JP2573381B2

JP2573381B2 - 生物学的診断分析システム

Info

Publication number: JP2573381B2
Application number: JP1509233A
Authority: JP
Inventors: ピー．リンドホルム，エドワード; ジェイ．ジュニアヤマーティノ，アーネスト
Original assignee: BEERINGU DAIAGUNOSUTEIKUSU Inc
Current assignee: BEERINGU DAIAGUNOSUTEIKUSU Inc
Priority date: 1988-11-23
Filing date: 1989-07-31
Publication date: 1997-01-22
Anticipated expiration: 2012-01-22
Also published as: ATE102356T1; AU621935B2; DE68913440D1; FI903540A0; ES2051963T3; JPH03502370A; EP0370417A1; EP0370417B1; NO902951L; NO902951D0; NZ230473A; AU4196789A; CA1337174C; NO177876C; FI97425B; NO177876B; DK173990A; DE68913440T2; DK173990D0; FI97425C

Description

【発明の詳細な説明】この発明の背景この発明は多層診断分析エレメント、より詳しくは、
そのエレメントの特定の層に例えば蛋白質のような生物
学的検体を固定化するために適した材料の使用に関す
る。

生物学的流体中の分析物又は代謝物の迅速分析用のさ
まざまなタイプの診断分析エレメントが報告されてい
る。一般的に生物学的流体の試料、例えば血漿、血清、
その他は分析エレメントに施され、分析物又は代謝物と
分析エレメントに存在する試薬との相互作用の結果とし
て、分析物又は代謝物に対応する検知可能の変化がもた
らされる。検知可能の変化は目視で評価しえる色の変化
であるか又はデンシトメータのような分光光度計で読む
ことができる。蛍光でラベルされた生物学的検体の存在
をベースにした別の計画では蛍光の出力シグナルが発生
し分光蛍光分析計で読まれる。

免疫学的分析の実施に適した薄膜多層分析エレメント
は当該学会で報告されている。これらの薄膜多層エレメ
ントは通常少くともひとつの試薬層とひとつの光ブロッ
キング層をもつ支持層を含むことにより、ひとつの層に
おけるシグナル発生検体を他の層に存在する材料からの
妨害なしに読みとることができる。そのエレメントは
又、たとえば、その層において形成されるか又は他の層
から放出されるシグナル発生検体を保持するための記録
層のようなさまざまな機能を行う他の層をも含む。

さまざまな分析法において、たとえば抗原又は抗体の
ような生物学的検体が試薬層に固定化され、又そのよう
な検体が分析を通して特定の層に留まることが要求され
る。抗原又は抗体のような蛋白質系材料をアガロースの
ようなマトリックス材料に共有結合させてそのような分
析エレメントに試薬層を形成することが知られている。
しかしこの固定化技術は常に満足とはいえない。免疫学
では、高分子ビーズ材料に結合することによって固定化
された蛋白質を利用する古典的な湿式化学法を用いて分
析が行われることも又知られている。これらの分析にお
いては、固定化された蛋白質と相互作用のない生物学的
検体は通常洗浄法によって反応ゾーンから除かれる。し
かし洗浄ステップは、未反応試薬を含むであろう洗浄液
の除去に対する用意がないので薄膜多層分析エレメント
では通常用いられない。

従って、多層分析エレメントに多様な機能を提供する
のに用いることのできる新しい材料に対して、引き続い
て要望がある。

従ってこの発明の目的は新規な生物学的診断分析シス
テムを提供することである。

この発明のもうひとつの目的は、アガロースから誘導
されたアルデヒドグループであるグリオキシルアガロー
スを一層又はそれ以上の層において含む多層生物学的診
断分析エレメントを提供することである。

更にこの発明の目的は、約5000又はそれ以下の分子量
をもつ分析物に対する多層生物学的診断分析エレメント
を提供することである。

この発明の簡単な要約これらの及びその他の目的と利益は、この発明に従っ
て多糖類から誘導されたアルデヒドグループであるグリ
オキシルアガロースがエレメントの一又はそれ以上の層
において利用される多層診断分析エレメントを提供する
ことによって達成される。グリオキシルアガロースは生
物学的検体を特定の層に固定化し、その検体をその層に
分析プロセス中保持するのに有用である。その材料は又
濾過材料としても有用である。即ち蛋白質のような、即
ち分子量が約10,000又はそれ以上である材料が層の中へ
又は層の外に拡散することを防止すると同時に、ハプテ
ン又はシグナル発生ダイでラベルされたハプテンのよう
なより低分子量の材料がその層の中に又は外に又はその
層を通して拡散することを許容することができる。グリ
オキシルアガロースは同じ診断分析エレメントのひとつ
の層以上に用いることができる。例えば、グリオキシル
アガロースは試薬層の中でその中の試薬を固定化するの
に用いられ又、同じ分析エレメントの濾過層においても
用いることができる。

