KR20020047316A - 리간드 고정 기체 - Google Patents

리간드 고정 기체 Download PDF

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KR20020047316A
KR20020047316A KR1020027005576A KR20027005576A KR20020047316A KR 20020047316 A KR20020047316 A KR 20020047316A KR 1020027005576 A KR1020027005576 A KR 1020027005576A KR 20027005576 A KR20027005576 A KR 20027005576A KR 20020047316 A KR20020047316 A KR 20020047316A
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disc
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KR1020027005576A
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카토이쿠노신
이주히로유키
아사다키요조
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오미야 히사시
다까라 슈조 가부시키가이샤
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Abstract

그 표면상의 예정된 영역에 복수의 상이한 리간드가 각각 고정화되어 있는 스트링, 테이프 또는 원형 디스크형 기체.

Description

리간드 고정 기체 {Bases having ligands immobilized thereon}
분자의 구조 및 활성간의 관계는 생물학적 시스템에 관하여 연구되어야 할 본질적인 문제이다. 특정 분자는 다른 분자와 상호작용하고 결합한다는 것이 알려져 있다. 이런 특이적인 분자간 결합은 수용체와 리간드간의 관계로 알려져 있다. 리간드와 수용체의 결합 친화도를 결정하기 위한 많은 방법이 알려져 있다 (예를 들어, JP-A 4-505763 참조).
본 발명은 생화학 분야에서 유용한, 고속으로 리간드와 수용체의 결합에 관한 많은 정보를 연속적으로 획득하기 위한 기질, 상기 기질을 이용하는 장치, 리간드와 수용체의 결합을 검출하는 장치, 및 결합을 검출하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 본 발명에 관한 대표적인 검출 장치를 예시하는 도식도이다.
발명의 상세한 설명
리간드가 인식되는 분자이고 특이적인 수용체에 의해 결합하는 한 본 발명에 관한 리간드에 대하여 특이적인 제한은 없다. 예를 들어, 리간드는 핵산, 당류, 단백질 또는 펩티드이다.
리간드의 예는 세포막 수용체의 작용제 및 길항제, 독소 및 뱀독, 바이러스의 에피토프, 호르몬(예를 들어, 진정제, 아편제 및 스테로이드), 호르몬 수용체, 펩티드, 효소, 효소에 대한 기질, 보조인자, 약물, 렉틴, 당류, 오리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 핵산, 올리고당, 단백질뿐만 아니라 모노클로날 항체를 포함한다.
수용체가 상기 리간드에 결합하는 능력을 갖는 한 본 발명에 관한 수용체에 대하여 특이적인 제한은 없다. 그것은 자연적으로 생성되는 분자 또는 인공적인 분자일 수 있다. 수용체의 예는 핵산, 당류, 효소와 같은 단백질 및 펩티드, 세포 표면 단백질 (수용체), 당단백질 및 항체를 포함한다.
본 발명에 관한 리간드와 리간드에 결합하는 능력을 갖는 수용체의 표면에 접촉하는 특성은 서로 상보적이다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "코드-형"은 기질의 폭이 테이프-형보다 좁음을 의미하고, 코드-형, 끈(string)-형 및 밧줄(rope)-형을 포함한다. 코드-형 기질은 리간드가 기질 표면 상의 예정된 부위에 고정될 수 있는 한 어떤 물질로부터도 만들어질 수 있을 것이다. 테이프-형 기질은 좁고, 길며 벨트와 비슷한 기질이다. 테이프-형 기질은 리간드가 기질 표면 상의 예정된 부위에 고정될 수 있는 한 어떤 물질로부터도 만들어질 수 있을 것이다. 본 발명에 관한 디스크-형 기질은 리간드가 기질 표면 상의 예정된 부위에 고정될 수 있는 한 어떤 물질로부터도 만들어질 수 있는 디스크-형 기질이다.
어떤 유연한 또는 반-유연한 물질이 코드-형 기질로 사용될 수 있을 것이다. 복수의 리간드 고정 부위는 표면 상의 물리적으로 분리된 위치에 배치되는 것이 바람직하다. 어떤 유연한 또는 반-유연한 물질이 테이프-형 기질로서 사용될 수 있다. 적어도 하나의 테이프-형 기질 표면이 실질적으로 편평하다. 복수의 리간드 고정 부위가 표면 상의 물리적으로 분리된 위치에 배치되는 것이 바람직하다. 단단한, 유연한 또는 반-유연한 물질이 디스크-형 기질로서 바람직하게 사용될 수 있다. 적어도 하나의 디스크-형 기질의 표면이 실질적으로 편평하다. 복수의 리간드 고정 부위가 표면 상의 물리적으로 분리된 위치에 배치되는 것이 바람직하다.
코드-, 테이프-, 또는 디스크-형 기질 표면 상의 리간드 고정 위치의 배열에 관해 특이적인 제한은 없다. 배열은 목적에 따라 변화될 수 있다.
예를 들어, 리간드는 코드-형 기질 위에 1 내지 100 리간드/cm, 1 내지 100 리간드/cm2, 또는 1 내지 100 리간드/cm3의 밀도로 배치될 수 있다. 리간드는 테이프-형 기질 위에 짧은 쪽으로 1 내지 100 리간드/cm 및 긴 쪽으로 1 내지 100의 밀도로 배치될 수 있다. 디스크-형 기질의 경우에는, 리간드가 1 내지 10000 리간드/cm2의 밀도로 배치될 수 있다.
리간드는 상업적으로 이용가능한 배치기(spotter)를 사용하여 기질 위에 편리하게 배치될 수 있다. 특정 형태의 리간드는 기질 위에 합성될 수 있다.
리간드와 리간드에 결합하는 능력을 갖는 수용체간의 결합을 고속으로 검출하는데 사용 가능한 기질은 바람직하게는 본 발명에 관한 기질로서 사용된다. 리간드와 리간드에 결합하는 능력을 갖는 수용체간의 결합이 기질을 사용하여 고속으로 검출되는 경우, 리간드 고정 부위가 서로 떨어져 위치하는 기질이 사용된다고 할지라도 리간드와 리간드에 결합하는 능력을 갖는 수용체간의 수많은 결합은 짧은 시간 내에 검출 가능하다. 리간드 고정 부위가 서로 떨어져 위치하는 기질이 편리하게 제조 가능하다. 이런 기질이 사용된다고 할지라도, 높은 밀도의 리간드 고정 부위를 갖는 기질을 사용하여 달성되는 것과 동등한 효과는 고속으로 기질로부터 정보를 얻음으로써 야기된다.
또한, 제조에서의 리간드 중의 오염의 가능성은 리간드 고정 부위가 떨어져 위치하는 기질에 대하여 감소될 수 있다.
