CS262653B2

CS262653B2 - Process for performing immunochemical tests and device for making thereof

Info

Publication number: CS262653B2
Application number: CS848965A
Authority: CS
Inventors: Helmut Rndr Freitag; Anselm Rndr Rothe
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1983-11-25
Filing date: 1984-11-22
Publication date: 1989-03-14
Also published as: DE3485513D1; ES537910A0; FI78786B; CS896584A2; DD234495A5; EP0143412A2; AU557485B2; AU3581884A; EP0143412A3; ATE72704T1; EP0143412B1; DE3342627A1; JPS60190864A; FI78786C; ES8600813A1; CA1248446A; FI844607A0; FI844607L

Description

Předložený vynález se týká způsobu provádění imunochemických rychlotestů na bázi použití chromatografických pomocných prostředků a zařízení pro provádění tohoto způsobu.

Imunochemické testy získávají pro stanovení hormonů, proteinů, farmaceutik aj., například ve vzorcích krve, moče a stolice, ale i mimo klinickou chemii například při analytických stanoveních potravin nebo při analytických stanovení vzorků odpadních vod, stále větší význam.

Přednost těchto testů spočívá ve vysoké specificitě a afinitě imunočinidel, která dovolí bezpečně stanovit i malá množství substrátů, která se mají stanovit, vedle vysokých koncentrací relativně podobných sloučenin. Nedostatkem při tom je, že zejména pro laiky, mnoho manipulačních kroků, které jsou při obvyklých testech velmi náročné na čas a normálně je lze provádět pouze za pomoci rozsáhlého laboratorního vybavení. Pro širší použití imunochemických stanovení je tedy žádoucí mít к dispozici specifické testy schopné stanovit i nižší množství dokazované látky, které by bylo možné používat i bez komplikovaného přídavného zařízení a podle možnosti bez dodatečného předběžného zpracování nebo dodatečné úpravy substrátu a s indikací výsledku v krátké době.

Úlohou předloženého vynálezu proto bylo vyvinout rychlotesty, pomocí nichž by imunologická stanovení mohli jednoduše a rychle provádět i laici.

Pro imunochemické testy jsou například známy následující reakční postupy:

1. Způsob konkurenční vazby

Při tomto způsobu se к neznámému množství stanovovaného antigenu nebo haptenu (dále krátce označovaného jako antigen) přidává přesně známé množství odpovídajícího značeného antigenu, které se potom nechá zreagovat v konkurenci s odpovídající antilátkou, která je fixována na pevný nosič. Pevná a kapalná fáze se oddělí a stanovením značeného antigenu v pevné nebo v kapalné fázi se usuzuje na množství stanovovaného antigenu.

2. Princip IEMA

Zde se nechá zreagovat stanovovaný antigen se značenou antilátkou v přebytku a při druhém kroku se nezreagovaná antilátka na odpovídající antigen fixovaný na nosiči. Opět se může po rozdělení fází stanovením značeného antigenu v pevné nebo v kapalné fázi usuzovat na množství antigenu.

3. Princip sendviče

Při tomto způsobu se nechá zreagovat bivalentní antigen jednak s antilátkou vázanou na pevnou fázi a jednak se značenou antilátkou a opět po rozdělení kapalné a pevné fáze se v jedné z obou fází určí koncentrace značené antilátky a z ní se usuzuje na koncentraci bivalentního antigenu.

Všem těmto způsobům je společné to, že jeden z obou reaktantů je vázán na nosič nebo je na tento vázán dodatečně, aby se tak umožnilo rozdělení komplexu a přebytečného činidla. Nepřihlížeje к tomu, že toto fixování na nosič způsobuje dodatečné náklady a především, že se mohou změnit imunochemické vlastnosti, vyžadují tyto způsoby, jak bylo již shora řečeno, relativ ně vysoký náklady při jejich provádění. Z tohoto důvodu se tedy nehodí pro jednoduché, levné způsoby rychlotestů.

