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Die Erfindung bezieht sich auf die Charakterisierung von Proben, die sich zu vielen Hunderten bis Zehntausenden in einem regelmäßigen Array auf einer Probenträgerplatte befinden, durch präzise positionierte Messungen, wie sie beispielsweise durch einen eng fokussierten Laserstrahl bei matrixunterstützter Laserdesorption (MALDI) in einem Massenspektrometer möglich sind.
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Durch die mechanischen Toleranzen in der Halterung der Probenträger kann die Position des Probenmusters bei einem Wechsel der Probenträger vom Laborautomaten, der die Proben des Arrays erzeugt und aufbringt, zum charakterisierenden Messinstrument nicht genügend genau reproduziert werden. Bei vielen Präparationsverfahren lassen sich die Probenpositionen optisch nicht erkennen. Zur vollständigen Ausnutzung der teilweise winzigen Proben, die durchaus sehr kleine Durchmesser zwischen 10 und 50 Mikrometer haben können, ist es aber notwendig, dass die Positionen aller Proben im Messinstrument möglichst auf etwa ein bis zwei Mikrometer genau bekannt sind. In der Erfindung wird nun vorgeschlagen, die Position und die Orientierung des Probenarrays, und damit die Position jeder Probe, im Messinstrument durch Vermessung von mindestens zwei fein strukturierten internen Erkennungsmustern aus leicht zu detektierendem Probenmaterial, beispielsweise feinen Kreuzen, festzustellen. Die Erkennungsmuster werden bevorzugt im Zuge der Probenerzeugung mit derselben Apparatur aufgebracht, die auch das Probenarray erzeugt. Für eine massenspektrometrische Charakterisierung, die hier bevorzugt behandelt wird, ist nach Möglichkeit ein Massenspektrometer einzusetzen, in dem sich ionisierende Strahlen oder Laserspots mit Durchmessern von wenigen Mikrometern erzeugen lassen, die möglichst auf ein Mikrometer genau positioniert werden können.
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Stand der Technik
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Zurzeit leben Verfahren der kombinatorischen Chemie mit Tausenden von synthetisierten Proben wieder auf, insbesondere zur Untersuchung von Reaktionen von biopolymeren Proben mit Antikörpern, mit aufbauenden oder abbauenden Enzymen, oder mit oxidierenden oder reduzierenden Chemikalien. So können beispielsweise auf Probenträgern in der Größe von mikroskopischen Objektträgern mit fotochemischen Verfahren 100 000 voneinander verschiedene, fest haftende Peptide aufgebaut werden, die alle menschlichen Proteinsequenzen abdecken und die dann beispielsweise gemeinsamen Reaktionen mit einer speziell ausgewählten Phosphorylase unterworfen werden, um zu sehen, an welchen Stellen der Gesamtsequenz des humanen Proteoms dieses Enzym seine Wirkung entfaltet. Alternativ könnten derlei Peptid-Arrays z.B. mit Serum oder Plasma in Kontakt gebracht werden, um festzustellen, an welchen Peptiden Blutbestandteile spezifisch binden. Die daraus gewonnenen Erkenntnisse könnten beispielsweise zum Screening auf Autoantikörper genutzt werden.
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Fragestellungen dieser Art sind höchst aufschlussreich für die biochemische Forschung, insbesondere auch für die Pharmaforschung. Die Lösungen dieser Fragestellungen bedürfen aber eines analytischen Verfahrens, das zumindest eindeutig anzeigen kann, welche Proben auf dem Probenträger reaktiv verändert sind. Günstiger noch ist ein analytisches Verfahren, das Art und Stellung der reaktiven Veränderung innerhalb der Probenmoleküle anzeigen kann.