グリオキシルアガロースは試薬層又は濾過層に対しそ
れ自体マトリックス材料として用いられ、又は誘導体で
ないアガロースのようなその他の多糖類と共に用いるこ
とができる。

図面の簡単な説明この発明及び、この発明の他の目的更にその特徴をよ
りよく理解するために、付属の図面と共に以下の各種の
好ましい実施態様の詳細な説明がなされている。

第１図はこの発明による多層分析エレメントの部分的
断面説明図である。

第２図はこの発明による別の多層分析エレメントの部
分的断面説明図である。

好ましい実施態様の説明グリオキシルアガロースは米国特許第4,275,196に記
載され、それは又複合蛋白質の分離に対する電気泳動技
術における蛋白質の帯状固定化及び引続く分離された蛋
白質の分析に有用であることを教示している。その特許
は出願者らによって提供された乾燥した薄膜多層分析エ
レメントにおけるグリオキシルアガロースの使用を提案
していない。

グリオキシルアガロースは２段階のプロセスでつくる
ことができる。最初に、市販の４％アガロースゲルの懸
濁物をグリシドールと、抗酸化剤としてNaBH₄を含む1M
のNaOHの溶液とで処理する。ついで、得られたグリセリ
ルアガロースは過ヨウ素酸塩との反応によって開裂され
グリオキシルアガロースとホルムアルデヒドとなる。グ
リオキシルアガロースはアガロースのビオス単位当り２
つまでのアルデヒドグループをもつことができる。

アガロースの誘導体のアルデヒドは第一級アミンと可
逆反応をして次に示すようにシッフ塩基を形成する。

アガロース−Ｏ−CH₂CHO＋RNH₂ アガロース−Ｏ−CH₂CH＝NR＋H₂O この反応の平衡はpHが高くなるにつれて右にシフトす
る。このようにして、抗体のような蛋白質は、蛋白質の
アミングループとアルデヒドグループとの反応を通して
既に説明したようにグリオキシルアガロースと共有結合
することができる。

誘導体アガロースの単位重量当りのアルデヒドの量は
誘導体材料の調製に用いられた方法によって変化しえ
る。誘導体材料のグラム当りの利用できるアルデヒドの
量は以下に示されるヒドラゾンを形成するためのアルデ
ヒドグループとｐ−ニトロフェニルヒドラジンとの反応
性を利用することによって計算することができる。

高分子支持層によって支持されたグリオキシルアガロー
スの乾燥フィルムの円形サンプル（１″直径）は、揺動
トレー上の密封ガラスジャー中の50mlのｐ−ニトロフェ
ニルヒドラジン試薬の表面上にpH4において被覆面を下
にして浮かすことができ、このようにしてそのフィルム
は緩やかにかき混ぜられる。３時間後フィルムサンプル
は取り出され、水でよく洗われて室温で乾燥される。1c
mの経路長さ（path length）及びヒドラゾンに対する吸
光係数（ε）を30,000として、３ 90nmにおけるフィル
ムの吸光度が記録され誘導体アガロースのグラム当りの
利用できるアルデヒドのmeqが計算される。

この発明による試薬層は最初にグリオキシルアガロー
スの水溶液（約１％固形物）を沸騰するまで加熱するこ
とによって形成することができる。ついで溶液は50°−
55℃まで冷却され試薬（単数又は複数）の溶液、例えば
抗体のような蛋白質材料、及びバッファーが加えられ
る。抗体をグリオキシルアガロースに結合する反応は比
較的高いpH、約8.5又はそれ以上、を要求する。反応性
の範囲はpHによって変り、pHが上ると結合の増加が生じ
る。結合の実際量はpHとグリオキシルアガロースのアル
デヒド含量による。その材料は、高温における抗体の望
ましくない変質を防ぐために可及的速やかに被覆され
る。その層は被覆後乾燥され、その間に結合平衡は水分
の減少と共に有利になる。反応条件は又、強固なマトリ
ックス構造を提供するグリオキシルアガロースの架橋反
応、例えばアルドール縮合経由の反応、を有利にする。
この見解によれば結合及び架橋反応は高いpH条件におい
て継続して起こる。

前記のようにグリオキシルアガロースは又誘導体でな
いアガロースのような他の多糖類とも結合する。この発
明の好ましい実施態様においては、誘導体でないアガロ
ースとグリオキシルアガロースとの重量比で約3:1の混
合物が薄膜多層分析エレメントに用いられる。その混合
物がその調製中の取扱い及びつづくプロセスが容易なた
め好まれる。混合物は、通常５％以下の固形物の50℃の
グリオキシルアガロース溶液とアガロース溶液とを50℃
でかき混ぜながら混合し、数分間50℃でかき混ぜを続け
ることによって調製することができる。全混合物グラム
当りの利用しえるアルデヒドを好ましくは約0.04meqか
ら約0.20meqもつ混合物は、調製されたままで用いるこ
ともでき、又は将来薄膜多層分析エレメントにその材料
を取り込むことが望まれるときゲルにしついで加熱する
ことができる。