Pro rychlotesty podle vynálezu by se proto neměly používat žádné na nosič fixované antilátky nebo antigeny nýbrž antilátky odpadající přímo při imunizaci, popřípadě v jejich značené formě. Pod pojmem antilátky se mají podle vynálezu rozumět celistvé antilátky, ale i aktivní zlomky antilátek, například Fab-fragmenty. Antilátky se mohou používat jak v polyklonární, tak i monoklonární formě. S překvapením bylo zjištěno, že toto je možné protože se imunokomplexy z antilátky a antigenu nechají chromatograficky oddělit v důsledku jejich rozdílné molekulární hmotností, popřípadě jejich rozdílné velikosti od nezreagovaných antilátek popřípadě antigenu a odpovídající důkaz v chromatograficky rozdělených frakcích je potom snadný.

Metody dělení proteinů v důsledku jejich rozdílné velikosti jsou dobře známy jako gelová filtrace například na sloupcích Sephadexu, Sephacrylu a ultrogelových sloupcích. Tyto metody se ale vyznačují zvláštními nároky, takže je mohou provádět pouze zaškolení lidé s odpovídajícím laboratorním zařízením. Gelový materiál se musí nechat například více dní předběžně nabotnávat, chromatografické sloupce se musí pečlivě plnit, musí se uvést do rovnováhy s rozpouštědlem a stále udržovat vlhké, aby se docílilo dobrého dělení.

Kromě toho jsou vedle sloupců nezbytné ještě zásobní nádrže pro rozpouštědla, čerpadla, sběrače frakcí, systémy detektorů atd. a nadto doba přípravy vzorků a chromát ografie si vyžádá více hodin, takže tyto způsoby nepřicházejí pro provedení rychlotestů v úvahu.

S překvapením bylo nyní zjištěno, že se pro rychlé dělení substrátů odpovídající velikosti molekul může používat kapiláraktivní vrstva, která sestává ze suchého, porézního, nebotnajícího zrnitého materiálu s vlastnostmi molekulárního síta (například pórovité sklo, silikagel aj.), jestliže se využije transport kapaliny na základě kapilárních sil.

V závislosti na průměru pórů probíhá chromatografie substrátů v souladu s je5 jich velikostí molekul rychleji nebo pomaleji, přičemž vysokomolekulární látky, které v důsledku své velikosti nemohou vniknout do pórů, chromatoigrafují se bezprostředně za frontou rozpouštědla. Tímto se tedy podaří bez předběžného velkého nákladu, tj. bez předcházející ekvilibrace těchto sloupců nebo bez dodatečného čerpání kapalin čerpadly, během relativně krátkých dob — 5 až 30 minut při délce sloupců 5 až 20 centimetrů — provést odpovídající dělení. Aby se zabránilo ,,šikmému toku“ sloupců, měl by průměr sloupce činit 0,5 až 5 mm, s výhodou 1 až 2 mm. Vzhledem к tomu, že imunokomplex jsou obvykle podstatně větší než antilátky a antigeny, používané к jejich vytvoření, je možné při použití vhodných molekulárních sít, volit průměr pórů tak, aby imunokomplexy do pórů buď revnikaly vůbec, nebo jen málo, tj. aby se chromatografovaly spolu s frontou rozpouštědla nebo krátce za ní, zatímco antilátky mohou vniknout do pórů a tím mohou být zadrženy popřípadě chromatografují podstatně pomaleji. Vpředu uvedené suché kapilární sloupce se proto mohou používat pro imunologický rychlotest.

Podle vynálezu jsou tedy možné dva rozdílné způsoby:

1. Substrát, obsahující antigen, se může doplnit přebytkem antilátky a předběžně inkubovat. Po* provedené reakci se potom směs vnese na vpředu popsané molekulární síto a chromatografuje se buď vhodným rozpouštědlem, tj. normálně vodným pufračnírn roztokem, nebo přebytkem reakčního roztoku. Ve frontě rozpouštědla, zbavené nezreagovaných antilátek se může potom stanovit jednou ze známých metod koncentrace imunokomplexu.