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Die Mikroskopie ist nur in geringem Umfang einsetzbar, beispielsweise wenn Reaktionen mit Farbumschlägen oder Fluoreszenzänderungen einhergehen. Verfahren der Oberflächen-Plasmonenresonanz (SPR), besonders die bildgebende SPR, können eingesetzt werden, haben aber Beschränkungen in der Größe der Proben. Aber auch völlig andere Verfahren, wie beispielsweise Mikro-Raman-, Infrarot- oder UV-Spektrometrie, können zur Bestimmung besonderer Arten von Reaktionen eingesetzt werden.
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Das günstigste Verfahren für die Charakterisierung der Proben mit Hochdurchsatz bietet jedoch die Massenspektrometrie. J. H. Lee et al. konnten bereits zeigen, dass sie 5000 Proben auf einem Objektträger mit einer belegten Fläche von 23 mal 54 Millimetern korrekt analysieren konnten (High-Throughput Small Molecule Identification Using MALDI-TOF and a Nanolayered Substrate; Analytical Chemisty, 2011, pubs.acs.org/ac). Die Autoren entwickelten ein Verfahren, mit dem einzeln mit Matrix belegte Probenflächen von jeweils 300 Mikrometer Durchmesser (bei 500 Mikrometer Rasterabstand in einem quadratischen Array) erzeugt werden konnten. Die Positionierung des Arrays im Massenspektrometer konnte anhand der eingebauten Kamera und zur Absicherung mit Hilfe von 36 gleich großen Probenflecken mit Referenzsubstanzen innerhalb des Arrays festgestellt werden.
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Dieses Verfahren stößt an seine Grenzen, wenn die Dichte der Proben wesentlich erhöht werden soll. Vor allem dann, wenn die Proben in monoatomaren Schichten auf dem Probenträger synthetisiert werden, lassen sie sich nicht mehr optisch erkennen. Hinzu kommt, dass zumindest für eine Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption die Proben nachträglich mit Matrixsubstanz versehen werden müssen und sich eine homogene Überschichtung kaum umgehen lässt. Die in die Massenspektrometer eingebaute Videokamera kann also für die Feststellung der Position des Probenarrays nicht mehr verwendet werden, die Positionen der Proben müssen mit anderen Mitteln festgestellt werden. Das gilt nicht nur für massenspektrometrische, sondern auch für andersartige Messverfahren.
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Die Veröffentlichung
US 2004/0217276 A1 beschreibt eine Probenplatte für die massenspektrometrische Analyse einer Probe, umfassend ein Substrat mit einer elektrisch leitenden Oberfläche, auf das eine Maske appliziert wird. Die Maske wird auf dem Substrat mit einer rauen Oberfläche appliziert, um wenigstens eine Probenstelle zu bilden. Die Probenstelle umfasst einen zentralen Abschnitt, der aus der elektrisch leitenden Oberfläche gebildet wird, und einen aus der Maske gebildeten Randabschnitt, wo der Randbereich hydrophober als der zentrale Abschnitt ist.
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Die Veröffentlichung
US 2004/0217278 A1 offenbart Verfahren zum Festlegen des Layouts einer MALDI-Probenplatte. Es wird eine Datei mit Probenplatte-Layout-Parametern erstellt, die das Layout einer MALDI-Probenplatte beschreiben, und vor der Platzierung der MALDI-Probenplatte in eine MALDI-Ionenquelle auf einem computerlesbaren Medium gespeichert. Die Datei enthält Informationen über die Größe oder die Form der Probenplatte, oder Informationen über die Größe, Form oder Position einer Probe auf der Probenplatte. Die MALDI-Probenplatte wird in eine MALDI-Ionenquelle gesteckt, und die gespeicherte Layoutdatei für die Probenplatte wird abgerufen und verwendet, um einen Bereich der Probenplatte einem Laserstrahl auszusetzen.
