JPH06502717A - 無限小場を用いて流体サンプル中の特異的リガンドを測定する方法、およびまたこの目的に適切な必須測定装置構成要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 無限小鳩を用いて流体サンプル中の特異的リガンドを測定する方法、およびまた この目的に適切な必須測定装置構成要素本発明は、 一無限小場（ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ　ｆｉｅｌｄ）を発生し得るものであり、そ して測定すべきリガンドに特異的な結合相手が表面に備わっているところの、光 学要素の表面に、サンプルを接触させ；−該無限小鳩を生じさせるに適切な波長 を有する光を該光学要素に照射し：そして 一反射光を分析することで、該リガンドと該特異的結合相手との間の複測定する 、 ことによって流体サンプル中のリガンドを測定する方法に関する。「表面プラズ モン共鳴Ｊ　（ＳＰＲ）効果、ブレナ光導体または光学繊維を用いて無限小鳩を 発生させることができる。

この種類の方法は、国際特許出願１０８８１０７２０２に記述されている。より 詳細には、この特許出願に記述されている方法は、図１に示されている装置を用 いて行われる。上記図１において、（１）は、透明なプラスチック材料中の浅い ウェルを表しており、これの平らな基部（２）には、その表面に回折格子（３） が備わっている。この格子（３）の上部表面は、半反射材料または金属フィルム 、例えば銀、アルミニウム、銅または金などのフィルムで覆われている。これの 上部で、この格子には、測定すべきリガンドに特異的な結合相手の薄フィルムが コートされている。

例えば、リガンドとして抗原を用いることができ、そしてこの特別な抗−原のた めの抗体を、特異的結合相手として用いることができる（図２参照）。図１に示 されており、そして該格子（３）中に「表面プラズモン共鳴Ｊ　（ＳＰＲ）を発 生させるための、該基部（２）の下側表面上に適切な角度でレーザー光を向ける ためのレーザー光源（５）が備わっているハウジング（４）の中で、上記の如き 検出を行う。このハウジング（４）の中に取り付けられている光検出装置（６） で、上記反射光が捕捉され、そして検出装置（６）から派生する電気シグナルが 測定装置（７）［これは該ハウジング（４）の中に取り付けられているか或は取 り付けられていな（でもよい］で処理される。該ウェル（１）の中に入っている サンプル（８）の中に、金属層に拘束されている特異的結合相手に結合する関連 したリガンドが存在している場合、検出装置（６）から派生するシグナルが変化 する。上記国際特許出願１０８８１０７２０２に記述されているＳＰＲ方法は、 明らかに、用いられたサンプル（８）中の光散乱粒子によって悪影響を受けるも のではないが、しかしながら、このようなＳＰＲ方法の再現性は望ましくない程 低いことが見いだされた。

例えば、抗体の場合、これは、該金属フィルムの上に存在している上記抗体を固 定化するとき脱離するか或は活性の損失が生じることに帰するものである。更に 、上述した方法の感度（検出限界）もまた望まれる程のものではない。

ヨーロッパ特許出願０．３４６．０１６にもまた、国際特許出願ＷＯ８８１０７ ２０２に示されている種類の装置が記述されており、上記ヨーロッパ特許出願に 記述されている装置もまた上記欠点を有する。

上に概略を示した上記方法の欠点は、リガンドか或はりガントに特異的な結合相 手を保持しているところの、粒状形態の支持体、を多数用いることによって克服 され得る。

より詳細には、上述した目的は、前文で記述した方法において、リガンドを保持 している粒状形態支持体の懸濁液と一緒にサンプルを用いる、ことによって達成 され得る（競合アッセイ：図３ａ、特に３ｂを参照）。

本発明に従う目的はまた、前文で記述した方法において、流体／固体接触面に位 置しているその表面に、リガンドに特異的な結合相手を含んでいる粒状形態の支 持体が多数備わっている、光学要素を用いる、ことによって達成され得る（図４ 参照）。