2. Pro uživatele je ale jednodušší používat předem zhotovené sloupce, které ve své dolní části obsahují materiál molekulárního síta, který je impregnován vhodnými antilátkami a v horní části obsahují neimpregnovaný materiál pro chromatografii. Jestliže se nyní pokryje část impregnované antilátky substrátem obsahujícím antigen, vytvoří se v mobilní fázi imunokomplex, který v důsledku své velikosti nemůže vniknout do pórů molekulárního síta a tedy putuje rychleji než nezreagovaná antilátka, která zůstává ve stacionární fázi v pórech.

Zdá se být mimořádně překvapující, že je možné s tak jednoduchými prostředky dosáhnout rychlého a použitelného dělení, neboť podle údajů literatury by se muselo očekávat, že by se suché sloupce protékající kapalinou smáčeny jen nedokonale, tj. za vytvoření více nebo, méně velkých vzduchových vměstků uvnitř a mezi částicemi, čímž by se znemožnilo dělení. Na druhé straně bylo nutné předpokládat, že zejména u metody 2, se tvorba velkých imunokomplexů, které se mohou nacházet jen mimo póry, difúzními pochody tak zpomalí, že se nedostaví dostatečná reakční rychlost během krátké doby styku, která činí několik sekund.

Předmětem vynálezu podle toho je způsob provádění imunochemických rychlotestů, při kterých antigeny reagují s antilátkami za vzniku imunokomplexů, jehož podstata spočívá v tom, že se zkoumaný substrát nanese na dolní část zařízení a chromatografuje pomocí el.uce rozpouštědla vrstvou a popřípadě vzniklý imunokomplex se dokazuje v horní části zařízení.

Při způsobu se dolní část zařízení naplní substrátem, obsahujícím antigen a tento se vnese do rozpouštědla, například vody nebo vodného roztoku pufru, které kapilárně stoupá vzhůru zařízením a dělí antilátku od popřípadě vytvořeného imunokomplexů.

Roztok substrátu, obsahující antigen, slouží při chromatografii jako eluční činidlo.

Detekuje se bud samotný imunokomplex, nebo s ním spojený značkovací enzym, po chromatografickém oddělení.

Zařízení pro provádění způsobu podle vynálezu obsahuje kapilární aktivní vrstvu, sestávající ze suchého, porézního, nebotnajícího materiálu, který je zrnitý. Podstata zařízení podle vynálezu spočívá v tom, že antilátky, antigeny a imunokomplexy jsou rozpustné sloučeniny a materiál vykazuje vlastnosti molekulárního síta, přičemž póry molekulárního síta jsou větší než antilátka, ale menší než imunokomplexy, vytvořené z antigenu a antilátky.

Kapilárně aktivní vrstva tvoří kapilární sloupec. Kapilárně aktivní vrstva je uložena na inertním nosiči, například fólii z plastické hmoty nebo na skle. Antilátka je naimpregnována na dolní části molekulárního síta.

V alternativním případě je antilátka naimpregnována na porézní vrstvu předřazenou kapilární vrstvě.

Antilátka je značena radioaktivní látkou, fluorescenční látkou nebo chromofórem.

V alternativním případě je antilátka značena enzymem. Horní část materiálu je impregnována reagenčním systémem pro značící enzym.

Materiál molekulárního· síta obsahuje inertní, hydrofobní, jemně zrnitý materiál, například talek, hydrofobizované sklo nebo silikagel.

Molekulární síto sestává z hydrofilního materiálu, například silikagelu nebo porézního skla a/nebo je impregnována smáčedlem, například kationtovým, aniontovým nebo neionogenním, jako glykolethery, alkylsulfáty, fenolethery a bis-2-hydroxyethylaminem kyseliny laurové.

Materiál molekulárního síta je opatřen dodatečnou impregnací pufry a/nebo solemi a/nebo komplexotvornými látkami nebo jinými účinnými látkami.