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Aufgabe der Erfindung
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Es ist die Aufgabe der Erfindung, Geräte und Verfahren bereitzustellen, mit denen Position und Orientierung eines Probenarrays, das sich optisch nicht erkennen lässt, in einem Analyseninstrument auf einem Probenträger, dessen Position nicht genügend genau bekannt ist, auf wenige Mikrometer genau festgestellt werden können, damit jede Probenfläche möglichst vollständig für eine Charakterisierung der Proben genutzt werden kann, insbesondere für eine massenspektrometrische Charakterisierung mit kleinflächiger Abtastung.
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Beschreibung der Erfindung
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Für hohe Probendichten von Hunderten bis Hundertausenden von Proben mit Durchmessern bis herunter zu zehn Mikrometern lassen sich, wenn überhaupt, nur mit hohem Aufwand Strukturen entwickeln, in denen die Proben wie bei J. H. Lee et al. einzeln so präpariert sind, dass sie sich, beispielsweise durch erkennbare Zwischenräume zwischen den Proben, durch eine Kamera erkennen lassen und so die Position des Probenarrays über das optische Kamerabild in der Ionenquelle des Massenspektrometers wiedergeben. Insbesondere bei „self-assembled monolayers (SAM)“ können die monomolekularen Schichten der Proben nicht optisch erkannt werden und jede homogene Präparation hinterlässt ebenfalls ein unsichtbares Array von Proben. Nach Entnahme des Probenträgers aus der Apparatur der Probenerzeugung, und der Einführung in das Analyseninstrument (oft durch Vakuumschleusen hindurch) ist die Position der Proben des Probenarrays durch die mechanischen Toleranzen der Halterungen für die Probenträger nur auf einige Zehntel Millimeter genau bekannt.
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Diese Ungenauigkeiten der Positionierung der Probenträger sowohl in der Apparatur, die das Probenarray erzeugt (Pipettier-Roboter, Piezo-Dispenser, Fotolithographischer Peptid-Synthesizer) wie auch im Analyseninstrument, beispielsweise in der Ionenquelle des Massenspektrometers, verhindern bei hohen Probendichten und kleinen, unsichtbaren Probenflächen das sichere Auffinden der einzelnen Probenpositionen und die vollständige Ausnutzung der Probenfläche, beispielsweise durch Abrastern mit einem MALDI-Laser.
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In der Erfindung wird daher vorgeschlagen, in der Apparatur der Probenerzeugung innerhalb oder außerhalb des Feldes mit dem Probenarray mindestens zwei, vorzugsweise drei (oder mehr) interne Referenzmuster aus einem Material aufzubringen, das dem Probenmaterial ähnelt. Die internen Referenzmuster sollen mit hoher Empfindlichkeit im Analyseninstrument in ähnlicher Weise wie die Proben detektiert werden können und sollten eine Größe haben, die mehrfach größer ist als die Positionierungenauigkeit, also etwa 0.5 bis 5 Millimeter, vorzugsweise 1 bis 2 Millimeter. Die Referenzmuster sollen so geformt sein, dass sie einfach aufgefunden und vermessen werden können; beispielsweise durch je einen horizontalen und einen vertikalen Messrasterstrich oder auch durch flächenhaftes Abrastern.
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Die Referenzmuster können beispielsweise Kreuze aus zwei feinen, linienförmigen Probenaufträgen von etwa 2 bis 20 Mikrometer Strichstärke und zwei Millimeter Länge sein. Durch einen oder mehrere horizontale und vertikale Rasterstriche mit einem Laserspot von nur fünf Mikrometer Durchmesser lässt sich die Position des Kreuzes auf etwa zwei Mikrometer genau bestimmen. Die Vermessung eines zweiten Kreuzes ergibt die Lage und Verdrehung des Probenmusters, die Vermessung eines dritten Kreuzes ergibt eine mögliche Verzerrung des Arrays zu einem Parallelogramm. Kompliziertere Referenzmuster wie zum Beispiel konzentrische Quadrate oder Mehrfach-Linien können die Genauigkeit der Positionsfindung noch erhöhen.
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Abbildungen
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gibt einen üblichen QR-Code wieder.
