JP5231495B2 - 微生物の検出方法及び微生物検出装置 - Google Patents

Description

本発明は、例えば菌体などの微生物の存在の有無や微生物の増殖速度を圧電振動子により検出する方法及び微生物検出装置に関する。

昨今、食の安全に対する意識が高まりをみせており、食品や飲料等を変敗させる変敗菌の早期発見は重要な課題となっている。
従来、食品や飲料等に変敗菌が含まれているか否かの判断をする手段として、Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ（免疫計測法）、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ：酵素結合免疫吸着法）、ガスクロマトグラフ−質量分析計（ＧＣ／ＭＳ：Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ／Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、液クロマトグラフ−質量分析計（ＬＣ／ＭＳ：Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ／Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）等の計測法が用いられてきたが、測定の前処理が煩雑であり判定の精度も十分であるとは言えない。そのため、長い時間を掛けて変敗菌を培養する方法が一般的である。

この培養方法は、試料液中に存在する可能性のある変倍菌を培養温度３０℃から６０℃の下で例えば２日から４日かけて培養した上で、コロニーの目視検査を行う方法である。しかし、この方法では食物や飲料等の短期間での判定が必要な試験対象に対しては適用することが難しく、製造してから短期間で出荷できないという課題がある。
特許文献１には、生物試料を識別するための方法であって、センサーアレイに結合した成分がその表面上の質量の増加を測定することによって直接決定されること、表面の質量増加の検出法が水晶発振子天秤であること、生物試料が真菌、ウイルス、細菌であることが記載されているが、本発明を記載しているものではない。

特表２０００−５１３４３６（請求項１、７及び１５）

本発明はかかる事情においてなされたものであって、その目的は、より短期間で試料液中の微生物の有無や微生物の増殖速度を簡便に、速やかに検出することのできる方法を提供することにある。

本発明は、両面に電極が形成された圧電振動子を用い、その圧電振動子の一面側の電極に形成した吸着層であると共に、層厚が０．１μｍから１μｍの滅菌寒天培地である固体培地層に、検出対象である微生物が混入している可能性がある試料液を供給する工程と、
この圧電振動子を発振回路により発振させ、圧電振動子の発振周波数を測定する工程と、を含み、
前記固体培地層に吸着して増殖する微生物の質量増加に伴う前記発振周波数の経時的な低下の有無またはその低下度合いに基づいて微生物の有無及び微生物の増殖速度の少なくとも一方を求めることを特徴とする微生物の検出方法である。

また、前記検出方法の具体例を挙げておく。
（ｂ）前記圧電振動子は、両面に電極を形成して構成された微生物検出用の第１の振動領域と、弾性的な境界層を介して前記第１の振動領域とは異なる領域に設けられ、前記圧電振動子の両面に電極を形成して構成された参照用の第２の振動領域とを備え、前記吸着層は前記第１の振動領域の一面側の電極に形成され、前記第２の振動領域のいずれの電極にも吸着層が形成されていない。
（ｃ）前記発振回路は、発信周波数の測定値を表示する表示部に接続され、前記発振周波数の測定値を時系列データとして前記表示部に表示する工程を含む。
（ｄ）前記発振周波数の経時変化を測定する工程は、温度調節部を備えた恒温の培養容器内に圧電振動子を入れた状態で行われることを特徴とする場合。
（ｅ）微生物は菌体である。

本発明は、圧電振動子の電極上に形成した培地にて試料液中の微生物を培養し、菌体の増殖を共振周波数の変化として検出するようにしている。この結果、簡便に速やかに微生物の有無や増殖速度を検出することができる。

本発明の実施の形態に係る、培養装置の一部を示した外観斜視図である。 前記培養装置の各部品の上面側を示した分解斜視図である。 前記培養装置を示す縦断面図である。 本発明の実施の形態に係る、電極の上面に培地層を形成した水晶振動子を模式的に示した縦断面図である。 試料液を添加した培地層において菌が培養されている状態の前記水晶振動子を模式的に示した縦断面図である。 前記培養装置の全体の構成を模式的に示した図である。 前記水晶振動子の周波数温度特性の一例を表した特性図である。 前記培養装置による測定結果の一例を示した特性図である。 第２の実施の形態に係る微生物検出装置の構成を示す説明図である。 前記微生物検出装置の培養器内に配置される水晶振動子の構成を示す模式図である。 前記微生物検出装置に用いられる水晶振動子及び配線基板を示す斜視図である。 前記水晶振動子を備えた圧電センサーを示す斜視図である。 前記微生物検出装置による測定結果の一例を示した特性図である。