Při výhodném provedení vynálezu se kapilára ze skla nebo plastu, s vnitřním průměrem 0,5 až 5 mm, s výhodou 1 až 2 mm a s délkou 5 až 20 cm, s výhodou 10 až 20 centimetrů, uzavře na jednom konci nasákavým, kyprým materiálem. Na tento materiál uzávěru se vnese 0,2 až 10 mm silná vrstva materiálu molekulárního síta impregnovaného značenou antilátkou a sloupec se naplní dalším neimpregnovaným molekulárním sítem a na horním konci opět utěsní propustným materiálem uzávěru. Když se značená antilátka nemůže přímo detekovat, například v důsledku její barvy, fluorescence nebo radioaktivity, může horní část sloupce obsahovat ještě indikační oblast, ve které jsou například obsaženy odpovídající činidla, aby se spolu se značenou antilátkou, například nakopulovaným enzymem, vytvořil detekovatelný produkt.

Jestliže se do tako véhoto sloupce vstřik ne na jeho dolním konci několik ,ul zkoumaného roztoku a sloupec se pak postaví do vhodné vyvíjecí kapaliyn, potom putuje kapalina až do úplného pokrytí obsahu sloupce v důsledku kapilárních sil směrem nahoru. Za přítomnosti antigenu dojde, jak je shora popsáno, ke tvorbě komplexu а к oddělení tohoto komplexu na horním konci kapilárního sloupce. Vzhledem к tomu, že chromatografie je úplným zvlhčením automaticky ukončena, není zvláštní kontrola ze strany použivatele nutná. Výsledek lze zejména při kvalitativním testu odečíst ještě i po delší době a popřípadě dokonce odpařit rozpouštědlo a sloupec uchovat pro dokumentační účely.

V další výhodné formě provedení se materiál molekulárního síta ve vrstvě o tloušťce 0,05 až 1 mm, rozprostře popřípadě za přídavku pojivá, na nenasákavém nosiči a tento se rozdělí v proužky, široké 5 až 10 milimetrů a dlouhé 50 až 150 mm Vždy podle účelu použití se jeden konec těchto proužků impregnuje odpovídajícími antilátkami a slouží к nanášení vzorku a druhý konec se dodatečně impregnuje indikačními činidly pro značené antilátky a slouží к důkazu vytvořených komplexů antilátek s antigeny. Jestliže se tyto tři oblasti nanášejí odděleně, musí se dbát na to, aby mezi nimi byl dostatečný kapilární styk. Je ale také možné, nejdříve natírat například stěrkou, nanášecí hmotu, která je suspendována ve vhodném rozpouštědle, tuto usušit a nakonec dodatečně impregnovat činidly.

Jako nepropustný nosič se s výhodou používají proužky z plastických hmot, například polykarbonátů, polyesterů, polyamidů nebo polyethylenu, ale je možné použít s výhodou i nosiče ze skla.

Jak je shora řečeno mají molekulární síta, používaná pro chromatografií, sestávat z nebotnajícího materiálu. Proto přichází v úvahu s výhodou anorganické nosiče a z toho zejména různé v obchodě se nacházející druhy pórovitého skla nebo silikagelu s definovanou velikostí pórů. Vnitřní a vnější povrch anorganického materiálu nosiče může být povlečen vhodnou organickou látkou, například polyolem, která tomuto propůjčuje adsorpční vlastnosti agarovéhoi nebo celulózovéhO’ gelu a zabraňuje negativním vlivům anorganického nosiče na antilátky, popřípadě antigeny.

Vzhledem к tomu, že jako rozpouštědla pro chromatografií přichází v úvahu převážně vodné roztoky, musí být použité materiály dostatečně hydrofilní. Jestliže toto není již zaručeno výrobou materiálů, ukázalo se být výhodné, suspendovat materiály nosičů před zpracováním ve vodném roztoku, obsahujícím smáčedla a vhodný pufr a takto impregnovaná zrníčka opět sušit.