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zeigt einen Objektträger (10) mit einem Probenarray (12) und drei Erkennungsmustern (11) in Form einfacher Kreuze auf der gleichen Seite des Probenarrays. In diesem Beispiel befinden sich die Erkennungsmuster (11) am Rand des Trägers (10). Eine mittige, von dem Array (12) eingeschlossene Anordnung zumindest von einigen der Muster (11) wäre aber auch denkbar.
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bildet schematisch drei Erkennungsmuster ab: ein einfaches Kreuz aus zwei Probenstrichen (20) und (21); ein Kreuz aus jeweils fünf nebeneinander liegenden Probenstrichen (22) und (23); und ein Kreuz aus jeweils neun Probenstrichen (24) und (25), mit eingezeichneter Bahn (26), längs der die Messungen stattfinden.
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zeigt das Abrastern eines Probenstrichs (30) von fünf Mikrometer Breite in dazu senkrechter Rasterrichtung (31 bis 35), wobei jeweils seitlich versetzte Gruppen (1, 2, 3, ...) zu je drei Laserspots von jeweils fünf Mikrometer Durchmesser um jeweils einen Mikrometer in Vorwärtsrichtung verschoben werden, um jeweils neues Probenmaterial ohne Überlappung mit verbrauchten Flächen messen zu können. Jede Gruppe (1, 2, 3, ...) führt zu einem eigenen Summenspektrum, das durch Aufaddieren mehrerer Einzelaufnahmen erhalten wird.
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Ausführungsformen
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Es ist heute technisch möglich, auf vergoldeten Glasoberflächen schwefelhaltige Verbindungen wie Thiole, Thioäther und andere über Schwefel-Gold Interaktion in selbststrukturierender Weise monomolekulare Lagen von Molekülen anzubinden (SAM). Diese Moleküle können Reaktionszentren tragen, an denen man durch gezielte Laserbestrahlung definiert kleiner Flächen fotochemisch weitere Moleküle an die Moleküle der bestrahlten Flächen kovalent binden kann. An diese Moleküle kann man bei geeigneter Konfiguration der kovalent gebundenen Moleküle wieder fotochemisch beliebige andere Moleküle kovalent binden. Man kann auf diese Weise Probenarrays erzeugen, die auf einem Objektträger 100 000 kleine Probenflächen enthalten, die mit jeweils unterschiedlichen Peptiden gleicher Länge von beispielsweise je 20 Aminosäuren bedeckt sind. Die Peptide können beispielsweise alle Peptidketten entsprechender Länge des menschlichen Proteoms darstellen und dabei auch noch mit ihren Sequenzen überlappen.
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Grundsätzlich kann solch ein Array auf zwei verschiedene Arten genutzt werden: als Modifikations-Array und als Interaktions-Array. Die Peptide kann man gezielt mit Reaktanten wie zum Beispiel Enzymen oder Chemikalien umsetzen (Modifikations-Array) oder man kann Liganden an sie binden lassen (Interaktions-Array), um festzustellen, welche Reaktanten mit welchen Peptidsequenzen an welchen Stellen reagieren oder welche Liganden an welchen Peptidketten binden.
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Die Verfahren zur Präparation und Messung der Modifikationen oder der Interaktionen hängen stark von dem verwendeten Analysenverfahren ab. Es werde hier für die weitere Beschreibung ein massenspektrometrisches Analysenverfahren angenommen.
