JPH0682455A - 結合マトリックスの製造方法、試料溶液中の被検体の測定方法、再生可能な層および新規化合物 - Google Patents
結合マトリックスの製造方法、試料溶液中の被検体の測定方法、再生可能な層および新規化合物Info
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- C07C323/50—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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- G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 担体物質およびそれに固定基を介して吸着さ
れた固相反応物を含有し、固相反応物が担体物質の表面
上に希薄で主として横に均一な結合層を形成する結合マ
トリックスを、妨害有機溶剤および洗剤を使用せずに製
造する。 【構成】 担体物質を、短鎖スペーサ分子を介して固定
基と結合した固相反応物および少なくとも１つの親水性
希釈分子を含有する水性反応溶液と共にインキュベート
する。
れた固相反応物を含有し、固相反応物が担体物質の表面
上に希薄で主として横に均一な結合層を形成する結合マ
トリックスを、妨害有機溶剤および洗剤を使用せずに製
造する。 【構成】 担体物質を、短鎖スペーサ分子を介して固定
基と結合した固相反応物および少なくとも１つの親水性
希釈分子を含有する水性反応溶液と共にインキュベート
する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、担体物質およびそれに
固定基を介して吸着された、少なくとも１つの遊離反応
成分と結合しうる固相反応物を含有し、この固相反応物
が担体材料の表面上に希薄結合層を形成する結合マトリ
ックスを製造する方法に関する。
固定基を介して吸着された、少なくとも１つの遊離反応
成分と結合しうる固相反応物を含有し、この固相反応物
が担体材料の表面上に希薄結合層を形成する結合マトリ
ックスを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】分子の認識反応とは共有原子結合を形成
することなしに起きる２つの分子の強固かつ特異的結合
である。実際の操作には、殊に固体担体物質と流体環境
との間の境界面において進行するような反応が重要であ
る。このためには固体担体物質の表面に、固相反応物を
含有する固定層が塗布される。この固定層において本来
の認識反応が進行する。
することなしに起きる２つの分子の強固かつ特異的結合
である。実際の操作には、殊に固体担体物質と流体環境
との間の境界面において進行するような反応が重要であ
る。このためには固体担体物質の表面に、固相反応物を
含有する固定層が塗布される。この固定層において本来
の認識反応が進行する。
【０００３】かかる固定層の１例は重合アルブミンに結
合したストレプトアビジンであり、これがプラスチック
表面に良好に吸着結合する。この固相は、ビオチンない
しはビオチニル化反応物を用い多数の免疫試験に使用す
ることができる。ストレプトアビジン／ポリアルブミン
に基づくこの結合マトリックスは、“大きい”プラスチ
ック表面に対し極めて好適である。しかし、被覆される
表面が小さくなると、試験の精度が減少する。新しい試
験系（たとえば古典的ＥＬＩＳＡ）または光学的または
電気化学的センサによる測定においては、ミニアチュア
化の必要性が増加している。
合したストレプトアビジンであり、これがプラスチック
表面に良好に吸着結合する。この固相は、ビオチンない
しはビオチニル化反応物を用い多数の免疫試験に使用す
ることができる。ストレプトアビジン／ポリアルブミン
に基づくこの結合マトリックスは、“大きい”プラスチ
ック表面に対し極めて好適である。しかし、被覆される
表面が小さくなると、試験の精度が減少する。新しい試
験系（たとえば古典的ＥＬＩＳＡ）または光学的または
電気化学的センサによる測定においては、ミニアチュア
化の必要性が増加している。
【０００４】ブランケンブルグ（Ｂｌａｎｋｅｎｂｕｒ
ｇ）等（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８（１９８９
年）、第８２１４頁）およびアーレリス（Ａｈｌｅｒ
ｓ）等（Ｔｈｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｆｉｌｍｓ，第１８０
巻（１９８９年）第９３頁〜第９９頁）の研究には、ラ
ングミュア・ブロジェット（ＬＢ）膜に基づくストレプ
トアビジン単分子層が記載される。このためには、差当
りビオチンリピド単分子層をフィルムバランスの複雑な
技術を用いて製造し、引き続き該単分子層をストレプト
アビジン溶液と共に約２時間インキュベートしなければ
ならない。さらに、このＬＢ膜の欠点は、殊にその乾燥
に対する安定性が制限されていることである。
ｇ）等（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８（１９８９
年）、第８２１４頁）およびアーレリス（Ａｈｌｅｒ
ｓ）等（Ｔｈｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｆｉｌｍｓ，第１８０
巻（１９８９年）第９３頁〜第９９頁）の研究には、ラ
ングミュア・ブロジェット（ＬＢ）膜に基づくストレプ
トアビジン単分子層が記載される。このためには、差当
りビオチンリピド単分子層をフィルムバランスの複雑な
技術を用いて製造し、引き続き該単分子層をストレプト
アビジン溶液と共に約２時間インキュベートしなければ
ならない。さらに、このＬＢ膜の欠点は、殊にその乾燥
に対する安定性が制限されていることである。
【０００５】担体物質上に固定層をつくるもう１つの方
法は、いわゆる“自己集合性単分子層（Ｓｅｌｆ−ａｓ
ｓｅｍｂｌｅｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）”（ＳＡＭ）で
ある。それで、ヌッツオ（Ｎｕｚｚｏ）およびアレーラ
（Ａｌｌａｒａ）（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第
１０５巻（１９８３年）、第４４８１頁〜第４４８３
頁）は最密充填の単分子層を生じる、金への有機二硫化
物の吸着を記載している。かかる単分子層の自然組織化
（Ｓｐｏｎｔａｎｅ Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ、従っ
て記号ＳＯＭ）は、担体物質と吸着質との間の強い特異
的相互作用に基づく。ベイン（Ｂａｉｎ）およびホワイ
トサイズ（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ）（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈ
ｅｍ．，第１０１巻（１９８９年）、第５２２頁〜第５
２８頁）は、金表面に長鎖チオールの吸着によって生成
するＳＡＭを記載している。それで、金表面を希薄有機
溶液（たとえば１ｍモル／ｌ）からの式：
法は、いわゆる“自己集合性単分子層（Ｓｅｌｆ−ａｓ
ｓｅｍｂｌｅｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）”（ＳＡＭ）で
ある。それで、ヌッツオ（Ｎｕｚｚｏ）およびアレーラ
（Ａｌｌａｒａ）（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第
１０５巻（１９８３年）、第４４８１頁〜第４４８３
頁）は最密充填の単分子層を生じる、金への有機二硫化
物の吸着を記載している。かかる単分子層の自然組織化
（Ｓｐｏｎｔａｎｅ Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ、従っ
て記号ＳＯＭ）は、担体物質と吸着質との間の強い特異
的相互作用に基づく。ベイン（Ｂａｉｎ）およびホワイ
トサイズ（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ）（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈ
ｅｍ．，第１０１巻（１９８９年）、第５２２頁〜第５
２８頁）は、金表面に長鎖チオールの吸着によって生成
するＳＡＭを記載している。それで、金表面を希薄有機
溶液（たとえば１ｍモル／ｌ）からの式：
【０００６】
【化１】
【０００７】で示されるチオールと共にインキュベート
することによって最密充填の単分子層が得られる。この
単分子層は、乾燥状態で、水またはエタノール中で室温
で数ケ月にわたって安定である。７０℃以上の温度に加
熱すると、脱着が起きる。単分子層の安定性は、チオー
ルの脂肪族連鎖の長さと共に増加する。希酸（たとえば
１Ｎ ＨＣｌ）または希アルカリ（たとえば１Ｎ Ｎａ
ＯＨ）に対しても、この単分子層は特定期間（１〜７
日）にわたって安定である。
することによって最密充填の単分子層が得られる。この
単分子層は、乾燥状態で、水またはエタノール中で室温
で数ケ月にわたって安定である。７０℃以上の温度に加
熱すると、脱着が起きる。単分子層の安定性は、チオー
ルの脂肪族連鎖の長さと共に増加する。希酸（たとえば
１Ｎ ＨＣｌ）または希アルカリ（たとえば１Ｎ Ｎａ
ＯＨ）に対しても、この単分子層は特定期間（１〜７
日）にわたって安定である。
【０００８】ヨーロッパ公開特許第３３９８２１号は、
適当な固相反応物、たとえばビオチンを結合し、次いで
それにストレプトアビジンを結合するために、固体担体
物質に対する結合媒体としてチオール基およびアミノ基
を含有する、金属表面を被覆するためのポリマーを開示
している。しかし、これらのチオール基含有ポリマー
は、同様にそのポリマー特性に基づき厳密に均一な被覆
を達成できない。
適当な固相反応物、たとえばビオチンを結合し、次いで
それにストレプトアビジンを結合するために、固体担体
物質に対する結合媒体としてチオール基およびアミノ基
を含有する、金属表面を被覆するためのポリマーを開示
している。しかし、これらのチオール基含有ポリマー
は、同様にそのポリマー特性に基づき厳密に均一な被覆
を達成できない。
【０００９】エバーソール（Ｅｂｅｒｓｏｌｅ）等
（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１２２巻（１９９
０年）、第３２３９頁〜第３２４１頁）は、金および銀
の表面でのこれらタンパク質の直接吸着によるアビジン
およびストレプトアビジンの機能活性吸着を開示してい
る。その際、ビオチニル化結合成分との２０分の比較的
長いインキュベーション時間にも拘らず、この結合成分
による非常に不十分な被覆しか生じない最密充填のスト
レプトアビジン結合相が生じる。
（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１２２巻（１９９
０年）、第３２３９頁〜第３２４１頁）は、金および銀
の表面でのこれらタンパク質の直接吸着によるアビジン
およびストレプトアビジンの機能活性吸着を開示してい
る。その際、ビオチニル化結合成分との２０分の比較的
長いインキュベーション時間にも拘らず、この結合成分
による非常に不十分な被覆しか生じない最密充填のスト
レプトアビジン結合相が生じる。
【００１０】要するに、先行技術については、そこに記
載された単分子層を基礎とする結合相は、緩慢にまたは
僅かな被覆で、遊離反応物を結合しうるにすぎないこと
が確認される。従って、先行技術のこれらの欠点を少な
くとも部分的に除去する大きな必要性が存在した。殊
に、できるだけ短時間にできるだけ大量の細かい反応物
を結合することのできる、できるだけ微視的に均一な普
遍結合相を提供すべきである。
載された単分子層を基礎とする結合相は、緩慢にまたは
僅かな被覆で、遊離反応物を結合しうるにすぎないこと
が確認される。従って、先行技術のこれらの欠点を少な
くとも部分的に除去する大きな必要性が存在した。殊
に、できるだけ短時間にできるだけ大量の細かい反応物
を結合することのできる、できるだけ微視的に均一な普
遍結合相を提供すべきである。
【００１１】このために、ドイツ国特許第４０３９６７
７号には、担体物質およびそれに固定基を介して吸着さ
れた、少なくとも１つの遊離反応成分と結合しうる固相
反応物を含有する結合マトリックスが提案されており、
その際固相反応物は担体物質の表面上に、希薄で主とし
て横に均一な結合層を形成する。固相反応物は、スペー
サ分子を介して固定基と結合していてもよく、その際さ