Jako smáčedla se mohou používat všechna známá, aniontová, kationtová nebo neionogenní smáčedla. S výhodou se používají koncentrace 0,01. až 0,1 %, je ale možné použít i nižší koncentrace, a to zejména u materiálů, které jsou již od přírody hydrofilní, rovněž je možné použít vyšší koncentrace, pokud neovlivňují imunokomplexy.

Jako smáčedla lze například jmenovat glykolethery jako například polyoxyethylenstearát, polyoxyethylenlaurát, alkylsulfáty jako například dodecylsulfát, polyglykolethery vyšších alifatických alkoholů, fenolethery, například 10,5-ethoxynonylfenol, cetyltrimethylamoniumbrornid a bis-2-hydroxyethylamin kyseliny laurové.

Ostatní součásti impregnačního roztoku odpovídají přibližně součástem obsaženým v pozdějším vyvíjecím roztoku, tj. pufrům, solím, komplexotvorým látkám, sterilizačníni prostředkům atd., které jakožto nízkomolekulární součásti pomaleji chromatografují než fronta rozpouštědla, čímž se dosáhne, že i u fronty rozpouštědla panují stacionární podmínky.

Dále se ukázalo být výhodným přimíchat ke chromatografickému materiálu dodatečně co možná jemně práškovitý, inertní a popřípadě liydrofobní plnivo, přičemž se zejména osvědčil talek, hydrofobizované sklo, silikagel apod. Tento materiál zmenšuje jednak výplňový objem mezi částicemi nosiče a vede tak к lepšímu dělení a na druhé straně zpomaluje eluční rychlost kapalné fáze čímž se zlepší ustavení rovnováhy v důsledku zlepšení difúze mezi mobilní a stacionární fází a tím se opět zlepší výkonnost dělení. Kromě toho je náplň sloupce homogenější, čímž se dodatečně zabrání případné tvorbě vzduchových vměstků.

Při volbě pojiv pro výrobu povlékaných nosičů je nutné dbát na to, aby tato na jedné straně vedla ke stabilním povlakům avšak na druhé straně ale podstatně nezměnila eluční rychlosti materiálů nosiče, tj. zejména se nezmenšily póry. To se s překvapením zdaří tím, že se použije vodná disperze plastické hmoty například polyvinylpropionátu nebo polyakrylátu ve směsi s dobře ve vodě rozpustným, popřípadě botnavým pojidlem. S úspěchem byly použity agar — a9

575 U/ml rozpuštěno v 10 mM KP_b 5 mM chloridu hořečnatého MgCH., 25 mM chloridu sodného NaCl, 2 % sacharózy, 0,5 °/o albuminu séra hovězího dobytka, 0,1 % azidu sodného NaN₃, pH 7,0.

2626S3 gar, hydroxypropylcelulóza a podobné vysokomolekulární materiály.

Ačkoliv v mnoha případech postačí stanovit, zda v úvahu přicházející antigen je či není obsažen v roztoku substrátu, je ale nejčastěji žádoucí provést polokvantitativní nebo kvantitativní stanovení. Pokud imunokomplex není sám o sobě barevný, ukazuje se být nutným značit antilátku nějakým detekovatelným způsobem.

Jedním z nejstarších způsobů tohoto druhu je značení radioaktivními isotopy, například jódem (1.25) nebo tritiem a stanovení množství radioaktivity oblasti, obsahující komplex aotilátky a antigenu pomocí detektoru radioaktivity. Vzhledem к tornu, že manipulace s radioaktivními látkami vyžaduje opět speciální laboratoř, dává se dnes před nost značení fluorescenčními bcrvivy, takže se může antilátka popřípadě hnunokomplex stanovit a měřit na základě její fluorescence.

Zejména u proteinů, které se vyskytují pouze v nepatrné koncentraci, se antilátka kopuluje s výhodou se vhodným enzymem a využívá se reakce vhodného substrátu za katalytického účinku tohoto enzymu pro detekční reakci. Vyhodnocení lze, jak již bylo shora popsáno, provádět buď přímo na materiálu' nosiče, nebo po oddělení zóny, obsahující komplex a suspendování ve vhodném rozpouštědlo, fotometricky v kývete.