上述した目的は、同様に、流体／固体接触面に位置しているその表面が多数の特 異的結合相手を含んでいる光学要素を用い、これに、上記特異的結合相手に可逆 的に結合する粒状形態の「脱離剤」を与える、ことによって達成され得る（図５ 参照）。この言葉「脱離剤」は、少な（とも１種のリガンドが備わっている粒状 形態の支持体として定義される。

上述した目的はまた、流体／固体接触面に位置しているその表面が、リガンドと 「脱離剤」とが一定濃度で存在しておりそして有利に循環している媒体で定まる 平衡に従っていくつかには該リガンドが与えられておりそしていくつかには該「 脱離剤」が与えられているところの、リガンドに特異的な多数の結合相手、を含 んでいる光学要素を用い、ここで、試験すべきサンプルを投与した後、上記平衡 状態が一時的にシフトして、相当する無限小鳩の変化が生じる、ことによって達 成され得る（図６ａ参照）。

この最後に述べた解決法に関する重要な利点は、この方法では、測定を例えばＳ ＰＲ測定装置（図６ａ（０）〜（３））を用いた「連続」測定が可能なことであ る、と言うのは、該光学要素表面上で測定を行った後再び初期の平衡状態になり 、従って再び測定の実施で使用できるからである。このような「連続」測定方法 の場合、測定すべきリガンドに対しては透過性を示すが「脱離剤」に対しては透 過性を示さない膜を、好適には、該光学要素と、試験するサンプルを付ける場所 と、の間に挿入する（図７）。このようにして、有利に循環している上記媒体は 、一定濃度でその関連したリガンドのみを含有している、と言うのは、該「脱離 剤」は、上記膜と光学要素表面との間の間隙から出て行くことはないからである 。

最初に述べた解決方法の特別な変法は、該流体／固体接触面に位置している表面 を有する光学要素を用い、これに、リガンドに特異的な結合相手を含有している 粒状形態の多数の支持体を与えると共に、これらの特異的結合相手にも、上記特 異的結合相手に可逆的に結合する粒状形態の「脱離剤」を与えることから成る（ 図８参照）。

無限小鳩を用いた測定方法に関する従来技術で公知の欠点に打ち勝つための上記 解決方法に関して、上記解決方法は全て、該光学要素単位表面積当たりの質量変 化を上昇させることに関するものであり、その結果として、これが「発明の一貫 性」の内容である。

該光学要素単位表面積当たりの質量変化を上昇させることに関する上記原理を用 いて、無限小鳩の変化を基とした測定、例えば特にＳＰＲ方法の感度および再現 性の両方を上昇させることが可能になった。

本発明に従う方法で用いる光学要素は、銀または金の金属層が好適にコートされ ている適切な屈折率を有するプラスチック材料もしくはガラスから成り、特異的 結合相手が充填されている支持粒子をこの金属層に取り付ける。この金属層の厚 さは通常１０〜１１００ｎであり、公知方法、例えば蒸着などによって塗装され 得る。この光学要素は、特定の厚さを有する小板の形態である。

上で定義した光学要素に加えて、光学繊維およびプレナ光導体もまた光学要素と して使用され得る。

本発明の範囲内に入る粒状形態の支持体としては、数多くの種々の形態を有する 支持体粒子が使用できる。有利には、例えば１０〜５０００ｍの範囲の直径を有 するラテックス球体を支持体として用いる。適切な材料の例は、とりわけ、（単 分散）ポリスチレンラテックス、ポリメタアクリル酸メチルラテックスまたはシ リカラテックスである。ラテックスの特定例は、直径が５０ｎｍ（タイプ１０） または１０１００ｎタイプ１１）のＵｎｉｓｐｈｅｒｅラテックス粒子（Ｂｒｕ ｎｓｃｈｗｉｇ　Ｃｈｅｍｉｅ　Ｂ、　Ｖ９、Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ ）および直径が５０．１００または２００ｎｍのｒＰｏｌｙｂｅａｄＪポリスチ レンミクロ球（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｃａｒｐ、、Ｎｉ１ｅｓ／１１１Ｌ ｎｏｉｓＳＵＳ＾）である。金属のゾル（ゾル粒子）、例えば金ゾル、銀ゾルな ども粒状形態の支持体として用いられ得る。