기질은 하기에 의하여 예시되고, 그 모든 것은 본 발명에 따라서 바람직하게 사용 가능하다: 리간드 고정 부위가 적어도 1mm의 간격으로 위치하는 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질; 리간드 고정 부위가 100 부위/cm2미만의 밀도로 위치하는 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질; 리간드 고정 부위가 10 부위/cm2미만의 밀도로 위치하는 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질; 기질 상의 리간드 고정 부위의 수가 100 이상인 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질; 및 기질 상의 리간드 고정 부위의 수가 1000 이상인 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질이다.
리간드 및 관심의 수용체간의 결합은 리간드 고정 부위가 본 발명에 따른 라인 상의 특정 부위에 위치한다면 단지 1차원 스캐닝에 의하여 검출 가능하다. 반면에, 높은 밀도로 리간드 고정 부위를 함유하는 전통적인 기질을 사용하여 리간드 및 관심의 수용체간의 결합을 검출하기 위하여 이차원 스캐닝이 필요하다. 따라서, 본 발명은 전통적인 것과 비교하여 리간드 및 관심의 수용체간의 결합을 검출하는획기적으로 편리한 방법을 제공한다.
상기의 라인은 직선 또는 곡선에 제한되지 않는다.
실질적으로 불용해성 물질로부터 만들어진 기질은 바람직하게는 본 발명의 코드- 또는 테이프-형 기질로서 사용될 수 있다. 리간드가 공유결합 또 비공유결합으로 부착되는, 이런 물질의 예는 헤테로-폴리머, 폴리우레탄, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 폴리우레아, 폴리아미드, 폴리에틸렌 이민, 폴리아릴렌 설파이드, 폴리실록산, 폴리이미드, 폴리아세테이트, 폴리비닐 클로라이드, 나일론 및 본 출원서의 개시 후에 본 분야에서 공지가 될 다른 폴리머 뿐만 아니라, 종이, 나일론, 셀룰로스 및 니트로셀룰로스와 같은 셀룰로스 유도체를 포함한다.
실질적으로 불용해성 물질로부터 만들어진 기질은 바람직하게는 본 발명의 디스크-형 기질로서 사용될 수 있다. 리간드가 공유결합 또 비공유결합으로 부착되는, 이런 물질의 예는 헤테로-폴리머, 폴리우레탄, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 폴리우레아, 폴리아미드, 폴리에틸렌 이민, 폴리아릴렌 설파이드, 폴리실록산, 폴리이미드, 폴리아세테이트, 폴리비닐 클로라이드, 나일론 및 본 출원서의 개시 후에 본 분야에서 공지가 될 다른 폴리머, 종이, 나일론, 셀룰로스 및 니트로셀룰로스와 같은 셀룰로스 유도체, 폴리카보네이트와 같은 플라스틱, 폴리스티렌 및 폴리프로필렌 뿐만 아니라 플라스틱 유도체, 자기성 또는 비자기성 금속, 석영 및 유리를 포함한다.
본 발명의 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질은 부드러운 표면을 갖는 중합성 또는 비중합성, 다공성의(porous) 물질로부터 만들어진다. 하지만, 본 발명에사용되는 기질은 이런 물질로부터 만들어진 것에 제한되지 않는다. 예를 들어, 기질은 DNA 칩 또는 바이오센서를 위한 기질로서 사용되는 것일 수 있고 그것의 표면에 고정되는 DNA를 보유 가능한 것일 수 있다. 예를 들어, 그것의 표면에 친수성 또는 소수성 기능적 그룹을 갖는 기질이 바람직하게 사용 가능하다. 기능적 그룹의 예는 하이드록실 그룹, 아민 그룹, 티올 그룹, 알데하이드 그룹, 카복실 그룹 및 아실 그룹을 포함한다. 기질은 또한 기질의 물질의 특성으로서 그것의 표면에 이런 기능적 그룹을 갖는 기질을 포함한다. 기질이 그것의 표면에 친수성 또는 소수성 기능적 그룹을 갖지 않는다고 할지라도, 표면 처리에 의하여 그것의 표면에 이런 기능적 그룹을 갖도록 만들어질 수 있는 한 그것은 제한 없이 사용될 수 있을 것이다.
이런 표면 처리를 받는 기질의 예는 아미노알킬실란과 같은 상업적으로 이용가능한 실란-결합제(silane-coupling agent)로, 폴리라이신 또는 폴리에틸렌이민과 같은 다중양이온(polycation)으로, 또는 아미노알킬실레인 및 글루타르알데히드로 처리된 표면을 갖는 기질을 포함한다.
전기적으로 음성, 중성 또는 양성인 기질은 만약 리간드가 효율적으로 그 위에 고정된다면 본 발명의 코드-, 테이프- 도는 디스크-형 기질로서 바람직하게 사용될 수 있을 것이다. 게다가, 기질은 리간드 고정화 부분 및 리간드 고정화 부위를 지지하는 부분으로 구성되는 이중 구조를 가질 수 있을 것이다. 리간드 고정화 효율 및 코드-, 테이프- 도는 디스크-형 기질의 강도를 고려하여 선택될 것이다.
리간드 고정화를 위한 부분은 미리 제조되고, 리간드 고정화 부분을 지지하는 부분에 달라붙고, 그 다음 사용될 것이다. 리간드 고정화 부분의 형태에 관하여 제한이 없다. 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질은 미리 그 위에서 리간드가 고정된 비드(beads), 그 위에서 리간드가 합성되는 비드 등을 사용하여 제조될 것이다.
배경(background)이 검출기를 사용하여 신호를 검출하기에 충분하게 억제되는 한 어떤 물질도 제한 없이 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질로서 바람직하게 사용될 수 있을 것이다. 투명, 반투명 또는 불투명한 기질은 본 발명에 관하여 바람직하게 사용될 수 있을 것이다. 빛 전달형 검출기 또는 빛 반사형 검출기 등은 기질의 물질에 기초하여 선택되고 사용될 것이다.
기질은 검출기를 이용한 검출을 위하여 일차원적으로 움직일 수 있을 것이다. 또한, 검출기는 기질 상에서 일차원적으로 움직일 수 있을 것이다.