本発明に係る菌体の検出方法の実施形態について、図面を用いて説明する。図１及び図２は夫々この実施形態で用いる培養装置の一部を示した外観斜視図及び分解斜視図である。７は培養器（培養容器）であり、支持体７１とカバー８１とからなり、これらの間には、図３にも示すように封止部材３Ａ、配線基板３、水晶振動子２、水晶押さえ部材４の各部品がこの順に下から重ね合わさることにより構成される。

圧電振動子である水晶振動子２は、図２に示すように圧電片である円形状の水晶片２１、励振電極２２及び導出電極２４、２５（図４では図示せず）より構成されている。水晶片２１の表面側には箔状の励振電極２２が当該水晶片２１よりも小径の円形状に形成され、また、箔状の導出電極２４の一端側が前記励振電極２２に接続されて形成されている。この導出電極２４は、水晶片２１の端面に沿って屈曲され水晶片２１の裏面側に回し込まれている。一方、水晶片２１の裏面側にも励振電極２２及び導出電極２５が表面側と同様のレイアウトで接続されて形成されている。前記励振電極２２及び導出電極２４、２５の等価厚みは例えば０．２μｍであり、電極材料としては例えば金あるいは銀などが用いられている。

図４に示すように水晶片２１に設けられた表面側（試料液に接触する側）の励振電極２２には、微生物例えば菌体である変敗菌の培養環境となる吸着層である培地層１０が形成されている。この培地層１０としては例えば滅菌寒天培地を用いることができる。この寒天培地の層厚は、例えば０．１μｍから１μｍとされる。層厚が０．１μｍ以下では菌の増殖が困難であり、また層厚が１μｍを超えると、寒天は粘度が高いため水晶振動子が容易に駆動しないためである。励振電極２２上に培地層１０を形成する手法は例えば次のようにして行われる。先ず水晶ウエハの表裏両面において、多数の水晶片の形成位置に対応した位置に電極パターンを形成する。次いでこの水晶ウエハを回転自在なバキュームチャック（真空吸着機能を備えた回転スラージ）にウエハ中心と回転中心とを位置合わせした状態で水平に保持する。そして所定の寒天濃度に調整した培地を含む溶液をウエハの中心に供給すると共にスピンチャックを、当該スピンチャックの回転軸に連結されているモータにより回転させ、これにより溶液をウエハの表面に広げて薄い液膜を形成する。この液膜の厚さは回転数に応じて調整できることから、この回転数を調整することにより、層厚が０．１μｍ〜１．０μｍの培地層１０をウエハ上に形成することができる。その後ウエハをダイシングにより分断して水晶振動子の個片が得られる。なお図面では励振電極上にのみ培地層１０が形成されていることとして描いているが、このスピンコーティング法によれば水晶片の表面全体に培地層１０が形成されることになる。この場合であっても、水晶片の表面全体の面積に対する電極の面積の割合が多くなるように構成することにより、培地の重量が水晶振動子の駆動に影響を与えることはない。この時点でのこの水晶振動子の発振周波数を微生物検出の際の基準とする。その際、寒天濃度が一定であれば粘性抵抗は一定であるとみなし、ＫＡＮＡＺＡＷＡ−ＧＯＲＤＯＮの式を用いる。