Kromě toho je polokvantitativní stanovení tím, že se do koncové oblasti materiálu nosiče přimísí definované množství specifického adsorpčníhO' činidla pro značený enzym a/nebo komplex ve formě fixované na nosič a ze šířky absorpční zóny, která se vyvine, usuzovat na původní množství enzymu v imimokomplexu.

V následujících příkladech jsou, blíže vysvětleny rychlotesty, aniž by se tyto omezovaly pouze na uvedené příklady.

Příklad 1

Důkaz hCG (lidského Chorionic Gonadotropinu) v moči pomocí testovací kapiláry.

Roztoky

A.

mg indolylgalaktosidu se rozpustí v 1 mililitru methanolu.

B.

Konjugát Fab-anti-hCG /3-galaktosidázy byl vyroben z ovčího anti-hCG-séra [imunizace: D. M. Weir, Handbook of Experimental Immunologie, A 2.8; štěpení Fah: M. E. Davis, A. J. Barret, R. M. Hernbry, J. of Immunological Methods, 21, 305 (1978)];

Konjugace: T. Kitagawa in Enzyme Immunol Essay, Editors: E. Ishikawa, T. Kawai, K. Miyai, nakladatelství Igaku — Shoiu, Tokio — New York 1981) a do

Materiál:

[pórovité sklo: glycerylové sklo, Controlled Póre (Sigma, St. Louis)], 259 A průměr pórů,

Skleněná průměr 1 buničinou velikost částic: 200 až 400 msh. kapilára: délka 12 cm, vnitřní mm, na jedné straně uzavřená (do výšky 2 mm).

Úprava kapiláry

Kapilára je na dolním konci utěsněna trochou buničiny a naplněna pórovitým sklem (výška náplně 7 cm). 500 mg pórovitého skla se smísí s 1 ml roztoku A a potom se usuší při 60 Kapilára naplněná pórovitým sklem se nyní převrství směsí pórovitého skla a substrátu indolylgalaktosídu (výška náplně 1 cm). Buničina na dolním konci kapiláry se impregnuje 3 μΐ roztoku В a usuší.

Provedení testu

Kapilára se postaví do testované moči. Během asi 5 minut dosáhne kapalina horní vrstvu substrátu. Galaktosidáza z imunokomplexu dosáhne tuto vrstvu substrátu pouze za přítomnosti hCG. Bezbarvý indolylgalaktosid se hydrolyzuje a v přítomnosti kyslíku které lze vizuálně.

so nechá zreagovat na indigo, poznat podle modrého zbarvení

Důkaz hCG v moči pomocí testovacích proužků.

Roztoky:

A.

ml 0,3% ogar-agaru ve 150 ml mM chloridu sodného ŇaCl mM KP_h pH 7,2

4- 400 μϊ tritonu X—100

4- 2,3 ml vody

2 g 50% disperze polyvinylpropionátu ve vodě (Propiofan 70 D, BASF, Ludwigshafen)

B.

Konjugát ovčího

Fab-Anti-hCG galaktosidázy z antiséra jako v příkladu 1.

Materiály (Daltosil, SP 300, velikost pórů

Silikagel asi 300 A, velikost částic 120 až 200 mesh, fa, Serva).

Směs silikagelu a indolylgalaktosidu/roztok 3 mg indolylgalaktosidu v 1 ml methanolu se doplní 250 mg vpředu uvedeného silikagelu a získaná kaše se suší v proudu vzduchu při 60 až 70 °C.

Polykarbonátová fólie (Pokalon, fa. Lonza, Lórrach).

Nanášení

Vyrobí se následující směsi:

a) 8 ml roztoku A -|- 1,5 g silikagelu

b) 1 ml roztoku A 4- 0,19 g směsi silikagelu a indolylgalaktosidu

c) 0,15 ml roztoku A -|- 0,05 ml roztoku В 4- 0,04 g silikagelu.