別の層又は複数の層がグリオキシルアガロース層の上
に被覆される場合、又はグリオキシルアガロース層が乾
燥層のpHを下げるための洗浄のような何らかの方法で更
に処理される場合は、最初に形成された層は数時間から
１日又はそれ以上の範囲の時間キュアーすべきであるこ
とが判明した。

実験はこの発明に従って得られた結果が部分的には試
薬層、濾過層又は他の層におけるマトリックス材料（グ
リオキシルアガロース又はグリオキシルアガロースと他
の多糖類との混合物）のアルデヒド含量によることを示
した。どのような特定の分析エレメントにおいても所望
の結果を提供するマトリックス材料の単位重量当りのア
ルデヒドの量は、層が形成される被覆流体のpH及び被覆
流体に用いられる特定の緩衝液のような変量によって大
きく変る可能性がある。上記のように、マトリックス材
料として誘導体でないアガロースとグリオキシルアガロ
ースの約3:1の混合物を使うことが好ましい。混合物グ
ラム当りの利用しえるアルデヒドが約0.04meqから約0.2
meqである好適な混合物は、グラム当り約0.16meqから約
0.8meqの利用しえるアルデヒドをもつグリオキシルアガ
ロース１部と、３部のアガロースとを混合することによ
って調製することができる。

定型の範囲（scoping）テストが特定の多層分析エレ
メントのどの層にも所望の結果を提供するアルデヒド含
量を定めるために用いることができる。

この発明の多層分析エレメントにおいては、他の層又
は複数の層はグリオキシルアガロース上を被覆すること
が必要で、又層（等）の機能及び特定の材料により、時
によって１又はそれ以上のこれらの層を比較的低いpH、
即ち中性以下のpHで被覆することが必要である。これら
の場合シッフ塩基生成物は遊離のアミン（蛋白質）と高
分子アルデヒドに対し逆反応を行うであろう。しかしこ
れらの場合であっても、グリオキシルアガロース層は蛋
白質材料を効率的に継続して結合し続けることが判明し
た。被覆されたグリオキシルアガロース層のこの性質は
実験結果によって示された。理論的機構のいずれに対し
てもこの発明を制限するつもりはないが、グリオキシル
アガロース材料が極めて強固なマトリックス構造を形成
して、通常中性pHを含む典型的な分析条件下で極めて効
率よく試薬又は他の材料を結合することが理論化され
る。

問題とする特定の分析を妨害しない好適な生物学的に
適合しえる緩衝液材料はどれでも、層の形成後にその中
に残留することが許容される場合は、グリオキシルアガ
ロース層の調製に使うことができる。前記のようにグリ
オキシルアガロース層が被覆される被覆流体のpHは、シ
ッフ塩基を形成するグリオキシルアガロースと第一級ア
ミンとの反応の平衡及びグリオキシルアガロースに対す
る架橋反応にも又影響する。典型的に好適な緩衝液はバ
イシン、ビストリスプロパン、炭酸ナトリウム及びホウ
酸ナトリウムを含む。緩衝液の選択はある程度まではグ
リオキシルアガロースのアルデヒド置換の程度による。
例えば、グリオキシルアガロースのアルデヒド置換が少
い場合は、よい結果は比較的高いpKaをもつ緩衝液と共
に又は炭酸ナトリウムのような無機の緩衝液と共に得ら
れる。通常同じ緩衝液材料に対しては、高いpHがよい結
合を提供する。しかし同じpHで使われる異った緩衝液は
異なった結果を示す。