異なる大きさを有する粒子、異なる官能基を有する粒子、異なる固有屈折率を有 する粒子などの粒子の組み合わせ、そしてまた金属ゾルと一緒にラテックスを用 いることも可能である。

ラテックスと金属ゾルとの組み合わせは、２つの無限小場の重なり、即ちこの装 置が発生する無限小場と該金属粒子が発生する無限小場との重なり、に関連した 一層の感度と特異性を与えることができる。

粒状形態の支持体が充填されている該光学要素の表面に関する「被覆度」は太き （変化する、例えば、この被覆度は、該支持体粒子の大きさ、または特異的結合 相手、例えば抗体およびＤＮＡストランドなどの種類、に依存している。一般に 、この被覆度は５０〜９９．５％であると述べることができる。完全さをめる目 的で、粒状形態（「球状」）支持体による該光学要素表面の「被覆度」は、この 「球状」支持体の断面表面積の合計に１００を掛けた値を該光学要素の全表面積 で割った比率を意味するものと理解する、ことを特記する。

該球状支持体上の該特異的結合相手の「充填車」は、該球状支持体の充填されて いる表面積（即ち、この特異的結合相手によって覆われている表面積）に１００ を掛けた値を単層もしくは副次的単層中の該球状支持体の全表面積で割った比率 であると理解される。一般に、この充填度合は１０〜９０％である。該球状支持 体上のリガンドに関しても同様な「充填車」を引用することができる（「脱離剤 」の定義を参照）。

サンプル中で測定すべきリガンドとしてか、或はそれぞれ、それに相補的な特異 的結合相手として、数多くの種々の種類の化合物を用いることができる。上で既 に、リガンドとして抗原を挙げ、そして特異的結合相手として、該抗原に特異的 な抗体を挙げた。利用できるリガンドおよび特異的結合相手を挙げた以下の表Ａ （これは完全ではない）を参照のこと。

抗原　抗体 抗体　抗原 ホルモン　ホルモンレセプタ ホルモンレセプタ　ホルモン ハブテン　ハブテンの抗体 ハブテンの抗体　ハブテン ポリヌクレオチド鎖　相補的ポリヌクレオチド鎖蛋白質Ａ　免疫グロブリン 免疫グロブリン　蛋白質Ａ 酵素　酵素共因子（基質）または阻害剤レクチン　特異的炭水化物 特異的炭水化物　レクチン アルギン酸塩　アルギン酸カルシウム複合体アルギン酸カルシウム複合体　アル ギン酸塩該ラテックス球体上への該特異的結合相手もしくはリガンドの固定化は 、本質的に公知の現象である。例えば、「ミクロ粒子免疫アッセイ技術Ｊ　（Ｍ ｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｉａ＋ａ＋ｕｎｏａｓｓａｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｓ）　（Ｓｅｒａｄｙｎ　Ｉｎｃｌ、Ｇａｌｌｏｗａｙおよびｆｌｉｃｋｓ編集 、Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、　Ｐ、０．Ｂ ｏｘ　１２１０、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ　４６２０６、ＵＳＡ）の 中に上記技術の一般的説明が与えられている。

次に、吸収によるか、接着剤または他の種類の粘着層から成る薄層を用い、浸漬 技術、スピンコーティングまたは他の一般的に知られている堆積技術によって、 特異的結合相手を充填した支持体を、該光学要素の金属層に結合させることがで きる。

