JP2005110666A - Pcr増幅とハイブリダイゼーションプロービングアッセイを組み合わせた方法およびそのための試薬 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 標的核酸配列を、少なくとも2つのPCRプライマーおよび5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に全て欠くポリメラーゼ酵素を含むPCR試薬、ならびにオリゴヌクレオチド;オリゴヌクレオチドの第1位置に付着した蛍光物質分子;オリゴヌクレオチドの第2位置に付着した消光物質分子;およびポリメラーゼの5'→3'伸長活性を受けないようにされた3'末端を含むオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程;ならびに標的核酸配列、オリゴヌクレオチドプローブおよびPCR試薬を、PCR試薬により特定される標的核酸配列を増幅するに十分な熱循環に供する工程を包含するPCR増幅およびハイブリダイゼーションプロービングを組み合わせて行なう方法。
【選択図】 なし
Description
好適な実施形態においては、前記オリゴヌクレオチドの前記第1の末端が5’末端である。
標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド;
オリゴヌクレオチドの第1の末端に付着した蛍光物質分子;
オリゴヌクレオチドの第2の末端に付着した消光物質分子であって、これにより、オリゴヌクレオチドプローブが1本鎖状態である場合はいつも、消光物質分子が、蛍光物質分子の蛍光を実質的に消光し、そしてオリゴヌクレオチドプローブが2本鎖状態である場合はいつも、蛍光物質が実質的に消光されない、消光物質分子;
ポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性による消化を受けないようにされた5’末端;および
ポリメラーゼの5’→3’伸長活性を受けないようにされた3’末端、
を含むオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程;および
標的核酸配列、オリゴヌクレオチドプローブ、およびPCR試薬を、重合化工程を含む熱循環に供する工程であって、熱循環はPCR試薬により特定される標的核酸配列を増幅するに十分である、工程、を包含する、方法である。
標的核酸配列を、少なくとも2つのPCRプライマーおよび5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に全て欠くポリメラーゼ酵素を含むPCR試薬、ならびに以下のもの:
オリゴヌクレオチド;
オリゴヌクレオチドの第1の末端に付着した蛍光物質分子;
オリゴヌクレオチドの第2の末端に付着した消光物質分子であって、これにより、オリゴヌクレオチドプローブが1本鎖状態である場合はいつも、消光物質分子が、蛍光物質分子の蛍光を実質的に消光し、そしてオリゴヌクレオチドプローブが2本鎖状態である場合はいつも、蛍光物質が実質的に消光されない、消光物質分子;および
ポリメラーゼの5’→3’伸長活性を受けないようにされた3’末端、
を含むオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程;および
標的核酸配列、オリゴヌクレオチドプローブ、およびPCR試薬を、PCR試薬により特定される標的核酸配列を増幅するに十分な熱循環に供する工程、を包含する、方法である。
標的核酸配列を、少なくとも2つのPCRプライマーおよびポリメラーゼ酵素を含むPCR試薬、ならびに以下のもの:
オリゴヌクレオチド;
オリゴヌクレオチドの第1の末端に付着した蛍光物質分子;
オリゴヌクレオチドの第2の末端に付着した消光物質分子であって、これにより、オリゴヌクレオチドプローブが1本鎖状態である場合はいつも、消光物質分子が、蛍光物質分子の蛍光を実質的に消光し、そしてオリゴヌクレオチドプローブが2本鎖状態である場合はいつも、蛍光物質が実質的に消光されない、消光物質分子;および
ポリメラーゼの5’→3’伸長活性を受けないようにされた3’末端、
を含むオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程;
標的核酸配列をエキソヌクレアーゼ活性インヒビターと接触させる工程であって、インヒビターはプローブハイブリダイゼーション温度でポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を阻害するに十分である工程;
標的核酸配列、オリゴヌクレオチドプローブ、PCR試薬、およびインヒビターを、PCR試薬により特定される標的核酸配列を増幅するに十分な熱循環に供する工程;および
プローブハイブリダイゼーション温度で、オリゴヌクレオチドプローブの蛍光消光の程度を測定する工程、を包含する、方法である。
標的核酸配列を、少なくとも2つのPCRプライマーおよびポリメラーゼ酵素を含むPCR試薬、ならびに以下のもの:
オリゴヌクレオチド;
オリゴヌクレオチドの第1の末端に付着した蛍光物質分子;
オリゴヌクレオチドの第2の末端に付着した消光物質分子であって、これにより、オリゴヌクレオチドプローブが1本鎖状態である場合はいつも、消光物質分子が、蛍光物質分子の蛍光を実質的に消光し、そしてオリゴヌクレオチドプローブが2本鎖状態である場合はいつも、蛍光物質が実質的に消光されない、消光物質分子;および
ポリメラーゼの5’→3’伸長活性を受けないようにされた3’末端、
を含むオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程:
標的核酸配列をエキソヌクレアーゼ活性インヒビターと接触させる工程であって、インヒビターはプローブハイブリダイゼーション温度でポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を阻害するに十分である工程;
標的核酸配列、オリゴヌクレオチドプローブ、およびPCR試薬を、PCR試薬により特定された標的核酸配列を増幅するに十分な熱循環に供する工程;
ポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を非活性化する工程;および
プローブハイブリダイゼーション温度で、オリゴヌクレオチドプローブの蛍光消光の程度を測定する工程、を包含する、方法である。
標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド;
オリゴヌクレオチドの第1の位置に付着した蛍光物質分子;
オリゴヌクレオチドの第2の位置に付着した消光物質分子であって、第1の位置と第2の位置とは少なくとも18ヌクレオチドにより隔てられている、消光物質分子;
ポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性による消化を受けないようにされた5’末端;および
ポリメラーゼの5’→3’伸長活性を受けないようにされた3’末端、
を含有する、オリゴヌクレオチドプローブである。
ここで、本発明の好ましい実施態様について詳細に言及する。本発明を、好ましい実施態様に関して記載するが、このことは本発明をこれらの実施態様に限定することを意図するものではないことが理解される。それどころか、本発明は、添付の特許請求の範囲によって規定される発明に含まれ得る代替物、改変物、および等価物を含むことが意図されている。
本明細書中で使用される場合、用語「PCR試薬」は、標的核酸配列を除く、PCRプロセスを実行するために必要とされる化学薬品をいう。これらの化学薬品は、一般的に、以下の5つのクラスの成分からなる:(i)水性緩衝物、(ii)水溶性マグネシウム塩、(iii)少なくとも4種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)、(iv)オリゴヌクレオチドプライマー(通常、それぞれの標的配列に対して2つのプライマー、その配列は、二本鎖標的配列の2つの相補鎖の5’末端を規定する)、および(v)ポリヌクレオチドポリメラーゼ、好ましくはDNAポリメラーゼ、より好ましくは熱安定性DNAポリメラーゼ(すなわち、少なくとも10分間の合計時間の間、その活性の約半分より多くを失うことなく、90℃と100℃との間の温度に耐え得るDNAポリメラーゼ)。
用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書中で使用する場合、規則的なパターンのモノマー−モノマー間の相互作用(例えば、Watson−Crick型の塩基対合など)によって標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し得る、天然のまたは改変されたモノマーまたは結合(linkage)(デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドなどを含む)の直鎖状オリゴマーを包含する。通常、モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのアナログにより結合されて、サイズが数個のモノマー単位(例えば、3〜4)から数十のモノマー単位の範囲のオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが、「ATGCCTG」のような文字の配列で表される場合はいつでも、他に注記がなければ、ヌクレオチドは左から右へ5’→3’の順序であること、および「A」はデオキシアデノシンを示し、「C」はデオキシシチジンを示し、「G」はデオキシグアノシンを示し、そして「T」はチミジンを示すことが理解される。ホスホジエステル結合のアナログには、ホスホロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデートなどが含まれる。
PCRおよびプローブハイブリダイゼーションアッセイを組み合わせて行うときに明言されなければならない、3つの重要な問題がある:(i)オリゴヌクレオチドプローブは、PCR重合化工程をブロックまたはさもなくば干渉し、それによって、増幅の段階的効率を低減すべきではない。ここで、本明細書中で用いられるように、用語「重合化工程」は、プライマーが、ポリメラーゼ媒介反応によるヌクレオチド塩基の取り込みによって、その3’末端から伸長される、PCRプロセスの中の工程をいう;(ii)オリゴヌクレオチドプローブは、ポリメラーゼ酵素の5’→3’エキソヌクレアーゼ活性により消化されるべきではない;および(iii)プローブは、ポリメラーゼによる5’→3’伸長が不可能であるべきである。
(一本鎖状態と二本鎖状態とでのプローブの蛍光発光の比較)
リンカーアームヌクレオチド (「LAN」)ホスホルアミダイトは、Glen Researchから入手した。標準DNAホスホルアミダイト、6−カルボキシフルオレセイン(「6−FAM」)ホスホルアミダイト、6−カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル(「TAMRA NHSエステル」)、および3’ブロッキングリン酸を付着するためのPhosphalinkTMヘ、Perkin−Elmer、Applied Biosystems Divisionから入手した。オリゴヌクレオチド合成を、モデル394 DNA Synthesizer(Applied Biosystems)で行った。オリゴヌクレオチドを、Oligo Purification Cartridges (Applied Bioststems)を用いて精製した。