第１図はこの発明の特に好ましい分析エレメントを示
す。分析エレメント10は試薬層14をもつ透明支持層12、
光ブロッキング層16及び試薬層、例えば蛋白質に対する
濾過層、耐摩層等である任意の層18を含む。ある実施態
様においては試薬層14は、グリオキシルアガロースのマ
トリックス又はグリオキシルアガロースとアガロース等
のようなその他のマトリックス材料との混合物に分散さ
れた、蛍光でラベルされた抗原と複合した抗体の免疫複
合体を含む。試薬層14は前記のように形成される。この
場合は蛍光でラベルされた抗原は抗体とともに被覆組成
物中に取り込まれる。光ブロッキング層16は、アガロー
スのような結合剤に分散された例えば酸化鉄、二酸化チ
タンその他のような好適な材料のいずれかを含む。層18
は任意で、試薬層14が免疫複合体を含む場合はアガロー
スのような材料の耐摩層を含み、又は緩衝液、ブロッキ
ング及び／又は置換剤等の各種材料を含むであろう。免
疫複合体が試薬層14に存在する場合は層18は省くことが
できる。別の実施態様においては蛍光でラベルされた抗
原は層18全域に分散することができ、層14は固定化され
た抗体を含む。分析エレメント10は、液体サンプルを層
18の表面に均一に分布するために被覆層又は他の手段
（図示されない）を含む。例えば、粒子層、高分子層、
繊維層、織物層及び当分野においてこの目的のために好
適として開示された液体輸送システムを含む好適な流体
分布技術のいずれも使うことができる。分析エレメント
の表面にサンプル流体の均一な分布を提供するための多
くの分布材料は当業者周知であるので、このような材料
のこれ以上の検討はここでは必要ではない。特に好まし
い液体輸送システムは、通常に譲渡された同時係属出願
シリアルNo.210,732、1988年６月23日出願、に記載され
ている。分布手段は、繊維材料その他であっても又は液
体輸送システムであっても、試薬層14にくらべかなり厚
くなるのであろう。

実際面においてはサンプル流体は分析エレメント10の
前面に分布され、その流体は層14,16及び18と共に分布
層又は分布システムに亘って拡散し、平衡に達する。
今、ひとつの分析物、この説明例では対象の抗原（又は
ハプテン）、は層14に固定化された抗体の利用しえる結
合サイトに対し蛍光でラベルされた抗原（サンプル抗原
又はその類似物と同一の抗原）と競合するであろう。蛍
光でラベルされた抗原が最初に層14における抗体と複合
している場合は、前者はそれから離脱しサンプル抗原に
よってサンプル抗原と蛍光でラベルされた抗原との相対
的な量にほぼ等しい割合で置換されるであろう。蛍光で
ラベルされた抗原が最初から層18に存在する場合は、そ
れは層14中に液体サンプルと共に拡散し、固定化抗体上
の結合サイトに対しサンプル抗原と競合する。このよう
に、それぞれの実施態様において、サンプルに存在する
抗原の量に応じて、蛍光でラベルされたある比率の抗原
がサンプル抗原と結合しない固定化抗体と結合する。ラ
ベルされた抗原の残りは分析エレメントの残りにくまな
く分布されるであろう。試薬層14固定化された抗体に結
合するラベルされた抗原の量はいかなる時でもサンプル
抗原の量に逆比例する。サンプル抗原の量の測定は透明
支持層12を通して適当な刺激エネルギで照射することに
よって得られる。固定化抗体の層14は、層16及び18と分
布層又は液体輸送システムのそれとを一緒に合わせた厚
さに比べ極めて薄いので、即ち通常その比は約1:20から
約1:100であるので、そして光ブロッキング層16が層18
又はその上部のいずれから入る刺激エネルギのすべてを
防ぐので、光学読み出しシステムは、固定化抗体と結合
するラベルされた抗原の量と、分析エレメントの残余に
亘って分布している極めて小さいパーセンテージのラベ
ルされない抗原を測定するであろう。前記のように、読
み出し信号はサンプル抗原の量に逆比例するので、信号
はサンプル抗原の量が増すに従って減少する。

グリオキシルアガロース層14はその中に固定化抗体を
分析中保持するのに反して、サンプル抗原及び蛍光でラ
ベルされた抗原は、両者とも抗体より小さい分子量をも
つが、試薬層14の中へ及び外へ、エレメントの中で確立
された平衡に従って拡散しえることとがわかる。このよ
うに第１図で示される分析エレメントは、比較的低分
子、例えば約1500までの分子量をもつものの分析に特に
よく適合する。特に好ましい低分子はテオフィリン、フ
ェニトイン、、カルバマゼピン、フェノバルビタール、
その他の薬剤である。

第２図はこの発明の別の好ましい分析エレメントを示
し、透明支持層20、試薬層22、濾過層24、光ブロッキン
グ層26及び任意層28を含む。この実施態様においては、
試薬層22はアガロースのような多糖類のマトリックスを
もつことが可能で、その中で蛍光でラベルされた抗原又
はその類似物及びその抗原に対する抗体とからつくられ
た免疫複合体が分散されている。濾過層24は既述のグリ
オキシルアガロース又はその混合物を含む。光ブロッキ
ング層26と任意層28は第１図に層16及び18として記され
たものとそれぞれ同様である。実際面において、液体サ
ンプルが分析エレメントに亘って分布されエレメント全
域に拡散されると、抗体は試薬層22を通して拡散し濾過
層24によって捕捉されるであろう。この実施態様は特定
の試薬の場合に有利な低いpHにおいて、試薬層22に被覆
することができる。