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Beim Modifikations-Array werden alle Analytmoleküle der Proben durch kovalente, ionische oder andere nicht-kovalente Bindungen reversibel an die Oberfläche gebunden. Die Analytmoleküle der Proben werden nach ihrer Erzeugung gemeinsam Testlösungen mit chemischer oder enzymatischer Aktivität („Reaktanten“) ausgesetzt, die die Struktur der Analytmoleküle potentiell verändern können. Um die Strukturveränderungen messen zu können, werden zunächst die Bindungen zwischen Probenträgeroberfläche und den Analytmolekülen aufgelöst (oder zwischen der monomolekularen Grundbedeckung und den Analytmolekülen), beispielsweise durch saure oder basische Reaktion mit TFA oder NH3, durch enzymatische Spaltung oder durch fotochemische Dissoziation. Eine lösungsfreie Spaltung durch reaktive Gase wie NH3 oder TFA oder Photochemie ist hierbei zu bevorzugen, da so die Diffusion der vom Array losgelösten Analytmoleküle verhindert und damit die erzielbare Ortsauflösung möglichst groß wird. Danach werden die Proben für die Ionisierung vorbereitet. Im Falle einer Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) wird dazu eine Matrixsubstanz aufgetragen. Bei hohen Arraydichten wird hier ein flächendeckendes Matrixdepositionsverfahren wie zum Beispiel ein Sprühverfahren gewählt, da die einzelnen Arraypositionen nicht mehr präzise durch die Matrixlösung überdeckt werden können. Dies ist ein weiterer Grund, warum die einzelnen Arraypositionen in typischer Weise in der Kamera der Ionenquelle des Massenspektrometers nicht mehr sichtbar sind. Nach dieser Probenpräparation können die freien Analytmoleküle ortsaufgelöst vermessen werden.
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Beim Interaktions-Array werden alle Analytmoleküle durch kovalente, ionische oder andere nicht-kovalente Bindungen irreversibel an die Oberfläche gebunden. Die Zugabe von Testlösungen mit potentiellen Bindungspartnern („Liganden“) bewirkt, dass die Liganden spezifisch an die Analytmoleküle einiger der im Array verteilten Proben reversibel binden. Die Liganden können beispielsweise Antikörper, andere bindende Proteine, Glykane, DNA oder Haptene sein. Nach Entfernung aller nicht-spezifisch gebundenen Testmoleküle durch Waschschritte wird das Array mit MALDI-Matrix bedeckt und es werden spezifisch nur die Liganden massenspektrometrisch detektiert.
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Im Falle dieses Interaktions-Arrays werden die Referenzmarken für die Positionsanalyse bevorzugt so gestaltet, dass bekannte Liganden für die Referenzsubstanzen existieren, die eine ähnliche Natur wie die erwarteten Liganden in dem array-basierten Test haben. Die Liganden für die Referenzmarken können dabei entweder natürlicherweise in den Testlösungen vorliegen oder extra hinzugefügt werden, um die Positionsanalyse durchzuführen.
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Die Probenträger, beispielsweise gläserne Objektträger für die Mikroskopie, werden innerhalb der Apparatur zur Probenerzeugung in einem Probenhalter fixiert. Dabei treten mechanische Positionsungenauigkeiten auf. Die Einführung der Probenträger in das Vakuumsystem eines Massenspektrometers bringt weitere Positionsunsicherheiten mit sich, so dass die Positionen der Probenarrays innerhalb des Massenspektrometers durch diese mechanischen Toleranzen nur auf einige Zehntel Millimeter genau bekannt sind.
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Moderne MALDI-Flugzeitmassenspektrometer sind mit Kameras ausgerüstet, die ein stark vergrößertes Bild der Probenfläche liefern und auf einem Bildschirm anzeigen, sofern die Proben einen genügend starken optischen Kontrast liefern – dies ist bei vielen Probenarrays aber nicht der Fall. Könnte man die Proben jeweils einzeln mit einer homogenen Schicht aus Matrixmaterial überziehen, so könnte man die Belegung mit der MALDI-Matrixsubstanz als Indiz für die Probenposition heranziehen. Nun lassen sich aber für hohe Probendichten von 50 000 bis 100 000 Proben und mehr mit Durchmessern von 10 bis 50 Mikrometern keine Belegungsverfahren mehr entwickeln, mit denen die Proben einzeln gleichmäßig und homogen mit Matrixsubstanz bedeckt werden. Da die Verfahren für das Aufbringen der Matrixsubstanz jede Probenfläche möglichst homogen überdecken sollen, ist nicht zu verhindern, dass auch die Zwischenräume homogen überdeckt werden. Dadurch bleiben aber die Proben unsichtbar und können nicht durch die Kamera in der Ionenquelle lokalisiert werden. In einer Variante kann die Position anderweitig, beispielsweise massenspektrometrisch, festgestellt werden.