らにスペーサ分子と固相反応物との間には親水性のリン
カー基、たとえばジアミノジオキソオクタン（ＤＡＤＯ
Ｏ）が存在しうる。
７号には、担体物質およびそれに固定基を介して吸着さ
れた、少なくとも１つの遊離反応成分と結合しうる固相
反応物を含有する結合マトリックスが提案されており、
その際固相反応物は担体物質の表面上に、希薄で主とし
て横に均一な結合層を形成する。固相反応物は、スペー
サ分子を介して固定基と結合していてもよく、その際さ
らにスペーサ分子と固相反応物との間には親水性のリン
カー基、たとえばジアミノジオキソオクタン（ＤＡＤＯ
Ｏ）が存在しうる。
【００１２】結合マトリックスの製造は従来、適当な有
機溶剤、たとえばクロロホルム、アルコールまたは双方
からなる混合物中のチオールの溶液を製造し、担体物
質、とくに金の表面を適当な条件下に該溶液で濡らすよ
うにして行なわれた。しかし、有機溶剤の使用は、大工
業的生産においては欠点を伴なっていた。さらに、これ
らの溶剤は固相反応物および結合成分の生物学的性質に
影響を及ぼしうる。
機溶剤、たとえばクロロホルム、アルコールまたは双方
からなる混合物中のチオールの溶液を製造し、担体物
質、とくに金の表面を適当な条件下に該溶液で濡らすよ
うにして行なわれた。しかし、有機溶剤の使用は、大工
業的生産においては欠点を伴なっていた。さらに、これ
らの溶剤は固相反応物および結合成分の生物学的性質に
影響を及ぼしうる。
【００１３】ドイツ国特許第４０３９６７７号の実施形
においては、固相反応物と結合しているスペーサ分子の
ほかになお、固定基を備えているが、固相反応物と結合
していないスペーサ分子を含有する結合マトリックスが
開示されている。こうして、遊離反応成分を固定するた
めの固相反応物の最適充填層、それと共に非充填結合マ
トリックスを得ることができる。固相反応物なしの適当
なスペーサ分子（希釈剤または希釈分子と呼ばれる）の
１例は、メルカプトウンデカノール、つまり長鎖の親油
性物質である。
においては、固相反応物と結合しているスペーサ分子の
ほかになお、固定基を備えているが、固相反応物と結合
していないスペーサ分子を含有する結合マトリックスが
開示されている。こうして、遊離反応成分を固定するた
めの固相反応物の最適充填層、それと共に非充填結合マ
トリックスを得ることができる。固相反応物なしの適当
なスペーサ分子（希釈剤または希釈分子と呼ばれる）の
１例は、メルカプトウンデカノール、つまり長鎖の親油
性物質である。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】意外にも、固相反応物
と結合した短鎖のスペーサ分子は、親水性希釈剤と組合
せて水溶液から自己集合性プロセスで、普遍性結合マト
リックスとしてなお有利な性質を有する単分子層を形成
することが確認された。このような親油性成分の使用
は、担体物質の被覆を水または水性反応溶液から行なう
ことができ、これによって固相反応物が強い親水性を有
する場合、結合マトリックスの構成による溶解度の問題
が生じないという利点を有する。水性溶媒使用のもう１
つの利点は、付加的溶解助剤（たとえば洗剤）が存在す
る必要がないことである。即ち、このような溶解助剤
は、結合マトリックスの均一な構成ならびに固相反応物
および結合成分の生物学的性質を妨げうる。
と結合した短鎖のスペーサ分子は、親水性希釈剤と組合
せて水溶液から自己集合性プロセスで、普遍性結合マト
リックスとしてなお有利な性質を有する単分子層を形成
することが確認された。このような親油性成分の使用
は、担体物質の被覆を水または水性反応溶液から行なう
ことができ、これによって固相反応物が強い親水性を有
する場合、結合マトリックスの構成による溶解度の問題
が生じないという利点を有する。水性溶媒使用のもう１
つの利点は、付加的溶解助剤（たとえば洗剤）が存在す
る必要がないことである。即ち、このような溶解助剤
は、結合マトリックスの均一な構成ならびに固相反応物
および結合成分の生物学的性質を妨げうる。
【００１５】
【課題を解決するための手段】従って、本発明の対象
は、担体物質およびそれに固定基を介して吸着された、
少なくとも１つの遊離反応成分と結合しうる固相反応物
を含有し、その際固相反応物は希薄で主として横に均一
な結合層を形成する結合マトリックスの製造方法であ
り、担体物質を、短鎖のスペーサ分子を介して固定基と
結合した固相反応物および少なくとも１つの親水性希釈
分子を含有する水性反応溶液とインキュベートすること
を特徴とする。
は、担体物質およびそれに固定基を介して吸着された、
少なくとも１つの遊離反応成分と結合しうる固相反応物
を含有し、その際固相反応物は希薄で主として横に均一
な結合層を形成する結合マトリックスの製造方法であ
り、担体物質を、短鎖のスペーサ分子を介して固定基と
結合した固相反応物および少なくとも１つの親水性希釈
分子を含有する水性反応溶液とインキュベートすること
を特徴とする。
【００１６】水性反応溶液は、とくに２０％（ｖ／ｖ）
よりも少ない、とくに望ましくは１％（ｖ／ｖ）よりも
少ない有機溶剤を含有する水または水性緩衝液系であ
る。水性緩衝剤系は最も望ましくは、有機溶剤または洗
剤のような付加的溶解助剤を含有していない。
よりも少ない、とくに望ましくは１％（ｖ／ｖ）よりも
少ない有機溶剤を含有する水または水性緩衝液系であ
る。水性緩衝剤系は最も望ましくは、有機溶剤または洗
剤のような付加的溶解助剤を含有していない。
【００１７】本発明による結合マトリックスの担体物質
は、金属または金属酸化物の表面を有することができ
る。とくに、担体物質は金属表面、とくに望ましくは貴
金属表面を有する。金表面を有する担体物質の製造は、
たとえば付着助剤としてクロムを用いて金を蒸着するこ
とによって行なわれ、その際約０．１〜１０ｎｍの厚さ
の層が生じる。このクロム層に引き続き金を蒸着し、そ
の際本発明による結合マトリックスの担体物質の表面を
形成する金層が生じる。この金層は、結合マトリックス
を表面プラズモン共鳴の範囲内で使用する場合には、有
利に約１０〜１００ｎｍの厚さである。他の適用の場
合、たとえば電気化学的センサとして使用する場合に
は、結合マトリックスはより厚く選択することもでき
る。
は、金属または金属酸化物の表面を有することができ
る。とくに、担体物質は金属表面、とくに望ましくは貴
金属表面を有する。金表面を有する担体物質の製造は、
たとえば付着助剤としてクロムを用いて金を蒸着するこ
とによって行なわれ、その際約０．１〜１０ｎｍの厚さ
の層が生じる。このクロム層に引き続き金を蒸着し、そ
の際本発明による結合マトリックスの担体物質の表面を
形成する金層が生じる。この金層は、結合マトリックス
を表面プラズモン共鳴の範囲内で使用する場合には、有
利に約１０〜１００ｎｍの厚さである。他の適用の場
合、たとえば電気化学的センサとして使用する場合に
は、結合マトリックスはより厚く選択することもでき
る。
【００１８】担体物質の表面への固相反応物の吸着は、
固定基によって媒介される。固定基の種類は、担体物質
のそのつどの表面に依存する。金属表面を有する担体物
質の固定基としては、チオール基、ジルスフィド基また
はホスフィン基が適当である。それで、たとえばチオー
ル基またはジルスフィド基は金または銀表面の固定基と
してかつホスフィン基はパラジウム表面の固定基として
とくに適当である。担体物質が金属酸化物（たとえばＡ
ｌ2Ｏ3）表面を有する場合、固定基としてはカルボキシ
レート基またはスルホネート基が適当である。
固定基によって媒介される。固定基の種類は、担体物質
のそのつどの表面に依存する。金属表面を有する担体物
質の固定基としては、チオール基、ジルスフィド基また
はホスフィン基が適当である。それで、たとえばチオー
ル基またはジルスフィド基は金または銀表面の固定基と
してかつホスフィン基はパラジウム表面の固定基として
とくに適当である。担体物質が金属酸化物（たとえばＡ
ｌ2Ｏ3）表面を有する場合、固定基としてはカルボキシ
レート基またはスルホネート基が適当である。
【００１９】固相に対する吸着のための固定基は直接に
固相反応物自体に取付けられていないで、短鎖のスペー
サ分子、とくに可変スペーサ分子を介して固相反応物と
結合している。短鎖のスペーサ分子としては、本発明の
範囲内では式：（ＣＨ2）n（ここでｎは１〜６、とくに
１〜４、殊に望ましくは１〜３の自然数である）で示さ
れるアルキレン基が妥当である。スペーサ分子はその一
方の側に、担体物質の表面への吸着に適当な固定基（た
とえばチオール基またはジスルフィド基）を含有する。
スペーサ分子は、その他方の側（つまり担体物質から離
反する側）に、固相反応物またはその１成分がスペーサ
分子と結合している１つまたは幾つかの結合基を含有す
る。これらの結合基は、たとえば固相反応物のカルボキ
シル官能基とエステル基またはアミド基の形成下に結合
しているアミノ−またはヒドロキシル官能基であっても
よい。しかし、スペーサ分子は結合基として、同様に固
相反応物の反応性アミノ−またはヒドロキシル官能基と
結合しているカルボキシル官能基を含有しうる。スペー
サ分子の選択の場合には短い鎖長が重要である。それと
いうのも疎水性基が大きすぎると、固相反応物およびス
ペーサからなる錯体はもはや十分に水溶性ではないから
である。
固相反応物自体に取付けられていないで、短鎖のスペー
サ分子、とくに可変スペーサ分子を介して固相反応物と
結合している。短鎖のスペーサ分子としては、本発明の
範囲内では式：（ＣＨ2）n（ここでｎは１〜６、とくに
１〜４、殊に望ましくは１〜３の自然数である）で示さ
れるアルキレン基が妥当である。スペーサ分子はその一
方の側に、担体物質の表面への吸着に適当な固定基（た
とえばチオール基またはジスルフィド基）を含有する。
スペーサ分子は、その他方の側（つまり担体物質から離
反する側）に、固相反応物またはその１成分がスペーサ
分子と結合している１つまたは幾つかの結合基を含有す
る。これらの結合基は、たとえば固相反応物のカルボキ
シル官能基とエステル基またはアミド基の形成下に結合
しているアミノ−またはヒドロキシル官能基であっても
よい。しかし、スペーサ分子は結合基として、同様に固
相反応物の反応性アミノ−またはヒドロキシル官能基と
結合しているカルボキシル官能基を含有しうる。スペー
サ分子の選択の場合には短い鎖長が重要である。それと
いうのも疎水性基が大きすぎると、固相反応物およびス
ペーサからなる錯体はもはや十分に水溶性ではないから
である。
【００２０】差当り、水溶液から製造できない固相反応
物の本発明によらない最密充填の単分子層を記載する。
かかる層は、ベイン（Ｂａｉｎ）およびホワイトサイズ
（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ）（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，
第１０１巻（１９８９年）、第５２２頁〜第５２８頁）
の研究により、ヒドロキシル−またはアミノ末端基を有
する脂質を活性化ビオチン誘導体と反応させると得ら
れ、その際出発物質として１１−ヒドロキシ−ウンデカ
ン−１−チオールの使用下に次式で示されるビオチニル
化アルカンチオールが生成する：
物の本発明によらない最密充填の単分子層を記載する。
かかる層は、ベイン（Ｂａｉｎ）およびホワイトサイズ
（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ）（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，
第１０１巻（１９８９年）、第５２２頁〜第５２８頁）
の研究により、ヒドロキシル−またはアミノ末端基を有
する脂質を活性化ビオチン誘導体と反応させると得ら
れ、その際出発物質として１１−ヒドロキシ−ウンデカ
ン−１−チオールの使用下に次式で示されるビオチニル
化アルカンチオールが生成する：
【００２１】
【化２】
【００２２】金表面を有する担体物質にこのアルカンチ
オールを飽和するまで吸着する場合、厚さの測定によれ
ばビオチンに関して１００％の被覆を有する最密充填の
単分子層が生成する。こうして、そのものとしては本発
明によらずかつ遊離反応成分（この場合にはストレプト
アビジン）に対し僅かな結合力しか有しない剛体の結合
マトリックスが得られる。
オールを飽和するまで吸着する場合、厚さの測定によれ
ばビオチンに関して１００％の被覆を有する最密充填の
単分子層が生成する。こうして、そのものとしては本発
明によらずかつ遊離反応成分（この場合にはストレプト
アビジン）に対し僅かな結合力しか有しない剛体の結合
マトリックスが得られる。
【００２３】これとは異なり、本発明による結合マトリ
ックスの製造は、固相反応物の２以上の分子、とくに２