完全さをめる目的で、望まれるならば上と逆に、最初に該光学要素の金属層に該 球体を接着させた後、支持体として作用するこれらの球体上に該特異的結合相手 を固定化する、ことによって上記操作を行ってもよい。フラットコーティング、 例えばポリスチレンコーティングによって、該粒状形態の支持体を該金属表面に 取り付けてもよい、即ち、間接的に該粒状形態支持体を該金属表面に固定化して もよい。更に、粒状形態の支持体、抗体および抗原から成る組み合わせを用いる ことで、この測定システムの感度を最適することができる。これは、開発する用 途に依存している。これらの粒状形態の支持体は、生物学的ドメインと光学的ド メインとの間の接触面として働く。

用いる光源は、従来技術で公知の光源、例えばヘリウム−ネオンレーザ−光源お よび赤外ダイオードレーザ−光源であってもよい。

本発明はまた、ＳＰＲ測定装置で用いるに適切であり、そしてプラスチックもし くはガラス製の透明な小板もしくは繊維から成る光学要素に関するものであり、 これの１つの表面には、金もしくは銀の金属層がコートされており、この金属層 にはそれに取り付けられているある量の粒状形態支持体が与えられており、そし てこれらは特異的結合相手を含有している。これに関する詳細は上に示しである 。

解説 図１は、表面プラズモン共鳴効果を検出するための装置に関する図である（従来 技術）。

図２は、金属表面上に拘束されている抗体がリガンドに結合する図式的表示であ る（従来技術）。

図３ａは、金属表面上に拘束されている抗体が、リガンドが備わっている粒状形 態支持体に結合する図式的表示である。

図３ｂは、リガンドとリガンドが備わっている粒状形態支持体との混合物が、金 属表面に拘束されている抗体に結合することに関する「競合アッセイ」の図式的 表示である（測定角の差に関する大きさの位数に関しては図１０の曲線Ｃおよび ａを参照）。

図４は、光学要素の表面に接着している粒状形態支持体の上に特異的結合相手が 位置し、そしてリガンドに結合している、本発明に従う方法の図式的表示である 。

図５は、光学要素の表面に接着しているリガンドに特異的な結合相手の上に１脱 離剤」が位置し、そして置換反応を通してリガンドによって除去されている、本 発明に従う方法の図式的表示である。

図６は、光学要素（９）の表面に接着している特異的結合相手と、媒体中に存在 しているリガンドと、「脱離剤」と、の間の平衡状態を示している、本発明に従 ・）方法の図式的表示である。

図６ａ（０〜３）　これらの図は、測定に関する時間点を示している。

図６ａ（０）は、時間ｔ０の平衡相を表し、図６ａ（］、）は、時間ｔ１のサン プリングを表し、図６８（２）は、時間ｔ２のサンプリングのため変化した平衡 相を表し、そして 図６８（３）は、時間ｔ、の回復した平衡相（ｔｏと同じ）を表している。

図７は、リガンドに対しては透過性を示すが「脱離剤」に対しては透過性を示さ ない膜（１０）が、それに接着している特異的結合相手が備わっている光学要素 （９）の表面と、試験すべきサンプルが供給される場所と、の間に取り付けられ ている、本発明に従う方法の図式的表示である。

図８は、光学要素の表面に接着している球体の上に、リガンドに特異的な結合相 手が存在しており、そしてこのリガンドそれ自身に特異的な結合相手に「脱離剤 」が付いており、そしてこの「脱離剤」が、置換反応を通してリガンドによって 除去されている、本発明に従う方法の図式的表示である。

図９は、図１０に示すような表面プラズモン共鳴効果を発生させるために用いる 光学システムを示すものである。図９において、（１１）はプリズムを表し、（ １２）は偏光の入射光線を表し、（１３）は反射光線を表し、（１４）はガラス 製基質を表し、（１５）はこの基質に取り付けられている金層を表し、（１６） は、この金層に取り付けられている本発明に従う特異的結合相手の層か、或は特 異的結合相手が充填されているラテックス球体を表し、そして（１７）は試験す べき流体サンプルを表している。