図２に戻って、配線基板３は例えばプリント基板により構成され、その表面には電極３１、電極３２が間隔をおいて設けられている。前記電極３１、３２との間には、後述するように水晶振動子２の裏面側の励振電極２２が臨む気密空間をなす凹部のための貫通孔３３が形成されており、その口径は励振電極２２が収まる大きさに形成されている。配線基板３の後端側には、接続端子部３４、３５が設けられており各々導電路を介して電極３１、３２に電気的に接続されている。封止部材３Ａは中央に凹部が形成された円形体からなり、貫通孔３３の下面を塞いで水晶振動子２の裏面側雰囲気である気密空間を構成する役割を持っている。水晶振動子２の導出電極２４、２５は、導電性接着剤により電気的に接続される。

水晶押さえ部材４は、弾性材料例えばシリコンゴムを用いて配線基板３に対応した形状に作られている。水晶押さえ部材４の下面には図３に示すように、水晶振動子２の励振電極の周囲部分を支持体７１側に押さえつけるように構成されている。水晶押さえ部材４の役割は水晶振動子２を配線基板３に形成されている貫通孔３３の外側領域に押し付けて、カバー８１を支持体７１に装着したときに水晶押さえ部材４が、水晶振動子２及び配線基板３を支持体７１側に押し付ける。

カバー８１は、図３に示すように下面に形成された凹部８２と、支持体７１側に設けられた突起７５とが嵌合することで支持体７１に対して位置決めされるとともに、ねじ８３が支持体７１側の孔７４に螺嵌することにより固着される。また培養器７を構成するカバー８１及び支持体７１には温度調節部であるヒータ６０が設けられ、このヒータ６０により、培地層が置かれる雰囲気を予め設定した温度雰囲気（恒温雰囲気）に設定している。

支持体７１は配線基板３を収容し保持する凹部７２が設けられており、この凹部７２には係合突起７３が垂直方向に伸びて配線基板３の係合孔３７ａ、３７ｂ及び水晶押さえ部材４の係合孔４６ａ、４６ｂに係合し、配線基板３と水晶押さえ部材４の位置を固定する。

続いて培養装置の回路部分及び信号処理部分について説明すると、図６中、５０は発振回路、５１は信号処理部、５２はパーソナルコンピュータであり、このパーソナルコンピュータ５２の画面は表示部をなすものである。
発振回路５０は、配線基板３に形成されている電極３４、３５に電気的に接続され、例えば支持体７１に設けられる。信号処理部５１は、発振回路５０からの周波数の信号をアナログ／ディジタル変換（Ａ／Ｄ変換）し、所定の信号処理を行って周波数信号の周波数を計測する。

次に、このように構成された培養装置を用いて、試料液中に目的とする菌体が存在するか否かを検出する工程について説明する。この例では菌体が変敗菌であるとすると、変敗菌が通過するフィルタを用意し、試料液をこのフィルタに通過させる。次いで通過した液を例えばスポイトで採取し、支持体７１に装着された既述の水晶振動子２上の培地層１０の表面に滴下し、薄く延ばす。その後カバー８１を支持体７１に装着し、ヒータ６０により培養器７内の温度（水晶振動子２が置かれている雰囲気の温度）が例えば４０〜６０℃、この例では４５℃に加熱される。

そして前記雰囲気は気密に保たれ、培地層１０上の試料液が蒸発して例えば当該雰囲気が飽和水蒸気雰囲気となる。一方パーソナルコンピュータ５２には水晶振動子２の発振周波数の計測値が時系列で取り込まれ、その画面には当該時系列データが表示される。培養器７内は試料液の水分が蒸発して飽和となるまで水晶振動子２の電極上の試料液及び培地層１０の合計質量が変化するが、飽和雰囲気が確立されると合計質量が安定する。そして図５に示すように培地層１０に塗布された試料液中に変敗菌（検出対象物１５）が存在すれば培地層の栄養分を取り込んで増殖するため、電極上の部分の質量が増殖開始時から増加し、発振周波数が小さくなっていく。このため発振周波数の時系列データを例えばパーソナルコンピュータ５２の画面にグラフ化して表示するようにすれば、発振周波数の立ち上がりを例えば目視で検出することにより変敗菌の存在が確認できる。
また発振周波数の低下の度合いを求めることにより変敗菌の増殖速度が得られる。この場合発振周波数と水晶振動子２の電極２２の上に搭載されている搭載物の質量との関係を予め求めておけば、例えば所定の時間間隔毎の増殖速度を求めることができる。また培養器７に前記雰囲気に各々連通する送気管（送気路）、排気管（排気路）を接続し（図示せず）、排気管を開放した状態で送気管から気体例えば乾燥空気を供給して水晶振動子２上の水分をある程度除去する。次いで培養器７内の設定温度において例えば飽和水蒸気雰囲気よりも僅かに水蒸気が少ない空気を送り込み、送気管及び排気管に設けた各バルブを閉じ、水晶振動子２上の水分が僅かに蒸発して前記雰囲気が飽和水蒸気になった後、発振周波数の計測を行うようにしてもよい。

