JP2002501174A - ディスク表面上に固定された捕獲分子を含む方法 - Google Patents

ディスク表面上に固定された捕獲分子を含む方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は記録データを含むディスク表面上に固定された開裂不能捕獲分子と標的分子の結合によって標的分子を検出及び／又は定量する方法に関する。本発明は表面に開裂不能捕獲分子を固定されたディスク、その製造方法、及び前記ディスクの又は前記ディスクを含む診断及び／又は読取り装置にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の属する分野 本発明はディスクの表面上に固定された捕獲分子と標的分子との結合によって
標的分子を検出及び／又は定量する方法に関する。
【０００２】 本発明は開裂不能捕獲分子を表面上に固定されたディスク、その製造方法、及
び前記ディスクの又は前記ディスクを含む診断及び／又は読取り装置にも関する
。
【０００３】発明の背景 （微生物から得られるヌクレオチド配列のような）標的分子の完全な検出方法
は以下のステップを必要とする： − 所望によりサンプルを調製し、 − 所望により「精製された」分子を増幅し、 − 前記分子を「捕獲」分子（即ち、配列又はレセプター）、好ましくは固体
支持体上に固定された「捕獲」分子上に結合させ、 − それをラベリングし、そして最後に − 前記ラベリングから得られた信号を分析する。
【０００４】 従って、これらのステップのうちのいくつか（又は好ましくは全て）、特に得
られた信号の分析を行うことができ、多数の複雑な分子の中から検出されるべき
特異的な分子又は微生物を識別することができる所望により単純化された自動装
置及び方法に対する要求が存在する。
【０００５】 決められた小表面上に結合する分子の小型化及びそれらの位置の同定のための
探索はＤＮＡチップとして設計されたネットワークの構築のための微小電子回路
の利用に導いた（米国特許５６３２９５７、米国特許５６０５６６２及びＷＯ
９４／２２８８９）。
【０００６】 多数の生物学的分子を分析するための他のアプローチはバイオチップである。
これらの生物学的分子はバイオチップの表面上での捕獲分子の直接合成によって
（ＷＯ ９７／２９２１２）、又は合成又は単離後のこれらの捕獲分子の固定（
ＷＯ ９８／２８４４４）によって形成させることができる。前記技術の欠点の
一つは極めて低い信号を読取るために複雑で高価な装置を使用することである。
加えて、定量的アッセイを行う必要がある場合、この装置はスポットの位置の同
定及び前記信号の一体化のための特殊なソフトウェアを含まなくてはならない。
【０００７】 電子装置はチップを自己アドレス可能な装置を作るために特異的微小位置へ捕
獲されたオリゴヌクレオチド又は抗体の如き特異的結合成分を輸送して付着させ
ることを制御することができる。分子を固定するためには、一つの微小電極が正
に帯電されてオリゴヌクレオチドをその表面に吸引する。ＤＮＡや抗原の如き標
的分子と結合した後、検出は標的分子が結合している微小電極を位置決定するた
めのエピ蛍光型顕微鏡検出システムを用いて行われる。
【０００８】 前記技術は微小回路を生ずるこの基体上のネットワークを形成するために基体
に付着されたＤＮＡ結合タンパク質に適合されている（米国特許５５６１０７１
）。
【０００９】 しかし、装置の微小電極の各々上に捕獲分子を一つずつ固定しなくてはならな
いという事実のため、使用することができる捕獲分子の数には限界がある。他の
限界は放出された信号の分散による、隣接電極から来る信号間の識別において得
られる解像度である。最後に、放出信号は処理される前に分析及び解釈される必
要がある。
【００１０】 従って、特異的な標的分子、標的微生物又はその一部分の同定及び／又は定量
を可能とするために固体支持体上に与えられる「捕獲分子」の数を増大させる必
要がある。しかし、古典的な検出支持体及び手段はかかる適用のためには容易に
適合されることができない。というのも、それらはそれらが含有し得る「捕獲分
子」の数、信号間の識別、アッセイの特異性又は再現性によって制限されるから
である（米国特許５５６７２９４参照）。更に、読取り機械は複雑で高価すぎる
。
【００１１】 文献ＷＯ ９８／０１５３３は基体付着端（これはコンパクトディスクである
ことができる）を有する開裂可能なスペーサー、信号反応端（これは金属ビーズ
、特に金ビーズに結合することができる）、及び選択された分析対象物上の第一
位置に結合するように適合された第一側部分及び前記選択された分析対象物の第
二位置に結合するように適合された第二側部分を含む開裂可能な信号素子を記述
している。分析対象物が第一側部分及び第二側部分上に固定される場合に信号が
測定される。固定後、スペーサーが開裂されるので、分析対象物の固定が陽性信
号の検出を可能にする。
【００１２】 しかし、この複雑で高価な検出方法及び装置は前記開裂可能な信号素子と様々
な相互作用を生じ得るので、様々な複合体分析対象物の検出において様々な偽陽
性又は偽陰性を生ずる。
【００１３】発明の概要 本発明は特許請求の範囲において記述されるような標的分子の検出及び／又は
定量方法に関する。
【００１４】 本発明は特許請求の範囲において記述されるような開裂不能捕獲分子を表面上
に固定されたディスクにも関する。前記ディスクは本発明による検出及び／又は
定量方法において用いることができる。
【００１５】 本発明の他の側面は前記ディスクの製造方法、前記ディスクを含む診断キット
、前記ディスクを含む診断及び読取り装置又は本発明によるディスクの上に存在
するデータの読取り及び分析を可能にする診断及び読取り装置に関する。
【００１６】「ディスク（disc）」の技術的特徴 「ディスク」という用語は平坦な固体支持体（通常、円板の形状をしている）
であって穴を含み（その穴はその穴の中心に位置する軸（Ａ）に従った前記支持
体の回転を可能とする）、通常一以上のポリマー層及びポリマー層を被覆するこ
とができる一以上の金属層（金やアルミニウムの薄層のような）を含む硬質材料
で作られており、光線、好ましくはレーザー光線（これらは前記ディスク上の予
め記録されたデータの検出及び読取りのために用いられる）を透過及び反射する
ものを意味する（図１参照）。
【００１７】 前記ポリマー層及び金属層の配置はレーザー光線の透過及び反射が選択された
層上でのみ可能となるように調節される。例えば、ディスクはレーザー光線を透
過する上位層を含んでいてもよく、透過したレーザー光線は第二の下位金属層だ
けによって反射されるであろう。
【００１８】 「ディスク」の定義は（レーザー光線の透過及び反射によって）ＣＤ読取り装
置によって読取ることができるデータを含むＣＤ又は「ＤＶＤ」の如きいかなる
固体支持体をも含む。
【００１９】 「ＣＤ読取り装置によって読取ることができるデータ」とは所望の記録データ
（即ち、前記固体支持体の特異的領域上の捕獲分子の特性についての）、又は標
的分子と捕獲分子の間の結合の結果である信号の処理に用いられるデータを意味
する。
【００２０】 コンパクトディスクの如きディスクの一以上の区分は標準的な読み書きディジ
タル技術によるデータ処理に供される（ＣＤトラック；図３〜５及び７を参照）
。処理及び分析のための特別のデータはディジタル記録手段を用いてコンパクト
ディスク表面上に記録される。好ましい実施態様に加えて、ディスク上の読出し
専用記憶素子（ＲＯＭ）は、ディスクを操作して捕獲分子と標的分子の間の結合
位置と結果を記録する使用者によってアクセス可能であるコンパクトディスク情
報、説明、実験プロトコール、データ分析及び統計方法を含む。
【００２１】 加えて、ディスクはディスク機能の調整のためのマイクロプロセッサーを含む
電子回路部品、及びディスク操作及び／又は読取り装置又は他の装置との通信の
ための装置を含むこともできる。ディスクは最適には以下のものを含む：検出器
及びセンサー、又はこれらの装置の部品及び様々な検出方法のためのエネルギー
源（電気化学システムのための電力供給、分光分析システムのための電磁放射源