プローブのオリゴヌクレオチド配列およびその相補体を表1に示す。本明細書中で用いられる用語「相補体」は、プローブ配列と特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド配列をいう。
b.差分消光を、(二本鎖状態のプローブの蛍光発光強度)÷(一本鎖状態のプローブの蛍光発光強度)として定義する。
Claims (4)
- PCR増幅およびハイブリダイゼーションプロービングを組み合わせて行なう方法であって、以下の工程:
標的核酸配列を、少なくとも2つのPCRプライマーおよび5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に全て欠くポリメラーゼ酵素を含むPCR試薬、ならびに以下のもの:
オリゴヌクレオチド;
該オリゴヌクレオチドの第1の末端に付着した蛍光物質分子;
該オリゴヌクレオチドの第2の末端に付着した消光物質分子であって、これにより、該オリゴヌクレオチドプローブが1本鎖状態である場合はいつも、消光物質分子が、該蛍光物質分子の蛍光を実質的に消光し、そして該オリゴヌクレオチドプローブが2本鎖状態である場合はいつも、該蛍光物質が実質的に消光されない、消光物質分子;および
ポリメラーゼの5'→3'伸長活性を受けないようにされた3'末端、
を含むオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程;および
該標的核酸配列、該オリゴヌクレオチドプローブ、および該PCR試薬を、該PCR試薬により特定される該標的核酸配列を増幅するに十分な熱循環に供する工程、
を包含する、方法。 - プローブハイブリダイゼーション温度で、前記オリゴヌクレオチドプローブの蛍光消光の程度を測定する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- PCR増幅およびハイブリダイゼーションプロービングを組み合わせて行なう方法であって、以下の工程:
標的核酸配列を、少なくとも2つのPCRプライマーおよびポリメラーゼ酵素を含むPCR試薬、ならびに以下のもの:
オリゴヌクレオチド;
該オリゴヌクレオチドの第1の末端に付着した蛍光物質分子;
該オリゴヌクレオチドの第2の末端に付着した消光物質分子であって、これにより、該オリゴヌクレオチドプローブが1本鎖状態である場合はいつも、該消光物質分子が、該蛍光物質分子の蛍光を実質的に消光し、そして該オリゴヌクレオチドプローブが2本鎖状態である場合はいつも、該蛍光物質が実質的に消光されない、消光物質分子;および
ポリメラーゼの5'→3'伸長活性を受けないようにされた3'末端、
を含むオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程;
該標的核酸配列をエキソヌクレアーゼ活性インヒビターと接触させる工程であって、該インヒビターはプローブハイブリダイゼーション温度で該ポリメラーゼの5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を阻害するに十分である工程;
該標的核酸配列、該オリゴヌクレオチドプローブ、該PCR試薬、および該インヒビターを、該PCR試薬により特定される該標的核酸配列を増幅するに十分な熱循環に供する工程;および
該プローブハイブリダイゼーション温度で、該オリゴヌクレオチドプローブの蛍光消光の程度を測定する工程、
を包含する、方法。 - PCR増幅およびハイブリダイゼーションプロービングを組み合わせて行なう方法であって、以下の工程:
標的核酸配列を、少なくとも2つのPCRプライマーおよびポリメラーゼ酵素を含むPCR試薬、ならびに以下のもの:
オリゴヌクレオチド;
該オリゴヌクレオチドの第1の末端に付着した蛍光物質分子;
該オリゴヌクレオチドの第2の末端に付着した消光物質分子であって、これにより、該オリゴヌクレオチドプローブが1本鎖状態である場合はいつも、該消光物質分子が、該蛍光物質分子の蛍光を実質的に消光し、そして該オリゴヌクレオチドプローブが2本鎖状態である場合はいつも、該蛍光物質が実質的に消光されない、消光物質分子;および
ポリメラーゼの5'→3'伸長活性を受けないようにされた3'末端、
を含むオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程:
該標的核酸配列をエキソヌクレアーゼ活性インヒビターと接触させる工程であって、該インヒビターはプローブハイブリダイゼーション温度で該ポリメラーゼの5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を阻害するに十分である工程;
該標的核酸配列、該オリゴヌクレオチドプローブ、および該PCR試薬を、該PCR試薬により特定された該標的核酸配列を増幅するに十分な熱循環に供する工程;
該ポリメラーゼの5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を非活性化する工程;および
該プローブハイブリダイゼーション温度で、該オリゴヌクレオチドプローブの蛍光消光の程度を測定する工程、
を包含する、方法。
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