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Die grundlegende Idee des Verfahrens liegt nun darin, dass in dem Apparat, der das Probenarray erzeugt, nicht nur die Probensubstanzen auf den Probenträger aufgebracht werden, sondern auch Referenzsubstanzmuster für die Positionsbestimmung des Arrays aus Probensubstanzen. Die Referenzsubstanz ist dabei so zu wählen, dass sie sich mit hoher Empfindlichkeit und hoher Positionsgenauigkeit messen lässt. Dies gestattet es, in dem verwendeten Analysenapparat, beispielsweise einem MALDI-TOF Massenspektrometer, unter identischen Präparations- und Messbedingungen zuerst die Referenzmuster zu vermessen und so eine Positionskalibrierung vorzunehmen. Die Referenzmuster sind somit genau lokalisierbare „Interne Positionsstandards“, die die Probleme lösen, die mit den äußeren Positionierungsungenauigkeiten zwischen Erzeugung und Analyse eines Probenarrays verbunden sind.
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Es wird daher vorgeschlagen, in der Apparatur der Probenerzeugung innerhalb oder außerhalb des Probenarrays mindestens zwei, vorzugsweise drei (oder mehr) interne Referenzmuster aufzubringen, die zur Positionsbestimmung geeignet sind. zeigt einen Objektträger (10) mit Probenarray (12) und drei Erkennungsmustern (11). Diese gehören vorzugsweise der gleichen Substanzklasse an wie die Analyseproben, da sie so in einem einzigen Array-Schreibschritt erzeugt werden können. Vorzugsweise sollen sie aus einer leicht zu detektierenden Substanz bestehen oder sich in eine leicht zu detektierende Substanz umwandeln lassen. Die internen Referenzmuster sollen eine solche Größe haben und so geformt sein, dass sie einfach aufgefunden und vermessen werden können; beispielsweise durch je einen horizontalen und einen vertikalen Messrasterstrich einer Länge, die größer ist als die Positionierungsungenauigkeit oder auch durch flächenhaftes Abrastern eines Musters, das als Ganzes zur Bestimmung der Position der Referenzfläche genutzt werden kann.
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Die Referenzfiguren können beispielsweise, wie in den und 3 zu sehen, Kreuze aus zwei oder mehr feinen, gekreuzten, linienförmigen Probenaufträgen von etwa zwei bis zehn Mikrometer Strichstärke und 300 bis 3000 Mikrometer Länge sein, vorzugsweise etwa fünf Mikrometer breit und ein bis zwei Millimeter lang. zeigt links ein einfaches Kreuz als Erkennungsmuster; in der Mitte besteht das Kreuz aus jeweils fünf parallelen Strichen, und rechts aus jeweils neun Strichen. Durch horizontale und vertikale Rasterstriche (26) mit einem Laserspot von etwa fünf Mikrometer Durchmesser lässt sich die Position des Kreuzes auf etwa ein Mikrometer genau bestimmen, wenn bestimmte Vorsichtsmaßnahmen eingehalten werden. Die Vermessung eines zweiten Kreuzes mit seiner im Array definierten Position ergibt die Lage und die Verdrehung des Probenarrays, die Vermessung eines dritten Kreuzes ergibt eine mögliche Verzerrung des Arrays zu einem Parallelogramm. Ein viertes Kreuz könnte sogar perspektivische Verzerrungen feststellen, wie sie bei fotolithographischen Syntheseprotokollen auftreten können.