なお、培養温度の設定値については、菌体の生育温度の範囲内において水晶振動子の周波数の温度特性が最も安定となる温度とすることが好ましい。図７にはＡＴカットの水晶振動子の周波数温度特性の一例を示す。この場合においては、生育温度範囲内において単位温度変化あたりの周波数変化量が最も小さい温度は、グラフの極値の時の温度である４５℃であり、培養温度をこの温度に設定することが望ましい。試料液は、飲料水であればそのまま前記フィルタを通して作成できるが、食品中の変敗菌の有無を調べる場合には、公定法に基づく方法で変敗菌を培養するかまたは変敗菌を直接水に混ぜた後、前記フィルタを通すことにより試料液が作成される。
このような菌体の検出方法によれば、培地層１０に試料液を滴下し、周波数が安定した後、例えば数十分後に発振周波数が低下し始めるので、短時間で菌体の有無を検出でき、従って食品や飲料水中に変敗菌が存在するか否かを速やかに検出することができる。また操作が簡単であり、測定精度も高い。
なお本発明において菌体とは、真菌及び細菌などを指す。

上述の培養装置を用い、既述のようにして変敗菌を含む試料液を水晶振動子２の培地層１０に付着させ、発振周波数が安定した後、当該周波数に対する周波数差分の経時変化を測定した。測定結果を図８に示す。水晶振動子としては直径φ８．７ｍｍで９ＭＨｚのＡＴカット水晶振動子（電極径φ５．０ｍｍ）を用い、周波数の計測は１０ｍＨｚ／秒で行った。検出対象物となる菌株としてＡｌｉｃｙｃｏｂａｉｌｌｕ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓの標準株（ＡＴＣＣ４９０２５）を用い、これを層厚０．５μｍの水晶振動子上の寒天培地において摂氏４５度で培養した。なおこの寒天には酵母エキス、グルコース、各種微量元素等を添加した。図８に示すように、培養開始からおよそ０．５時間後には周波数が１Ｈｚ低下しており、その後も固有周波数は低下し続けている。これは変敗菌の増殖による質量増加によるものであり、このことから変敗菌の増殖が確認できる。なお周波数の検出のための装置としては、出願人が販売している、極めて高精度に周波数を測定できる装置（登録商標ＮＡＰｉＣＯＳシステム）を用いている。

また、事前に重量と発振周波数の関係を表す検量線を求めておくことで、周波数差を質量増加量に変換できるため、各培養経過時点における質量変化の速度、すなわち各培養経過時点における検出対象物の増殖速度を数値化することができる。

次に、抗体を利用して菌体などの微生物を検出する第２の実施の形態について説明する。本例に係る微生物の検出方法は、水晶振動子２ａの励振電極２２上に吸着層として抗体層を設け、この水晶振動子２ａの載置雰囲気に培地溶液（液体培地）を供給して微生物の培養が行われる点が、励振電極２２上に培地層１０を形成して培養を行う第１の実施の形態に係る検出方法と異なっている。図９は第２の実施の形態に係る微生物の検出方法を利用した微生物検出装置７０の構成を示している。図９において、第１の実施の形態と共通の構成要素には図１〜図６に付したものと同様の符号を付してある。