分子と同時に結合しているスペーサ分子の使用によって
可能である。かかるスペーサ分子の１例はシスタミンで
あり、このものは固定基として１つのジスルフィド基お
よび結合基として２つのアミノ官能基を含有し、従って
活性化ビオチンの２分子と結合することができ、その際
次式で示されるビオチニル化化合物が生成する：
ックスの製造は、固相反応物の２以上の分子、とくに２
分子と同時に結合しているスペーサ分子の使用によって
可能である。かかるスペーサ分子の１例はシスタミンで
あり、このものは固定基として１つのジスルフィド基お
よび結合基として２つのアミノ官能基を含有し、従って
活性化ビオチンの２分子と結合することができ、その際
次式で示されるビオチニル化化合物が生成する：
【００２４】
【化３】
【００２５】このビオチニル化化合物は、金表面に吸着
する際、ビオチンに関して３０％の被覆度を有する本発
明による結合マトリックスを構成し、該マトリックスは
高い親和力を有する遊離反応成分（ストレプトアビジ
ン）を最密充填膜に結合することができる。
する際、ビオチンに関して３０％の被覆度を有する本発
明による結合マトリックスを構成し、該マトリックスは
高い親和力を有する遊離反応成分（ストレプトアビジ
ン）を最密充填膜に結合することができる。
【００２６】とくに、スペーサ分子と固相反応物の間に
は親水性のリンカー基が存在する。このリンカーは、殊
に４〜１５原子の鎖長を有する直鎖状分子であり、その
際リンカーの連鎖はとくにＣ原子とヘテロ原子（とくに
Ｎ原子およびＯ原子）から構成されている。この場合、
１つまたは幾つか、とくに１〜５個の親水性エチレンオ
キシド単位を含有するリンカー基がとくに望ましい。と
くに望ましくは、親水性リンカー基はアミン−またはヒ
ドロキシル成端ポリエチレンオキシドによって形成され
る。
は親水性のリンカー基が存在する。このリンカーは、殊
に４〜１５原子の鎖長を有する直鎖状分子であり、その
際リンカーの連鎖はとくにＣ原子とヘテロ原子（とくに
Ｎ原子およびＯ原子）から構成されている。この場合、
１つまたは幾つか、とくに１〜５個の親水性エチレンオ
キシド単位を含有するリンカー基がとくに望ましい。と
くに望ましくは、親水性リンカー基はアミン−またはヒ
ドロキシル成端ポリエチレンオキシドによって形成され
る。
【００２７】親水性リンカーと固相反応物の間には、と
くに、式：（ＣＨ2）n（ここでｎは２〜１２、とくに２
〜８の自然数である）で示されるアルキレン基および結
合基からなるもう１つのスペーサ分子を組み込むことが
できる。
くに、式：（ＣＨ2）n（ここでｎは２〜１２、とくに２
〜８の自然数である）で示されるアルキレン基および結
合基からなるもう１つのスペーサ分子を組み込むことが
できる。
【００２８】固相反応物のとくに適当なリンカーとして
は、１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタンが判
明した。それで、Ｃ3−チオールスペーサ分子とビオチ
ンスペーサ分子の間に１，８−ジアミノ−３，６−ジオ
キサオクタンを組込むことによって次式で示されるビオ
チニル化化合物が生成する：
は、１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタンが判
明した。それで、Ｃ3−チオールスペーサ分子とビオチ
ンスペーサ分子の間に１，８−ジアミノ−３，６−ジオ
キサオクタンを組込むことによって次式で示されるビオ
チニル化化合物が生成する：
【００２９】
【化４】
【００３０】結合マトリックスを製造するための水性反
応溶液は、上記の固相反応物のほかにもう１つの親水性
希釈分子、つまり固定基を備え、固相反応物が結合して
いない分子を含有する。適当な希釈分子は固定基および
スペーサ成分ならびに場合により１つのリンカー基を含
有し、その際スペーサ分子のＣ原子数はとくに１〜６、
とくに望ましくは１〜４、最も望ましくは１〜３であ
る。この場合でも、スペーサ分子の選択の際には、短か
い鎖長が望ましい。それというのも疎水性基が大きすぎ
ると希釈分子はもはや十分に水溶性でないからである。
応溶液は、上記の固相反応物のほかにもう１つの親水性
希釈分子、つまり固定基を備え、固相反応物が結合して
いない分子を含有する。適当な希釈分子は固定基および
スペーサ成分ならびに場合により１つのリンカー基を含
有し、その際スペーサ分子のＣ原子数はとくに１〜６、
とくに望ましくは１〜４、最も望ましくは１〜３であ
る。この場合でも、スペーサ分子の選択の際には、短か
い鎖長が望ましい。それというのも疎水性基が大きすぎ
ると希釈分子はもはや十分に水溶性でないからである。
【００３１】固相反応物の代りに、とくに希釈分子の固
定基から離れた末端に、親水性官能基、たとえばヒドロ
キシル基、カルボン酸基、カルボン酸エチルエステル基
またはメチルエステル基、カルボン酸アミド基、１個ま
たは２個のメチル基またはエチル基で置換されたカルボ
ン酸アミド基、スルホン酸基またはスルホンアミド基が
存在する。同様に、希釈分子の固定基から離れた末端に
親水性リンカー（上記定義による）または親水性リンカ
ーの一部を結合するのが望ましい。従って、望ましい希
釈分子は、スペーサ分子の一方の側に、担体物質と反応
性の固定基を含有し、他方の側に親水性末端基を含有す
る。
定基から離れた末端に、親水性官能基、たとえばヒドロ
キシル基、カルボン酸基、カルボン酸エチルエステル基
またはメチルエステル基、カルボン酸アミド基、１個ま
たは２個のメチル基またはエチル基で置換されたカルボ
ン酸アミド基、スルホン酸基またはスルホンアミド基が
存在する。同様に、希釈分子の固定基から離れた末端に
親水性リンカー（上記定義による）または親水性リンカ
ーの一部を結合するのが望ましい。従って、望ましい希
釈分子は、スペーサ分子の一方の側に、担体物質と反応
性の固定基を含有し、他方の側に親水性末端基を含有す
る。
【００３２】希釈分子の全特性は、水または水性緩衝液
に可溶である程度に親水性でなければならない。さら
に、結合分子は担体物質に自然に付加できなければなら
ない。意外にも、希釈分子は、固相反応物と結合してい
るスペーサ／リンカーよりも著しく短かい鎖長を有する
必要のあることが判明した。たとえば、固相反応物に結
合したスペーサ／リンカーの鎖長の５０％よりも小さい
希釈分子は、むしろ、固相反応物におけるスペーサ／リ
ンカーの鎖長に一致する鎖長を有する希釈分子よりもな
お良好な結果を生じる。
に可溶である程度に親水性でなければならない。さら
に、結合分子は担体物質に自然に付加できなければなら
ない。意外にも、希釈分子は、固相反応物と結合してい
るスペーサ／リンカーよりも著しく短かい鎖長を有する
必要のあることが判明した。たとえば、固相反応物に結
合したスペーサ／リンカーの鎖長の５０％よりも小さい
希釈分子は、むしろ、固相反応物におけるスペーサ／リ
ンカーの鎖長に一致する鎖長を有する希釈分子よりもな
お良好な結果を生じる。
【００３３】従って、希釈分子は、とくに一般式： Ｘ1−Ｓ−Ｓ−Ｘ2 または ＨＳ−Ｘ3 ［式中Ｘ1，Ｘ2およびＸ3はそれぞれ−（ＣＨ2）n−Ｃ
Ｏ−ＮＨ−Ｌ−Ｙを表わし、ここでｎは１〜６の自然数
を表わし、Ｌは４〜１５原子の鎖長を有する親水性のリ
ンカー基であり、Ｙは親水性末端基、とくに−ＮＨ2、
−ＯＨ、−ＣＯＯＨまたは−ＳＯ3Ｈである］で示され
る新規化合物である。
Ｏ−ＮＨ−Ｌ−Ｙを表わし、ここでｎは１〜６の自然数
を表わし、Ｌは４〜１５原子の鎖長を有する親水性のリ
ンカー基であり、Ｙは親水性末端基、とくに−ＮＨ2、
−ＯＨ、−ＣＯＯＨまたは−ＳＯ3Ｈである］で示され
る新規化合物である。
【００３４】本発明による結合マトリックスの構成のた
めには、上記化合物の数種からなる混合物を使用するこ
ともできる。
めには、上記化合物の数種からなる混合物を使用するこ
ともできる。
【００３５】短かい親水性希釈分子のとくに望ましい１
つの例は、２−メルカプトプロピオン酸−［２−（２−
ヒドロキシエトキシ）］−エチルアミドである。
つの例は、２−メルカプトプロピオン酸−［２−（２−
ヒドロキシエトキシ）］−エチルアミドである。
【００３６】
【化５】
【００３７】本発明のもう１つの実施形においては、固
相反応物を有するスペーサと固相反応物を有しないスペ
ーサが共有結合によって結合されていてもよい。金また
は銀表面を使用する場合には、この結合はとくにジスル
フィド架橋を介して行なわれる。
相反応物を有するスペーサと固相反応物を有しないスペ
ーサが共有結合によって結合されていてもよい。金また
は銀表面を使用する場合には、この結合はとくにジスル
フィド架橋を介して行なわれる。
【００３８】希釈分子（固相反応物なしのスペーサ分
子）および固相反応物を有するスペーサ分子からなるか
かる混合単分子層においては固相反応物を有するスペー
サ分子の割合は有利には０．１〜９０モル％、とくに
０．５〜７０モル％、とくに望ましくは１〜４０モル％
である。
子）および固相反応物を有するスペーサ分子からなるか
かる混合単分子層においては固相反応物を有するスペー
サ分子の割合は有利には０．１〜９０モル％、とくに
０．５〜７０モル％、とくに望ましくは１〜４０モル％
である。
【００３９】固相反応物は、とくにビオチンまたはビオ
チン類似分子、たとえばデスチオビオチン、イミノビオ
チンまたはＨＡＢＡ（４−ヒドロキシ−フェニルーアゾ
安息香酸）であり、これらは同様にストレプトアビジ
ン、アビジンまたはその誘導体と反応する。
チン類似分子、たとえばデスチオビオチン、イミノビオ
チンまたはＨＡＢＡ（４−ヒドロキシ−フェニルーアゾ
安息香酸）であり、これらは同様にストレプトアビジ
ン、アビジンまたはその誘導体と反応する。
【００４０】本発明による結合膜の１つの特別な態様
は、固相反応物として、デスビオチンのようにストレプ
トアビジンに対し著しく小さい結合力を有するビオチン
誘導体を使用する方法である。これらの固相反応物を使
用する場合、結合されたストレプトアビジンを、通常の
ビオチンを含有する溶液の添加によって置換することが
可能であるので、普遍結合膜はこうして再使用可能にな
る。
は、固相反応物として、デスビオチンのようにストレプ
トアビジンに対し著しく小さい結合力を有するビオチン
誘導体を使用する方法である。これらの固相反応物を使
用する場合、結合されたストレプトアビジンを、通常の
ビオチンを含有する溶液の添加によって置換することが
可能であるので、普遍結合膜はこうして再使用可能にな
る。
【００４１】しかし、適当な固相反応物のもう１つの例
は、抗体と結合しうる抗原またはハプテンである。この
場合には、固相反応物はとくに１００〜１２００の分子
量を有するハプテンである。適当なのは、たとえばステ
ロイド（たとえばジゴキシン、ジゴキシゲニン、コルチ
ゾール、エストリオール、エストラジオール、チオフィ
リン、ジフェニルヒダントイン、テストステロン、胆汁
酸、プロゲステロンおよびアルドステロン）；短鎖ペプ
チド（たとえばアルギプレシン、オキシトシンおよびブ
ラジキニン）；フルオレセインおよびその誘導体；
Ｔ3、Ｔ4、アフラトキシン、アトラジン、植物ホルモ
ン、たとえばジベレリン；およびアルカロイド（たとえ
ばレセルピンおよびアジマリシン）である。
は、抗体と結合しうる抗原またはハプテンである。この
場合には、固相反応物はとくに１００〜１２００の分子
量を有するハプテンである。適当なのは、たとえばステ
ロイド（たとえばジゴキシン、ジゴキシゲニン、コルチ
ゾール、エストリオール、エストラジオール、チオフィ
リン、ジフェニルヒダントイン、テストステロン、胆汁
酸、プロゲステロンおよびアルドステロン）；短鎖ペプ
チド（たとえばアルギプレシン、オキシトシンおよびブ
ラジキニン）；フルオレセインおよびその誘導体；
Ｔ3、Ｔ4、アフラトキシン、アトラジン、植物ホルモ
ン、たとえばジベレリン；およびアルカロイド（たとえ
ばレセルピンおよびアジマリシン）である。
【００４２】とくに望ましくは、ハプテンとしてビオチ
ンおよびビオチン誘導体、ジゴキシン、ジゴキシゲニ
ン、フルオレセインおよび誘導体ならびにテオフィリン
が使用される。
ンおよびビオチン誘導体、ジゴキシン、ジゴキシゲニ
ン、フルオレセインおよび誘導体ならびにテオフィリン
が使用される。
【００４３】他面において、固相反応物は幾つかの成分
からなっていてもよい。これは殊に、固相反応物の内側
成分がスペーサ分子と共有結合で結合され、固相反応物
の外側成分には共有結合で結合されていないことを表わ
す。その際、固相反応物の外側成分は、遊離の反応成分
を結合することができる。たとえば、内側成分がビオチ
ンであり、外側成分がストレプトアビジンであってもよ
い。かかる結合マトリックスは同様に、ビオチニル化反
応成分（たとえばビオチニル化抗体）を溶液から結合す