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Für die Vermessung sollte der Laserspot immer um etwa einen Mikrometer vorwärts bewegt werden. Dadurch trifft aber der nächste Laserspot auf eine Fläche, die schon teilweise aufgebraucht ist, wodurch bei aufeinanderfolgenden Laserspots nicht mehr der wahre Anstieg der Messintensitäten gefunden wird. Um diese Verzerrung der Ergebnisse durch den Verbrauch der Probe unter überlappenden Laserspots zu vermeiden, sind die aufeinanderfolgenden Laserspots, wie in gezeigt, jeweils so weit seitlich zu versetzen, dass sie sich nicht mehr überlappen und jeweils auf frisches Probenmaterial stoßen. Auf diese Weise ist die erzielbare Positionsgenauigkeit höher als die Strichbreite der Referenzlinie oder der Durchmesser des Laserspots.
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Bei allen MALDI-Analysen ist es üblich, zur Verbesserung des Verhältnisses von Signal zu Rauschen möglichst mehrere Massenspektren pro Messpunkt aufzunehmen und zu einem Summenspektrum zu addieren. Wird dabei die Probe erschöpft, was bereits nach zwei bis drei Laserschüssen auf dieselbe Stelle der Fall sein kann, werden bevorzugt auch hier für jedes Summenspektrum ein oder mehrere seitwärts liegende Probenpunkte mit frischem Probenmaterial hinzugezogen. zeigt dieses Rasterverfahren mit Gruppen zu je drei Laserspots für jeweils ein Summenspektrum, und einem Fortschreiten des Rasterns um jeweils ein Mikrometer. Die Rasterbreite beträgt in diesem Fall etwa 75 Mikrometer, ergibt also immer noch einen dünnen Rasterstrich. Wird jeder Rasterpunkt dreimal mit einem Laserspot bestrahlt, so stehen jeweils neun Einzelspektren für ein Summenspektrum zur Verfügung.
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Kompliziertere Muster der Referenzmusterfiguren können die Genauigkeit der Positionsfindung noch erhöhen. So kann das Kreuz beispielsweise aus jeweils mehreren feinen Strichen bestehen, beispielsweise, wie in rechts gezeigt, aus jeweils neun Probenstrichen zu je fünf Mikrometer Breite und ebensolchen Abständen voneinander. Der vermutete (hier unbelegte) Mittelpunkt des Kreuzes, der in der Regel auf etwa 0,3 Millimeter genau bekannt ist, kann dann beispielsweise in Form eines kleinen Quadrates (26) von etwa einem Millimeter Kantenlänge umfahren werden. Die Auswertung der Massensignale, deren Intensitäten in etwa einer Sinuskurve folgen, ergibt dann eine Genauigkeit für die Positionsbestimmung des Kreuzes von besser als einem Mikrometer.
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Es können die Referenzmuster für die Positionsbestimmungen auch ähnlich geformt sein wie die Referenzmuster der aus dem Stand der Technik für optische Anwendungen bekannten QR-Codes ( ) und dann entweder in Linien oder als gesamte Fläche abgerastert werden.
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Für dieses Verfahren ist es günstig, ein Massenspektrometer zu verwenden, das mit einer hohen Laserschussrate ausgerüstet ist, beispielsweise mit einem 10-kHz-Laser und entsprechender Elektronik für Ionenführung und Spektrenaufnahme. Außerdem ist es günstig, wenn im Massenspektrometer für das Rasterverfahren nicht nur der Probenträger bewegt wird, sondern auch mit einer Laserspotführung gearbeitet werden kann. Die Kombination von Probenträgerbewegung und Laserspotführung erlaubt es, das Rastern eines Quadrates mit einem Millimeter Seitenlänge um das vermutete Zentrum des Kreuzes herum, das bei zehn Einzelspektren pro Summenspektrum insgesamt 40 000 Laserschüsse erfordert, in nur vier Sekunden durchzuführen. Auf diese Weise ist es möglich, in nur 12 Sekunden die Position des Probenarrays auf besser als einen Mikrometer genau zu bestimmen.