）、又は前記検出器及びセンサーを用いたデータ生成及び操作を容易にする光学
的に透明な材料の如き材料、作動器、電磁的（レーザー、赤外線、高周波、マイ
クロウェーブ）、電気的、又は他の手段を用いてディスクと作動／読取り装置の
間の通信を媒介する通信及びデータ取扱い装置；診断システム、アッセイプロト
コール及びアッセイデータの分析を含むディスク上での手順及び処理を制御する
ために設計された回路部品。これらは製造時点のみでプログラムされるＡＳＩＣ
ｓ又はＲＯＭ；ＦＧＰＡのＥＰＲＯＭ、フラッシュ・メモリ（ＵＶ消去可能ＥＰ
ＲＯＭ）、又はプログラム可能なＩＣ配列、又はプラットフォーム操作装置又は
他の装置を通して使用者によってプログラムされることができる同様の配列の形
で与えられる。本発明の部品にはＣＰＵ及びマイクロプロセッサーユニット及び
アセンブラ言語又はディスク通信を通してプログラム可能な高レベル言語を用い
て操作する関連ＲＡＭ、及び遠隔ディスプレイ又はデータ分析システムとのファ
クシミリ／モデム通信を含む、他の装置との通信を媒介するための部品をも含む
。
【００２２】 本発明によるディスクの一つの注目すべき側面はディスク材料内に埋め込まれ
た所望により予め記録されたデータパターンの微視的配列の密度である。それは
反射性ディスクの表面におけるくぼみを検出するためのレーザー光線を用いた光
学的記憶である。このように高度にデータを圧縮して正確に読み戻す能力は本発
明によるディスクにその規定する特徴の一つ、つまり莫大な量のデータを記憶す
る能力（音声データのコンパクトディスクについては記憶の量は約６５０ＭＢの
データである）を与える。
【００２３】 本発明によるディスクは様々なポリマー又は金属層上で様々なレーザー光線を
透過及び反射するために適合されることができる。
【００２４】 例えば、レーザー光線の放出及び反射されたレーザー光線の検出のために用い
られるレーザー装置はディスクと測光器の間に配置されるホログラムを有利には
含んでいてもよい。
【００２５】 ディスクは１．２ｍｍの厚さと４．７２インチの直径を一般的に持つが、より
小さい支持体も存在し、特殊な適用（ペトリ皿への捕獲分子と標的分子の間の結
合の如き）のために適合されることができ、厚さは用いられる本発明の検出方法
と捕獲分子の技術的要求に応じて適合されることができる。
【００２６】 ディスクはレーザー光線によって検出を行うための溝を組入れることができる
。前記溝中には「記録された」データが組入れられ、このデータは後で分析され
て有利にはディジタルデータに転記される。好ましくは前記記録されたデータは
２進情報の形である。好ましくはこれらの溝は固定された開裂不能な捕獲分子を
も含む。
【００２７】 レーザーはその強力で狭く焦点を合わされた光線を通して、高速で回転してい
るディスク表面上の何千もの小さなくぼみの通過を正確に検出及び記録するため
の手段を提供する。前記検出方法は摩擦を全く生じない。というのも前記検出は
反射光における位相シフトの測定に基づいているからである。この技術はかなり
のデータ圧縮を検出することを可能にする。というのも、注意深く焦点を合わさ
れたレーザー光線はディスク表面における極めて小さい変異に光速で応答するこ
とができるからである。
【００２８】 通常天然又は人工光源から由来する光は、たとえ同一周波数の光線から由来す
る場合であっても無作為波パターンで動く光子からなる。この種類の光線は非干
渉性とみなされる。つまり、波があらゆる方向に移動するということである。こ
れに対し、レーザーに関連する光は有利なことに、干渉性であるとみなさなれる
。
【００２９】 レーザー光線はエネルギー源がいわゆる活性媒体（active medium）中へ導入 されることによって生成される。活性媒体の各側に配置された一対の鏡はそれに
衝突する放射線の一部分を透過させるために用いられる。活性媒体は気体状混合
物（ヘリウムやネオンの如き）又は結晶質マトリックス内のイオン（コンパクト
ディスク（ＣＤ）のドライブ及び記録装置において通常用いられるヒ化ガリウム
レーザーにおいて見出される如き）からなることができる。光を刺激するのに用
いられるエネルギー源と材料が生ずる光線の強度と光度を決定する。ＣＤ装置内
で用いられるレーザーは通常、極めて低出力のものである。
【００３０】 ＣＤ駆動レーザーは回転しているディスクに指向され、反射光はレンズを通過
して光ダイオードに衝突する（図３−５を参照）。ディスク表面上のデータはピ
ット（ディスク中のくぼみ）及びランド（ディスクの表面）又はディスクトラッ
クの形でコードされている。
【００３１】 光ダイオードに結合された論理測時回路は（光がディスク表面に衝突する場合
に）光が走行した距離と（光がディスク表面中のくぼみに衝突する場合に）光が
走行した距離の間の差異を記録することができる。この差異は光線中の位相シフ
トとして検出される。
【００３２】 すべてのディジタルコードされた情報と同様に、連続したピットとランドから
なるパターン−これは光ダイオードによって１と０の電子ストリングとして中継
される−は大幅に複雑なアナログ等価物（例えば現在の事例では標的分子とその
捕獲分子の間の結合レベル）を表すことができる。本発明によるディスクの表面
上に存在するピットとして示されるこの情報は「捕獲」分子と「標的」分子の間
の結合の結果である。
【００３３】 表面上に捕獲分子を固定された本発明によるディスクは保護層を含んでもよい
。この保護層は「捕獲」分子の保護及び安定化を可能にするか又は改良する有機
化合物から所望によってなり、例えばアルブミン、二糖類（トレハロース等のよ
うな）のタンパク質性化合物及び／又は糖化合物からなる。
【００３４】 前記層の組成は用いられる捕獲分子の特異性に応じて当業者によって適合され
る。もし必要ならば、前記組成はレーザー光線が前記層を困難なく読取ることが
できるように、そして「標的」分子とその「捕獲」分子の間の結合又は前記結合
の結果を検出することができるようにするために適合されることができる。もし
必要ならば、前記層は捕獲分子と標的分子の間の結合が行われる前又は後に省か
れてもよい。
【００３５】 ディスク中の一連のピットによる通信を成功させるためにはコンピューター処
理及びいくつかの既に利用可能な高度技術が必要とされる。レーザーの読取り機
構はディスク表面にはいかなる点においても接触しない；すべてのデータはレー
ザーの反射によって好ましくは伝えられる。通常の音声ＣＤにおいてはレーザー
光線がランドによって反射されて戻ってくるのにはある程度の時間がかかるが、
入り込んでピットによって反射される場合はより長い時間がかかる。ピットの深
さはレーザー光の波長の１／４となるように設計される。ピットからの反射光線
がランドからの光線と相殺するならば、信号通過が得られる。（ピットの始まり
又は端によって信号を送られた）信号通過は２進数１を表す。もし信号通過がな
ければ、これは２進数０を示す。
【００３６】 商業的なＣＤドライブの一つの特異的な特徴はかかるピットを読取って９００
Ｋｂ／秒で送出するそれらの特性である。このことはこのレーザー反射器技術を
記録されたピットの読出しのみならず結合の結果の読出しのためにも特に好適な
ものにする。
【００３７】 データパターンを読取る間同調を維持するため、ＣＤドライブはRun Length L
imitedと呼ばれるハードディスクドライブに通常見出される自己測時機構を用い
る。データはらせん形トラック上の制限された部分内に存在するので、各データ
部分は約３００ナノメータ広がり、ＣＤマイクロ制御器はディスクの回転速度と
通過の出現に同調することによって規則正しい測時信号を作り出すことができる
。多くの形のデータ記憶はデータバイトを記憶するために８ビット配列を用いる
が、通常のＣＤは１と０の組合せの生成を回避して記憶されたデータの解読を防
止するために１４ビットのパターンを必要とする。この改変された形の記憶はＥ
ＦＭ（Eight-to-Fourteen Modulation）と呼ばれる。縁取りビットと呼ばれる付
加的な３ビットは１４ビット部分の間のセパレーターとして作用し、単一８ビッ
トバイトのデータを表す１７ビットパターンを生ずる。