Pomocí stěrky, rozdělené přepážkami (na jedné straně zaoblené) se nanáší směsi a až c v dotýkajících se vrstvách na 15 cm širokou polykarbonátovou fólii (tloušťka vrstvy 400 ₍«m). Šířky vrstev a sled řad jsou přitom následující:

Vrstva a 1 cín, vrstva c 0,5 cm, vrstva a 8 cm, vrstva b 1 cm a přesahující polykarbonátová fólie sloužící pro uchopení 4,5 cm.

Fólie se při tom suší při 45 °C a rozřeže se kolmo ke směru nanášerií v 0,5 cm široké testovací proužky (délka 6 cm).

Provedení testu

Popis

Během 0 minut dosáhla kapalina až к nejhořejšímu konci testovacího proužku a přítomnost hCG vede stejně jako v příkladu 7 к barevné reakci.

Příklad 3

Vliv smáčecích prostředku na vlastnosti dělení pórovitých skel

Neupravená pórovitá skla vykazují špatné dělicí schopnosti. Předběžná úprava přináší značné zlepšení. Skla se předběžně inkubují s roztokem, sestávajícím z 0,025% Tweeiiu 20, 10 mM hydrogenfosforečnanu sodného Na-iHPO/,, 25 mM chloridu sodného NaCl, 0,01% azidu sodného NaNn, 30 minut při pH 7,2, odsají pomocí nuče a suší v sušicí skříni při 35 ^CC až do získání schopnosti zkrápění.

Jř ko míra kvality dělení se stanoví uzavřený objem pomocí nízkomolekulární látky, chlorfenolové červeni, v naplněných kapilárních sloupcích o délce 11 cm.

Pórovitá skla: firma Sigma, 120 až 200 mesh Náplň: 4 μΐ barevného roztoku, chromatografie ve vodě.

Výška náplně kapilárního sloupce: 11 cm.

Testovací proužky se ponoří svým dolním koncem do moče.

průměr pórů	neošetřený matetriál	impregnovaný materiál
barevné maximum při	šířka píku	barevné maximum při	šířka píku
240 A	8,0 cm	1,2 cm	5 cm	0,8 cm
350 A	10,0, cm	2,0 cm	5 cm	1,2 cm
500 A	7,5 cm	4,0 cm	4,8 cm	1,2 cm
700 A	7,2 cm	1,7 cm	4,9 cm	1,2 cm
1000 A	10,3 cm	1,3 cm	4,8 cm	0,8 cm

Podle údajů výrobce by se mělo teoreticky, tj. u matetriálu pečlivě suspendovaného v kapalině a ekvilibrovaného ve sloupcích, dosáhnout v tomto příkladě 4,7 centimetru.

Příklad 4

Víiv inertních příměsí na vlastnosti dělení pórovitých skel

Kvalita dělení závisí u gelové chromatografie i na rychlosti chromatografie. Příliš rychlá chromatografie vede ke snížení výkonu dělení. Rychlost chromatografie v kapilárních sloupcích naplněných suchým pórovitým sklem se může zmenšit přísadou hydrofobních částic. V následující tabulce je uveden vliv příměsi hydrofobizovaného silikagelu [Octyl—SP 500, 40 až 100 μΐη. fa Serva/na eluční rychlost kapilárního sloup ce (průměr 1 mm, délka 10 cm)] s pórovitým sklem (Controlled Póre Glass, 240 A, 200 až 400 mesh, fa, Serva).

Tabulka

§ (W/W) Octyl— —SP 500	doba chromatografie min.
0	3,4
3	7,8
5	12
7	16
10	19
13	20
14	21
17	24
20	52
22	58
25	175

Příklad 5 Pórovité sklo CPG, fa. Serva, 200 až 400 niečh, výška náplně sloupců: 10 cm, nános.