ることができる。それというのもストレプトアビジンは
ビオチンに対し４つの結合部位を有し、そのうちの少な
くとも２つはなおあいているからである。
からなっていてもよい。これは殊に、固相反応物の内側
成分がスペーサ分子と共有結合で結合され、固相反応物
の外側成分には共有結合で結合されていないことを表わ
す。その際、固相反応物の外側成分は、遊離の反応成分
を結合することができる。たとえば、内側成分がビオチ
ンであり、外側成分がストレプトアビジンであってもよ
い。かかる結合マトリックスは同様に、ビオチニル化反
応成分（たとえばビオチニル化抗体）を溶液から結合す
ることができる。それというのもストレプトアビジンは
ビオチンに対し４つの結合部位を有し、そのうちの少な
くとも２つはなおあいているからである。
【００４４】２成分からなる固相反応物を含有する結合
層は、固相反応物の外側、つまり遊離反応成分と結合し
うる成分（即ち特殊な場合にはストレプトアビジン）が
結合マトリックスの表面に希薄層を形成するときには、
本発明による結合マトリックスである。
層は、固相反応物の外側、つまり遊離反応成分と結合し
うる成分（即ち特殊な場合にはストレプトアビジン）が
結合マトリックスの表面に希薄層を形成するときには、
本発明による結合マトリックスである。
【００４５】希薄な結合性固相反応物のこの本発明によ
る原理は、ビオチン・ストレプトアビジンの結合から他
の結合組、たとえば抗体・抗原等に拡張することができ
る。
る原理は、ビオチン・ストレプトアビジンの結合から他
の結合組、たとえば抗体・抗原等に拡張することができ
る。
【００４６】結合マトリックスの表面における固相反応
物の被覆度は、結合層の厚さの測定によって決めること
ができる。その際、測定される層厚は結合層の被覆度に
つれて減少する。
物の被覆度は、結合層の厚さの測定によって決めること
ができる。その際、測定される層厚は結合層の被覆度に
つれて減少する。
【００４７】本発明による結合マトリックスの異なる種
類に基づき、製造方法も細部が異なる。この製造方法の
１つの望ましい別法は実施例に示されている。一般に、
本発明による方法は担体物質と、本発明による結合マト
リックスの結合層を形成する分子が存在する水性反応溶
液とのインキュベーションを内容としている。これらの
分子は、相対する側に固定基および固相反応物を含有
し、その際、上述したように、結合層のすべての分子が
固相反応物と結合してはいない。とくに、固相反応物は
１つのスペーサ分子を介して固定基と結合している。本
発明による結合マトリックスの形成下に溶液から担体物
質への固定基の付加は自発工程である。
類に基づき、製造方法も細部が異なる。この製造方法の
１つの望ましい別法は実施例に示されている。一般に、
本発明による方法は担体物質と、本発明による結合マト
リックスの結合層を形成する分子が存在する水性反応溶
液とのインキュベーションを内容としている。これらの
分子は、相対する側に固定基および固相反応物を含有
し、その際、上述したように、結合層のすべての分子が
固相反応物と結合してはいない。とくに、固相反応物は
１つのスペーサ分子を介して固定基と結合している。本
発明による結合マトリックスの形成下に溶液から担体物
質への固定基の付加は自発工程である。
【００４８】第１結合層製造のための担体物質と反応溶
液とのインキュベーションは、とくに保護ガス下、水ま
たは水性緩衝液中で、有機溶剤および洗剤のような妨害
物質の添加なしに行なわれる。
液とのインキュベーションは、とくに保護ガス下、水ま
たは水性緩衝液中で、有機溶剤および洗剤のような妨害
物質の添加なしに行なわれる。
【００４９】場合により、殊に固相反応物が幾つかの非
共有結合で互いに結合している成分からなる場合、第２
工程で第２の反応溶液と共にインキュベートすることに
より、別の物質を付加することができる。第２の、場合
により別の層を設けるための反応条件は臨界的ではない
ので、保護ガスなしで作業することができる。
共有結合で互いに結合している成分からなる場合、第２
工程で第２の反応溶液と共にインキュベートすることに
より、別の物質を付加することができる。第２の、場合
により別の層を設けるための反応条件は臨界的ではない
ので、保護ガスなしで作業することができる。
【００５０】従って、本発明のもう１つの対象は、担体
物質への固定基を備える固相反応物の吸着後、得られる
結合マトリックスを、非共有結合で結合している幾つか
の成分からなる固相反応物をつくるために、結合マトリ
ックスと結合しうる１つまたは幾つかの別の物質と共に
インキュベートする方法である。
物質への固定基を備える固相反応物の吸着後、得られる
結合マトリックスを、非共有結合で結合している幾つか
の成分からなる固相反応物をつくるために、結合マトリ
ックスと結合しうる１つまたは幾つかの別の物質と共に
インキュベートする方法である。
【００５１】本発明方法により製造した横の結合層は、
たとえば表面プラズモン鏡検法によって立証可能である
ように、微視的に均一である（Ｂ．Ｒｏｔｈｅｎｈａｅ
ｕｓｌｅｒおよびＷ．Ｋｎｏｌｌ，“Ｓｕｒｆａｃｅ
Ｐｌａｓｍｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”，Ｎａｔｕｒ
ｅ，第３３２巻，６１６５号，第６１５頁〜第６１７頁
（１９８８年）；Ｗ．Ｈｉｃｋｅｌ，Ｂ．Ｒｏｔｈｅｎ
ｈａｅｕｓｌｅｒおよびＷ．Ｋｎｏｌｌ，“Ｓｕｒｆａ
ｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｃｈ
ａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｅｒｎａ
ｌ ｓｕｒｆａｃｅｓ”，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．，
（１９８９年），第４８３２頁〜第４８３６頁；Ｗ．Ｈ
ｉｃｋｅｌ，Ｗ．Ｋｎｏｌｌ，“Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌ
ａｓｍｏｎ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓ
ａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ
ａｔ ５ μｍ ｌａｔｅｒａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉ
ｏｎ”，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．，第６７巻（１９９
０年），第３５７２頁以降）。５μｍの解像の場合、厚
さの相違は測定できない。
たとえば表面プラズモン鏡検法によって立証可能である
ように、微視的に均一である（Ｂ．Ｒｏｔｈｅｎｈａｅ
ｕｓｌｅｒおよびＷ．Ｋｎｏｌｌ，“Ｓｕｒｆａｃｅ
Ｐｌａｓｍｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”，Ｎａｔｕｒ
ｅ，第３３２巻，６１６５号，第６１５頁〜第６１７頁
（１９８８年）；Ｗ．Ｈｉｃｋｅｌ，Ｂ．Ｒｏｔｈｅｎ
ｈａｅｕｓｌｅｒおよびＷ．Ｋｎｏｌｌ，“Ｓｕｒｆａ
ｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｃｈ
ａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｅｒｎａ
ｌ ｓｕｒｆａｃｅｓ”，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．，
（１９８９年），第４８３２頁〜第４８３６頁；Ｗ．Ｈ
ｉｃｋｅｌ，Ｗ．Ｋｎｏｌｌ，“Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌ
ａｓｍｏｎ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓ
ａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ
ａｔ ５ μｍ ｌａｔｅｒａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉ
ｏｎ”，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．，第６７巻（１９９
０年），第３５７２頁以降）。５μｍの解像の場合、厚
さの相違は測定できない。
【００５２】さらに、本発明は、少なくとも２つの生物
親和性反応物（ｂｉｏａｆｆｉｎｅｎ Ｒｅａｋｔａｎ
ｄｅｎ）（そのうちの１つは固相に結合して存在し、他
方の成分は遊離である）の間の特異的結合反応により試
料溶液中の被検体を定量するため、本発明による結合マ
トリックスの成分である固相反応物を使用する方法に関
する。
親和性反応物（ｂｉｏａｆｆｉｎｅｎ Ｒｅａｋｔａｎ
ｄｅｎ）（そのうちの１つは固相に結合して存在し、他
方の成分は遊離である）の間の特異的結合反応により試
料溶液中の被検体を定量するため、本発明による結合マ
トリックスの成分である固相反応物を使用する方法に関
する。
【００５３】このような方法では、固相反応物における
遊離反応成分の結合の検出は、遊離反応成分が標識基を
有することによって可能にすることができる。殊に、酵
素または蛍光成分または発光成分による標識付けが慣用
である。これにより可能となる、結合の間接的光学的観
察は、正確な定量的検出が可能である。
遊離反応成分の結合の検出は、遊離反応成分が標識基を
有することによって可能にすることができる。殊に、酵
素または蛍光成分または発光成分による標識付けが慣用
である。これにより可能となる、結合の間接的光学的観
察は、正確な定量的検出が可能である。
【００５４】原則的に、結合は光学的、電気化学的に、
実熱量変化または質量形成によって測定することができ
る。電気化学的技術には殊に、たとえば“バイオセンサ
ーズ（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ）”（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｋａ
ｒｕｂｅ，Ｗｉｌｓｏｎ（編集）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｒ
ｅｓｓ出版（１９８７年）またはベルグフェルド（Ｂｅ
ｒｇｖｅｌｄ）著“バイオセンサーズ・アンド・バイオ
エレクトロニクス（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ＆ Ｂｉｏ
ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）”第６巻，第５５頁〜第７２
頁（１９９１年）に記載されているような電位差測定お
よび電流滴定（Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｅ）法が挙げら
れる。導電率または容量変化による測定も、電気化学的
技術として同様に可能である。
実熱量変化または質量形成によって測定することができ
る。電気化学的技術には殊に、たとえば“バイオセンサ
ーズ（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ）”（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｋａ
ｒｕｂｅ，Ｗｉｌｓｏｎ（編集）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｒ
ｅｓｓ出版（１９８７年）またはベルグフェルド（Ｂｅ
ｒｇｖｅｌｄ）著“バイオセンサーズ・アンド・バイオ
エレクトロニクス（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ＆ Ｂｉｏ
ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）”第６巻，第５５頁〜第７２
頁（１９９１年）に記載されているような電位差測定お
よび電流滴定（Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｅ）法が挙げら
れる。導電率または容量変化による測定も、電気化学的
技術として同様に可能である。
【００５５】しかし、とくに結合の検出は光学的、殊に
反射光学的技術により行なわれ、この技術では担体固定
の反応物を有する極めて薄い層の層厚は遊離結合成分の
結合によって観察することができる。これらの技術の観
察はサドフスキー（Ｓａｄｏｗｓｋｉ）：“レビュー・