第１図及び第２図に示される特定の薄膜多層エレメン
トはこの発明による好ましい分析エレメントであるが、
他のこのような分析エレメントが提供されることは勿論
理解されるであろう。通常この発明の薄膜多層分析エレ
メントは、１又はそれ以上の試薬層、任意の光ブロッキ
ング層及び任意の濾過層を含み、この中で少くともひと
つの試薬層はグリオキシルアガロースを含むマトリック
スに固定化された試薬を含み、及び／又はもうひとつの
層はグリオキシルアガロースを含むマトリックス材料で
形成される。この発明の薄膜多層エレメントは通常約0.
1mmまでの厚さをもつ。

前記のように、米国特許第4,275,196はグリオキシル
アガロースを開示し、更にそれが抗原、抗体等のような
生物起源の蛋白質の帯状の固定化に有用であることを開
示している。特許権所有者は複合蛋白質の電気泳動によ
る分離及びそれにつづく分離された生物学的検体の分析
のような応用に対する材料を開示している。しかし、グ
リオキシルアガロースは、例えばシアノボロハイドライ
ドイオンのような還元剤に接触させるなどして還元しな
ければならず、又は高いpH（≧10.0）にシフトしなけれ
ばならないと教示している。この発明は乾燥した多層分
析エレメントを含み、それは永久固定化を提供し、従っ
て層のpHは、次いでグリオキシルアガロースの還元をし
ないで下げることができる。この発明に従って形成され
た試薬層のこの特性は下記の実施例IIに示される実験に
よって説明される。

この発明は特定の好ましい実施態様に関し実施例の方
法で更に詳細にここに記載されるが、これらは単に説明
だけを意図するものであってこの発明がここに記載され
た材料、条件、プロセスパラメーター、その他によって
制限されるものでないことを理解すべきである。

実施例１グリオキシルアガロースはグリセリルアガロースの過
ヨウ素酸塩酸化によって調製された。この生成物は前述
のヒドラゾン形成法によって分析したとき誘導体材料グ
ラム当り0.533meqの利用しえるアルデヒドをもってい
た。

被覆流体は9.48gの蒸留水に溶けた0.10gのアガロース
に50℃において以下の成分を加えることによって調製さ
れた。300μｌの0.25M炭酸ナトリウムpH9.0の緩衝液、2
0μｌの10％ツィーン20（ロームアンドハース社から得
られる界面活性剤）、0.5MのヘペスpH7.5緩衝液40μｌ
を含む200μｌのグルコースオキシダーゼ貯蔵溶液、7.5
mgのグルコースオキシダーゼと蒸留水で合計3.0gに調製
された7.5mgのウシの血清アルブミン。被覆流体は下被
覆されたポリエチレンテレフタレートベース層にドロー
ダウンロッドを用いて施され、ついで室温で乾燥され
た。乾燥層は約600mg/m²のアガロースと約3mg/m²のグル
コースオキシターゼをもった。

4.82m²のエレメントのサンプルは5mlのpH7.0のリン酸
塩緩衝液を用い緩やかにかき混ぜ乍ら30分間溶離され
た。緩衝液の1mlのアリコートが取り出されグルコース
オキシダーゼの活性がそれをグルコース、セイヨウワサ
ビのペルオキシターゼ及びＯ−フェニレンジアミンとpH
7.0で30分間反応することによって分析された。酸化Ｏ
−フェニレンジアミン基質の吸光度が492nmで記録され
た。

グルコースオキシダーゼ層は又グリオキシルアガロー
ス及びアガロースとそれとの混合物を用いてマトリック
ス材料として調製された。得られた結果は表Ｉに示され
る。

この結果はアガロースマトリックスが多量のグルコー
スオキシダーゼを試薬層から拡散させるのに対し、グリ
オキシルアガロースはそれ自体で又3:1の割合で含む混
合物において極めて効果的にグルコースオキシダーゼを
固定化したことを示す。又5:1の混合物はグリオキシル
アガロース層及び他の混合比でつくられた層と同様に効
果的ではないが、それにも拘らずグルコースオキシダー
ゼの固定化がアガロース層より顕著により効果的であっ
たこともわかる。

実施例II 対照の被覆流体が重量で１％のアガロース、10mMpH7.
0のヘペス緩衝液及びI¹²⁵でラベルされたIgG抗体を水の
中に含んで形成された。この被覆流体は下被覆されたポ
リエチレンテトラフタレートベース層にドローダウンロ
ッドを用いて施され、そしてその抗体層はついで室温で
乾燥された。乾燥層は約1000mg/m²のアガロースと約15m
g/m²のI¹²⁵でラベルされたIgG抗体をもった。