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Nach der Feststellung der genauen Position der Proben kann mit ihrer massenspektrometrischen Charakterisierung begonnen werden, die wie oben ausgeführt, in einer Vermessung der modifizierten Analytmoleküle oder der Interaktions-Liganden besteht. Durch die genaue Kenntnis der Probenpositionen stehen jeweils alle Probenmoleküle für die Analyse zur Verfügung. Es können die Flächen der Proben jeweils soweit abgerastert werden, wie es für die Messung erforderlich ist.
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Das Verfahren der Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) zeigt in der Regel nur die Molekül-Ionen. Bei enzymatischen Spaltungsreaktionen ist dadurch auch bereits die Stelle der Spaltung zu erkennen. Bei additiven Reaktionen, beispielsweise einer Phosphorylierung, wird zwar angezeigt, welche der Proben reagiert haben, aber die Reaktionsposition ist nicht zu erkennen. Um auch die Position der Reaktion zu erkennen, ist das Analytmolekülion zu fragmentieren, und es ist ein Tochterionenspektrum aufzunehmen. Mit den sehr kleinen Probemengen ist das sehr schwierig: es ist ein außerordentlich hoher Ionisierungs-, Fragmentierungs- und Ausnutzungsgrad der Probe notwendig, um auch MS/MS durchführen zu können. Bei etwas größeren Probenflecken von etwa 30 mal 30 Quadratmikrometern mag das aber noch gelingen, aber vor allem nur dadurch, dass die Position der Proben sehr genau bekannt ist.
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Das Verfahren der internen Referenzmuster kann auf weitere Bildgebungsverfahren erweitert werden, sodass mehrdimensionale Information mit den massenspektrometrisch ausgelesenen Arraydaten verknüpft werden kann. So ist beispielsweise ein Verfahren interessant, bei dem die Bindung unbekannter Liganden an ein Array mittels bildgebender SPR (SPR-Imaging, SPRi) zunächst in einem bildgebenden Verfahren kinetisch und quantitativ bestimmt wird. Dabei werden die Arraypositionen bestimmt, an denen jeweils die Bindung eines Liganden stattgefunden hat. Die massenspektrometrische Analyse des Arrays kann sich daher in einem intelligenten Workflow auf lediglich diese Positionen beschränken, die allerdings vorzugsweise mit der gleichen Genauigkeit ausgelesen werden. Molekulargewichte der Liganden und Bindungskenndaten können in solch einem bimodalen Datensatz dann miteinander verknüpft werden, da auch im SPR-Bild die Referenzpunkte sichtbar und zur Positionsbestimmung herangezogen werden können.
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Bei der multimodalen Analyse der Arrays können außerdem die direkt bildgebenden Verfahren wie IR, Ramanspektroskopie oder SPR auch dazu verwendet werden, Abweichungen einzelner Arraypunkte von der Idealgeometrie des Arrays festzustellen und spotspezifische Korrekturvektoren zu bestimmen. Diese können dann nach der Ortsbestimmung der Referenzpunkte angewandt werden um selbst spotspezifische Positionsabweichungen zusätzlich zu korrigieren.
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Das Verfahren kann erweitert werden, indem die an Arraypositionen gebundenen Proteinliganden durch Trypsin zu Peptiden abgebaut werden und durch Peptidmassen Fingerprintanalysen mittels MS und MS/MS und einer Sequenzdatenbanksuche identifiziert werden. So können den funktionellen Daten die Ligandenmolekularmasse und die Proteinidentität gegenübergestellt werden. Auch derartige tryptische Peptide von bekannten Proteinliganden könnten in einem solchen Fall als Referenzsubstanzen zur Positionsbestimmung herangezogen werden.