図９に示した微生物検出装置７０において、培養器７００は、水晶振動子２ａと配線基板３ａとから構成される圧電センサーを水晶押さえ部材４及び封止部材３Ａを用いて培養器７００内に保持する点において、図２、図３に示した培養器７と共通している。一方で当該培養器７００のカバー８１には、当該培養器７００内に試料液を供給するための供給ポート７０４、及び培養器７００内から試料液を排出するための排出ポート７０５が設けられており、外部から試料液や培地溶液を供給できる点が、培地層１０に試料液を塗布して閉鎖雰囲内に配置する第１の実施の形態に係る培養器７と異なっている。

培養器７００の供給ポート７０４は、試料液と培地溶液との混合を抑えつつ、各液を一時的に保持する不図示のサンプルループを備えると共に、培地溶液を保持したシリンジポンプなどからなる培地溶液供給部７０１と、試料液を保持した注射器などからなる試料液供給部７０２との間で供給ポート７０４の接続先を切り替える供給液切替部７０３と接続されている。一方、排出ポート７０３は、吸引ポンプ７０７を介して排液受槽７０８に接続されており、この吸引ポンプ７０７を利用して培養器７００内への培地溶液や試料液の供給及び排出が行われる。

また本例に係る培養器７００は、水晶振動子２ａに接続される発振回路５０と共に例えば熱風式の恒温チャンバー７０６内に配置されることにより、水晶振動子２ａの配置雰囲気の温度調節が行われる点がヒータ６０を用いて温度調節を行う第１の実施の形態と異なる。
また水晶振動子２ａ発振回路５０に接続され、信号処理部５１を介してパーソナルコンピュータ５２に接続される点は図６に示した第１の実施の形態と同様である。

ここで本実施の形態に係る水晶振動子２ａは、図１０、図１１（ａ）、図１１（ｂ）に示すように水晶片２１の表裏両面に設けられた励振電極２２ａ、２２ｂが２組設けられており、各々第１の振動領域２０ａ及び第２の振動領域２０ｂを形成している。そして第１の振動領域２０ａの表面側の励振電極２２ａの上面には、検出対象物１５である菌体の表面に特異的に含まれる膜タンパク質などを抗原として、当該抗原と反応する抗体を担持させてなる抗体層１１が形成されており、菌体を励振電極２２ａ表面に吸着させる微生物検出用の振動領域を構成している。一方で第２の振動領域２０ｂの励振電極２２ｂの表面には、前記抗原と反応しにくいタンパク質などからなるブロッキング層１２が形成されており、菌体は当該励振電極２２ｂの表面には吸着しにくい。このため第２の振動領域２０ｂは、微生物の吸着に起因しない他の要因（例えば後述の環境変化）に起因する発振周波数の変化を検出するための参照用の振動領域を構成していることになる。

励振電極２２ａへの抗体の固定は、例えば他方側の励振電極２２ｂが予めマスクされた水晶振動子２ａの上面側に前記抗体を含む試薬を供給することなどにより露出している励振電極２２ａの表面に抗体層１１を形成する。他方側の励振電極２２ｂへのブロッキング層１２の形成も同様に、抗体層１１が形成される励振電極２２ａをマスクしてから当該他方側の励振電極２２ｂをブロッキング層となるタンパク質を含む試薬と接触させることなどにより行われる。

そして図１２に示すように水晶振動子２ａは、第１の振動領域２０ａ及び第２の振動領域２０ｂから各々独立して発振周波数を取り出すことが可能な配線基板３ａ上に配置されており、各領域２０ａ、２０ｂが別々の発振回路５０に接続されている。図１１、図１２に示した例では、表面側の励振電極２２ａ、２２ｂは共通の導出電極２４及び配線基板３側の電極３２を介して接続端子部３５に引き出され、発振回路５０側の接地ラインに接続されている。一方、裏面側の励振電極２２、２２ｂは別々の導出電極２５及び配線基板３側の電極３１を介して接続端子部３４に引き出され、各々独立した発振回路５０に接続されている。