オブ・オプティカル・メソーズ・イン・インムノセンシ
ング（Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｏｐｔｉｃａｌ ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｉｎｇ）”，ＳＰ
ＩＥ，第９５４巻，Ｏｐｔｉｃａｌ ｔｅｓｔｉｎｇ
ａｎｄ Ｍｅｔｒｏｌｏｇｙ ＩＩ（１９８８年），第
４１３頁〜第４１９頁に記載されている。
反射光学的技術により行なわれ、この技術では担体固定
の反応物を有する極めて薄い層の層厚は遊離結合成分の
結合によって観察することができる。これらの技術の観
察はサドフスキー（Ｓａｄｏｗｓｋｉ）：“レビュー・
オブ・オプティカル・メソーズ・イン・インムノセンシ
ング（Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｏｐｔｉｃａｌ ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｉｎｇ）”，ＳＰ
ＩＥ，第９５４巻，Ｏｐｔｉｃａｌ ｔｅｓｔｉｎｇ
ａｎｄ Ｍｅｔｒｏｌｏｇｙ ＩＩ（１９８８年），第
４１３頁〜第４１９頁に記載されている。
【００５６】とくに望ましい反射光学的方法は表面プラ
ズモン共鳴（Ｏｂｅｒｆｌａｅｃｈｅｎｐｌａｓｍｏｎ
ｅｎｒｅｓｏｎａｎｚ）による結合の検出である。この
方法では、分析素子は、透明な誘電材料上に極めて小さ
い層厚で、固相反応物を有する金属導電層を設けてな
る。この分析素子はしばしば光学的免疫センサーとも呼
ばれる。かかる光学的免疫センサーの例は、ヨーロッパ
公開特許（ＥＰ−Ａ）第２７６１４２号、同第２７６１
４２号および同第２５４５７５号に記載されている。し
かし、固相における結合の定量的検出にとくに望ましい
のは、ドイツ国特許（ＤＥ）第４０２４４７６号に詳細
に開示されている免疫センサーである。
ズモン共鳴（Ｏｂｅｒｆｌａｅｃｈｅｎｐｌａｓｍｏｎ
ｅｎｒｅｓｏｎａｎｚ）による結合の検出である。この
方法では、分析素子は、透明な誘電材料上に極めて小さ
い層厚で、固相反応物を有する金属導電層を設けてな
る。この分析素子はしばしば光学的免疫センサーとも呼
ばれる。かかる光学的免疫センサーの例は、ヨーロッパ
公開特許（ＥＰ−Ａ）第２７６１４２号、同第２７６１
４２号および同第２５４５７５号に記載されている。し
かし、固相における結合の定量的検出にとくに望ましい
のは、ドイツ国特許（ＤＥ）第４０２４４７６号に詳細
に開示されている免疫センサーである。
【００５７】上記に記載したように、遊離の反応成分に
比べて比較的小さい結合力を有する固相反応物を使用す
ることができる。この場合には、固相に結合した反応成
分を、大きい結合力を有する別の遊離反応物の添加によ
って分離し、それと共に結合マトリックスを再生するこ
とが可能である。
比べて比較的小さい結合力を有する固相反応物を使用す
ることができる。この場合には、固相に結合した反応成
分を、大きい結合力を有する別の遊離反応物の添加によ
って分離し、それと共に結合マトリックスを再生するこ
とが可能である。
【００５８】とくに望ましくは、再生可能な結合マトリ
ックスに対し、たとえばテスチオビオチンおよびイミノ
ビオチンのようなビオチン誘導体を、ストレプトアビジ
ンに対し、固相反応物としてのビオチンよりも小さい結
合親和力に基づき、使用することができる。（デスチオ
ビオチン／ストレプトアビジンの結合定数は１０12であ
り、ビオチン／ストレプトアビジンの結合定数は１０15
である）。従って、小さい親和力を有する固相反応物を
使用する場合、結合したストレプトアビジンを、高親和
性反応物（たとえばビオチン）を含有する溶液の添加に
よって除去することが可能であるので、こうして普遍結
合膜を繰返し使用することができる。
ックスに対し、たとえばテスチオビオチンおよびイミノ
ビオチンのようなビオチン誘導体を、ストレプトアビジ
ンに対し、固相反応物としてのビオチンよりも小さい結
合親和力に基づき、使用することができる。（デスチオ
ビオチン／ストレプトアビジンの結合定数は１０12であ
り、ビオチン／ストレプトアビジンの結合定数は１０15
である）。従って、小さい親和力を有する固相反応物を
使用する場合、結合したストレプトアビジンを、高親和
性反応物（たとえばビオチン）を含有する溶液の添加に
よって除去することが可能であるので、こうして普遍結
合膜を繰返し使用することができる。
【００５９】再生可能のデスチオビオチン−またはイミ
ノビオチン結合相の使用下に免疫検定の実施には、デス
チオビオチニル化またはイミノビオチニル化抗体または
抗体フラグメントまたはデスチオビオチニル化またはイ
ミノビオチニル化（ポリ−）ハプテンを使用するのが有
利である。
ノビオチン結合相の使用下に免疫検定の実施には、デス
チオビオチニル化またはイミノビオチニル化抗体または
抗体フラグメントまたはデスチオビオチニル化またはイ
ミノビオチニル化（ポリ−）ハプテンを使用するのが有
利である。
【００６０】本発明のもう１つの対象は、被検体測定実
施後に結合マトリックスを、固相反応物に結合した遊離
の反応成分を別の遊離反応物の添加によって結合マトリ
ックスから分離することにより再生することを特徴とす
る方法である。その際、別の遊離反応物は固相反応物と
しての反応成分よりも高い親和力を有するのが有利であ
る。固相反応物と遊離反応物からなる適当な組の例は、
たとえばデスチオビオチンとビオチン、または相応に、
化学的に極めて僅かに相違し、従って抗体に対して若干
異なる結合力を有する２つのハプテンである。
施後に結合マトリックスを、固相反応物に結合した遊離
の反応成分を別の遊離反応物の添加によって結合マトリ
ックスから分離することにより再生することを特徴とす
る方法である。その際、別の遊離反応物は固相反応物と
しての反応成分よりも高い親和力を有するのが有利であ
る。固相反応物と遊離反応物からなる適当な組の例は、
たとえばデスチオビオチンとビオチン、または相応に、
化学的に極めて僅かに相違し、従って抗体に対して若干
異なる結合力を有する２つのハプテンである。
【００６１】従って、本発明により製造された結合マト
リックスは再生可能な層として使用することもできる。
リックスは再生可能な層として使用することもできる。
【００６２】さらに、本発明を図１〜３と結合して次の
実施例により明らかにする。
実施例により明らかにする。
【００６３】
例１ ビスビオチノイルシスタミンの合成
【００６４】
【化６】
【００６５】ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
エステルを、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のシス
タミニウムジクロリドおよびトリエチルアミンの溶液に
加えた。反応混合物を夜どおし室温で撹拌した。反応終
了後、生じた沈殿物を濾取し、油ポンプで乾燥し、アセ
トンから再結晶した。自然化合物は４０％の収率で得ら
れた。
エステルを、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のシス
タミニウムジクロリドおよびトリエチルアミンの溶液に
加えた。反応混合物を夜どおし室温で撹拌した。反応終
了後、生じた沈殿物を濾取し、油ポンプで乾燥し、アセ
トンから再結晶した。自然化合物は４０％の収率で得ら
れた。
【００６６】例２： 本発明による単分子層の層厚の測定 図１は、固相への遊離反応成分の結合を反射光学的に測
定するための測定装置を略示する。
定するための測定装置を略示する。
【００６７】修正クレッチュマン（Ｋｒｅｔｓｃｈｍａ
ｎｎ）装置（図１）中に取付けて、被覆した試料を空気
ならびに水性媒体に対して調べることができる。
ｎｎ）装置（図１）中に取付けて、被覆した試料を空気
ならびに水性媒体に対して調べることができる。
【００６８】この反射光学的測定装置はレーザー１０を
含有する。レーザーから発する一次光線は、試験部分２
０の表面の法線に対し角度θで入射する。反射光は、集
光レンズ１２により像面内に配置されたダイオード１３
上に結像される。
含有する。レーザーから発する一次光線は、試験部分２
０の表面の法線に対し角度θで入射する。反射光は、集
光レンズ１２により像面内に配置されたダイオード１３
上に結像される。
【００６９】この測定装置は、さらにクレッチュマン装
置のプリズム１６および試験溶液の入口および出口１５
を有する流動クベット１４を含有する。
置のプリズム１６および試験溶液の入口および出口１５
を有する流動クベット１４を含有する。
【００７０】試験部分２０は、クレッチュマン装置のプ
リズム１６、光学的に透明な誘電担体層２２および担体
層２２上に蒸着されている薄い金属層２３ａ，２３ｂか
らなる。指標液２１の薄層は、プリズム１６を光学的屈
折なしに光学的に透明な担体層２２と結合する。それと
いうのも該薄層はこれら双方の部品と同じ屈折率を有す
るからである。本例の場合、２３ａは上述したクロム層
であり、２３ｂは蒸着した金層である。２５は固定基を
介して金表面への固相反応物２６の結合を媒介するスペ
ーサ分子である。２７は、固相反応物と結合可能であっ
て固相２８中に存在する遊離反応成分である。
リズム１６、光学的に透明な誘電担体層２２および担体
層２２上に蒸着されている薄い金属層２３ａ，２３ｂか
らなる。指標液２１の薄層は、プリズム１６を光学的屈
折なしに光学的に透明な担体層２２と結合する。それと
いうのも該薄層はこれら双方の部品と同じ屈折率を有す
るからである。本例の場合、２３ａは上述したクロム層
であり、２３ｂは蒸着した金層である。２５は固定基を
介して金表面への固相反応物２６の結合を媒介するスペ
ーサ分子である。２７は、固相反応物と結合可能であっ
て固相２８中に存在する遊離反応成分である。
【００７１】フレネルの式を用いて界面における反射を
計算し、ＰＳＰ分光にデータを適合することができ、そ
の際各層の“光学的厚さ（ｏｐｔｉｓｃｈｅｎ Ｄｉｃ
ｋｅ）”（＝ｎ×ｄ，ｎ＝屈折率、ｄ＝厚さ）が得られ
る。
計算し、ＰＳＰ分光にデータを適合することができ、そ
の際各層の“光学的厚さ（ｏｐｔｉｓｃｈｅｎ Ｄｉｃ
ｋｅ）”（＝ｎ×ｄ，ｎ＝屈折率、ｄ＝厚さ）が得られ
る。
【００７２】例３ １−ｔｅｒｔ．ブチルオキシカルボニル−１，８−ジア
ミノ−ジオキサオクタン（ｍｏｎｏ−ＢＯＣ−ＤＡＤＯ
Ｏ）の合成 ジオキサン／水（１／１ ｖ／ｖ）９００ｍｌ中の１，
８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン（ＤＡＤＯ
Ｏ）１４２ｇ（１モル）の溶液に、撹拌下徐々に、ジオ
キサン４５０ｍｌ中のジ−ｔｅｒｔ．ブチルカーボネー
ト１０９ｇ（０．５モル）の溶液を加える。添加後、混
合物をなお１．５ｈ、２０℃で撹拌し、引き続き溶媒を
留去し、残留物を酢酸エチル／水（１／１ ｖ／ｖ）１
ｌにとる。水相を分離した後、有機相を０．１Ｎ ＨＣ
ｌ １００ｍｌ宛で２回抽出する。水相を合し、ｐＨ値
を希カセイソーダでｐＨ９〜１０に調節し、溶液をパー
ホレーター中で液・液抽出する。酢酸エチル７５０ｍｌ
で８時間抽出した後、溶剤を除去し、残留物を高度真空
で乾燥する。
ミノ−ジオキサオクタン（ｍｏｎｏ−ＢＯＣ−ＤＡＤＯ
Ｏ）の合成 ジオキサン／水（１／１ ｖ／ｖ）９００ｍｌ中の１，
８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン（ＤＡＤＯ
Ｏ）１４２ｇ（１モル）の溶液に、撹拌下徐々に、ジオ
キサン４５０ｍｌ中のジ−ｔｅｒｔ．ブチルカーボネー
ト１０９ｇ（０．５モル）の溶液を加える。添加後、混
合物をなお１．５ｈ、２０℃で撹拌し、引き続き溶媒を
留去し、残留物を酢酸エチル／水（１／１ ｖ／ｖ）１
ｌにとる。水相を分離した後、有機相を０．１Ｎ ＨＣ
ｌ １００ｍｌ宛で２回抽出する。水相を合し、ｐＨ値
を希カセイソーダでｐＨ９〜１０に調節し、溶液をパー
ホレーター中で液・液抽出する。酢酸エチル７５０ｍｌ
で８時間抽出した後、溶剤を除去し、残留物を高度真空
で乾燥する。
【００７３】収率：３２ｇ（２６％） ＤＣ：Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ 溶離剤：酢酸ブチル／水／水酸化アンモニウム＝３０／
１５／１５ Ｒf＝０．４５ 例４ １−（ビオチン−アミノカプロン酸）−（１，８−ジア
ミノ−４，６−ジオキサオクタン）−アミド，（ビオチ
ン−Ｘ−ＤＡＤＯＯ）の合成 ジオキサン１０ｍｌおよびリン酸カリウム緩衝液０．１
モル／ｌ（ｐＨ８．５）１０ｍｌ中のＤ−ビオチノイル
−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｂ
ｅｓｔ Ｎｒ．１００３９３３）０．９ｇ（２ｍモル）
およびｍｏｎｏ−ＢＯＣ−ＤＡＤＯＯ０．５ｇ（２ｍモ
ル）の溶液を、２０℃で約２時間撹拌する。反応終了後
（ＤＣ制御：Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０，溶離剤 酢酸
エチル／メタノール＝３／７，ＲＦ＝０．６）、溶剤を
真空で蒸発し去り、残留物にトリフルオロ酢酸１ｍｌを
加える。ＢＯＣ基が完全に脱離するまで約３０分撹拌す
る。引き続き、トリフルオロ酢酸を真空中で蒸発した
り、残留物に酢酸エチル５ｍｌを加え、不溶物を濾去
し、濾液を蒸発乾凅する。
１５／１５ Ｒf＝０．４５ 例４ １−（ビオチン−アミノカプロン酸）−（１，８−ジア
ミノ−４，６−ジオキサオクタン）−アミド，（ビオチ
ン−Ｘ−ＤＡＤＯＯ）の合成 ジオキサン１０ｍｌおよびリン酸カリウム緩衝液０．１
モル／ｌ（ｐＨ８．５）１０ｍｌ中のＤ−ビオチノイル
−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｂ
ｅｓｔ Ｎｒ．１００３９３３）０．９ｇ（２ｍモル）
およびｍｏｎｏ−ＢＯＣ−ＤＡＤＯＯ０．５ｇ（２ｍモ
ル）の溶液を、２０℃で約２時間撹拌する。反応終了後
（ＤＣ制御：Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０，溶離剤 酢酸
エチル／メタノール＝３／７，ＲＦ＝０．６）、溶剤を
真空で蒸発し去り、残留物にトリフルオロ酢酸１ｍｌを
加える。ＢＯＣ基が完全に脱離するまで約３０分撹拌す
る。引き続き、トリフルオロ酢酸を真空中で蒸発した
り、残留物に酢酸エチル５ｍｌを加え、不溶物を濾去
し、濾液を蒸発乾凅する。
【００７４】収率：０．９６ｇ（９８％） ＤＣ：Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０，溶離剤 酢酸エチル
／メタノール＝２：８，Ｒf＝０．２ 例５ Ｓ−アセチル−メルカプトプロピオン酸の合成 メルカプトプロピオン酸１０．６ｇ（１００ｍモル）
に、２０℃で徐々に、塩化アセチル８．６ｇ（１１０ｍ
モル）を滴加する。添加終了後、１０分間１００℃に加
熱する。反応混合物を真空蒸留にかけ、生成物は０．４
バール、１０５℃で純粋に得られる。
／メタノール＝２：８，Ｒf＝０．２ 例５ Ｓ−アセチル−メルカプトプロピオン酸の合成 メルカプトプロピオン酸１０．６ｇ（１００ｍモル）
に、２０℃で徐々に、塩化アセチル８．６ｇ（１１０ｍ
モル）を滴加する。添加終了後、１０分間１００℃に加
熱する。反応混合物を真空蒸留にかけ、生成物は０．４
バール、１０５℃で純粋に得られる。
【００７５】収率：５．８ｇ（３６％） １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ（ｐｐｍ）＝２．３
（ｓ，３Ｈ），２．７（ｔ，２Ｈ），３．１（ｔ，２
Ｈ） 例６ Ｎ−スクシンイミド−Ｓ−アセチルチオプロピオネー
ト，（ＳＡＴＰ）の合成 Ｓ−アセチル−メルカプトプロピオン酸１６．２ｇ
（０．１ｍモル）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１
２．７ｇ（０．１１モル）およびジシクロヘキシルカル
ボジイミド２２．７ｇ（０．１１モル）を、無水酢酸エ
チル０．４ｌ中で２０℃で１６時間撹拌する。析出した
沈殿物を濾別し、濾液を真空中で蒸発濃縮する。油状残
留物を少量の酢酸エチルにとり、冷却する。その際、さ
らに沈殿物が析出し、これを捨てる。この工程を２回繰
返す。最後の濾液から、蒸発濃縮した後にＳＡＴＰ１３
ｇ（５０％）が得られる。
（ｓ，３Ｈ），２．７（ｔ，２Ｈ），３．１（ｔ，２
Ｈ） 例６ Ｎ−スクシンイミド−Ｓ−アセチルチオプロピオネー
ト，（ＳＡＴＰ）の合成 Ｓ−アセチル−メルカプトプロピオン酸１６．２ｇ
（０．１ｍモル）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１
２．７ｇ（０．１１モル）およびジシクロヘキシルカル
ボジイミド２２．７ｇ（０．１１モル）を、無水酢酸エ
チル０．４ｌ中で２０℃で１６時間撹拌する。析出した
沈殿物を濾別し、濾液を真空中で蒸発濃縮する。油状残
留物を少量の酢酸エチルにとり、冷却する。その際、さ
らに沈殿物が析出し、これを捨てる。この工程を２回繰
返す。最後の濾液から、蒸発濃縮した後にＳＡＴＰ１３
ｇ（５０％）が得られる。
【００７６】１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ（ｐｐ
ｍ）＝２．３（ｓ，３Ｈ），２．８（ｓ，４Ｈ），２．
９（ｍ，２Ｈ），３．１（ｍ，２Ｈ） 例７ ビオチン−アミノカプロン酸−アミドジオキサオクチル
−メルカプトプロピオン酸アミド（化合物１）
ｍ）＝２．３（ｓ，３Ｈ），２．８（ｓ，４Ｈ），２．
９（ｍ，２Ｈ），３．１（ｍ，２Ｈ） 例７ ビオチン−アミノカプロン酸−アミドジオキサオクチル
−メルカプトプロピオン酸アミド（化合物１）
【００７７】
【化７】
【００７８】ビオチン−Ｘ−ＤＡＤＯＯ（例４から）
０．９６ｇ（２ｍモル）およびＳＡＴＰ（例６から）
０．５ｇ（２ｍモル）からなる溶液を、ジオキサン２０
ｍｌおよびリン酸カリウム緩衝液０．１モル／ｌ（ｐＨ
８．５）２０ｍｌ中で２０℃で２時間撹拌する。引き続
き、溶液を蒸発乾凅し、残留物をトリフルオロ酢酸２ｍ
ｌにとり、不活性ガス下２０℃で０．５時間撹拌する。
精製はシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー
（溶離剤：酢酸エチル／メタノール＝３：７）によって
行なう。
０．９６ｇ（２ｍモル）およびＳＡＴＰ（例６から）
０．５ｇ（２ｍモル）からなる溶液を、ジオキサン２０
ｍｌおよびリン酸カリウム緩衝液０．１モル／ｌ（ｐＨ
８．５）２０ｍｌ中で２０℃で２時間撹拌する。引き続
き、溶液を蒸発乾凅し、残留物をトリフルオロ酢酸２ｍ
ｌにとり、不活性ガス下２０℃で０．５時間撹拌する。
精製はシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー
（溶離剤：酢酸エチル／メタノール＝３：７）によって
行なう。
【００７９】収率：１５０ｍｇ（１３％） ＤＣ：Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０，酢酸エチル／メタノ
ール＝３／７ Ｒf＝０．３５ 例８ ビオチンアミド−３，６−ジオキサオクチル−Ｓ−アセ
チル−メルカプトプロピオン酸アミド，（ビオチン−Ｄ
ＡＤＯＯ−ＳＡＴＰ）の合成 リン酸カリウム緩衝液０．１モル／ｌ（ｐＨ７．０）４
０ｍｌに溶かしたビオチン−ＤＡＤＯＯ １ｇ（２．７
ｍモル）に、ジオキサン４０ｍｌ中のＳＡＴＰ（例６か
ら）１．４ｇ（５．３５ｍモル）からなる溶液を徐々に
加える。添加の間、ｐＨ値は、リン酸カリウム緩衝液
０．１モル／ｌで連続的にｐＨ７．０に調整しなければ
ならない。添加終了後、なお１０分撹拌し、引き続き蒸
発乾凅する。粗生成物はさらに精製せずに次の工程にお
いて使用することができる。
ール＝３／７ Ｒf＝０．３５ 例８ ビオチンアミド−３，６−ジオキサオクチル−Ｓ−アセ
チル−メルカプトプロピオン酸アミド，（ビオチン−Ｄ
ＡＤＯＯ−ＳＡＴＰ）の合成 リン酸カリウム緩衝液０．１モル／ｌ（ｐＨ７．０）４
０ｍｌに溶かしたビオチン−ＤＡＤＯＯ １ｇ（２．７
ｍモル）に、ジオキサン４０ｍｌ中のＳＡＴＰ（例６か
ら）１．４ｇ（５．３５ｍモル）からなる溶液を徐々に
加える。添加の間、ｐＨ値は、リン酸カリウム緩衝液
０．１モル／ｌで連続的にｐＨ７．０に調整しなければ
ならない。添加終了後、なお１０分撹拌し、引き続き蒸
発乾凅する。粗生成物はさらに精製せずに次の工程にお
いて使用することができる。
【００８０】ＤＣ：Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０，溶離剤
酢酸エチル／メタノール＝３．５／７．５ Ｒf＝０．３５ 例９ ビス−（ビオチンアミド−３，６−ジオキサアセチル）
−メルカプトプロピオン酸アミドジスルフィド（化合物
２）の合成
酢酸エチル／メタノール＝３．５／７．５ Ｒf＝０．３５ 例９ ビス−（ビオチンアミド−３，６−ジオキサアセチル）
−メルカプトプロピオン酸アミドジスルフィド（化合物
２）の合成
【００８１】
【化８】
【００８２】例８からの粗生成物１．６ｇを窒素飽和の
リン酸カリウム緩衝液０．５モル／ｌ（ｐＨ７．５）１
００ｍｌに溶かし、メタノール性ヒドロキシルアミン溶
液１モル／ｌ ５．４ｍｌを加える。２０℃で２時間撹
拌し、引き続き真空中で蒸発乾凅し、シリカゲルでのフ
ラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール
＝３／７）により精製する。
リン酸カリウム緩衝液０．５モル／ｌ（ｐＨ７．５）１
００ｍｌに溶かし、メタノール性ヒドロキシルアミン溶
液１モル／ｌ ５．４ｍｌを加える。２０℃で２時間撹
拌し、引き続き真空中で蒸発乾凅し、シリカゲルでのフ
ラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール
＝３／７）により精製する。
【００８３】収率：１５０ｍｇ（６％） ＤＣ：Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０，溶離剤 酢酸エチル
／メタノール＝３／７ Ｒf＝０．３５ 例１０ ビオチンアミド−３，６−ジオキサオクチル−Ｓ−アセ
チルメルカプト酢酸アミド，（ビオチン−ＤＡＤＯＯ−
ＳＡＴＡ）の合成 製造は、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオア
セテート（ＳＡＴＡ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｓ
ｔ Ｎｒ．１０８１７６５）１８７ｍｇ（０．８ｍモ
ル）およびビオチンＤＡＤＯＯ ３００ｍｇ（０．８ｍ
モル）から例８類似に行なう。
／メタノール＝３／７ Ｒf＝０．３５ 例１０ ビオチンアミド−３，６−ジオキサオクチル−Ｓ−アセ
チルメルカプト酢酸アミド，（ビオチン−ＤＡＤＯＯ−
ＳＡＴＡ）の合成 製造は、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオア
セテート（ＳＡＴＡ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｓ
ｔ Ｎｒ．１０８１７６５）１８７ｍｇ（０．８ｍモ
ル）およびビオチンＤＡＤＯＯ ３００ｍｇ（０．８ｍ
モル）から例８類似に行なう。
【００８４】収率：１０９ｍｇ（４９％） ＤＣ：Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０，溶離剤 酢酸エチル
／メタノール＝６．５／３．５ Ｒf＝０．３５ 例１１ ビス−（ビオチンアミド−３，６−ジオキサアセチル）
−メルカプト酢酸アミド−ジスルフィド（化合物３）の
合成
／メタノール＝６．５／３．５ Ｒf＝０．３５ 例１１ ビス−（ビオチンアミド−３，６−ジオキサアセチル）
−メルカプト酢酸アミド−ジスルフィド（化合物３）の
合成
【００８５】
【化９】
【００８６】製造はビオチン−ＤＡＤＯＯ−ＳＡＴＡ
１００ｍｇ（０．２ｍモル）およびメタノール性ヒドロ
キシルアミン溶液１モル／ｌ ０．２５ｍｌから、例９
類似に行なう。
１００ｍｇ（０．２ｍモル）およびメタノール性ヒドロ
キシルアミン溶液１モル／ｌ ０．２５ｍｌから、例９
類似に行なう。
【００８７】収率：５５ｍｇ（６０％） ＤＣ：Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０，溶離剤 酢酸エチル
／メタノール＝３／７ Ｒf＝０．３５ 例１２ ａ） ２−（Ｓ−アセチル）メルカプトプロピオン酸−
［２−（２−ヒドロキシエトキシ）］−エチルアミド ＴＨＦ２５ｍｌ中の２−（２−アミノエトキシ）−エタ
ノール２．１４ｇ（２０ｍモル）からなる溶液に、１５
分内に、ＴＨＦ５０ｍｌ中のＮ−スクシンイミジル−Ｓ
−アセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ，例２ｃ）５
ｇ（２０ｍモル）からなる溶液を滴加し、２０℃で２時
間撹拌する。反応終結後（ＤＣ制御）、反応混合物を真
空中で蒸発濃縮し、シリカゲルでのクロマトグラフィー
にかける（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０，溶離剤 酢酸エ
チル／メタノール＝７／３＋１％酢酸） ＤＣ：（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０，溶離剤 酢酸エチ