図１０は、５ＰＲ（以下の実施例を参照）で得られる測定結果のグラフを示して おり、ここで、 一曲線（ａ）は、そこにＨ３Ａ　（ヒト血清アルブミン）を取り付けた金層に関 する結果を示し、 一曲線（ｂ）は、そこに取り付けた抗Ｈ５Ａと反応したＨ５Ａを有する金層に関 する結果を示し、 一曲線（Ｃ）は、Ｈ８Ａが充填されているカルボキシル化ポリスチレンミクロ球 （１００ｎｍ）をコートした金層に関する結果を示し、そして−曲線（ｄ）は、 抗Ｈ３Ａと反応したＨ３Ａが充填されているカルボキシル化ポリスチレンミクロ 球（１００ｎｍ）をコートした金層に関する結果を示している。

図１１は、ＳＰＲ測定装置を用いた、一方の（曲線ａ）ブランクであるｈＣＧを コートしたラテックスと、他方の（曲線ｂ）２５０ＩＵのｈｃＧおよびｈＣＧを コートしたラテックス混合物と、の間の競合アッセイに関するグラフを表してお り、このアッセイでは、金層に取り付けられているポリクローナル抗ｈＣＧが抗 体と作用している。

図１２は、ＳＰＲ測定のグラフであり、ここで、は、Ｂｉｏｃｒｙ１球体を表し 、 は、ブランク（ＰＣＲｆｉ合物を有するがＤＮＡフラグメントを有していないＢ ｉｏｅｒｙ１球体）を表し、は、ＰＣＲ混合物とＤＮＡフラグメントを有するＢ ｉｏｃｒｙ１球体を表している。

以下の実施例を用いて本発明を更に詳しく説明する。

この実施例では、図９に示す測定装置を用いた。この場合、該金層にコーティン グを最初に施した。このコーテイング物は、ヒト血清アルブミン（ＨＳ　Ａ　： 　Ｓｉｇｍａ　Ａ　３７８２）　；濃度１ｍｇ／ｍＬから成り、この金層の表面 は上記生成物で完全に覆われており、そしてこのコートした金属表面を３０分後 ＰＢＳ　（燐酸塩緩衝食塩水溶液；Ｏ，ＯＩＭ；ｐＨ＝７゜４）に浸漬する。

次に、上記コートした金層にＰｏ１ｙｂｅａｄポリスチレン（２，５％固体）カ ルボキシル化ミクロ球（１００ｎ　ｍ）　（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｃｏｒ ｐ、、Ｎｉ１ｅｓ／ｌ１ｌＸＵＳＡ）を塗布する。１０分後、この金属表面をＰ ＢＳで濯いだ。

次の段階で、４５ｍｇのカルボジイミドをＰＢＳ２ｍＬに溶解することによって 調製したカルボジイミドの２％溶液２ｍＬを、上で得られる球体が備わっている 金属層の上に滴下した後、室温（２０℃）および相対湿度１００％で６時間培養 した。

その後、この得られる生成物をホウ酸塩緩衝液（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｃ ａｒｐ、、Ｎｉ１ｅｓ／Ｉｌｌ、ＵＳＡ）で濯いだ。

次の段階で、蛋白質（ＨＳ　Ａ　：　Ｓｉｇｍａ　Ａ　３７８２）を塗布した後 （１ｍｇ／ｍＬ；球体でコートした金層表面を完全に覆った）、この生成物を１ ００％相対大気湿度で一晩保存した。この後、再びこの生成物をＰＢＳで濯いだ 。

最後に、カルボジイミド由来の未反応基を、室温で３０分間、過剰の０．１Ｍエ タノールアミン溶液でブロックした。

Ｂ）抗Ｈ３Ａとの反応 該コートした金層の上に、抗ＨＳＡ含有溶液（Ｓｉｇｍａ、番号Ａ　１１５１） を滴下した。その後、この生成物を１時間培養した。次に、これをＰＢＳで濯い だ。図９に示す測定装置を用いて、関連した測定を行った。

その結果を図１０に示す。図１０において、曲線（ａ）は、ポリスチレンをコー トした金層に直接付けたＨ３Ａに関する測定結果を示しており、この層は、ラテ ックス球体を伴う段階を除外した上記様式で製造した。この図から、ラテックス 球体をコートした金層（ｃ−ｄ）の感度は、コートしていない金層（ａ　−ｂ　 ）に比べて評価できる程上昇していた。