例えばウェルシュ菌などの芽胞細菌は、５０℃〜７０℃といった比較的高い温度条件下でも増殖することが可能であり、こうした温度条件下で保存される食品の変敗要因となる。このため芽胞細菌を検出対象物１５とする場合には、食品の保存状態と同じ温度条件下で試料液と接触させた水晶振動子２ａを保持し、抗体層１１に吸着する菌体の存否や菌体の増殖の有無を測定する必要がある。一方で水晶振動子２ａの発振周波数特性は周囲の温度変化や流体の粘度変化など（簡単のため以下、環境変化という）に応じて変化することが知られているところ、発振周波数の変化が抗体層１１への菌体の吸着に起因するものなのか、恒温チャンバー７０６における温度制御の変動や周囲の流体の粘度変化に起因するものなのかを短時間の測定で峻別することは困難である。

そこで本実施の形態に係る微生物検出装置７０は、菌体が吸着する抗体層１１を設けた第１の振動領域２０ａと、菌体が吸着しないブロッキング層１２を設けた第２の振動領域２０ｂと、を同じ環境下に配置している。これにより、第１の振動領域２０ａからは菌体の吸着、環境変化の双方に起因する発振周波数の変化が取得される一方、第２の振動領域２０ｂからは菌体の吸着を除いて、周囲の環境変化のみに起因する発振周波数の変化を取得できる。そこで第１、第２の振動領域２０ａ、２０ｂから各々取得した発振周波数の差をとることにより、第１の振動領域２０ａの発振周波数から環境変化の影響が取り除かれ、菌体の吸着に起因する発振周波数の変化のみを取り出すことが可能となる。

以下、上述の微生物検出装置７０の作用について説明する。はじめに培養器７００内に圧電センサーを装着し、培養器７００及び発振回路５０の周囲の温度が例えば試料液中に含まれる食品の保存温度となるように恒温チャンバー７０６の温度設定を行う。恒温チャンバー７０６の温度が安定したら、供給液切替部７０３を培地溶液供給部７０１側に接続してから吸引ポンプ７０７を作動させ、培養器７００内およびこれに接続された配管内に、培地溶液を送液バッファとして満たす。そして発振回路５０を作動させ、第１、第２の振動領域２０ａ、２０ｂからの発振周波数の取得を開始する。

しかる後、供給液切替部７０３の接続先を試料液供給部７０２に切り替え、培養器７００に向けて試料液を供給し、培養器７００内が試料液にて置換されたタイミングでいったん吸引ポンプ７０７を停止する。このとき試料液中に、抗体層１１の抗体と抗原抗体反応を示す芽胞細菌などの変敗菌が含まれている場合には、当該変敗菌が抗体層１１へ吸着し、図１３（ａ）、図１３（ｂ）の「変敗菌吸着」と記した期間に示すように第１の振動領域２０ａの発振周波数が低下する。

一方でブロッキング層１２が設けられた第２の振動領域２０ｂ側では変敗菌の吸着は殆ど発生しないので、前記期間における発振周波数の変化は見られない。ここで簡単のため、図１３（ａ）、図１３（ｂ）に示した各例では、培地溶液供給部７０１から供給される培地溶液及び試料液供給部７０２から供給される試料液は、恒温チャンバー７０６にて温度調整されている培養器７００内の温度とほぼ同じ温度に予め調整されている。また培地溶液、試料液の粘度もほぼ揃っており、培地溶液-試料液の切り替えに起因する発振周波数の変化は発生しないものとする。

こうして予め定めた時間が経過し、抗体層１１に十分量の微生物が吸着可能な時間が経過したら、供給液切替部７０３の接続先を培地溶液供給部７０１に再度切り替えてから吸引ポンプ７０７を作動させ、培養器７００内を培地溶液にて置換する。こうして培養器７００内が培地溶液で満たされた状態となったら、再び吸引ポンプ７０７を停止して培養器７００内を静置状態とする。ここで抗体層１０に吸着した変敗菌が生きている場合には、培地溶液から栄養分を受け取って変敗菌が増殖する。このとき変敗菌の増殖は、当該変敗菌が吸着されている抗体層１１の表面付近にて発生するので、培養器７００内が静置状態となっている場合には、増殖した変敗菌は培地溶液内を拡散し、その一部は抗体層１１に吸着する。