리간드와 수용체의 결합은 복수의 리간드를 갖는 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질을 적어도 하나의 리간드에 대한 결합능력이 결정될 수용체 (예를 들어, 표지된 리간드) 에 노출시키고, 기질 상의 표지의 위치를 검출함으로써 결정 가능하다. 모든 기질은 수용체에 노출 되거나, 기질의 부분은 연속적으로 수용체에 노출될 수 있을 것이다. 예를 들어, 리간드와 수용체의 결합은 연속적으로 하기와 같이 결정 가능하다: 코드-형 기질의 경우에는, 수용체에 대한 노출이 기질의 끝으로부터 시작될 것이다; 테이프-형 기질의 경우에는, 표지된 수용체에 대한 노출은 한 짧은 측면으로부터 시작될 수 있을 것이고, 다음 기질 상의 표지의 위치가 검출된다; 디스크-형 기질의 경우에는, 표지된 수용체에 대한 노출은 기질 상의 어떤 위치로부터도 시작될 수 있을 것이고, 다음 기질 상의 표지의 위치가 검출된다. 임의로, 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질을 세척 및/또는 건조하는 단계는 적절하게 상기 과정에 포함될 것이다.
코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질이 기질 검출기를 통과하는 속도는 리간드 및 수용체간 결합의 결정에 기초하여 적절하게 선택될 수 있을 것이다. 예를 들어, 속도는 일정할 것이다. 또한, 자세히 검사하는 부위에 대해서는 속도가 바뀔 수 있을 것이다. 만약 기질이 일정한 속도로 통과한다면, 10 μm의 분석을 위한 속도는, 예를 들어, 바람직하게는 15 초/cm2이하, 보다 바람직하게는 10 초/cm2이하이다. 80 μm의 분석을 위한 속도는 바람직하게는 1 초/cm2이하, 보다 바람직하게는 0.5 초/cm2이하이다. 검출은 기질의 이동 방향을 거꾸로 하면서, 전체 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질, 또는 자세하게 검사되어야 할 그의 부위를 검출기를 통한 통과를 반복함으로써 수행될 수 있을 것이고 신호 데이터가 통합된다.
리간드 및 수용체의 결합을 검출하는 단계는 미리 수용체를 리간드에 결합하는 단계를 거친 기질을 사용하여 고속으로 수행될 수 있다. 이 경우에, 낮은 밀도의 리간드 고정화 부위를 갖는 기질이 사용된다고 할지라도, 높은 밀도의 리간드 고정화 부위를 갖는 기질을 사용하여 수행되는 것과 동등한 효과가 빠른 속도의 결과로서 야기될 수 있다. 게다가, 리간드가 정확하고, 편리하고 적은 비용으로 저밀도 기질 위에 고정될 수 있기 때문에, 본 발명의 기질은 높은 밀도로 리간드 고정화 부위를 갖는 기질의 그것과 동등하거나 그 이상의 산업상 유용성을 갖는다.
하나의 바람직한 구체예에서, 연결(linker) 분자가 기질 상에 주어진다. 리간드는 연결 분자 상에 노출된 기능적 그룹과 반응한다. 바람직한 예에서, 리간드는 그의 끝에 아미노 그룹 또는 카복실 그룹을 갖고, 연결 분자는 리간드의 끝과 반응하는 아미노 그룹 또는 카복실 그룹을 갖는다.
생성된 기질은, 예를 들어, 생물학적 활성을 위한 많은 수용체의 스크리닝을 포함하는 다양한 용도를 갖는다. 기질은 생물학적 활성을 스크리닝하기 위하여 하나 이상의 수용체에 노출된다. 수용체는 예를 들어, 항체, 전체 세포, 소포체 상의 수용체, 지질 또는 다른 다양한 수용체로부터 선택된 것일 수 있다. 수용체는 바람직하게는 예를 들어, 형광 표지, 방사능 표지 또는 수용체와 반응하는 표지된 항체로 표지된다. 예를 들어, 기질 상의 표지의 위치는 광자 검출 방법 또는 오토래디오그래피(autoradiography) 방법으로 검출된다. 본 발명을 제한하려고 의도되지 않을 지라도, 예를 들어, 하나의 형광 표지가 검출을 위하여 사용될 수 있다. 이 경우에, 수용체의 존재는 하나의 형광 표지된 복수의 시험 샘플을 개별적으로 본 발명의 복수의 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질과 반응시키고, 그 다음 고속으로 복수의 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질 상의 형광 신호를 동시에 또는 개별적으로 검출함으로써 시험 샘플 중에서 비교되거나 분석될 수 있다. 분석을 둘 이상의 형광 표지를 사용하여 수행될 수 있다.
게다가, 수용체와 기질 상에 고정되는 리간드 간의 결합은 수용체를 표지하기 위하여 사용되는 자기 물질의 자기장을 검출함으로써 검출될 수 있다.
따라서, 본 발명은 수용체와 기질 상의 예정된 부위에 고정된 리간드 간의결합이 수용체를 표지하기 위하여 사용되는 자기 물질의 자기장을 검출함으로써 검출되는 리간드와 수용체의 결합의 검출 방법을 제공한다.
예를 들어, 이 방법에서, 수용체는 수용체에 결합하는 기능적 그룹을 갖는 연결 분자에 결합하거나 연결 분자로 코팅된 소자화된(demagnetized) 자기 미세입자로 표지된다.
소자된 자기 미세입자로 표지된 수용체가 리간드에 노출된 후에, 리간드에 결합하지 않은 수용체는 세척되고 제거된다.
리간드에 결합한 수용체에 부착된 자기 미세입자는 적절한 수준의 자기장에 노출시킴으로써 재자화된다(re-magnetized).
따라서, 리간드 및 수용체 간의 결합은 재자화된 자기 미세입자의 자기장을 검출함으로써 검출 가능하다.
단단한 자기 물질은 본 발명에 따른 자기 미세입자로서 사용 가능하다. 본 발명을 제한하는 것을 의도하지 않는다고 할지라도, 침상 물질을 형성하는 마그네타이트(magnetit; Fe3O4) 또는 마그헤마이트(maghemite; 감마 Fe2O3)의 성장하는 미세입자에 의해 제조된 자기 분말은 단단한 자기 물질으로서 사용 가능하다. 고도로 정확한 검출은 높은 자기 포화점을 갖는 단단한 자기 물질 또는 가열 소자화 하지 않은 단단한 자기 물질을 사용하여 수행 가능하다. 임의로, 소수성 결합을 통하여 부착된 자기 물질을 갖는 수용체가 사용될 수 있을 것이다. 자기 물질은 소자화 없이 사용될 수 있을 것이다. 미생물로부터 유래된 자기 물질이 사용될 수 있을 것이다.
수용체에 결합하는 리간드는 결합이 검출되는 위치의 리간드에 관한 정보를 통하여 고속으로 결정 가능하다. 따라서, 많은 수용체가 이 기술을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 본 발명의 다른 가능한 용도는 진단을 포함한다. 이 경우에, 특이적인 수용체에 대한 다양한 리간드는 기질 상에 위치되고, 수용체의 비정상과 관련된 질병은 시험 샘플에서의 수용체의 존재에 기초하여 진단된다.