被覆流体は又3:1配合の１％のアガロースとグリオキ
シルアガロース（混合物グラム当り0.092meqのアルデヒ
ド）と、pH7.0と8.0のヘペス緩衝液（Ａ及Ｂ）のそれぞ
れと、又pH9.0とpH10.0の炭酸ナトリウム緩衝液（Ｃ及
Ｄ）のそれぞれと共に、それぞれに調製された。その乾
燥層は約1000mg/m²のアガロース／グリオキシルアガロ
ース混合物と約15mg/m²のラベルされた抗体をもった。

被覆された抗体層は最初にマイクロスタットガンマカ
ウンタ（マイクロメディックシステム社）で読まれ、つ
いで2mlのpH7.0のヘペス緩衝液に30分間浸漬された。そ
のエレメントはガンマカウンタで浸漬10分後と30分後に
読まれた。その結果を表IIに示す。

これらのデータは異なった緩衝液による固定化につい
てのpHの影響を示している。ほとんどすべてのI¹²⁵でラ
ベルされた抗体が10分後に対照層の外へ拡散したことが
わかる。

グリオキシルアガロースを含む抗体層は10分後にラベ
ルされた抗体の実質的にすべてを保持した。更に炭酸ナ
トリウム緩衝液をもつ抗体層は30分後においてさえ、pH
9.0では実質的にすべてのラベルされた抗体を、pH10.0
ではすべての抗体を保持した。ヘペス緩衝液を含むグリ
オキシルアガロース層が30分間の浸漬後にpH8.0におい
てはpH7.0におけるより実質的に多くの抗体を保持した
ことも又明らかである。

実施例III 対照の被覆流体が9.48gの蒸留水に溶かした0.10gのア
ガロースに以下の成分を50℃で加えることによって調製
された。400μｌの0.25Mビス−トリスプロパンpH11.3緩
衝液、20μｌの10％ツィーン20、及び40μｌの0.5ヘペ
スpH7.5緩衝液、5.0mgのグルコースオキシダーゼと、蒸
留水で総量2.0gに調製された5.0mgのウシの血清アルブ
ミンを含む200μｌのグルコースオキシダーゼストック
溶液。組成物は下被覆されたポリエステルテレフタレー
トベース層にドローダウンロッドを用いて施されそのエ
レメントは室温で乾燥された。乾燥層は約1000mg/m²の
アガロースと約300mg/m²の緩衝液を含んだ。グルコース
オキシダーゼ層は5mlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液溶
液（pH7.0）と接触しておかれその混合物は揺動テーブ
ルにおかれて緩やかにかき混ぜられた。緩衝液溶液のア
リコートが種々の時間おきにとり出されGOD含量が分析
された。

又試験層はアガロース／グリオキシルアガロースの異
った配合とアルデヒデの異った含量で形成された。試験
層は又400μｌの0.25M炭酸ナトリウムpH9.0緩衝液を前
記のビス−トリスプロパン緩衝液の位置に加えることに
よって緩衝処理され、90mg/m²の炭酸ナトリウムを含む
層が得られた。得られたデータを表IIIに示す。

試験エレメントのグルコースオキシダーゼの活性が対
照の値を1.00としてそれに対する相対値で示されてい
る。炭酸ナトリウム緩衝液をもつグリオキシルアガロー
ス層は試薬層に極めて効果的にグルコースオキシダーゼ
を固定化保持したことが判る。異ったアルデヒド含量を
もつ２つの3:1配合物が同等にグルコースオキシダーゼ
の固定化に有効であったことも明らかである。又ビス−
トリス−プロパン緩衝液をもつグリオキシルアガロース
層がマトリックス材料のアルデヒド含量が増加するに従
って有効性が増大したことも判った。

実施例IV この発明による分析エレメントが透明な下被覆をされ
たポリエチレンテレフタレート支持層に以下を順次重ね
て調製された。

1.約500mg/m²の3:1アガロース／グリオキシルアガロー
ス混合物、約21.5mg/m²の炭酸ナトリウム（pH9.1）、及
びテオフィリン抗体と次式で示される蛍光でラベルされ
たテオフィリン共役体との約10mg/m²の複合体を含む試
薬層。

2.約6000mg/m²の酸化鉄及び約2000mg/m²のアガロース中
の約15.1mg/m²の２′−モルホリノエタンスルホン酸（p
H5.7）を含む光ブロッキング層。と 3.約2000mg/m²のアガロースを含むトップコート層。

分析装置は分析エレメントのトップコートをサンプル
適用ユニットの溝面に接触させるようにおくことによっ
て形成された。サンプル適用ユニットは、詳細は共有に
譲渡された同時係属出願シリアルNo.133,071、1987年12
月21日提出に記載されているが、溝面に流体的に接触す
る濾過エレメントも含んでいた。既知量のテオフィリン
をもつサンプルが濾過エレメントに供給された。装置は
そのあと37℃で30分間インキュベートされた。キセノン
ランプからの550nmの刺激エネルギを用いてベース層を
通して分析エレメントを刺激することにより２分間ごと
に読みとりがなされた。蛍光シグナルは580nmにおいて
読まれた。供試サンプルにおけるテオフィリンの濃度
（μg/ml）はそれぞれ0;2.5;5.0;10.0;及び40.0であっ
た。