この結果、図１３（ａ）に「変敗菌が増殖」と記した期間に示すように、増殖した変敗菌の吸着に起因して、時間の経過と共に第１の振動領域２０ａ側の発振周波数が低下する。一方でブロッキング層１２が設けられた第２の振動領域２０ｂ側においては、依然として発振周波数の低下は殆ど見られない。そしてこれら図１３（ａ）中の「変敗菌吸着」及び「変敗菌が増殖」と記載した期間中に、温度変化や粘度変化など培養器７００内の環境変化があった場合であった場合には、共通の温度、培地溶液雰囲気内に載置された第１、第２の振動領域２０ａ、２０ｂでは、これらの環境変化に伴う発振周波数の変化がほぼ同程度の幅で発生する。

このため、例えば第１、第２の振動領域２０ａ、２０ｂから得られた発振周波数の差分の絶対値をとることにより環境変化に伴う発振周波数の変化が相殺され、変敗菌の吸着のみに起因する発振周波数の変化を取り出すことができる。そして、第１の実施の形態と同様に、予め求めておいた変敗菌の重量と発振周波数の低下量との関係を示す検量線などを用いて変敗菌の吸着量が特定される。
また環境変化に起因する第１、第２の振動領域２０ａ、２０ｂの発振周波数の変化量が厳密には等量でない場合もあり得る。この場合には、予め求めておいた比例定数を各発振周波数に乗じ、温度や粘度などの単位変化あたりの発振周波数の変化量を互いに揃えてから両発振周波数の差分を取ることにより、こうした環境変化に伴う発振周波数の変動を正しく相殺することができる。

なお、変敗菌の増殖が指数関数的に進んでいくと、培地溶液内の変敗菌の濃度が高くなり、ブロッキング層１２の上に変敗菌が沈着するなどすると共に、第２の振動領域２０ｂに沈着した変敗菌も増殖を開始する。この結果、図１３（ａ）中の「第２の振動領域２０ｂでも増殖」と記した期間に示すように、第２の振動領域２０ｂ側の発振周波数も低下し始める場合がある。しかし、既述のように第２の振動領域２０ｂ側の発振周波数は、当該領域２０ｂにて変敗菌の増殖が観察されるまでの期間中（図１３（ａ）中の「変敗菌吸着」及び「変敗菌が増殖」の期間に相当する）は殆ど変化しない。従って、これらの期間内に得られたデータを利用すれば、変敗菌の有無及び増殖速度の計測を正しく行うことができる。

また試料液に含まれている変敗菌が死んでいる場合には、図１３（ｂ）に示すように「変敗菌吸着」と記した期間にて第１の振動領域２０ａの発振周波数が低下するが、当該変敗菌が増殖しないので、当該第１の振動領域２０ａの発振周波数はこれ以上変化しない。また変敗菌が殆ど吸着しないことに伴って、第２の振動領域２ｂの発振周波数も一定の値を保つこととなる。このような場合においても環境変化に起因する発振周波数の変化は、第１、第２の振動領域２０ａ、２０ｂから得られる発振周波数の差分の絶対値をとることなどにより相殺することができる。

第２の実施の形態に係る微生物検出装置７０によれば、抗体層１１を設けた水晶振動子２ａを培養器７００内に配置し、この培養器７００に試料液を供給して抗体層１１を設けた水晶振動子２の発振周波数の変化に基づいて検出対象物である微生物の有無や微生物の増殖速度を検出する。従来行われていた寒天培地上で増殖させた菌体などの微生物を光学顕微鏡などにより観察する手法では、微生物の有無や増殖速度を特定するためには例えば３日〜１週間程度の試験期間を要していた。これに対して水晶振動子２ａなどの圧電振動子を用いた微生物の検出法は感度が高く、例えばナノグラムといった非常に微量の質量変化を検出することが可能である。このため、光学的に観察可能になるまで微生物の増殖を待つ必要がなく、例えば１０時間〜２日といった従来よりも非常に短い時間で検出対象物の有無や増殖速度を検出することが可能となる。