리간드와 수용체의 결합의 결정은 본 발명의 두 번째 면의 리간드와 수용체의 결합을 결정하기 위한 장치를 사용함으로써 자동화 가능하다. 장치는 표면 상에 예정된 부위에 고정된 복수의 상이한 리간드를 갖는 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질 상의 리간드 및 시험 샘플에서의 수용체간의 결합을 검출하기 위한 것이고:
a) 기질을 적어도 하나의 리간드에 결합하는 수용체에 노출시키는 수단; 및
b) 기질 상의 수용체와 적어도 하나의 리간드의 결합 부위를 검출하는 수단
을 포함한다.
예를 들어, 장치는 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질의 이동 수단, 전-전하이브리디제이션(pre-prehybridization) 베쓰, 전하이브리디제이션 베쓰, 표지된 수용체 베쓰, 세척 베쓰, 건조 수단, 리간드 및 수용체간 결합의 검출 수단, 리간드와 수용체의 결합에 대한 데이터를 분석하기 위한 컴퓨터로 구성될 수 있다. 하나의 베쓰 또는 복수의 베쓰는 개별적 베쓰로서 역할을 한다.
도 1은 본 발명의 대표적인 검출 장치의 구조를 예시한다. 고정된 리간드를 갖는 테이프-형 기질(10)을 테이프-형 기질의 이동 수단(20)의 도움으로사전처리(pretreatment)를 위하여 전-전하이브리디제이션 베쓰(30)로 이동시키며, 이는 롤러(21)에 의하여 구동된다. 사전 처리된 기질은 전하이브리디제이션 베쓰(40)로 이동시키고 다음 표지된 수용체 베쓰(50)로 이동시킨다. 리간드와 수용체의 결합은 표지된 수용체 베쓰에서 발생한다. 기질은 세척 베쓰Ⅰ(60)에서 다음 세척 베쓰Ⅱ(70)에서 세척된다. 세척 후에, 기질은 세척을 위한 이동 수단(80)의 도움으로 이동되고 건조 수단(90)을 사용하여 건조된다. 다음 기질은 리간드와 수용체의 결합을 검출하기 위한 이동 수단(100)의 도움으로 이동된다. 리간드와 수용체의 결합은 리간드와 수용체의 결합의 검출 수단(110)을 사용하여 검출된다. 검출된 결합에 대한 정보는 리간드와 수용체의 결합에 대한 데이터를 분석하기 위한 컴퓨터(120)을 사용하여 분석된다.
카세트는 하나의 베쓰가 개별적 베쓰로 역할을 하는 장치의 좋은 예이다. 카세트는 베쓰로서 기능을 하고 입구 및 출구를 갖는 용기에서, 코드- 또는 테이프-형 기질 및 감는 수단의 조합, 또는 디스크-형 기질 및 회전 수단의 조합을 포함한다. 이 경우에, 예를 들어, 사전 처리 단계부터 세척 단계까지의 과정은 유체를 교환하면서 카세트에서 수행된다. 다음, 감는 또는 회전시키는 수단의 도움으로 기질을 이동시키면서 카세트는 기질을 건조시키고 리간드와 수용체의 결합을 검출하는 건조/검출 수단을 갖춘다.
또한, 리간드와 수용체의 결합의 결정은 본 발명의 세 번째 면의 리간드와 수용체의 결합을 결정하기 위한 장치를 사용하여 자동화 가능하다. 장치는 표면에 예정된 부위에 복수의 상이한 리간드가 고정된 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질 상의 리간드와 시험 샘플에서의 수용체간의 결합을 검출하기 위한 것이고: 기질 상의 수용체와 리간드의 결합 부위를 검출하는 수단을 포함한다.
이 장치가 사용된다면, 이전의 수용체를 기질 상의 리간드에 결합시키는 단계를 거친 기질을 사용하는 것이 편리하다.
수용체를 기질 상의 리간드와 결합시킨 후에, 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질은 리간드가 고정되는 부위를 포함하도록 제조될 수 있을 것이다. 다음, 그 부위를 장치를 사용하여 검출한다.
장치를 사용하여 측정하는데 필요한 시간은 장치에서 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질의 이동 속도를 조정함으로써 조절될 수 있다. 따라서, 리간드와 수용체의 결합은 더 고속으로 결정 가능하다.
본 출원서는 개선된 검출 장치 및 개선된 검출 방법을 개시한다. 복수의 리간드가 표면의 알려진 위치에 고정되는 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질은 검출 방법 및 장치를 위해 사용된다. 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질은, 예를 들어, 연속적인 방법으로 수용체(예를 들어, 형광 표지된 수용체)에 노출된다. 수용체는 하나 또는 몇 개의 리간드에 결합한다. 만약 유니트로서 일 그룹의 리간드의 여러 세트가 반복되는 방법으로 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질 상에 고정된다면, 각 그룹의 리간드는 유니트로서 복수의 수용체 각각에 노출될 것이다. 달리 말해서, 장치가 복수의 표지된 수용체 베쓰를 갖는다면, 유니트로서의 각 그룹은 각 표지된 수용체에 노출될 수 있다. 다음 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질은 결합의 위치를 동정하기 위한 검출기(예를 들어, 현미경 검출기)에 연속적으로위치된다. 현미경 검출기는 빛을 기질로 보내는 광원, 검출 수단, 예를 들어, 기질로부터의 형광, 및 형광의 위치를 결정하는 수단을 포함한다. 리간드와 수용체의 결합을 전기적, 시간적으로 검출하는 검출기가 사용될 수 있을 것이다. 검출된 신호의 배경에 대한 신호 비율(신호 대 잡음 비율)은 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질을 신호를 통합하는 여러 번의 측정을 하게 함으로써 개선 가능하다.
코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질 상의 형광을 검출하는 수단의 예는 광자 카운터(counter)를 포함한다. 리간드와 수용체의 결합의 위치의 결정 수단이 고정될 수 있을 것이고, 코드- 테이프- 또는 디스크-형 기질이 그것을 통과하게 된다. 또한, 그것은 X-Y 운동이 가능할 것이다. 검출기를 통과한 코드- 테이프- 또는 디스크-형 기질로부터 수집한 데이터는 적절하게 프로그램된 디지털 컴퓨터를 이용하여 기록되고, 분석된다.
발명의 목적
본 발명의 주요 목적은 다양한 리간드와 수용체의 결합에 대한 정보를 고속으로 연속적으로 분석하기 위해 고정된 다양한 리간드를 갖는 코드(cord)-, 테이프(tape-) 또는 디스크(disk)-형의 기질뿐만 아니라 기질을 이용하는 장치를 제공하는 것이다.