サンプルに対するシグナル強度はテオフィリンの濃度
の増加と共に減少しそれによって分析エレメントは意図
した方法で操作されたことが示された。更に各サンプル
に対し、平衡に達する最初の時間の経過後（対照に対し
２分、テオフィリンサンプルに対し６分）、電圧シグナ
ルは実質的に同一に保たれそれによって抗体は試薬層に
おいて30分間固定化されて残ったことを示した。

６分間インキュベーションの後サンプルからの読みを
ベースにした標準曲線がプロットされた。読みは以下の
通り。

標準曲線は分析範囲（2.0−40μg/ml）では直線で、
そして分析範囲の中心で比較的急な傾斜をもった。

実施例Ｖこの発明による分析エレメントが、透明な下被覆され
たポリエチレンテレフタレート支持層に以下を順次重ね
て調製された。

1.フェニトイン抗体と、フェニトインに結合した、実施
例IVに例示されたテオフィリン共役体中に示されるロー
ダミン染料でつくられ、蛍光でラベルされたフェニトイ
ン共役体との複合体の約15mg/m²、及び約1000mg/m²の3:
1配合のアガロース／グリオキシルアガロースの混合物
に分散された約84mg/m²の炭酸ナトリウム（pH9.0）を含
む試薬層。

2.約6000mg/m²の酸化鉄と約2000mg/m²のアガロース中の
約212mg/m²の２′−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン
酸（pH5.75）を含む光ブロッキング層。及び 3.約4000mg/m²のアガロースとポリアクリルアミドとの
グラフト共重合体を含むトップコート層。

既知量のフェニトイン（０、2.0及び50.6μg/ml）を
含む約40μｌの血漿サンプルが分析エレメントのジスク
（3.5cm径）に、下被覆されたポリエチレンテレフタレ
ート層上に最初にそのサンプルを施すことにより供給さ
れ、ついで分析サンプルをトップコート層を下にして液
体サンプル上におかれた。このようにして形成された分
析装置は37℃の実験装置におかれそしてキセノンランプ
からの分析エレメントに対する550nmの刺激エネルギに
よるベース層を通した刺激によって580nmにおける蛍光
シグナルが集められ２分間隔で蛍光シグナルが読まれ
た。対照（０μg/mlフェニトイン）が加えられた分析エ
レメントから得られたシグナルは実質的に30分間に亘っ
て同一の値を表しそれによって抗体が試薬層から拡散し
なかったことを示した。更にシグナルはフェニトイン濃
度の増加に伴って減少しそれによって分析エレメントが
意図通りに働いたことを示した。

実施例VI この発明による分析エレメントが下被覆されたポリエ
チンレンテレフタレートベース層に以下を順次重ねて調
製された。

1.テオフィリン抗体と、約500mg/m²のアガロース中の実
施例IVに記載の蛍光でラベルされたテオフィリン共役体
との複合体を約10mg/m²含む試薬層。

2.1000mg/m²の3:1配合のアガロース／グリオキシルアガ
ロースの混合物を含む濾過層。

この構造をもつ分析エレメントは、異ったphで緩衝さ
れた溶液からつくられた濾過層をもつものでもつくられ
た。対照の分析エレメントは、アガロース／グリオキシ
ルアガロース混合物の代りに約1000mg/m²のアガロース
を含む濾過層でつくられた。

3.3cm²の各分析エレンメント片は、濾過層を下にして約
2mlのpH7.0のリン酸塩緩衝液に30分間浮かされた。つい
で分析エレメントは乾燥され蛍光の放射シグナルが測定
された。同様の実験が10^-3Ｍのテオフィリンを含むpH7.
0のリン酸塩緩衝液について行われた。得られたデータ
を表IVに示す。

テオフィリンを含まない緩衝液に浮かせた分析エレメ
ントから得られたデータは、アガロースを含む濾過層は
共役体が試薬層の外に拡散することを防止しなかったの
に対し、3:1配合のアガロース／グリオキシルアガロー
ス混合物をもつ濾過層は、特にpH9.0及び10.0に緩衝さ
れたものはそれぞれ、効果的にテオフィリン抗体が拡散
するのを防止したことを示す。分析エレメントが10^-3Ｍ
のテオフィリンを含む溶液と接触した時、競合反応が生
じて極めて低いシグナルが得られた。10^-3Ｍのテオフィ
リン濃度は、最初に層に存在したラベルされたテオフィ
リン共役体のすべてを実質的に追い出すのに十分である
と計算された。