実施例ＩＩ Ａ）ｈＣＧに対するポリクローナル抗体を与えた金層が備わっている光学要素の 製造 この実施例でもまた、図９に示す測定装置を用い、そして下記の材料を用いたニ ードルエン中０．１％のポリスチレン溶液（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）　；−ｈＣＧに 対するポリクローナル抗体（ｌｌｕｍａｎ　Ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ　Ｇｏｎａｄｏ ｔｒｏｐｈｉｎ）、ロット番号２６０９９、濃度１７　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｌ　、 　Ｆｌｅａｕａｉｎｇ　ＧｒａｂＢ　；−ｈＣＧコートしたラテックス、ロット 番号２６０７０、直径領　２３８　ｕｍ、　Ｆｌｅｍｍｉｎｇ　ＧｍｂＨ；−ｈ ＣＧ、ロット番号１２８Ｆ−０６５１；５０００１Ｕ／びん；　ｓｉｇ＋ａ−Ｐ 　Ｂ　Ｓ　／Ｔｗｅｅｎ　２０中０．１％のゼラチン、ゼラチンのロット番号０ ７３　２９２８２　；　０ｘａｉｄ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ。

Ｐ　Ｂ　Ｓ　／Ｔｗｅｅｎ　２０溶液；１リツトルのＰＢＳ当たり１リツトルの Ｔｗｅｅｎ２０（０，１％溶液） −ＰＢＳ／燐酸塩緩衝食塩水（０，０１％Ｍ、ｐＨ＝７．４）。

該光学要素の上に存在している金層（表面積＝約１ｃｍ”）に、トルエン中の０ ．　１％ポリスチレン溶液３００ルを塗布することによって、ポリスチレン層を 最初に取り付けた。１０秒間培養した後、このポリスチレンを４４００ｒｐｍで １０秒間回転させた。続いて、この得られるポリスチレン基質にポリクローナル ｈＣＧ抗体の希釈液（０，０８ｍｇ／　ｍ　Ｌ　）を塗布した後、２０分間培養 した。次に、この生成物をＰＢＳで３回洗浄した。洗浄に続いて、ブロッキング 段階を行ったが、これは、Ｐ　Ｂ　Ｓ　／Ｔｗｅｅｎ　２０中の０１％ゼラチン 溶液を用いて行った。これのための培養時間は１０分間であった。最後に、検出 それ自身を行った。この検出では、ｈＣＧをコートしたラテックス溶液（０，０ １％の固体濃度）と種々の濃度のｈＣＧ溶液を混合することによって得られる競 合混合物を用いた。ブランクは、遊離のｈＣＧを全く含有していない。上記ラテ ックスとｈＣＧをＰ　Ｂ　Ｓ／Ｔｗｅｅｎ　２０中の０．１％ゼラチンで希釈し た。２００μＬの溶液を該全小板に塗布した。

この実施例の結果を図１１にグラフの形態で示す。この図から、明らかなシグナ ルの変化が、２０分の測定時間内に生じることが分かる。この図１１において、 分で表す時間がＸ軸上に示されており、そして得られるシグナルの変化がＹ軸上 に変化する単位（反射の変化パーセントで表される）で示されている。

実施例ＩＩＩ この実施例では、実施例Ｉに記述したＳＰＲ装置を用い、そして下記の材料を用 いたニ ーＢｉｏｃｒｙ１球体（Ｔｏｓｏ　Ｈａａｓ、サイズ０．１μｍ、タイプＢｉｏ ｃｒｙｌ　ＢＰＡ　１００−ＤＮＡ材料＝ＰＶＡプラスミドからのＤＮＡ−ＰＢ Ｓ緩衝緩衝液酸燐酸塩緩衝食塩水、ＯＩＭ、ｐＨ＝７．４）−ＰＣＲ混合物＝領 　２ＭのＫＣＩ、１．５ｍＭのＭｇＣ１，，０，０２Ｍのトリス（ｐＨ＝７．７ ）　、０．０１％のゼラチン、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’　ｓ　（４ｘ）　、５０ ｐｍｏｌのプライマー、１０ｎｇのＤＮＡおよび２．５μＬのＷｌ。