발명의 요약
본 발명은 하기와 같이 개요된다. 본 발명의 첫 번째 면은 기질의 표면 상의 예정된 부위에 복수의 상이한 리간드가 고정된 코드-, 테이프-, 또는 디스크-형의 기질에 관한 것이다.
하나의 구체예에서, 리간드의 예는 핵산, 당류, 펩티드 또는 단백질이다. 핵산의 예는 이중 나선 DNA 또는 단일 나선 DNA이고, DNA의 예는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드이다. 기질은 바람직하게는 리간드와 리간드에 결합하는 능력을 갖는 수용체의 결합을 고속으로 검출하는데 사용될 수 있는 것이다. 본 발명의 기질의 예는 기질 상의 부위(region) 간의 거리가 적어도 1mm, 기질 상의 부위의 밀도가 100 부위/cm2미만, 기질 상의 부위의 밀도가 10 부위/cm2미만, 기질 상의 부위의 수가 100 이상, 또는 기질 상의 부위의 수가 1000 이상인 것이다. 수용체의 예는 핵산, 당류, 펩티드 또는 단백질에 결합하는 능력을 갖는 핵산, 당류, 펩티드 또는 단백질이다. 표지된 수용체가 수용체로 사용 가능하다.
본 발명의 두 번째 면은:
a) 복수의 상이한 리간드가 기질 표면 상의 예정된 부위에 고정되는 코드-, 테이프-, 또는 디스크-형의 기질;
b) 기질을 적어도 하나의 리간드에 결합하는 수용체에 노출시키는 수단; 및
c) 기질 상의 수용체와 적어도 하나의 리간드의 결합 부위를 검출하는 수단을
포함하는, 리간드와 수용체의 결합을 검출하기 위한 장치에 관한 것이다.
본 발명의 세 번째 면은 수용체와 기질 표면 상의 예정된 부위에 고정되는복수의 상이한 리간드 중 하나간의 결합 부위를 고속으로 검출하는 수단을 포함하는, 리간드와 수용체의 결합을 검출하는 장치에 관한 것이다.
본 발명의 네 번째 면은:
a) 기질 표면 상의 예정된 부위에 복수의 상이한 리간드가 고정된 코드-, 테이프-, 또는 디스크-형의 기질을 적어도 하나의 리간드에 결합하는 수용체에 노출시키고;
b) 기질 상의 수용체와 적어도 하나의 리간드의 결합 부위를 검출하는 것을
포함하는, 리간드와 수용체의 결합을 검출하는 방법에 관한 것이다.
두 번째 내지 네 번째 면에서, 첫 번째 면의 기질을 사용하는 것이 바람직하다. 표지된 수용체를 사용하여, 기질 상의 수용체와 리간드의 결합 부위는 표지에 의하여 검출 가능하다. 수용체로서, 리간드와 같이 핵산, 당류, 펩티드 또는 단백질에 결합하는 능력을 갖는 핵산, 당류, 펩티드 또는 단백질을 사용하는 것이 바람직하다.
하기의 실시예는 본 발명을 자세하게 추가로 예시하지만 그의 범위를 제한하지는 않는다.
실시예 1
(1) 내분비 교란물질(endocrine disruptors)에 의해 영향받는 유전자에 대하여 조사를 수행하였다. 특히, 33개의 유전자가 잠재적으로 내분비 교란물질에 의해 영향받는 일 그룹의 유전자로부터 선택되었다.그 유전자는 표 1에 표시하였다.
표 1
유전자 번호 고정된 유전자의 명칭(유전자 생성물 명칭) 프라이머의 조합(서열 번호)
1234567891011121314151617181920212223242526272829303132333435 Smad3VEGF 수용체ACTRN-Cor/SMRTefpc-Myc-1비타민 D 수용체카텝신 Gc-Myc-2BaxJNK1p38TRIP 1ARA 70인슐린 수용체NGF 수용체PDGF 수용체CSF1 수용체-1CSF1 수용체-2FGF 수용체p38 감마Bcl-Xc-Myc-3pS2 단백질락토페린RIP 140TIF2JNK2Bax 델타BMK-1BMK-2Src-1p300/CBPβ-액틴 (양성 대조군)pBR 322 (음성 대조군) 1, 23, 45, 67, 89, 1011, 1213, 14CAP *15, 1617, 1819, 2021, 2223, 2425, 2627, 28CAP *29, 30CAP *31, 3233, 3435, 3637, 3839, 4041, 4243, 4445, 4647, 4849, 5051, 5253, 5455, 5657, 5859, 6061, 62
* CAP :상업적으로 이용가능한 프라이머.
표 1에 기재된 유전자 또는 그의 DNA 단편은 하기와 같이 제조된다. 고정된, 특정의 접근 번호 하에서 제출된, 유전자의 뉴클레오티드 서열, 또는 유전자 생성물을 위한 유전자에 대한 정보는 GenBank로부터 입수하였다. PCR 증폭을 위한 프라이머 쌍을 정보에 기초하여 제작하였다. OLIGOTM프라이머 분석 소프트웨어 (Takara Shuzo)가 소프트웨어의 파라미터를 설정하는 제조를 위해 사용되었고, 본 발명의 방법에 최적인, 약 100b 내지 약 1kb의 DNA 단편을 생성했다. 그 다음 결정된 뉴클레오티드 서열에 따른 DNA 합성기를 사용하여 프라이머를 합성하였다. 카텝신(cathepsin) G, NGF 수용체와 CSF1 수용체 유전자를 위하여, Human UniGene DNA 세트(Research Genetics)에 함유되어 있는 개별 유전자에 대한 프라이머를 사용하였다.
관심있는 PCR 증폭 단편은 주형(template)으로서 프라이머 쌍뿐만 아니라 게놈 DNA, 게놈 DNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리를 사용하는 상업적으로 이용가능한 PCR 키트에 부착된 표준 프로토콜에 따라 얻어진다. 얻은 DNA 단편을 SUPREC-02 (Takara Shuzo)를 사용하여 정제하였다. 만약 관심의 단편이라면 증폭된 cDNAs의 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위하여 분석하였다. 증폭된 단편 각각은 에탄올 침전에 의하여 회복되었고 1μM의 농도에서 100 mM 탄산염 버퍼 (pH 9.5)에 용해되었다. 또한, 양성 대조군으로서 하우스키핑(housekeeping) 유전자, β-액틴 유전자를 유사한 방법으로 제조하였다. 플라스미드 pBR322 DNA를 음성 대조군으로서 사용하였다.
함유하는 다섯 개의 일련의 희석물이 각각의 정제된 DNA 단편의 부위를 50 mM 탄산염 버퍼 (pH 9.5)에 용해하고 농도를 결정하기 위하여 260 nm에서 흡광도를 측정한 후에 각각의 정제된 DNA 단편에 대하여 제조되었다. 각 희석물은 0.1 내지 0.5 mg/ml 범위의 농도로 DNA 단편을 함유하였다. 하기와 같이 알칼리 변성을 위해사용되는 샘플이 제조되었고 처리는 상기와 같은 농도를 생성하였다.