【００３８】 ビットレベルでのデータの他の重要な部分は５８８ビットからなる枠（frame ）である。枠はビットの集合を包含する：それらのうちのいくつかはデータを意
味し、他のものはレーザがディスクの回転と同調することを可能にし、更に他の
ものはＣＤ装置内のエラー訂正能力に寄与する。ビットのこの集合のうち、２４
の１７ビットユニット（全部で４０８ビット）のみが８ビットバイトへと翻訳さ
れることができる。多くの付加的なビットは含まれる情報を単なる２ダースのデ
ータバイトに伝えるのに必要である。
【００３９】 本発明によるディスクはいかなる「外部（external）」形状であることができ
る。上述の通り、前記ディスクの形状は円形又は楕円形であることが好ましいが
、その外部形状は中心軸（Ａ）に沿った前記ディスクの回転を可能にする例えば
六角形、八角形、四角形又は三角形であることができる。
【００４０】 本発明によるディスクはＣＤ−ＲＯＭ ＸＡ、ＣＤ−ＤＶＤ、音声ＣＤ、ＣＤ
−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｉ、記録可能ＣＤ及び写真又はビデオＣＤ（ＣＤ−ＲＯＭ及び
ＣＤ−Ｉブリッジ）等の標準規格に対応することができる。前記ＣＤ標準規格は
データ記憶の種類、精度及び情報量に応じて異なることができる。
【００４１】 本発明によるディスクの特別な領域は標的分子と捕獲分子の間の結合の結果で
ある反応を読取るために用いられる。これらの特別な領域は本発明によるディス
ク表面の一部又はディスク上のある領域であり、その上に第二材料が固定されて
おり、その表面が捕獲分子を含む。これらの領域はディスク中の空洞であること
ができる。前記第二材料はプラスチックのストリップであり、この上で標的分子
と捕獲分子の間の結合が既に行われており、その後でその特異的読取りのために
ディスク上に固定される。
【００４２】 有利には各ストリップは分析されるべき同一サンプル又は異なるサンプルと特
異的に反応するいくつかの異なる捕獲分子を担持していてもよい。その後、信号
は同一ディスク上で個別に又は同時に読取られることができる。コンパクトディ
スクの如き古典的なディスクはかかるストリップを２０以上も取扱うことができ
る。
【００４３】 本発明のコンパクトディスクの製造及び操作のために最も有利な好ましい実施
態様は以下の四つの既に存在する様式のうちの一以上の範囲内の寸法を有する： − 約３．８ｃｍの半径と約１ｍｍの厚さを有する３インチコンパクトディス
ク（ＣＤ）、 − 約６ｃｍの半径と１ｍｍの厚さを有する５インチＣＤ、 − １０ｃｍの半径と２ｍｍの厚さを有する８インチＣＤＶ（商業的には「レ
ーザービジョン（Laservision）」ディスクと称される）、及び − １５ｃｍの半径と２ｍｍの厚さを有する１２インチＣＤＶディスク。
【００４４】 磁気テープに記憶されたデータの寿命は約６−１２年である。記録可能なコン
パクトディスクの寿命は一世紀は安定してデータを記憶できると一般的に推定さ
れている。
【００４５】 本発明による特殊なディスクの寿命はそれよりは短く、金属の腐蝕と固体表面
上に固定された捕獲分子の起こり得る変性によって通常制限される。ＣＤに記憶
されるデータはハードディスクドライブ業界でおなじみの同心円（トラックと称
される）で存在してもよいし、又は過去のレコードの如き連続らせんで存在して
もよい。
【００４６】 コンパクトディスクとそこにコードされた情報の一つの特殊な特性はトラッキ
ングシステムである。ディスクを半径方向に横切るＣＤレコーダーでの全光学ピ
ックアップの動きを制御するために、及びＣＤ上に存在する２００００にも達す
る異なる半径トラックのいずれか一つを探索するために様々なシステムが商業的
に利用可能なＣＤレコーダーには存在する。前記技術は標的分子と捕獲分子の間
の結合の結果である信号を読取るために有利に適合させることができる。信号の
読取りと予め記録された情報の読取りは同じ装置によって又は二つの異なる読取
り装置によって行うことができ、それらは同じレーザー光線読取り装置又は二つ
のレーザー光線読取り装置であることができる。
【００４７】 半径方向のトラッキングの訂正（光線による捕獲分子上の結合の同定）は刊行
物“The CD-ROM Handbook，第２版（Chris Sherman 編、Intertext Publication
, McGraw-Hill Inc.）”において記述されているシステムのような特殊なシステ
ムを用いて行われる。ＣＤドライブはレーザーの読取りヘッドを位置させるため
の特殊な装置サーボ機構をも用いる。
【００４８】 好ましくはディスクは例えばプラスチック、シリカ、石英、金属又はセラミッ
ク製の微小二次加工された機械的及び／又は光学的制御部品をプラットフォーム
上に、及び／又は文献ＷＯ ９７／２１０９０に記載のような微小流路を組込ん
でいる。本発明の目的のためには、用語「微小加工された（microfabricated） 」はサブミリメートル規模でこれらの構造の製造を可能にする処理に関する。こ
れらの処理はフォトリソグラフィー、エッチング、スタンピング及び当業者には
周知の他のナノ又はマイクロ技術手段を含むが、これらに限定されるものではな
い。
【００４９】 ＣＤ固体支持体の付加的な説明は以下の刊行物中に与えられている：The CD-R
OM Handbook，第２版（Chris Sherman 編、Intertext Publication, McGraw-Hil
l Inc.），The Complete Recordable CD Guide（Lee Purcell & David Martin,
Sybex 編），Digital Audio and Compact-disc Technology，第２版（Luc Bart,
Luc Theunissen and Guido Vergult, Sony Service Center Europe, Ed. BH Ne
wnes）。
【００５０】「標的」分子及び「捕獲」分子 「標的」分子及び「捕獲」分子は相互の間の結合（又は特異的固定）を作り出
すことができるいかなる種類の生物学的及び化学的化合物であることができる。
前記結合又は前記結合の結果は読取り装置によって、好ましくは光線（好ましく
はレーザー光線）を用いて検出することができる。
【００５１】 好ましくは前記「標的」分子は血液、尿、脳脊髄液、血漿、だ液、精液、羊水
、空気、水、土壌又は粉砕された生物学的物質からなる群から選択されるサンプ
ル中に存在する。
【００５２】 好ましくは前記「標的」分子及び開裂不能「捕獲」分子は核酸、抗体、糖類、
脂質、ペプチド、タンパク質、レクチン、触媒、レセプター、レセプターのアゴ
ニスト又はアンタゴニスト、発蛍光団、発色団、キレート、ハプテン、イオン、
異なるキラル構造を持つ分子、組合せ化学によって得られた新規の合成化学巨大
分子、又は他の機能化巨大構造、部分又はこれらの組合せからなる群から選択さ
れる合成又は天然分子である。
【００５３】 「開裂不能捕獲分子（non-cleavable capture molecule）」は文献ＷＯ ９８
／０１５３３に記載のような開裂可能なスペーサーを含まずかつ必要としない分
子を意味し、これによって標的分子（又は分析対象物）と捕獲分子の間の結合の
検出が可能となる。本発明によれば標的分子と捕獲分子の間の単純な結合は以前
には存在していなかった信号であって捕獲分子のいかなる特異的開裂をも必要と
せずに光線、好ましくはレーザー光線を用いた読取り装置によって直接的又は間
接的に検出することができる信号を生成することを可能とする。
【００５４】 本発明による標的分子又は開裂不能捕獲分子は標的分子の病原性の、治療上の
、毒性の及び／又は他の改良された特性の特徴的挙動を監視又は研究するために
検出及び／又は定量することが有利である。
【００５５】 抗原／抗体結合は抗原又は抗体の検出を可能とするものであり、ＲＩＡ及びＥ
ＬＩＳＡ検出方法に基づいた診断テストにおいて用いられる。リガンド／レセプ
ターは新規分子（レセプターのアゴニスト、アンタゴニスト、又は逆アゴニスト
）のスクリーニングのための薬学研究において主に開発されてきた。核酸配列の