この発明は特定の好ましい実施態様について記載され
たが、それはそれらに限定されることを意図するもので
はなく、当業者はむしろ変形や修正がこの発明の精神や
付属の特許請求項の範囲においておこないえることを認
識するであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｑ 1/26 7823−4ＢＣ１２Ｑ 1/26

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】少くともひとつが試薬層である別々に分離
した複数の層を含み、前述の複数の層の少くともひとつ
がグリオキシルアガロースを含むマトリックス材料で形
成された多層診断分析エレメント。
【請求項２】請求項１に記載の診断エレメントであっ
て、前述のマトリックス材料がグリオキシルアガロース
と他の多糖類との混合物を含むことを特徴とする診断エ
レメント。
【請求項３】請求項２に記載の診断エレメントであっ
て、前述のマトリックス材料がアガロースとグリオキシ
ルアガロースとの重量で3:1の混合物を含むことを特徴
とする診断エレメント。
【請求項４】請求項３に記載の診断エレメントであっ
て、前述のマトリックス材料がマトリックス材料グラム
当り約0.04meqから約0.20meqのアルデヒドを含むことを
特徴とする診断エレメント。
【請求項５】請求項４に記載の診断エレメントであっ
て、前述の試薬層が前述のマトリックス材料で形成され
ることを特徴とする診断エレメント。
【請求項６】請求項５に記載の診断エレメントであっ
て、前述の試薬層が蛋白質を含むことを特徴とする診断
エレメント。
【請求項７】請求項６に記載の診断エレメントであっ
て、前述の蛋白質が抗体又は抗体断片であることを特徴
とする診断エレメント。
【請求項８】ひとつの支持層と、グリオキシルアガロー
スを含むマトリックス材料に固定化された試薬を含むひ
とつの試薬層と、ひとつの光ブロッキング層とを含む多
層診断分析エレメント。
【請求項９】請求項８に記載の診断分析エレメントであ
って、前述のマトリックス材料がグリオキシルアガロー
スと他の多糖類との混合物を含むことを特徴とする診断
分析エレメント。
【請求項１０】請求項９に記載の診断分析エレメントで
あって、前述のマトリックス材料がアガロースとグリオ
キシルアガロースとの重量で3:1の混合物を含むことを
特徴とする診断分析エレメント。
【請求項１１】請求項10に記載の診断分析エレメントで
あって、前述のマトリックス材料がマトリックス材料グ
ラム当り約0.04meqから約0.20meqのアルデヒドを含むこ
とを特徴とする診断分析エレメント。
【請求項１２】請求項11に記載の診断分析エレメントで
あって、前述の試薬層が前述のマトリックス材料に固定
化された蛋白質を含むことを特徴とする診断分析エレメ
ント。
【請求項１３】請求項12に記載の診断分析エレメントで
あって、前述の蛋白質が抗体又は抗体断片であることを
特徴とする診断分析エレメント。
【請求項１４】請求項12に記載の診断分析エレメントで
あって、前述の抗体又は抗体断片が約5000までの分子量
をもつ分析物に対し特異的であることを特徴とする診断
分析エレメント。
【請求項１５】請求項８に記載の診断分析エレメントで
あって、更にトップコート層を含むことを特徴とする診
断分析エレメント。
【請求項１６】ひとつの支持層と、ひとつの試薬層と、
グリオキシルアガロースを含むマトリックス材料で形成
された試薬拡散防止層と、光ブロッキング層とを含む多
層診断分析エレメント。
【請求項１７】請求項16に記載の診断分析エレメントで
あって、前述のマトリックス材料がグリオキシルアガロ
ースと他の多糖類との混合物を含むことを特徴とする診
断分析エレメント。
【請求項１８】請求項17に記載の診断分析エレメントで
あって、前述のマトリックス材料がアガロースとグリオ
キシルアガロースとの重量で3:1の混合物を含むことを
特徴とする診断分析エレメント。
【請求項１９】請求項18に記載の診断分析エレメントで
あって、前述のマトリックス材料がマトリックス材料グ
ラム当り約0.04meqから約0.20meqのアルデヒドを含むこ
とを特徴とする診断分析エレメント。
【請求項２０】請求項19に記載の診断分析エレメントで
あって、前述の試薬層が蛋白質を含むことを特徴とする
診断分析エレメント。
【請求項２１】請求項20に記載の診断分析エレメントで
あって、前述の蛋白質が抗体又は抗体断片であることを
特徴とする診断分析エレメント。
【請求項２２】請求項21に記載の診断分析エレメントで
あって、前述の抗体又は抗体断片が約5000までの分子量
をもつ分析物に対し特異的であることを特徴とする診断
分析エレメント。
【請求項２３】請求項16に記載の診断分析エレメントで
あって、更に第２の試薬層を含むことを特徴とする診断
分析エレメント。