그 자체 또는 각각의 샘플을 0.5 M 염화나트륨을 함유하는 0.25 N 수산화나트륨(Nacalai Tesque)에 첨가한 후에 각각의 샘플을 10분 동안 실온에서 방치하였고, 다음 얼음 베쓰에서 냉각시켰다. DNA 용액은 GMS 417 배열기 (Genetic MicroSystems, GMS)를 사용하여 코드- 테이프- 또는 디스크-형 기질 상에 배치했다. 코드-형 기질을 나이론 막, 하이본드-N(Hybond-N) (Amersham) 및 유전자 스크린 플러스(Gene Screen Plus) (NEN)의 두 유형 중 하나를 1 mm 폭 및 1 m 길이의 조각으로 절단하고 조각을 꼬아서 코드를 만들어서 제조하였다. 샘플을 1 mm 이상의 간격으로 코드 상에 배치시켜 직경 0.1 mm의 점이 만들어졌다. 알칼리 변성을 갖거나(35 × 5 = 175 점) 알칼리 변성을 갖지 않는(35 × 5 = 175 점) 35개의 DNA 단편의 5개의 일련의 희석물 중의 두 그룹은 반복되는 방법으로 배치되었다. 두 유형의 나이론 막, 하이본드-N(Hybond-N) (Amersham) 및 유전자 스크린 플러스(Gene Screen Plus) (NEN)는 테이프-형 기질로서 사용되었다. 막은 1 cm 폭 및 1 m 길이의 테이프로 절단되었고 테이프-형 기질을 제조하였다. 샘플은 점(직경 0.1 mm)의 배열을 형성하기 위하여 테이프 상에 배치되었다. 배열은 5개의 종(column) 및 700개의 열(rows)을 포함한다(175 열의 4 그룹). 특히, 알칼리 변성을 갖거나(35 × 5 = 175 점) 알칼리 변성을 갖지 않는(35 × 5 = 175 점) 35개의 DNA 단편의 5개의 일련의 희석물 중의 두 그룹의 세트는 반복되는 방법으로 배치되었다. 반면, 디스크-형 기질의 경우, 알칼리 변성을 갖거나(35 × 5 = 175 점) 알칼리 변성을 갖지 않는(35 × 5 = 175 점) 35개의 DNA 단편의 5개의 일련의 희석물 중의 두 그룹은반복되는 방법으로 φ 87-mm 디스크-형 나일론 막, 하이본드-N(Hybond-N) (Amersham) 상에 배치되었다.
상기와 같이 DNA 단편이 배치되는 각 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질은 30분 동안 실온에서 방치하였고, 0.5 M 염화나트륨을 함유하는 0.5 M 트리스-염화수소 (pH 7.5)에서 세척하고 다음 2 × SSC (Sako Pure Chemical Industries)에서 헹구었다. DNA를 고정하기 위하여 투조기(transilluminator) (Cosmo Bio)를 사용하여 약 2분 동안 UV 방사를 했다. 따라서, 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질 상의 DNA 배열을 제조하였다.
(2) 배양된 세포에서 다양한 내분비 교란물질의 영향을 조사하였다.
인간 유방암 MCF-7 세포는 10% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 DME 배지에서 성장되었다. 트립신화(trypsinization)한 후에, 2×106개의 세포를 10-cm 접시에 배치시켰다. 세포를 활성된 카본-덱스트란으로 처리하여 스테로이드 호르몬이 제거된 5% 소 태아 혈청을 함유하는 DME 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후에, 세포는 10 nM의 농도의 디에틸스틸베스트롤 (DES)를 함유하는 동일한 배지에서 2시간 동안 배양되었다. 화학 물질이 없이 유사한 방법으로 배양된 세포는 대조군으로서 제조되었다. 총 RNA는 처리 후에 회복한 각각의 세포로부터의 TRIzol 시약 (Gibco-BRL)을 사용하여 제조되었다.
(3) 상기 (2)에서 제조된 총 RNA를 DNase로 처리하였다. 약 100 내지 약 300 μg의 총 RNA, 10 μl의 10 × AMV 버퍼 (Life Science) 및 10 U의 DNaseⅠ (Takara Shuzo)를 함유하는 12 μl의 반응 혼합물을 제조하였고, 10분 동안 37℃에서 배양하였고, 2회의 페놀-클로로포름 추출에 이어 에탄올 침전을 하였다. 농도는 생성된 총 RNA 부위를 사용하여 결정되었다.
(4) 상기 (3)에서 제조된 총 RNA를 사용하여 역전사 반응이 수행되었다. 반응 혼합물의 조성은 하기에 나타낸다:
반응 혼합물 A: 약 130 μg의 총 RNA, 10 μg의 올리고(dT) 프라이머 (Takara Shuzo) 및 디에틸피로카보네이트 (DEPC, Wako Pure Chemical Industries)로 처리된 20 μl의 물; 및
반응 혼합물 B: 12 μl의 5 × AMV RTase 버퍼 (Life Science), 0.5 mM의 각 dATP, dCTP 및 dGTP, 0.2 mM의 dTTP, 60 U의 RNase 억제제 (Takara Shuzo), 0.1 mM의 Cy3-표지된 dUTP (Amersham Pharmacia).
반응 혼합물 A를 10분 동안 70℃에서 배양하고, 다음 얼음 베쓰에서 냉각하였다. 반응 혼합물 B를 거기에 첨가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 42℃에서 배양하였다. 약 60 U의 AMV RTase (Life Science)를 추가로 거기에 첨가하여, 60 μl의 총 반응 부피를 생성하였다. RT 반응 혼합물을 70분 동안 42℃에서 배양하였다. 7.5 μl의 500 mM DETA 용액 및 15 μl의 1 M 수산화나트륨을 반응 혼합물에 첨가하였다. 주형 RNA를 분해하기 위해 생성된 혼합물을 1시간 동안 60 ℃에서 배양하였다. 실온까지 냉각한 후에, 거기에 37.5 μl의 1 M 트리스-염화수소 (pH 7.5)를 첨가하였다. 생성된 용액은 MicroconTM-30 (Millipore)를 사용하여 20 μl의 부피까지 농축하였다. 거기에 1 mM EDTA 용액을 함유하는 200 μl의 10 mM 트리스-염화수소를 첨가한 후에, 혼합물을 다시 20 μl의 부피까지 농축하였다. 하기의 하이브리디제이션을 위하여 이 Cy3-표지된 DNA 용액을 사용하였다.