検出は多数の遺伝子配列についての知識の増大及び増幅、ハイブリダイゼーショ
ン、分離及び精製技術の発達を通して高度に発展してきた（例えば J. Sambrook
, E.F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular cloning：laboratory manual, 第
２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York,
1989 参照）。
【００５６】 ヌクレオチド配列の最初の一般的な検出及び増幅方法はポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）（米国特許４６８３１９５及び４６８３２０２）又はリガーゼ連鎖反
応（ＬＣＲ）（Wu and Wallace, 1989, Genomics 4：560-569）、転写に基づい た増幅システム（Kwoh等，1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86：1173-1177 ）又は循環プローブ結合（ＣＰＲ）（Duck等，1990, Biotechniques 9：142-147
及び米国特許５０１１７６９）の如き他の増幅のステップを含む。
【００５７】 前記検出及び／又は定量の信号によるヌクレオチド配列の検出、定量及び記録
は捕獲プローブ上へのヌクレオチド配列のハイブリダイゼーション（単一又はサ
ンドイッチハイブリダイゼーションによる）及び配列の一つのラベリング後に得
られる。それによって検出信号が生じ、その変化が本発明による読取り装置によ
って記録されることができる。
【００５８】 ＤＮＡ配列に対しては多くの検出方法が適用されてきている（２６０ｎｍでの
それら自身の吸光度によって又はエチジウムブロマイドの存在下でのそれらの蛍
光によって検出される）。３２Ｐの如きヌクレオチド配列へ組入れられた放射能
活性のある標識の使用は高感度の検出を可能にするが、改良された安全性の制約
規制のために日常的なアッセイのためには勧められない。
【００５９】 加えて、ヌクレオチド配列は分子（例えば直接検出することができるフルオレ
セイン、ローダミン、ルテニウム又はランタナイドキレート）によってラベルす
ることができるし、又は酵素コンジュゲートに結合するような方法でラベルする
こともできる。ラベリングはビオチン又はハプテン及びストレプトアビジンにコ
ンジュゲートされた酵素又は対応する抗体を使用することによって得られる。有
利には結合の生成物に応じて異なる信号を得ることができる。例えばペルオキシ
ダーゼ及びアルカリホスファターゼはＴＭＢ（テトラメチルベンジディン）又は
５ブロモ−４クロロ−３−インドールイル−ホスフェートを基質として用いると
着色生成物を与える。光放出はルミノール又はＡＭＰＰＤ（３−（２′−スピロ
アダマンタン）−４−メトキシ−４（３′−ホスホリルオキシ）１，２ジオキシ
エタン）を基質として用いることによって得ることができる。
【００６０】 ＤＡＢ（ジアミノベンジディン）はペルオキシダーゼが触媒する結合による酸
化後、不溶性生成物に変換することができる。ピルビン酸キナーゼもＡＴＰを生
成させるために用いることができ、このＡＴＰはルシフェラーゼによって変換さ
れて検出光が得られる（生物発光検出方法）。
【００６１】 有利にはプラスモン表面共鳴又は光学波案内の如き新規技術をラベルされてい
ない標的分子の結合を検出するため、及び結合の動力学を追跡するために用いる
ことができる（Gotoh等，1995, DNA Res. 2：285-293, Stimpson等，1995, Proc
. Natl. Acad. Sci. USA：92, 6379-6383）。
【００６２】コンパクトディスクの表面上への開裂不能捕獲分子の固定 開裂不能捕獲分子は光線検出装置又は他の装置による特異的な開裂不能捕獲分
子とその標的分子の間に作られた各結合の間の特異的識別を可能にするためにＣ
Ｄ上に特異的な間隔をおいて固定されることが好ましい。特異的な検出のために
は、捕獲分子は溝や予め記録された情報を含まないディスクの特異的な領域に配
置されることが好ましい。これによって予め記録された情報上の信号の結果であ
り得る偽陽性が回避される。
【００６３】 コンパクトディスクの外部表面上の開裂不能「捕獲」分子の位置はインキュベ
ーションのマイクロリソグラフィー及び／又は微小機械加工技術を用いる従来の
物理的方法によって位置決めすることができる。これらの方法によって開裂不能
捕獲分子は特定位置で保持され、そこに固定されるであろう。代替法は光活性化
可能な化学基を使用することによって得られる。これは特異的な処理をされた位
置（例えば光線（例えば焦点合わせされたレーザー光線）によって処理された、
又は選択的イオンビーム又は選択的プラズマ処理によって処理された前記外部表
面の一部分）に開裂不能捕獲分子を固定することを可能にする（文献ＷＯ ９６
／１５２２３参照）。
【００６４】 有利には本発明によるコンパクトディスクの外部表面はディスクをレーザーに
基づくＣＤ読取り器で読取ることを可能にするためのデータ（ディスクの溝中に
配置された一連のピットとして通常記憶される情報であって、開裂不能捕獲分子
をディスク表面上に配置するのに必要な情報）をも含む。これはディスクの溝中
に好適なピット又はピットと等価の突出するくぼみを存在させることによって得
られる。表面上への開裂不能捕獲分子の位置決め（固定）は全装置の一部である
レーザー光線と前記データを用いて最も良く得られ、そしてもし可能ならば同一
のレーザー光線源がＣＤ情報を読取るために用いられる。
【００６５】 ディスク上への開裂不能捕獲分子の固定は共有結合又は非共有結合に基づく従
来方法を用いて得られる。好ましい実施態様は分子端の一つにおける共有結合に
よる固定であり、これは安定な固定と標的分子に結合するための表面における開
裂不能捕獲分子の均一な存在を可能にする。
【００６６】 光活性化可能な化学基の例はアジドニトロフェニルである。これは例えばスル
ホスクシンイミジル６−（４′−アジド−２′−ニトロフェニルアミノヘキサノ
エート（Pierce, Rockford, IL, USA）の如きヘテロ二官能性試薬を用いること によって自由アミノ基を担持するいかなる分子の端においても固定することがで
きる。かかる光活性化可能な基はレーザー光線の如き照射位置でのみ反応し（Do
ntha, N. 等，1997, Anal. Chem. 69：2619-2625）、このようにして特異的プロ
ーブの固定はディスク上に良好に位置決めすることができる。化学的固定の他の
例はカルボジイミドによるアミン上での核酸の５′−リン酸末端基固定、又はポ
リピロールポリマー中への閉じ込めである。ポリマーの表面は有機化学において
は周知の結合を通して大部分の生物学的分子の固定を可能にするためにカルボキ
シ化及びアミノ化することができる（Zammatteo等，1996, Anal. Biochem. 236 ：85-94）。
【００６７】 捕獲プローブを物理的に位置決めする一つの特別な方法はディスクの回転から
生ずる求心力を利用することである。液体は入口ピットを通してディスクへ注入
され、次に結合室に到達するまで微小流路を通して護送される（国際特許出願Ｗ
Ｏ ９７／２１０９０参照）。
【００６８】開裂不能「捕獲」分子と「標的」分子の間の結合 開裂不能捕獲分子上への標的分子の結合（又は固定）は標準的で再現可能な条
件下で得られる。これらはヌクレオチドハイブリダイゼーション（好ましくはSa
mbrook等，Molecular Cloningの§§9.31-9.58：A Laboratory Manual, Cold Sp
ring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(1989)に記載さ
れているような標準の厳格条件下でのハイブリダイゼーション）として、抗原／
抗体結合として、レセプター／リガンド結合又はタンパク質／ヌクレオチド又は
化学的／化学的分子認識の如き他の分子相互作用として現在では周知である。
