEQ ID NO.160所示探针；

针对SEQ ID NO.17的引物和探针为：SEQ ID NO.167和SEQ ID NO.168所示引物，以及SEQ ID NO.169所示探针；

针对SEQ ID NO.18的引物和探针为：SEQ ID NO.179和SEQ ID NO.180所示引物，以及SEQ ID NO.181所示探针；

针对SEQ ID NO.19的引物和探针为：SEQ ID NO.188和SEQ ID NO.189所示引物，以及SEQ ID NO.190所示探针。

20.根据权利要求18所述的用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含针对内参基因ACTB的荧光定量PCR检测的引物和探针。

21.根据权利要求20所述的用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述针对内参基因ACTB的引物和探针为：SEQ ID NO.191和SEQ ID NO.192所示引物，以及SEQ IDNO.193所示探针。

22.根据权利要求16-21任一项所述的用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样本为呼吸道样本。

23.根据权利要求22所述的用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述呼吸道样本为肺部组织样本，或呼吸道液体样本。