(5) 상기 (1)에서와 같이 제조된 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질을 1분 동안 2 × SSC로 투과시키고, 그 다음, 4 × SSC, 0.2% SDS 및 100 μg/ml 연어 정자 DNA를 함유하는 용액에서 1시간 동안 40℃에서 전하이브리디제이션 하였다. 다음, 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질 상의 DNA 배열을 하이브리디제이션 용액에서 밤새도록 40℃에서 배양하였다. 하이브리디제이션 용액은 상기 (4)에서 제조된 Cy3-표지된 표적 DNA를 가열-변성하고 그것을 4 × SSC, 0.2% SDS 및 100 μg/ml 연어 정자 DNA를 함유하는 용액에서 부유시켜 제조하였고 열-변성된 표적 DNA의 농도는 약 10 μg/ml가 되었다. 하이브리디제이션 후에, 기질을 2 × SSC, 0.1% SDS를 함유하는 용액에서 5분 동안 실온에서 두 번 세척하였고, 0.1 × SSC 및 0.1% SDS를 함유하는 용액에서 15분 동안 68℃에서 두 번 세척하였다. 기질 상의 각각의 점으로부터의 형광 신호는 하기와 같이 측정되었다. 기질을 형광 검출기에 보냈다. 검출기는 연속적인 방법으로 하나의 짧은 측면(코드- 또는 테이프-형 기질의 경우)로부터 또는 어떤 측정 출발점(디스크-형 기질의 경우)으로부터 측정하는데 사용될 수 있다. 다음 표지된 수용체와 리간드간의 결합을 분석하였다. 기질 상의 배열의 분석의 결과는 내분비 교란물질로 처리된 샘플에 대한 형광 신호 수치를 대조군에 대한 형광 신호 수치로 나눔으로써 수적으로 표현되었다. 만약 계산된 수치가 1.00보다 크다면, 유전자의 발현은 내분비 교란물질의 처리에 의하여 증진된다. 반면, 수치가 1.00보다 작으면, 발현은 처리에 의하여 억제된다. 수치가 1.00과 같으면, 유전자는 물질의 처리에 의하여 영향을 받지 않는다.
상기 분석에 따라, N-COR/SMRT 및 ARA 70 (핵 수용체와 핵 수용체 전사의 결합 인자), p38r, JNK2 및 BMK (키나제-형 신호 전달 인자), 및 PDGF 수용체 (수용체-형 키나제)에 대한 분석적 수치는 1.00 보다 작았다. 따라서, 이런 유전자의 발현은 내분비성-교란 작용을 나타내는 DES의 자극에 반응하여 억제된다는 것이 확인되었다. 또한, 배치(spotting) 이전의 단일 사슬으로의 변성은 더 강한 신호 강도를 생성하는 것이 확인되었다. 또한, 본 발명에 따른 두 나이론 막, 하이본드-엔(Hybond-N) 및 유전자 스크린 플러스(Gene Screen Plus)를 사용하여 유사한 결과를 얻었다. 상기와 같이, 내분비 교란물질에 의해 잠재적으로 영향을 받는 유전자의 발현에 대응하는 신호에서의 놀라운 변화를 본 발명의 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질을 사용하여 관측할 수 있었다. 따라서, 내분비 교란물질에 의해 영향 받는 유전자는 검출되고 동정될 수 있었다.
실시예 2
(1) 코드- 또는 테이프-형 기질의 운반 수단, 전-전하이브리디제이션 베쓰, 전하이브리디제이션 베쓰, 표지된 수용체 베쓰, 세척 베쓰 Ⅰ, 세척 베쓰 Ⅱ, 건조 수단, 리간드와 수용체의 결합의 검출 수단뿐만 아니라, 리간드와 수용체의 결합에 대한 데이터를 분석하기 위한 컴퓨터로 구성된 장치가 제조되었다. 리간드와 수용체의 결합은 실시예 1(1)에서 제조된 코드-, 또는 테이프-형 기질을 연속적으로 이동시켜 장치를 사용하여 연속적으로 결정되었다. 전-전하이브리디제이션 베쓰는 2 × SSC 용액을 함유하였다. 전하이브리디제이션 베쓰는 4 × SSC, 0.2% SDS 및 100μg/ml 연어 정자 DNA를 함유하는 용액을 함유하였다. 표지된 수용체 베쓰는 하이브리디제이션 용액을 함유하였다. 하이브리디제이션 용액은 실시예1(4)에서 제조된 Cy3-표지된 표적 DNA를 가열-변성하고 그것을 4 × SSC, 0.2% SDS 및 100 μg/ml 연어 정자 DNA를 함유하는 용액에서 부유시켜 제조하였고 가열-변성된 표적 DNA의 농도가 약 10 μl/ml가 됨으로써 제조된다. 세척 베쓰 Ⅰ은 2 × SSC 및 0.1% SDS를 함유하는 용액을 함유하였다. 세척 베쓰 Ⅱ는 0.1 × SSC 및 0.1% SDS를 함유하는 용액을 함유하였다.
(2) 실시예 1(1)에서 제조된 테이프-형 기질을 장치에 설치했고, 실온에서 한 짧은 측면으로부터 전-전하이브리디제이션 베쓰를 통과시켰다. 그것을 약 1시간 동안 40℃에서 전하이브리디제이션 베쓰에 놓아 두었고, 1시간 동안 배양하였다. 다음 기질을 40℃에서 Cy3-표지된 표적 DNA(수용체)를 함유하는 표지된 수용체 베쓰에 놓아 두었고 밤새도록 배양하였다. 기질을 실온에서 세척 베쓰 Ⅰ, 다음 68℃에서 세척 베쓰 Ⅱ를 통과시켜 세척하였다. 세척 후에, 테이프-형 기질을 각각의 점으로부터의 형광 신호를 측정하기 위하여 형광 검출기로 보냈다. 다음 표지된 수용체와 리간드간의 결합을 분석하였다. 결과적으로, 실시예 1에서 얻어진 것과 유사한 결과를 얻었다.
(3) 상기 (2)에서 기술된 과정을 실시예 1(1)에서 제조된 디스크-형 기질을 사용하여 장치에서 수행하였다. 장치는 코드- 또는 테이프-형 기질의 운반 수단 대신에 디스크-형 기질의 운반수단을 갖는 것을 제외하고는 상기 (1)에서 기술된 것과 유사하였다. 디스크-형 기질 상의 각각의 점으로부터의 형광 신호를 측정하였다. 다음 표지된 수용체와 리간드간의 결합을 분석하였다. 결과적으로, 실시예 1에서 얻어진 것과 유사한 결과를 얻었다.