【００６９】 好ましくは前記分子は前記結合を可能にするため、官能基性化学基（第一アミ
ン、スルフィドリル、アルデヒド等）、共通配列（核酸）、エピトープ（抗体）
、ハプテン又はリガンド基を（初めから又は改変によって）含む。
【００７０】 標的分子とその開裂不能捕獲分子の間の結合は分子の特異的親和性に、各分子
のアロステリック特性に、それらのイオン環境に、分子のイオン電荷に及び標的
分子とその開裂不能捕獲分子の間の可能な共有結合反応に依存することができる
。好ましくは前記条件は各種類の結合について文献に既に記載されているもので
あり、偽陽性又は偽陰性の検出を回避するために当業者によって適合されること
ができる。
【００７１】 好ましくは前記結合を読取ることができる光学検出システムは小さな光線を検
出することができる光ダイオードであってディスクの半径をカバーするために一
次元軸に沿って動く光ダイオードを含むことができる（図４参照）。ディスクの
回転と組合わせられると、かかる焦点合わせされた光検出装置はディスクの全表
面を走査し、ディスク上のいかなる位置に存在する標的分子をもアッセイする。
好ましい検出装置は音楽、ビデオ又はソフトウェアＣＤ用に用いられる商業的に
利用可能なＣＤ読取り器の光ダイオードである（図５参照）。
【００７２】 光システムはそれを検出表面に焦点合わせされた状態に留めるためにサーボ制
御されることができる。もし第二の光学検出システムが信号の検出のために与え
られるのなら、それもサーボ制御されることができるか又はその制御のために他
のシステムに連結されることができる。又はそれはディスクへのその焦点及びそ
のトラックを調整するために第一のシステムからデータを受取ることもできる。
ディスク表面の連続的読取りから受取られたデータはコンピュータに記憶され、
必要ならば再編成され、スポット位置を規定するために分析されることもできる
。
【００７３】 標的分子とその開裂不能捕獲分子の間の結合が光度信号を形成させると光度信
号が得られる。有利には前記結合（標的分子のその開裂不能捕獲分子への結合）
の検出及び／又は定量はレーザー光線の反射の変化を用いたＣＤ２進数検出シス
テムの原理に基づいている。レーザー反射の摂動はレーザー光線が溝中のピット
を検出する場合に得られる。
【００７４】 本発明の第一の実施態様によれば、前記ピットは標的分子と開裂不能捕獲分子
の間の結合の結果生ずる沈殿であることが有利である。
【００７５】 他の好ましい実施態様によれば、レーザー反射の摂動はコンパクトディスクの
一つの又はいくつかの層への腐蝕性攻撃によっても得ることができる。例えば、
標的分子とその開裂不能捕獲分子の間の結合は層の限定された改変を引き起こす
ことができ、それは前記層中にくぼみを形成するであろう（図３参照）。層中の
かかるくぼみは「マウンド（mounds）」又は「こぶ（bumps）」と通常呼ばれる が、負のピットとしても認められる（文献 Recordable CD Guide, Lee Purcell
& David Martin, Sybex 編を参照）。これらの摂動はレーザー光線によってラン
ドとは異なるピットとして検出される。標的分子とその開裂不能捕獲分子の間の
結合は前記結合が生ずる場合にのみ得られる光放出によっても直接検出及び定量
することができる。
【００７６】 本発明の他の好ましい実施態様によれば、標的分子とその開裂不能捕獲分子の
間の結合は一つ以上の分子の固定を可能にする。前記一つ以上の分子は化学的、
生物学的、蛍光的及び／又は電気的ルミネセンス光システムを通して光放出を生
成するか又は磁場及び／又は電場を生成し、これらは特別の読取り装置７によっ
て検出することができる（図１及び４参照）。
【００７７】 これらのシステムは光放出及び検出を可能にするか又は改良する特殊な酵素（
ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ピルビン酸キナーゼ等）の使用に
基づくことができる。
【００７８】 ラベルされた標的分子６又は標的分子が捕獲された後に第二のラベルされた反
応性分子を用いることができる。このラベルされた分子はビオチン１又はハプテ
ンでラベルされたプローブを用いるサンドイッチハイブリダイゼーションアッセ
イにおける、及び同様のラベルされた反応性分子を用いた抗体／抗原サンドイッ
チ結合における核酸２の如き結合対の第一部分であることができる。洗浄ステッ
プの後、ビオチン又はハプテンは酵素とコンジュゲートしたストレプトアビジン
又は抗体と反応することができ、それらは結合対の第二部分としてみなされる。
ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ピルビン酸キナーゼ又は他のデヒ
ドロゲナーゼの如き酵素を用いることができる。
【００７９】 不溶性生成物を得るために前記酵素に対する特異的な基質が選択される。例え
ばＤＡＢはペルオキシダーゼの存在下で酸化されて不溶性生成物を形成すること
ができる。この生成物は開裂不能捕獲分子上に沈殿し、かかる沈殿はディスク表
面にこぶ又はマウンドを形成し、ディスク表面は（レーザー）光線によって照射
される。反射された（レーザー）光線の強度は沈殿を照射する場合は低下し、（
レーザー）反射の摂動が得られる。かかる摂動はディスク表面上のピットとして
感光性検出装置によって分析される。
【００８０】 ディスクの透明部分を通る光透過によって検出されるのならば、沈殿の存在は
吸光度を示し、これを測定することができる。
【００８１】 別の不溶性生成物はコロイド金属金が用いられる場合、例えばストレプトアビ
ジン３への結合の場合に得られる。コロイド金は銀（Ａｇ）４の還元を触媒し、
結合が得られる場合にＡｇ沈殿を生成させる。銀付着はディスク５上に通常存在
する金又はアルミニウム層と比較して（レーザー）光線反射を減少させ、他の金
属が存在していない場合は光のいくらかを反射することができる。光に対して不
透明なこの沈殿はディスクを通した透過アッセイにおける光吸収によっても検出
することができる（図２及び６参照）。
【００８２】 標的分子に付着した第一結合対の認識を可能にする結合分子を担持するマイク
ロビーズ（第二結合対）を用いることも可能である。これらのマイクロビーズは
標的分子とその開裂不能捕獲分子の結合が得られたディスク表面上に配置される
。これらのビーズは（レーザー）光線を回折させて（レーザー）反射の摂動を生
成させる。（レーザー）反射のこれらの摂動は感光性検出装置によって検出され
てディスク表面上のピットとして分析される。
【００８３】 本発明の他の実施態様によれば、検出は標的分子の（蛍光分子での）ラベリン
グによって得られる。（レーザー）光線はコンパクトディスク表面を走査し、記
録された蛍光を分析する。フルオレセイン、フィコエリトリン、ローダミン又は
ランタナイドキレートの如き多くの蛍光分子が標的分子と関連して利用可能であ
る。これらは標的分子の直接又は間接ラベリングのために核酸、抗体、又はマイ
クロビーズ上に容易にラベルすることができる。
【００８４】 記録された信号は２進信号として又は絶対値として読取ることができる。２進
信号は電子情報化されたデータとして迅速に処理され、好適なソフトウェアによ
って分析させることが有利である。このソフトウェアは得られた検出を分析して
標的分子とその開裂不能捕獲分子の間の結合を定量することができるデータへと
この情報を変換する。
【００８５】 好ましくは、本発明によるディスクは付加的なピットを好ましくは開裂不能捕
獲分子に隣接する溝中に含むことができる。これは前記隣接する開裂不能捕獲分
子の型、量、及び特異性に関する情報を与える。
【００８６】 本発明の特別な実施態様によれば、本発明によるディスクは同一固体支持体（
本発明によるディスク表面）上での核酸配列の検出、増幅及び所望により定量を
可能にするために固定されたオリゴヌクレオチド捕獲プローブを担持する。実施
の他の形態においてはディスクは固定されたＰＣＲプライマーを含む。これは増
幅生成物を生成させてディスクの外部表面上に増幅生成物を固定させ、後ほど検