Dělení podle molekulární hmotnosti za po- nyní 3 μ! roztoku proteinu (2 mg proteinu/ užití předem upravených skel /ml), sirka píku: 0,5 až 0,7 cm. Rozpouštědlo: voda.

průměr pórů

Cytochrom C

MG — 12 000 antilátka (Antialbumin) značená fluoresceinem MG — 150 000 Ferritin

MG = 450 000 dextranová modř

MG asi 6 mil. antilátka (antialbumin) značená fluoresceinem chromatografie v 1 mg albuminu/ml PES maximum při

240 A	35C A
5,3 cm	5,4 cm
6,5 cm	5,6 cm
7,1 cm	6,2 cm
fronta	fronta

1) 2)

6,5 4- 8,1 cm

1) antilátka

2) komplex antilátky s antigenem

Claims

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

1. Způsob provádění imunocheimckých rychlotestů při kterých antigeny reagují s antilátkami za vzniku imunokomplexů, vyznačující se tím, že se zkoumaný substrát nanese na dolní část zařízení a chromatografuje se pomocí eluce rozpouštědla vrstvou a popřípadě vzniklý iiminokomplex se dokazuje v horní části zařízení.
2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se dolní část zařízení naplní substrátem, obsahujícím antigen a tento se vnese do rozpouštědla, například vody nebo vodného roztoku pufru, které kapilárně stoupá vzhůru zařízením, přičemž se antilátka a popřípadě vzniklý imunokomplex dělí.
3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že roztok substrátu, obsahující antiuen, slouží při chromatografií jako elu.čn.í činidlo.
4. Způsob podle bodů 1 až 3, vyznačující se tím, že se detekuje samotný imunokomplex nebo s ním. spojený značkovací enzym po chromatografickém oddělení.
5. Zařízení pro provádění způsobu podle bodu 1, obsahující kapilárně aktivní vrstvu, sestávající ze suchého, porézního, nebotnajícího, zrnitého- materiálu, vyznačující se tím, že antilátky, antigeny a imnnokoniplexy jsou rozpustné sloučeniny a materiál vykazuje vlastnosti molekulárního síta, přičemž póry molekulárního síta jsou větší než antilátka, ale menší než hnunokomplexy, vytvořené z antigenů a antilátky.
6. Zařízení podle bodu 5, vyznačující se tím, že kapilárně aktivní vrstva sestává z kapilárníhoi sloupce.
7. Zařízení podle bodu 1, vyznačující se tím, že kapilárně aktivní vrstva je uložena na inertním nosiči, například fólii z plastické hmoty nebo na skle.
8. Zařízení podle jednoho z bodů 5 až 7, vyznačující se tím, že antilátka je naimpregno-vána na dolní část molekulárního síta.
9. Zařízení podle jednoho z bodů 5 až 7, vyznačující se tím, že antilátka je naimpregnována na porézní vrstvu předřazenou kapilární vrstvě.
10. Zařízení podle jednoho z bodů 5 až 9, vyznačující se tím, že antilátka je značena radioaktivní látkou, fluorescenční látkou nebo chromofórem.
11. Zařízení podle jednoho z bodů 5 až 9, vyznačující se tím, že antilátka je značena enzymem.
12. Zařízení podle bodu 11, vyznačující se tím, že horní část materiálu je impregnována reagenčním systémem pro značící systém.
13. Zařízení podle jednoho z bodů 5 až 12, vyznačující se tím, že materiál molekulárního síta obsahuje inertní hydrofobní, jemně zrnitý materiál, například talek, hydrofobizované sklo nebo silikagel.
14. Zařízení podle jednoho z bodů 5 až 13, vyznačující se tím, že molekulární síto sestává z hydrofilního materiálu, například silikagelu nebo porézního skla a/nebo je impregnováno smáčedlem například kationtovým, aniontovým nebo neionogenním, jako glykolethery, alkylsulfáty, fenolethery a bis-2-hydroxyethylaminem kyseliny laurové.
15. Zařízení podle jednoho z bodů 5 až 14, vyznačující se tím, že materiál molekulárního síta je opatřen dodatečnou impregnací pufry a/nebo solemi a/nebo komplexotvo-rnými látkami nebo jinými účinnými látkami.