본 발명은 리간드와 수용체의 결합을 고속으로 연속적으로 결정하기 위한 기질 및 측정 장치를 제공한다. 본 발명은 생화학, 진단학 등의 다양한 분야에서 유용한, 고정된 핵산, 당류, 단백질 또는 펩티드를 갖는 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질을 제공한다. 또한, 리간드와 수용체의 결합은 기질 상의 단위 부위에서 리간드의 밀도의 증가없이 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질을 사용함으로써 고속으로 결정 가능하다. 따라서, 본 발명은 고속으로 리간드와 수용체의 결합의 검출을 가능하게 한다. 기질 상의 밀도가 증가될 지라도 빠른 속도의 검출은 효과를 초래한다. 따라서, 낮은 밀도의 리간드 고정 부위를 갖는 기질을 사용하여 높은 밀도의 기질을 사용에 의해 달성되는 것과 동등하거나 그 이상의 효과를 초래한다. 이 기질은 적은 비용으로, 정확하고 편리하게 제조 가능하다. 또한, 리간드가 본 발명에 따른 라인에 위치하기 때문에, 검출기는 단지 리간드와 수용체의 결합의 존재를 검출하기만 하면 되고, 검출기를 사용하여 표지된 물질의 검출에 대한 이차 스캐닝을 수행할 필요가 없다. 본 발명은 또한 이 점에서 매우 편리하다.
서열 목록 프리 텍스트
서열 번호 1 : Smad3 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 2 : Smad3 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 3 : VEGF 수용체 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 4 : VEGF 수용체 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 5 : ACTR 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 6 : ACTR 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 7 : N-CoR/SMRT 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 8 : N-CoR/SMRT 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 9 : efp 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 10 : efp 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 11 : c-Myc-1 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 12 : c-Myc-1 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 13 : 비타민 D 수용체 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 14 : 비타민 D 수용체 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 15 : c-Myc-2 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 16 : c-Myc-2 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 17 : Bax 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 18 : Bax 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 19 : JNK1 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 20 : JNK1 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 21 : p38 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 22 : p38 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 23 : TRIP 1 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 24 : TRIP 1 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 25 : ARA 70 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 26 : ARA 70 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 27 : 인슐린 수용체 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 28 : 인슐린 수용체 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 29 : PDGF 수용체 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 30 : PDGF 수용체 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 31 : CSF1 수용체-2 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 32 : CSF1 수용체-2 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 33 : FGF 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 34 : FGF 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 35 : p38 감마 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 36 : p38 감마 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 37 : Bcl-X 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 38 : Bcl-X 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 39 : c-Myc-3 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 40 : c-Myc-3 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 41 : ps2 단백질 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 42 : ps2 단백질 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 43 : 락토페린 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 44 : 락토페린 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 45 : RIP 140 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 46 : RIP 140 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 47 : TIF2 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 48 : TIF2 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 49 : JNK2 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 50 : JNK2 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 51 : Bax 델타 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 52 : Bax 델타 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 53 : BMK-1 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 54 : BMK-1 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 55 : BMK-2 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 56 : BMK-2 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 57 : Src-1 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 58 : Src-1 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 59 : p300/CBP 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 60 : p300/CBP 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 61 : β-액틴 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 62 : β-액틴 유전자 부분을 증폭하기 위한 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.

Claims (28)

  1. 표면 상의 예정된 부위에 복수의 상이한 리간드가 고정된 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질.
  2. 제 1 항에 있어서, 리간드가 핵산, 당류, 펩티드 또는 단백질인 기질.
  3. 제 2 항에 있어서, 핵산이 이중 사슬 DNA이거나 단일 사슬 DNA인 기질.
  4. 제 3 항에 있어서, DNA가 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드인 기질.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드와 리간드에 결합하는 능력을 갖는 수용체의 결합을 고속으로 검출하는데 사용될 수 있는 기질.
  6. 제 5 항에 있어서, 부위간의 거리가 적어도 1mm인 기질.
  7. 제 5 항에 있어서, 부위의 밀도가 100 부위/cm2미만인 기질.
  8. 제 5 항에 있어서, 부위의 밀도가 10 부위/cm2미만인 기질.
  9. 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질 상의 부위 수가 100 이상인 기질.
  10. 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질 상의 부위 수가 1000 이상인 기질.
  11. 제 5 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 수용체가 핵산, 당류, 펩티드 또는 단백질인 기질.
  12. 제 11 항에 있어서, 수용체가 표지된 수용체인 기질.
  13. a) 표면 상의 예정된 부위에 복수의 상이한 리간드가 고정된 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질;
    b) 기질을 적어도 하나의 리간드에 결합하는 수용체에 노출시키는 수단; 및
    c) 기질 상의 수용체와 적어도 하나의 리간드의 결합 부위를 검출하는 수단
    을 포함하는, 리간드와 수용체의 결합을 검출하기 위한 장치.
  14. 제 13 항에 있어서, 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질이 제 2 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 의하여 정의되는 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질인 장치.
  15. 제 14 항에 있어서, 수용체가 표지된 수용체인 장치.
  16. 제 15 항에 있어서, 기질 상의 수용체와 하나의 리간드의 결합 부위가 표지에 의해 검출되는 장치.
  17. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 수용체가 핵산, 당류, 펩티드 또는 단백질인 장치.
  18. 수용체와 표면 상의 예정된 부위에 리간드가 고정된 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질 상의 복수의 상이한 리간드 중 하나의 결합 부위를 고속으로 검출하는 수단을 포함하는, 리간드와 수용체의 결합을 검출하기 위한 장치.
  19. 제 16 항에 있어서, 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질이 제 2 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 의해 정의된 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질인 장치.
  20. 제 19 항에 있어서, 수용체가 표지된 수용체인 장치.
  21. 제 20 항에 있어서, 기질 상의 수용체와 리간드의 결합 부위가 표지에 의해 검출되는 장치.
  22. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서, 수용체가 핵산, 당류, 펩티드 또는 단백질인 장치.
  23. a) 표면의 예정된 부위에 복수의 상이한 리간드가 고정된 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질을 적어도 하나의 리간드에 결합하는 수용체에 노출시키고;
    b) 기질 상의 수용체와 적어도 하나의 리간드의 결합 부위를 검출하는 것을
    포함하는, 리간드와 수용체의 결합을 검출하기 위한 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질이 제 2 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 의해 정의된 코드-, 테이프- 또는 디스크-형 기질인 방법.
  25. 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 기질 상의 수용체와 리간드의 결합 부위가 고속으로 검출되는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 수용체가 표지된 수용체인 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 기질 상의 수용체와 리간드의 결합 부위가 표지에 의해검출되는 방법.
  28. 제 26 항 또는 제 27 항에 있어서, 수용체가 핵산, 당류, 펩티드 또는 단백질인 방법.
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