出するためである（Rasmussen等，1991, Anal. Biochem. 198：138-205に記載の
方法による）。
【００８７】 本発明によるディスクは診断キットにおいて、所望により化学的又は生物学的
化合物の前処理（ヌクレオチド配列の遺伝子増幅の如き）によって化学的又は生
物学的化合物のサンプル調製を自動的に行う診断及び読取り装置において用いら
れる。
【００８８】 好ましくは前記装置は、サンプル中の核酸配列の精製ステップ、それらの所望
による増幅ステップ（既知の遺伝子増幅方法による）、それらの診断及び所望に
よるそれらの定量ステップを行う自動核酸診断システムの如き一体化されたシス
テム中で多数のステップ又はサブステップを組合わせるシステムである。
【００８９】 本発明の好ましい実施態様は以下の非限定的実施例において説明されるであろ
う。
【００９０】
【実施例】実施例１：ＣＤ上のＤＮＡの検出 この実験の目的はＣＤ支持体に結合した捕獲プローブ上の直接ハイブリダイゼ
ーションによって特異的ＤＮＡを検出することであった。検出は比色測定によっ
て実行された。捕獲プローブはアミノ化されたポリカーボネートＣＤに結合され
、次に相補的ビオチン化ＤＮＡを用いてハイブリダイゼーションが行われ、スト
レプトアビジン−ペルオキシダーゼを用いて陽性ハイブリダイゼーションが検出
された。
【００９１】１．ＣＤのポリカーボネートのアミノ化 ＣＤは室温でＮａＯＨの１Ｎ溶液中で３０分間インキュベートすることによっ
てまずカルボキシ化された。水で３回洗浄した後、カルボキシ化されたＣＤは１
ｍｇ／ｍｌの水溶性カルボジイミドと１ｍＭのＮ−メチルプロパン１−３ジアミ
ンを含むＭＥＳ ０．１Ｍ ｐＨ６緩衝液溶液中で室温で２時間インキュベート
された。ＭＥＳ ０．１Ｍ ｐＨ６緩衝液で３回、水で３回洗浄した後、アミノ
化されたＣＤは３７℃で３０分間乾燥された。
【００９２】２．アミノ化されたＣＤへの捕獲プローブの固定 ＣＭＶ捕獲プローブを含む溶液と、ＨＩＶ捕獲プローブを含む溶液の二つの溶
液が調製された。これらの溶液は変性されたＤＮＡ捕獲プローブ（ＣＭＶ又はＨ
ＩＶ）を２μｇ／ｍｌの濃度で、カルボジイミドを１．６ｍｇ／ｍｌの濃度で含
むＭｅＩＭ ０．０１Ｍ ｐＨ７．５緩衝液であった。
【００９３】 ３×２０μｌのこれらの溶液は二つのアミノ化されたＣＤ上にスポット状に適
用され、これらのＣＤは湿潤雰囲気中で５０℃で５時間インキュベートされた。
ＮａＯＨ ０．４Ｎ＋Tween ０．２５％で５０℃で５分間３回洗浄した後、これ
らのＣＤは水で３回洗浄され、３７℃で３０分間乾燥された。
【００９４】３．ＣＤへのＣＭＶビオチン化されたＤＮＡのハイブリダイゼーション 両方のＣＤは捕獲プローブを変性させるためにＮａＯＨ ０．２Ｎ中で５分間
インキュベートされ、次に０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍマレイン酸緩衝
液ｐＨ７．５で洗浄された。次にこれらのＣＤは変性されたＤＮＡ鮭精液１００
μｇ／ｍｌ、ＳＳＣ ４Ｘ、Denhardt ５Ｘ及び変性されたＣＭＶビオチン化ＤＮ
Ａを７０ｎｇ／ｍｌの濃度で含むハイブリダイゼーション溶液中で６５℃で２時
間インキュベートされた。ハイブリダイゼーションステップの後、ＣＤは１５ｍ
ＭのＮａＣｌとTween ０．３％を含む０．０１Ｍマレイン酸緩衝液で室温で３回
洗浄された。
【００９５】 第一のＣＤは次に０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％牛乳粉末及びストレプトア
ビジン−ペルオキシダーゼ１μｇ／ｍｌを含む０．１Ｍマレイン酸緩衝液で室温
で４５分間インキュベートされた。コンジュゲートのインキュベート後、両方の
ＣＤは１５ｍＭのＮａＣｌとTween ０．３％を含む０．０１Ｍマレイン酸緩衝液
で室温で３回洗浄された。
【００９６】４．ハイブリダイズしたＤＮＡの検出 第一のＣＤは次にＴＭＢ溶液（Medgenix）中で１０分間インキュベートされた
。陽性ハイブリダイゼーションが生じた場所を表す青色を確認するためにこのイ
ンキュベーションの１分後にこのＣＤの写真が撮られた（図４）。結果はＣＤを
通る透過光の吸収によって得ることができる。
【００９７】実施例２：マスター検出を用いたＣＤ上のＤＮＡの検出 ＤＮＡ捕獲プローブはＣＤ表面上にスポット状に適用され、標的ＤＮＡを用い
たハイブリダイゼーションは実施例１と同様であった。ビオチン化されたハイブ
リダイズしたＤＮＡの検出のため、ＣＤは０．１５ＭのＮａＣｌ、０．１％牛乳
粉末及びストレプトアビジン−コロイド金（Sigma, St-Louis, USA）１μｇ／ｍ
ｌを含む０．１Ｍマレイン酸緩衝液で室温で４５分間インキュベートされた。陽
性のハイブリダイゼーションが生じた場所に銀沈殿を生成させるために、ＣＤは
銀増強キット（Sigma, St-Louis, USA）からの溶液Ａ及びＢを等容量合わせるこ
とにより調製した溶液中で３０分間更にインキュベートされた。このＣＤは金層
で回復され、レーザーＣＤプレーヤーによってＣＤ上に書き込まれた情報及び銀
沈殿による干渉を読取られた（図２及び３）。
【００９８】実施例３：光吸収によるＣＤ上のタンパク質の検出 用いられたＣＤはピットにデータを部分的に刻印され、この部分は金で被覆さ
れた。捕獲分子はＣＤの縁でプラスチック表面上に直接固定された。
【００９９】１．ＣＤのカルボキシ化 第一のＣＤはＮａＯＨ １Ｎ中で室温で３０分間インキュベートされ、次に水
で３回洗浄され、３７℃で３０分間乾燥された。
【０１００】２．ＣＤ上への抗体の固定 三つの異なる種類の抗体がカルボキシ化されたＣＤ上に固定された：ウシ血清
アルブミンに対する抗体、フルオレセインに対する抗体（陰性コントロールとし
て）、及びストレプトアビジンに対する抗体（陽性コントロールとして）。
【０１０１】 カルボジイミド（Acros）を１ｍｇ／ｍｌで及び三つの異なる抗体の一種類を １０μｇ／ｍｌで含む硼酸緩衝液０．０２Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．２の三つの異
なる溶液２０μｌは三つの異なるＣＤ部分にスポット状に適用された。これらの
スポットは４℃で一晩インキュベートされ、次にカゼインを０．１％含むグリシ
ン緩衝液０．１Ｍ ｐＨ９．２で１０分間洗浄され、次にTween ２０を０．１％
含むグリシン緩衝液０．１Ｍ ｐＨ９．２で５分間、２回洗浄され、最後にグリ
シン緩衝液０．１Ｍ ｐＨ９．２で２回洗浄された。ＣＤは３７℃で３０分間乾
燥された。
【０１０２】３．ＣＤ上でのＥＬＩＳＡ技術によるウシ血清アルブミンの検出 ＣＤは０．１％のカゼインを含むＰＢＳ中の１０μｇ／ｍｌの血清アルブミン
溶液と共に、表面上に固定された三つの異なる抗体で室温でインキュベートされ
た。インキュベーションは９０分間行われた。ＣＤは０．１％のTween ２０を含
むＰＢＳで３回洗浄され、次に０．１％のカゼイン及び２０μｇ／ｍｌの血清ア
ルブミンに対するビオチン化された抗体を含むＰＢＳと共に４５分間インキュベ
ートされた。ＣＤは次に０．１％のTween ２０を含むＰＢＳで３回洗浄され、次
に０．１％のカゼイン及びストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを１μｇ／ｍ
ｌで含むＰＢＳ溶液中で４５分間インキュベートされた。ＣＤは０．１％のTwee
n ２０を含むＰＢＳで３回洗浄された。検出のため、ストレプトアビジン−ペル
オキシダーゼが固定されたＣＤはＴＭＢの溶液中でインキュベートされ、ＢＳＡ
に対する及びストレプトアビジンに対する抗体がスポット状に適用された部分を
表す青色を確認するためにカメラの下で２分後、４分後及び６分後に写真が撮ら
れた。
【０１０３】実施例４：レーザー検出を用いたＣＤ上のタンパク質の検出 アルブミンはＣＤ表面上にスポット状に適用され、抗体との反応は実施例３と
同様であった。ビオチン化された抗体に対して反応させるために用いたコンジュ
ゲートはストレプトアビジン−金であった。それは１μｇ／ｍｌの濃度で０．１
％カゼインを含むＰＢＳ溶液中で４５分間インキュベートされた。ストレプトア