この実施例に記述する実験の目的は、それらが正電荷を有しているためＤＮＡに 高い親和性を示すＢｉｏｃｒｙ１球体を用いて、ＤＮＡを測定することができる か否かを試験することである。ＳＰＲ実験で既に、ＰＢＳ緩衝液中のＢｉｏｃｒ ｙ１球体それら自身は大きな角シフトを保証しているが、これらのＢｉｏｃｒｙ １球体が有する電荷に関するスクリーニングで、これらの球体にはＤＮＡが粘着 しているため、このようなりＮＡスクリーニングでは、より小さい角シフトが生 じるべきである。

この実験は下記のようにして行った。２個のエッペンドルフ試験管の中に１ｍＬ のＰＢＳを入れた。次に、１０倍に希釈した数多くのＢｉｏｃｒｙ１球体（全体 で１μＬ、１，５μＬ、２．ＯμＬおよび２．５μＬ）を各々の試験管に加えた 。この試験管の内容物を渦巻き撹拌で混合した。その後、ＤＮＡを含有している ＰＣＲ混合物（３５μＬ）を１つの試験管に加えた。渦巻き撹拌を用いてこの試 験管を充分に混合した。最後に、両方の試験管の内容物を２つのキュベツトに移 した後、ＳＰＲ測定を行った。ゲルの写真を基準にして、このＤＮＡ濃度は２． ３〜４および６μｇ／ｍＬであることが見積もられた。これらのＤＮＡフラグメ ントの長さは４００〜２９００ｂｐの範囲であった。ブランクのＰＣＲ混合物、 即ちＤＮＡが入っていないＰＣＲ混合物を、この実験のブランク測定として用い た。

この実施例で記述した実験の結果を図１２に示す。この得られる結果を基にして 、原則として、ＤＮＡは測定可能であると言える。

時間（分） ０．５１．０１５２．０２５３．０３．５Ｂｉｏｃｒｙｌの量（Ｐ１］ 国際調査報告 国際調査報告 ＮＬ　９１０００７３ 国際調査報告 フロントページの続き （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，ＤＥ、　ＤＫ、　ＥＳ 、　ＦＩ。

ＧＢ、　ＨＵ、Ｊ　Ｐ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＣ，ＭＧ、　ＭＷ 、　ＮＬ、　ＮＯ，ＰＬ、ＲＯ，ＳＤ、ＳＥ、ＳＵ、　ＵＳ