ル／メタノール＝７／３＋１％酢酸） Ｒf＝０．６７ 収率：２．７ｇ ＭＳ（ｐｏｓ ＦＡＢ）：ＭＨ+＝２３６ ｂ） ２−メルカプトプロピオン酸−［２−（２−ヒド
ロキシエトキシ）］−エチルアミド（化合物４）
／メタノール＝３／７ Ｒf＝０．３５ 例１２ ａ） ２−（Ｓ−アセチル）メルカプトプロピオン酸−
［２−（２−ヒドロキシエトキシ）］−エチルアミド ＴＨＦ２５ｍｌ中の２−（２−アミノエトキシ）−エタ
ノール２．１４ｇ（２０ｍモル）からなる溶液に、１５
分内に、ＴＨＦ５０ｍｌ中のＮ−スクシンイミジル−Ｓ
−アセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ，例２ｃ）５
ｇ（２０ｍモル）からなる溶液を滴加し、２０℃で２時
間撹拌する。反応終結後（ＤＣ制御）、反応混合物を真
空中で蒸発濃縮し、シリカゲルでのクロマトグラフィー
にかける（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０，溶離剤 酢酸エ
チル／メタノール＝７／３＋１％酢酸） ＤＣ：（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０，溶離剤 酢酸エチ
ル／メタノール＝７／３＋１％酢酸） Ｒf＝０．６７ 収率：２．７ｇ ＭＳ（ｐｏｓ ＦＡＢ）：ＭＨ+＝２３６ ｂ） ２−メルカプトプロピオン酸−［２−（２−ヒド
ロキシエトキシ）］−エチルアミド（化合物４）
【００８８】
【化１０】
【００８９】化合物ａ）２．７ｇ（８．７ｍモル）に、
メタノール中のヒドロキシルアミン溶液１モル／ｌ ６
００ｍｌを加え、２０℃で１時間撹拌した。引き続き、
溶剤を真空中で留去し、残留物をジクロルメタンで３回
抽出した。油状粗生成物１．５ｇが得られ、これをシリ
カゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製し
た（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０，溶離剤 ジクロロメタ
ン／メタノール＝９．３／０．７） ＤＣ：（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０，溶離剤 ジクロロ
メタン／メタノール＝９／１） Ｒf＝０．４５ 収率：０．８６（無色油状物） ＭＳ（ｐｏｓ ＦＡＢ）：ＭＨ+＝１９４ 例１３ ａ） 試料調製：金基板は、ＬＡＳＦＮ９からなる載せ
ガラス（Ｂｅｒｌｉｎｅｒ ＧｌａｓＫＧ）にＡｕ（９
９．９９％）約５ｎｍを蒸着することによって製造し
た。
メタノール中のヒドロキシルアミン溶液１モル／ｌ ６
００ｍｌを加え、２０℃で１時間撹拌した。引き続き、
溶剤を真空中で留去し、残留物をジクロルメタンで３回
抽出した。油状粗生成物１．５ｇが得られ、これをシリ
カゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製し
た（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０，溶離剤 ジクロロメタ
ン／メタノール＝９．３／０．７） ＤＣ：（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０，溶離剤 ジクロロ
メタン／メタノール＝９／１） Ｒf＝０．４５ 収率：０．８６（無色油状物） ＭＳ（ｐｏｓ ＦＡＢ）：ＭＨ+＝１９４ 例１３ ａ） 試料調製：金基板は、ＬＡＳＦＮ９からなる載せ
ガラス（Ｂｅｒｌｉｎｅｒ ＧｌａｓＫＧ）にＡｕ（９
９．９９％）約５ｎｍを蒸着することによって製造し
た。
【００９０】蒸着は、Ｂａｌｚｅｒｓ社の蒸着装置ＢＡ
Ｅ２５０中で行ない、圧力≦５×１０~6ｍバールで実施
した。
Ｅ２５０中で行ない、圧力≦５×１０~6ｍバールで実施
した。
【００９１】ｂ） 単分子層形成：金基板を、蒸着装置
を開けた直後、アルゴン保護ガス下に、水（Ｍｉｌｌｉ
Ｑ）中の化合物の０．５ｍモル溶液中に入れた。６ｈの
吸着時間後に、基板を水３００ｍｌで洗浄し、窒素気流
中で乾燥した。
を開けた直後、アルゴン保護ガス下に、水（Ｍｉｌｌｉ
Ｑ）中の化合物の０．５ｍモル溶液中に入れた。６ｈの
吸着時間後に、基板を水３００ｍｌで洗浄し、窒素気流
中で乾燥した。
【００９２】ｃ） 特性決定：単分子層の特性決定は、
表面プラズモン分光分析および接触角測定法を用いて行
なった。
表面プラズモン分光分析および接触角測定法を用いて行
なった。
【００９３】表面プラズモン分光分析は、表面および薄
膜の特性決定するための高い感度を有する光学的方法で
あって、特殊な分子標識（たとえば蛍光標識）も必要と
しない（Ｗ．Ｋｎｏｌｌ，ＭＲＳ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，
第１６巻，Ｎｏ．７（１９９１年）第２９頁〜第３９
頁）。
膜の特性決定するための高い感度を有する光学的方法で
あって、特殊な分子標識（たとえば蛍光標識）も必要と
しない（Ｗ．Ｋｎｏｌｌ，ＭＲＳ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，
第１６巻，Ｎｏ．７（１９９１年）第２９頁〜第３９
頁）。
【００９４】自己集合性単分子層（ＳＡＭ）の層厚の測
定のために、空気および水性媒体に対する測定を実施し
た。
定のために、空気および水性媒体に対する測定を実施し
た。
【００９５】接触角測定は、界面を分析するためしばし
ば利用される方法である。その際、基板、被膜の種類お
よび組成および膜上の秩序に関する情報を得ることがで
きる（Ａ．Ｕｌｌｍａｎｎ，“Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏ
ｎ ｔｏ ｕｌｔｒａｔｈｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｆｉ
ｌｍｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１
９９１年）。接触角の測定のためには、接触角顕微鏡Ｇ
１（Ｋｒｕｅｓｓ／Ｈａｍｂｕｒｇ）を使用した。第１
表および第２表からのすべての記載値は、担体上の異な
る個所での少なくとも６つの測定からの平均値である。
その際、誤差は±２°である。
ば利用される方法である。その際、基板、被膜の種類お
よび組成および膜上の秩序に関する情報を得ることがで
きる（Ａ．Ｕｌｌｍａｎｎ，“Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏ
ｎ ｔｏ ｕｌｔｒａｔｈｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｆｉ
ｌｍｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１
９９１年）。接触角の測定のためには、接触角顕微鏡Ｇ
１（Ｋｒｕｅｓｓ／Ｈａｍｂｕｒｇ）を使用した。第１
表および第２表からのすべての記載値は、担体上の異な
る個所での少なくとも６つの測定からの平均値である。
その際、誤差は±２°である。
【００９６】次の実験においては、それぞれの膜上で
の、限外濾過（Ｍｉｌｌｉ Ｑ）によって精製した水の
湿潤性を測定した。
の、限外濾過（Ｍｉｌｌｉ Ｑ）によって精製した水の
湿潤性を測定した。
【００９７】
【表１】
【００９８】測定された厚さは、理論的に計算した値と
良く一致する。これは、それぞれ整列し、密に充填され
た単分子層であることを指示する。その際、分子はホワ
イトサイズ（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ）等（Ｃ．Ｄ．Ｂａ
ｉｎ，Ｇ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０（１９８８年）第６２頁；Ｋ．Ｌ．Ｐｒｉｍ
ｅ，Ｇ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５２（１９９１年）第１１６４頁）により発表された
データと類似に、長鎖アルカンチオールに関しては同様
に表面の法線に対して約３０°傾斜していてもよい。
良く一致する。これは、それぞれ整列し、密に充填され
た単分子層であることを指示する。その際、分子はホワ
イトサイズ（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ）等（Ｃ．Ｄ．Ｂａ
ｉｎ，Ｇ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０（１９８８年）第６２頁；Ｋ．Ｌ．Ｐｒｉｍ
ｅ，Ｇ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５２（１９９１年）第１１６４頁）により発表された
データと類似に、長鎖アルカンチオールに関しては同様
に表面の法線に対して約３０°傾斜していてもよい。
【００９９】接触角も、多結晶性Ａｕ上のＯＨないしは
ビオチン成端アルカンチオールから得られた値と良く一
致する（Ｈ．Ｗｏｌｆ，Ｄｉｐｌｏｍａｒｂｅｉｔ Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｍａｉｎｚ １９９１年）。
接触角は、整列され、密に充填された単分子層のイメー
ジを支持する。
ビオチン成端アルカンチオールから得られた値と良く一
致する（Ｈ．Ｗｏｌｆ，Ｄｉｐｌｏｍａｒｂｅｉｔ Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｍａｉｎｚ １９９１年）。
接触角は、整列され、密に充填された単分子層のイメー
ジを支持する。
【０１００】これら新規の化合物類のストレプトアビジ
ン（ＳＡ）の結合力を調べるために、純化合物１のほか
に化合物４との混合物も調べた。同様に、さらにタンパ
ク質層を、ＨＣＧに対するモノクローナル抗体のビオチ
ニル化Ｆａｂフラグメント（Ｆａｂ＜ＨＣＧ＞）および
ＨＣＧの吸着によって累積した。
ン（ＳＡ）の結合力を調べるために、純化合物１のほか
に化合物４との混合物も調べた。同様に、さらにタンパ
ク質層を、ＨＣＧに対するモノクローナル抗体のビオチ
ニル化Ｆａｂフラグメント（Ｆａｂ＜ＨＣＧ＞）および
ＨＣＧの吸着によって累積した。
【０１０１】ストレプトアビジンおよびＦａｂは５×１
０~7モル／ｌ溶液として添加し、ＨＣＧ（ヒトコリオゴ
ナドトロピン）はＮａＣｌ ０．５モル／ｌ中の２５μ
ｇ／ｍｌ溶液として添加した。
０~7モル／ｌ溶液として添加し、ＨＣＧ（ヒトコリオゴ
ナドトロピン）はＮａＣｌ ０．５モル／ｌ中の２５μ
ｇ／ｍｌ溶液として添加した。
【０１０２】
【表２】
【０１０３】チオール単分子層の厚さｄ（ＳＡＭ）の増
加は、第１表からの値で修正する。
加は、第１表からの値で修正する。
【０１０４】化合物４により金表面における化合物１を
希釈することによって、ストレプトアビジン結合力の最
適化が達成される。
希釈することによって、ストレプトアビジン結合力の最
適化が達成される。
【０１０５】ストレプトアビジンによる表面の被覆が完
全な場合には測定された厚さは４０Åであり、従って理
論的に期待される値と良く一致する（Ｒ．Ｃ．Ｅｂｅｒ
ｓｏｌｅ，Ｍ．Ｄ．Ｗｏｒｄ，Ｊ．Ａ．Ｍｉｌｌｅｒ，
Ｊ．Ｒ．Ｍｏｒａｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，
第１１２巻（１９９０年）第３２３９頁〜第３２４１
頁；Ｐ．Ｃ．Ｗｅｂｅｒ，Ｄ．Ｈ．Ｏｈｌｅｎｄｏｒ
ｆ，Ｊ．Ｊ．Ｗｅｎｄｏｌｏｓｋｉ，Ｆ．Ｒ．Ｓａｌｅ
ｍｍｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２４２巻（１９８９年），
第８５頁）。
全な場合には測定された厚さは４０Åであり、従って理
論的に期待される値と良く一致する（Ｒ．Ｃ．Ｅｂｅｒ
ｓｏｌｅ，Ｍ．Ｄ．Ｗｏｒｄ，Ｊ．Ａ．Ｍｉｌｌｅｒ，
Ｊ．Ｒ．Ｍｏｒａｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，
第１１２巻（１９９０年）第３２３９頁〜第３２４１
頁；Ｐ．Ｃ．Ｗｅｂｅｒ，Ｄ．Ｈ．Ｏｈｌｅｎｄｏｒ
ｆ，Ｊ．Ｊ．Ｗｅｎｄｏｌｏｓｋｉ，Ｆ．Ｒ．Ｓａｌｅ
ｍｍｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２４２巻（１９８９年），
第８５頁）。
【０１０６】この最適化ストレプトアビジン層はＢ−Ｆ
ａｂ＜ＨＣＧ＞に対する最適結合相として働き、該層は
同様にＨＣＧ検出のために使用することができる。
ａｂ＜ＨＣＧ＞に対する最適結合相として働き、該層は