また感度の高い水晶振動子２ａを用いる本法においては、水晶振動子２ａの周囲の温度変化や水晶振動子２ａと接する液体（試料液や培地溶液）の温度変化や粘度変化などの環境変化が水晶振動子２ａの発振周波数に与える影響が大きくなる。ここで第２の実施の形態に係る微生物検出装置７０では、微生物を吸着させるための抗体層１１が設けられた微生物検出用の第１の振動領域２０ａと、微生物を吸着させない参照用の第２の振動領域２０ｂと、を備えた水晶振動子２ａを用いているので、両振動領域２０ａ、２０ｂから得られた発振周波数の差分を取ることにより、環境変化の影響を相殺し、微生物の吸着に起因する発振周波数の変化を正しく把握することが可能となる。

ここで第１の実施の形態に示した培養装置と第２の実施の形態に示した微生物検出装置７０の各構成は、必要に応じて適宜入れ替えることが可能である。例えば第１の実施の形態で用いたヒータ６０を第２の実施の形態の微生物検出装置７０に設けてもよいし、反対に第１の実施の形態の培養器７を恒温チャンバー７０６内に配置してもよい。また、いわゆるフローインジェクション方式の第２の実施の形態の微生物検出装置７０を第１の実施の形態に係る培養器７のようにバッチ式として構成してもよい。この場合には、例えば供給ポート７０４や排出ポート７０５を設けていない培養器７００内に抗体層１１に、試料液を予め塗布した水晶振動子２ａを配置し、その後、培養器７００内に培地溶液を供給した後、カバー８１で支持体７１の蓋をして、当該培養器７００内を予め設定された温度に調整することにより微生物の検出が行われる。この他、第１の実施の形態に係る培養装置にて微生物検出用の第１の振動領域２０ａと参照用の第２の振動領域２０ｂとを備えた水晶振動子２ａを用いた圧電センサー（以下、ツインセンサーという）を用いてもよい。これとは反対に、環境変化の影響が問題とならないような場合には、第２の実施の形態に係る微生物検出装置７０において、ツインセンサーに代えて参照用の振動領域２０ｂを設けていない図２に記載の水晶振動子２を用いてもよい。

７ 培養器
４ 水晶押さえ部材
１０ 培地層
１５ 検出対象物（変敗菌）
２ 水晶振動子
２２ 励振電極
５０ 発振回路
５１ 信号処理部
５２ パーソナルコンピュータ
７１ 支持体
８１ カバー

Claims (5)

1. 両面に電極が形成された圧電振動子を用い、その圧電振動子の一面側の電極に形成した吸着層であると共に、層厚が０．１μｍから１μｍの滅菌寒天培地である固体培地層に、検出対象である微生物が混入している可能性がある試料液を供給する工程と、
   この圧電振動子を発振回路により発振させ、圧電振動子の発振周波数を測定する工程と、を含み、
   前記固体培地層に吸着して増殖する微生物の質量増加に伴う前記発振周波数の経時的な低下の有無またはその低下度合いに基づいて微生物の有無及び微生物の増殖速度の少なくとも一方を求めることを特徴とする微生物の検出方法。
2. 前記圧電振動子は、両面に電極を形成して構成された微生物検出用の第１の振動領域と、弾性的な境界層を介して前記第１の振動領域とは異なる領域に設けられ、前記圧電振動子の両面に電極を形成して構成された参照用の第２の振動領域とを備え、前記吸着層は前記第１の振動領域の一面側の電極に形成され、前記第２の振動領域のいずれの電極にも吸着層が形成されていないことを特徴とする請求項１に記載の微生物の検出方法。
3. 前記発振回路は、発信周波数の測定値を表示する表示部に接続され、前記発振周波数の測定値を時系列データとして前記表示部に表示する工程を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の微生物の検出方法。
4. 前記発振周波数の経時変化を測定する工程は、温度調節部を備えた恒温の培養容器内に圧電振動子を入れた状態で行われることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか一項に記載の微生物の検出方法。
5. 前記微生物は菌体であることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか一項に記載の微生物の検出方法。

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