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．リガンドまたはこのリガンドに特異的な結合相手を保持している多数の粒状 形態支持体を用いることを特徴とする、−無限小場を発生し得るものであり、そ して測定すべきリガンドに特異的な結合相手が表面に備わっているところの、光 学要素の表面に、サンプルを接触させ； −該無限小場を生じさせるに適切な波長を有する光を該光学要素に照射し；そし て −反射光を分析することで、該リガンドと該特異的結合相手との間の複合体形成 の結果として該光学要素が示し得る修飾された無限小場特質を測定する、 ことによって流体サンプル中のリガンドを測定する方法。
2. ２．該リガンドを保持している粒状形態支持体の懸濁液を該サンプルと一緒に用 いることを特徴とする請求の範囲１記載の方法。
3. ３．流体／固体接触面に位置しているその表面に、リガンドに特異的な結合相手 を含んでいる粒状形態の支持体が多数備わっている、光学要素を用いる、ことを 特徴とする請求の範囲１記載の方法。
4. ４．該無限小場を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）効果で発生させ、そして該光学 要素は流体／金属接触面に、関連した粒状形態支持体を有することを特徴とする 請求の範囲１または３記載の方法。
5. ５．流体／固体接触面に位置しているその表面に多数の特異的結合相手が含まれ ている光学要素を用い、これに、上記特異的結合相手に可逆的に結合する粒状形 態支持体の形態の「脱離剤」を与える、ことを特徴とする請求の範囲１または３ 記載の方法。
6. ６．流体／固体接触面に位置しているその表面に、リガンドと「脱離剤」とが存 在している媒体で定まる平衡に従っていくつかには該リガンドが与えられており そしていくつかには該「脱離剤」が与えられているところの、該リガンドに特異 的な多数の結合相手が含まれている光学要素を用い、ここで、試験すべきサンプ ルを投与した後、上記平衡状態が一時的にシフトして、相当する無限小場の変化 が生じる、ことを特徴とする請求の範囲１または３記載の方法。
7. ７．測定すべきリガンドに対しては透過性を示すが「脱離剤」に対しては透過性 を示さない膜を、該光学要素と、該サンプルを供給する場所と、の間に取り付け る、ことを特徴とする請求の範囲６記載の方法。
8. ８．粒状形態の支持体に結合させた該特異的結合相手はまた、上記結合相手に可 逆的に結合する粒状形態支持体の形態の「脱離剤」を有する、ことを特徴とする 請求の範囲１または３記載の方法。
9. ９．金または銀の金属層でコートされている光学要素を用い、そして該リガンド に特異的な結合相手または「脱離剤」が与えられている該特異的結合相手がその 上に備わっている粒状形態支持体を、その金属層に適用することを特徴とする請 求の範囲４〜８の１項以上記載の方法。
10. １０．ポリスチレンコーティングの如きフラットコーティングを介して、該粒状 形態の支持体を該金属表面に適用することを特徴とする請求の範囲９記載の方法 。
11. １１．使用する粒状形態の該支持体がラテックス球体であることを特徴とする請 求の範囲１〜１０の１項以上記載の方法。
12. １２．直径が１０〜５００ｎｍの範囲のラテックス球体を用いることを特徴とす る請求の範囲１１記載の方法。
13. １３．ポリスチレンラテックスもしくはポリメタアクリル酸メチルラテックスの 如きポリマーラテックスを用いることを特徴とする請求の範囲１１または１２記 載の方法。
14. １４．シリカのラテックスを用いることを特徴とする請求の範囲１１または１２ 記載の方法。
15. １５．金属のラテックス（＝金属のゾル）を用いることを特徴とする請求の範囲 １１または１２記載の方法。
16. １６．異なる種類のラテックスから成る組み合わせを用いることを特徴とする請 求の範囲１１〜１５の１項以上記載の方法。
17. １７．粒状形態の該支持体による該光学要素表面の「被覆度」が５０〜９９．５ ％であることを特徴とする請求の範囲３、４および８〜１６の１項以上記載の方 法。
18. １８．該特異的結合相手を用いた粒状形態該支持体表面の「充填度」が１０〜９ ０％であることを特徴とする請求の範囲３、４および８〜１６の１項以上記載の 方法。
19. １９．ＳＰＲ測定装置で用いるに適切であり、そしてその上に取り付けられてい る請求の範囲３〜１８の１項以上で定義した特異的結合相手を有するある量の粒 状形態支持体が備わっている金または銀の金属層で１つの表面がコートされてい るプラスチックもしくはガラス製の透明な小板から成る光学要素。
20. ２０．ＳＰＲ測定装置で用いるに適切であり、そして特異的結合相手に可逆的に 結合する粒状形態支持体の形態の「脱離剤」が与えられているある量の、リガン ドに特異的な結合相手、が備わっている金または銀の金属層で１つの表面がコー トされているプラスチックもしくはガラス製の透明な小板から成る光学要素。
21. ２１．粒状形態の該支持体に結合している該特異的結合相手にまた、上記特異的 結合相手に可逆的に結合する粒状形態支持体の形態の「脱離剤」が備わっている 請求の範囲１９記載の光学要素。