同様にＨＣＧ検出のために使用することができる。
【０１０７】例１４ 再生される結合マトリックスの製造 例７に記載したと類似に、デスチオビオチンおよびイミ
ノビオチンをデスチオビオチン−Ｘ−ＤＡＤＯＯおよび
イミノビオチン−Ｘ−ＤＡＤＯＯとしてＳＡＴＰに結合
することができる。
ノビオチンをデスチオビオチン−Ｘ−ＤＡＤＯＯおよび
イミノビオチン−Ｘ−ＤＡＤＯＯとしてＳＡＴＰに結合
することができる。
【０１０８】これらの化合物は、結合相が再生可能であ
るべき場合に、結合マトリックスとして使用することが
できる。
るべき場合に、結合マトリックスとして使用することが
できる。
【０１０９】再生のためには、固相を室温で１０分間、
ＮａＣｌ ０．５モル／ｌ中のビオチン２×１０~4モル
／ｌの溶液と共にインキュベートする。引き続き、Ｎａ
Ｃｌ０．５モル／ｌで２回洗浄する。
ＮａＣｌ ０．５モル／ｌ中のビオチン２×１０~4モル
／ｌの溶液と共にインキュベートする。引き続き、Ｎａ
Ｃｌ０．５モル／ｌで２回洗浄する。
【０１１０】結合相の再生は９０％以上（表面プラズモ
ン共鳴により測定）行なわれる。
ン共鳴により測定）行なわれる。
【図１】固相への遊離反応成分の結合を測定することの
できる測定装置の略示断面図。
できる測定装置の略示断面図。
【図２】固相反応物を有する成分と希釈分子の組合せに
より製造された結合マトリックスの厚さならびにそれに
結合したストレプトアビジン（例１２）の厚さ／モル分
率線図。
より製造された結合マトリックスの厚さならびにそれに
結合したストレプトアビジン（例１２）の厚さ／モル分
率線図。
１０ レーザー １１ 一次光線 １２ 集光レンズ １３ ダイオード １４ 流動クベット １５ 入口および出口 １６ プリズム １７ 平面の法線 ２０ 試験部分 ２１ 指標液 ２２ 担体層 ２３ａ，２３ｂ 薄い金属層 ２５ スペーサ分子 ２６ 固相反応物 ２７ 遊離反応成分 ２８ 試験相 曲線１：ビオチン単分子層の厚さ 曲線２：ビオチンのモル分率Ｘに依存するストレプトア
ビジンによる厚さ増加
ビジンによる厚さ増加
【数１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クリスティアン クライン ドイツ連邦共和国 ヴァイルハイム ブリ ューテンシュトラーセ 16 (72)発明者 マーサ ライリー イギリス国 ロンドン ロンスデイル ロ ード 49 ビー (72)発明者 ユルゲン シュピンケ ドイツ連邦共和国 ケルクハイム−ミュン スター フランクフルター シュトラーセ 167 (72)発明者 ヴォルフガング クノル ドイツ連邦共和国 マインツ エルザ−ブ ラントシュトレーム−シュトラーセ 18デ ー
Claims (37)
- 【請求項１】 担体物質およびそれに固定基を介して吸
着された、少なくとも１つの遊離反応成分と結合しうる
固相反応物を含有し、その際固相反応物は、担体物質の
表面上に、主として横に均一な希薄な結合層を形成す
る、結合マトリックスの製造方法において、担体物質
を、短鎖のスペーサ分子を介して固定基と結合した固相
反応物および少なくとも１つの親水性希釈分子を含有す
る水性反応溶液と共にインキュベートすることを特徴と
する結合マトリックスの製造方法。 - 【請求項２】 担体物質の表面上の固相反応物の被覆
が、固相反応物および希釈分子からなる全被覆の０．１
〜９０％であることを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 担体物質の表面上の固相反応物の被覆が
全被覆の０．５〜７０％であることを特徴とする請求項
２記載の方法。 - 【請求項４】 担体物質の表面上の固相反応物の被覆が
全被覆の１〜４０％であることを特徴とする請求項３記
載の方法。 - 【請求項５】 担体物質が金属表面または金属酸化物表
面を有することを特徴とする請求項１から４までのいず
れか１項記載の方法。 - 【請求項６】 担体物質が金−、銀−またはパラジウム
表面を有し、固定基がチオール基、ジスルフィド基また
はホスフィン基であることを特徴とする請求項５記載の
方法。 - 【請求項７】 可変スペーサ分子を介して固定基と結合
している固相反応物を使用することを特徴とする請求項
１から６までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項８】 有機溶剤および洗剤を有しない水性反応
溶液を使用することを特徴とする請求項１から７までの
いずれか１項記載の方法。 - 【請求項９】 スペーサ分子と固相反応物の間に親水性
リンカー基が存在することを特徴とする請求項１から８
までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１０】 親水性リンカー基が１以上のオキシエ
チレン基を含有することを特徴とする請求項９記載の方
法。 - 【請求項１１】 親水性リンカー基をアミン−またはヒ
ドロキシル成端ポリエチレンオキシドによって形成する
ことを特徴とする請求項１０記載の方法。 - 【請求項１２】 親水性リンカー基が、１，８−ジアミ
ノ−３，６−ジオキサオクタンから形成されていること
を特徴とする請求項１１記載の方法。 - 【請求項１３】 親水性リンカー基と固相反応物の間に
もう１つのスペーサ分子が存在することを特徴とする請
求項１から１２までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１４】 親水性希釈分子が１個の固定基および
１個のスペーサ成分を含有することを特徴とする請求項
１から13までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１５】 親水性希釈分子が付加的に１つの親水
性リンカー基を含有することを特徴とする請求項１４記
載の方法。 - 【請求項１６】 希釈分子として一般式： Ｘ1−Ｓ−Ｓ−Ｘ2 または ＨＳ−Ｘ3 ［式中Ｘ1，Ｘ2およびＸ3はそれぞれ−（ＣＨ2）n−Ｃ
Ｏ−ＮＨ−Ｌ−Ｙを表わし、ｎは１〜６の自然数を表わ
し、Ｌは原子数４〜１５の鎖長を有する親水性リンカー
基であり、Ｙは親水性末端基である］で示される化合物
を使用することを特徴とする請求項１４または１５記載
の方法。 - 【請求項１７】 親水性末端基が−ＮＨ2、−ＯＨ、−
ＣＯＯＨまたは−ＳＯ3Ｈであることを特徴とする請求
項１６記載の方法。 - 【請求項１８】 親水性リンカー基が１以上のオキシエ
チレン基を含有することを特徴とする請求項１５から１
７までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１９】 ２−メルカプトプロピオン酸［２−
（２−ヒドロキシエトキシ）］−エチルアミドを希釈分
子として使用することを特徴とする請求項１から１８ま
でのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項２０】 固相反応物が抗体と結合しうる抗原ま
たはハプテンであることを特徴とする請求項１から１９
までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項２１】 固相反応物がビオチンまたはビオチン
誘導体であることを特徴とする請求項１から１９までの
いずれか１項記載の方法。 - 【請求項２２】 固相反応物がビオチンに比べて小さ
い、ストレプトアビジンへの結合親和力を有するビオチ
ン誘導体であることを特徴とする請求項２１記載の方
法。 - 【請求項２３】 固相反応物と結合しうる遊離反応成分
がストレプトアビジン、アビジンまたはその誘導体であ
ることを特徴とする請求項２１または２２記載の方法。 - 【請求項２４】 担体物質への固定基を備える固相反応
物の吸着後、得られる結合マトリックスを、非共有結合
で結合した幾つかの成分からなる固相反応物をつくるた
めに、結合マトリックスと結合しうる他の１種または数
種の物質と共にインキュベートすることを特徴とする請
求項１から２３までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項２５】 少なくとも２つの生物親和性反応物
（そのうちの１つは固相に結合して存在し、他方の反応
成分は遊離である）の間の特異的結合反応を用いて試料
溶液中の被検体を測定する方法において、成分が、請求
項１から２４までのいずれか１つにより製造された結合
マトリックスであることを特徴とする試料溶液中の被検
体の測定方法。 - 【請求項２６】 特異的結合反応を光学的、電子的に実
熱量または質量収支により測定することを特徴とする請
求項２５記載の方法。 - 【請求項２７】 特異的結合反応を反射光学的技術によ
って測定することを特徴とする請求項２５記載の方法。 - 【請求項２８】 特異的結合反応をプラズモン分光分析
で測定することを特徴とする請求項２７記載の方法。 - 【請求項２９】 特異的結合反応を電位差測定または電
流滴定で測定することを特徴とする請求項２５記載の方
法。 - 【請求項３０】 特異的結合反応を導電率または容量変
化により測定することを特徴とする請求項２５記載の方
法。 - 【請求項３１】 結合マトリックスを分析測定の実施
後、固相反応物に結合している遊離反応成分を別の遊離
反応物の添加によって結合マトリックスから分離するこ
とを特徴とする請求項２５から３０までのいずれか１項
記載の方法。 - 【請求項３２】 別の遊離反応物が、反応成分に対し、
固相反応成分よりも高い親和力を有することを特徴とす
る請求項３１記載の方法。 - 【請求項３３】 請求項１から２４までのいずれか１項
により製造した結合マトリックスを使用する再生可能な
層。 - 【請求項３４】 一般式： Ｘ1−Ｓ−Ｓ−Ｘ2 または ＨＳ−Ｘ3 ［式中Ｘ1，Ｘ2およびＸ3はそれぞれ−（ＣＨ2）n−Ｃ
Ｏ−ＮＨ−Ｌ−Ｙを表わし、ここでｎは１〜６の自然数
を表わし、Ｌは原子数４〜１５の鎖長を有する親水性リ
ンカー基であり、Ｙは親水性末端基である］で示される
化合物。 - 【請求項３５】 親水性末端基が−ＮＨ2、−ＯＨ、−
ＣＯＯＨまたは−ＳＯ3Ｈであることを特徴とする請求
項３４記載の化合物。 - 【請求項３６】 親水性リンカー基が１以上のオキシエ
チレン基を含有することを特徴とする請求項３４または
３５記載の化合物。 - 【請求項３７】 ２−メルカプトプロピオン酸［２−
（２−ヒドロキシエトキシ）］−エチルアミド。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4219159A DE4219159A1 (de) | 1992-06-11 | 1992-06-11 | Selbst assemblierende Monoschicht mit kurzkettigen Linkern |
| DE4219159.9 | 1992-06-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0682455A true JPH0682455A (ja) | 1994-03-22 |
| JP2672245B2 JP2672245B2 (ja) | 1997-11-05 |
Family
ID=6460812
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5140627A Expired - Lifetime JP2672245B2 (ja) | 1992-06-11 | 1993-06-11 | 結合マトリックスの製造方法、試料溶液中の被検体の測定方法、再生可能な層および新規化合物 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0574000B1 (ja) |
| JP (1) | JP2672245B2 (ja) |
| AT (1) | ATE157458T1 (ja) |
| DE (2) | DE4219159A1 (ja) |
| ES (1) | ES2108781T3 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10307141A (ja) * | 1997-04-14 | 1998-11-17 | Boehringer Mannheim Gmbh | プラズモン共鳴および蛍光検出を用いた生体分子相互作用の同時検出法 |
| JP2000146976A (ja) * | 1998-11-09 | 2000-05-26 | Japan Science & Technology Corp | Ｓｐｒセンサー用金属薄膜、その製法およびそれを用いた測定方法 |
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