ビジン−金は銀還元のための中心として働く。「銀増強剤」（Sigma）の溶液が １５分間室温で用いられた。銀沈殿はＢＳＡに対する及びストレプトアビジンに
対する抗体がスポット状に適用された場所で観察された。沈殿及び沈殿の大きさ
（直径約１μｍ）による光吸収の変動が観察された。ピットの存在はレーザー光
線の反射によって見出された（図５）。
【０１０４】実施例５：ＣＤ上のＤＮＡ又はタンパク質の磁性検出 ＣＤ支持体上にハイブリダイズしたＤＮＡ又はタンパク質の検出は磁性方法に
よって達成された。ＤＮＡ又は抗体に結合したビオチンは鉄流体（ferro-fluid ）（Immunicon, Hungtinton Valley, PA, USA）へコンジュゲートしたストレプ トアビジンによって認識されることができる。このコンジュゲートは鉄流体の鉄
核の大きさに応じて磁性又は常磁性であり、磁場中で検出することができる（図
７）。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明による検出ステップの一例である。
【図２】 本発明による信号形成ステップの一実施態様を示す。
【図３】 本発明による検出ステップの一実施態様を示す。
【図４】 本発明による検出ステップの一実施態様を示す。
【図５】 本発明による検出ステップの一実施態様を示す。
【図６】 ディスク上に形成された銀沈殿を示す。
【図７】 本発明による検出ステップの一実施態様を示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年２月４日（２０００．２．４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１２】 しかし、この複雑で高価な検出方法及び装置は前記開裂可能な信号素子と様々
な相互作用を生じ得るので、様々な複合体分析対象物の検出において様々な偽陽
性又は偽陰性を生ずる。 文献ＷＯ ９７／２１０９０は固体支持体、分析する生物学的サンプルのため
の入口、及び前記固体支持体の内側に前記サンプルの様々な処理のための微小流
路を含むディスクを記載している。ディスクの形状の前記平坦な固体支持体の他
の側は前記ディスクの回転を制御するための電磁的にコードされた指令を含む。
生物学的サンプルは求心力による運動によって様々な微小流路に注入することが
できる流体中に存在する。 文献ＷＯ ９６／０９５４８は光学的に透明なディスク上で生物学的、化学的
又は生化学的サンプルの分析を行う装置及び方法を記載している。前記一般的な
光学分析技術はサンプルが付着されているコンパクトディスクの表面を前記表面
に実質的に焦点を合わされた光線で走査することによってコンパクトディスクに
適合することができる。位置コードは各位置の間に位置コードを一つ増加させる
ことによって最内トラックの周りの別の領域に刻印することができる。コードは
トラックからトラックへと増加される。代わりに、アドレス情報は同様にトラッ
クセクター配置に従って分布させることができ、サーボコードは磁気フロッピー
及びハードディスクにコードされる。前記システムにおいては上部表面に付着さ
れたいかなる生物学的材料もディスクを励起させる光で干渉される。反射層によ
って反射された光はディスクにディジタル的にコードされた情報を用いて変調さ
れるので、検出器の出力は同様に変調される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２５】 ディスクは１．２ｍｍの厚さと１２ｃｍの直径を一般的に持つが、より小さい
支持体も存在し、特殊な適用（ペトリ皿への捕獲分子と標的分子の間の結合の如
き）のために適合されることができ、厚さは用いられる本発明の検出方法と捕獲
分子の技術的要求に応じて適合されることができる。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年３月２７日（２０００．３．２７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３６】 商業的なＣＤドライブの一つの特異的な特徴はかかるピットを読取って９００
Ｋｂ／秒で送出するそれらの特性である。このことはこのレーザー反射器技術を
記録されたピットの読出しのみならず結合の結果の読出しのためにも特に好適な
ものにする。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４３】 本発明のコンパクトディスクの製造及び操作のために最も有利な好ましい実施
態様は以下の四つの既に存在する様式のうちの一以上の範囲内の寸法を有する： − 約３．８ｃｍの半径と約１ｍｍの厚さを有する５ｃｍコンパクトディスク
（ＣＤ）、 − 約６ｃｍの半径と１ｍｍの厚さを有する１２ｃｍＣＤ、 − １０ｃｍの半径と２ｍｍの厚さを有する２０ｃｍＣＤＶ（商業的には「レ
ーザービジョン（Laservision）」ディスクと称される）、及び − １５ｃｍの半径と２ｍｍの厚さを有する３０ｃｍＣＤＶディスク。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００９４】３．ＣＤへのＣＭＶビオチン化されたＤＮＡのハイブリダイゼーション 両方のＣＤは捕獲プローブを変性させるためにＮａＯＨ ０．２Ｎ中で５分間
インキュベートされ、次に０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍマレイン酸緩衝
液ｐＨ７．５で洗浄された。次にこれらのＣＤは変性されたＤＮＡ鮭精液１００
μｇ／ｍｌ、ＳＳＣ ４Ｘ、Denhardt ５Ｘ及び変性されたＣＭＶビオチン化ＤＮ
Ａを７０ｎｇ／ｍｌの濃度で含むハイブリダイゼーション溶液中で６５℃で２時
間インキュベートされた。ハイブリダイゼーションステップの後、ＣＤは１５ｍ
ＭのＮａＣｌとTweenTM ０．３％を含む０．０１Ｍマレイン酸緩衝液で室温で ３回洗浄された。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００９６】４．ハイブリダイズしたＤＮＡの検出 第一のＣＤは次にＴＭＢ溶液（Medgenix）中で１０分間インキュベートされた
。陽性ハイブリダイゼーションが生じた場所を表す青色を確認するためにこのイ
ンキュベーションの１分後にこのＣＤの写真が撮られた。結果はＣＤを通る透過
光の吸収によって得ることができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１０１】 カルボジイミド（Acros）を１ｍｇ／ｍｌで及び三つの異なる抗体の一種類を １０μｇ／ｍｌで含む硼酸緩衝液０．０２Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．２の三つの異
なる溶液２０μｌは三つの異なるＣＤ部分にスポット状に適用された。これらの
スポットは４℃で一晩インキュベートされ、次にカゼインを０．１％含むグリシ
ン緩衝液０．１Ｍ ｐＨ９．２で１０分間洗浄され、次にTweenTM ２０を０．１
％含むグリシン緩衝液０．１Ｍ ｐＨ９．２で５分間、２回洗浄され、最後にグ
リシン緩衝液０．１Ｍ ｐＨ９．２で２回洗浄された。ＣＤは３７℃で３０分間
乾燥された。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１０２】３．ＣＤ上でのＥＬＩＳＡ技術によるウシ血清アルブミンの検出 ＣＤは０．１％のカゼインを含むＰＢＳ中の１０μｇ／ｍｌの血清アルブミン
溶液と共に、表面上に固定された三つの異なる抗体で室温でインキュベートされ
た。インキュベーションは９０分間行われた。ＣＤは０．１％のTweenTM ２０を
含むＰＢＳで３回洗浄され、次に０．１％のカゼイン及び２０μｇ／ｍｌの血清
アルブミンに対するビオチン化された抗体を含むＰＢＳと共に４５分間インキュ
ベートされた。ＣＤは次に０．１％のTweenTM ２０を含むＰＢＳで３回洗浄され
、次に０．１％のカゼイン及びストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを１μｇ
／ｍｌで含むＰＢＳ溶液中で４５分間インキュベートされた。ＣＤは０．１％の
TweenTM ２０を含むＰＢＳで３回洗浄された。検出のため、ストレプトアビジン
−ペルオキシダーゼが固定されたＣＤはＴＭＢの溶液中でインキュベートされ、
ＢＳＡに対する及びストレプトアビジンに対する抗体がスポット状に適用された
部分を表す青色を確認するためにカメラの下で２分後、４分後及び６分後に写真
が撮られた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，Ｈ Ｕ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，Ｔ Ｒ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 CA01 HA14 HA15 4B029 AA07 AA21 BB15 BB17 BB20 CC03 CC08 FA15 4B063 QA01 QA18 QQ10 QQ42 QR02 QR32 QR50 QR56 QR58 QR84 QS03 QS35 QS36 QS39 QX01 4H045 AA30 BA62 BA63 DA75 EA50 FA81

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下のステップを含む、サンプル、好ましくは生物学的サン
    プル中に存在する標的分子の検出及び／又は定量方法： − 記録データを含むディスクである固体支持体の表面上に固定された捕獲分
    子と前記標的分子の間の結合を行わせ、前記結合によって信号を生ぜしめ、 − 前記信号が捕獲分子の開裂を通して得られないという条件で前記信号を検
    出及び／又は定量する。
  2. 【請求項２】 捕獲分子及び標的分子がヌクレオチド配列であることを特徴
    とする請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 捕獲分子及び標的分子がそれぞれ抗原又は抗体であることを
    特徴とする請求項１の方法。
  4. 【請求項４】 捕獲分子及び標的分子がそれぞれレセプター又は前記レセプ
    ターのリガンドであることを特徴とする請求項１の方法。
  5. 【請求項５】 信号の検出及び／又は定量が光線、好ましくはレーザー光線
    の反射、吸収又は回折、又は電磁場の変化によって得られることを特徴とする請
    求項１−４のいずれか一項の方法。
  6. 【請求項６】 信号の検出及び／又は定量が光線による結合した標的分子及
    び捕獲分子の励起後の蛍光放出によって得られることを特徴とする請求項１−５
    のいずれか一項の方法。
  7. 【請求項７】 信号の検出及び／又は定量が標的分子とその捕獲分子の間の
    結合の結果である光線、放射線又は磁場の直接放出によって得られることを特徴
    とする請求項１−４のいずれか一項の方法。
  8. 【請求項８】 光線の放出が化学的、生物学的、蛍光的及び／又は電気的ル
    ミネセンス光又は放射線を放射する能力を持つ分子からなる群から選択される結
    合分子によって生成されることを特徴とする請求項６又は７の方法。
  9. 【請求項９】 標的分子と捕獲分子の間の結合が沈殿、好ましくはコロイド
    金属試薬の付着物の如き不透明の又は磁性沈殿、好ましくは銀沈殿をディスクの
    表面上に生成させ、及び／又はディスクの表面の一以上の層の腐蝕を生じさせる
    ことを特徴とする請求項１−８のいずれか一項の方法。
  10. 【請求項１０】 標的分子と開裂不能捕獲分子の間の結合が前記結合から生
    ずる信号の検出及び／又は定量において用いられる一以上の分子の固定を可能に
    することを特徴とする請求項１−９のいずれか一項の方法。
  11. 【請求項１１】 前記他の分子がマイクロビーズ又は磁性粒子であることを
    特徴とする請求項１０の方法。
  12. 【請求項１２】 ディスクがその軸（Ａ）上で回転している時に信号が得ら
    れることを特徴とする請求項１−１１のいずれか一項の方法。
  13. 【請求項１３】 ディスクの記録データが２進データ、好ましくは溝付２進
    データであることを特徴とする請求項１−１２のいずれか一項の方法。
  14. 【請求項１４】 ディスクがコンパクトディスクであることを特徴とする請
    求項１−１３のいずれか一項の方法。
  15. 【請求項１５】 記録データが捕獲分子と標的分子の間の結合から生ずる信
    号の処理及び解釈を可能にすることを特徴とする請求項１−１４のいずれか一項
    の方法。
  16. 【請求項１６】 ディスクが連結されて流体接触している微小流路を含むこ
    とを特徴とする請求項１−１５のいずれか一項の方法。
  17. 【請求項１７】 記録データを含むディスクにおいて、ディスクがその表面
    上に固定された開裂不能捕獲分子であって検出及び／又は定量されるべき標的分
    子と結合する捕獲分子をさらに含むことを特徴とするディスク。
  18. 【請求項１８】 開裂不能捕獲分子及び／又は標的分子が核酸分子、好まし
    くはヌクレオチド配列、抗原、抗体、レセプター、レセプターのリガンド、ペプ
    チド性又はタンパク質性分子、脂質、糖、ハプテン、発蛍光団、発色団、触媒、
    組合せ化学によって得られる新規巨大分子、又はそれらの組合せからなる群から
    選択されることを特徴とする請求項１７のディスク。
  19. 【請求項１９】 ディスクの記録データが２進データ、好ましくは溝付２進
    データであることを特徴とする請求項１７又は１８のディスク。
  20. 【請求項２０】 コンパクトディスクであることを特徴とする請求項１９の
    ディスク。
  21. 【請求項２１】 連結されて流体接触している微小流路を含むことを特徴と
    する請求項１７−２０のいずれか一項のディスク。
  22. 【請求項２２】 請求項１７−２１のいずれか一項のディスクの製造方法で
    あって、開裂不能捕獲分子の光活性化を通して、前記捕獲分子を予めデータが記
    録されているディスクの表面上に固定するステップを含む方法。
  23. 【請求項２３】 開裂不能捕獲分子が捕獲分子の端とディスクの表面層の間
    の共有結合を通して得られることを特徴とする請求項２２の方法。
  24. 【請求項２４】 ディスク表面が保護層、好ましくは有機化合物製の保護層
    によって回復され、前記保護層が開裂不能捕獲分子の保護及び安定化及び／又は
    標的分子とその開裂不能捕獲分子の間の結合の保護、安定化及び／又は検出を可
    能にするか又は改善することを特徴とする請求項２２又は２３の方法。
  25. 【請求項２５】 請求項１７−２１のいずれか一項のディスク、及び標的分
    子とその捕獲分子の間の結合を行わせる反応体、及び所望により前記結合から生
    ずる信号を検出する反応体を含む診断キット。
  26. 【請求項２６】 サンプル中に存在する標的分子とその捕獲分子の間の結合
    から生ずる信号を検出及び／又は定量する検出及び／又は読取り装置であって、
    請求項１７−２１のいずれか一項のディスク又は請求項２５のキット、及び前記
    信号の検出及び／又は定量のための手段を含む装置。
  27. 【請求項２７】 読取りコンパクトディスク装置である請求項２６の検出及
    び／又は読取り装置。
  28. 【請求項２８】 ディスク上の記録データを読取るための第一読取りヘッド
    、及び標的分子とその捕獲分子の間の結合から生ずる信号の検出及び／又は定量
    のための第二読取りヘッドを含むことを特徴とする請求項２７の検出及び／又は
    読取り装置。
  29. 【請求項２９】 一体化された検出及び／又は読取り装置内での標的分子の
    精製、標的分子の特異的開裂、前記標的分子の所望の遺伝子増幅のための付加的
    な手段を含む請求項２６−２８のいずれか一項の検出及び／又は読取り装置。
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