JP2004283153A

JP2004283153A - Ｑ熱菌のＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）法による高精度迅速検出法

Info

Publication number: JP2004283153A
Application number: JP2003120742A
Authority: JP
Inventors: Yoshiyuki Nishio; 義行西尾
Original assignee: SHIGETA ANIMAL PHARMACEUTICALS; SHIGETA ANIMAL PHARMACEUTICALS Inc
Current assignee: SHIGETA ANIMAL PHARMACEUTICALS; SHIGETA ANIMAL PHARMACEUTICALS Inc
Priority date: 2003-03-19
Filing date: 2003-03-19
Publication date: 2004-10-14

Abstract

【課題】Ｑ熱菌を検出するためのＰＣＲ法として、伸張反応を１サイクルのみしか行わず、しかも鮮明なバンドをつくることを可能とするプライマー。
【解決手段】プライマーとして、ＣＢ１（５‘−ＡＣＴＣＡＡＣＧＣＡＣＴＧＧＡＡＣＣＧＣ−３’）とＣＢ２（５‘−ＴＡＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＡＴＴＣＧＣＣ３’）のペアーあるいはＴｒａｎｓ１（５‘ＴＡＴＧＴＡＴＣＣＡＣＣＧＴＡＧＣＣＡＧＴＣ−３’）とＴｒａｎｓ２（５‘ＣＣＣＡＡＣＡＡＣＡＣＣＴＣＣＴＴＡＴＴＣ−３’）のペアーを用いることにより、伸張反応を１サイクルのみの短時間で、Ｑ熱菌に特異的な位置に明確なバンドをつくることを可能にした。
【選択図】なし

Description

【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）法でＱ熱菌を検出するためのプライマーに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生卵、生肉あるいは生乳汁などの生食品には、心内膜炎などを引き起こすＱ熱菌（Ｃｏｘｉｅｌｌａｂｕｒｎｅｔｉｌコクシェラ・バーネティ）がしばしば生息している。このため、食品を対象としてＱ熱菌に対する検査も行われており、検査法としてはＰＣＲ法が汎用されている。Ｑ熱菌に関するＰＣＲ法は、Ｑ熱菌のＤＮＡのうち、Ｑ熱菌に特異的な塩基配列部分のみを繰り返し伸張合成する反応である。この繰り返し伸張合成した部分を電気泳動にかけ、Ｑ熱菌に特異的な塩基配列の部分を蛍光下で肉眼観察する。しかし、繰り返し伸張反応を行っている間に、目的以外の塩基配列もつくられ、このようなミスあるいは非特異的な塩基配列部分の合成をできるだけ少なくすることが必要になっている。このため、伸張反応を１サイクル行った後、別のプライマーを用いて２サイクル目を行う、いわゆるネステットＰＣＲ法が行われている。このネステットＰＣＲ法は２サイクル行うため、時間と人手がかかる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
解決しようとする課題は、ＰＣＲにおいて１サイクルの伸張反応のみでＱ熱菌に対応する明確なバンドをつくるプライマーがないことである。
【０００４】
【問題を解決するための手段】
本発明は、Ｑ熱菌を検出するためのＰＣＲ用プライマーとして、ネステット法のように２サイクル行う必要はなく、１サイクルのみの伸張反応で、特異性が高く、しかも、鮮明なバンドをつくるプライマーである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
プライマーとして、ＣＢ１（５‘−ＡＣＴＣＡＡＣＧＣＡＣＴＧＧＡＡＣＣＧＣ−３’）とＣＢ２（５‘−ＴＡＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＡＴＴＣＧＣＣ３’）のペアーあるいはＴｒａｎｓ１（５‘ＴＡＴＧＴＡＴＣＣＡＣＣＧＴＡＧＣＣＡＧＴＣ−３’）とＴｒａｎｓ２（５‘ＣＣＣＡＡＣＡＡＣＡＣＣＴＣＣＴＴＡＴＴＣ−３’）のペアーを用いることにより、１サイクルの伸張反応のみでＱ熱菌に特異的で、しかも、鮮明なバンドをつくることができた。
【０００６】
【実施例１】Ｑ熱菌を検出するためのプライマーとしてＣＢ１とＣＢ２のペアーを用いたＰＣＲ法
【０００７】（Ａ）検体試料および試験方法
イ）試料の調製法
試験管にマヨネーズをとり、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に懸濁した後、この懸濁液を遠心分離した。この沈殿をｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫで処理し、再び遠心分離を行い、沈殿をＰＢＳに溶かしてＰＣＲ用試料液とした。陽性コントロールとしては、Ｑ熱菌・Ｃｏｘｉｅｌｌａｂｕｒｎｅｔｉｉ（コクシェイラ・バーネティ）アメリカ株、ＮｉｎｅＭｉｌｅ菌を細胞培養し、この培養液をＰＢＳに懸濁した液を用いた。陰性コントロールとしては、ＰＢＳを用いた。
ロ）ＰＣＲ法
試験管に、水、ＰＢＳ，デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、塩化マグネシウム、ＤＮＡポリメラーセとプライマーであるＣＢ１およびＣＢ２を入れた。この中に、ＰＣＡ用試料液を加え混合した。この混合液を常法のサーモサイクラーでＰＣＲを行った。すなわち、熱変性は９５℃、３０秒、アニーリングは５８℃、３０秒、伸張反応は７２℃、２分間行った。この条件で３０サイクル繰り返し反応を行った。繰り返し反応が終った液をアガロースゲル電気泳動にかけた。この電気泳動したゲルを臭化エチジウム液に浸した後、ＵＶ照射することにより現れたバンドを肉眼観察した。
【０００８】（Ｂ）試験結果および考察
検体としてマヨネーズを用いたＰＣＲの電気泳動のバンドを図１に示した。マヨネーズ１では、陽性コントロールと同じ位置に鮮明なバンドを認めた。一方、マヨネーズ２では、陽性コントロールの位置にバンドは認めなかった。このように、プライマーとしてＣＢ１とＣＢ２のペアーを用いてＰＣＲを行うことにより、マヨネーズなど食品中におけるＱ熱菌の検出を精度よく迅速に検査することを可能にした。
【０００９】
【実施例２】Ｑ熱菌を検出するためのプライマーとしてＴｒａｎｓ１およびＴｒａｎｓ２のペアーを用いたＰＣＲ法
【００１０】（Ａ）検体試料および試験方法
検体試料および試験方法は実施例１に準じて行った。ただし、サーモサイクラーの条件は次のとおりである。熱変性は９４℃、３０秒、アニーリングは６６℃、３０秒、伸張反応は７２℃で１分間行った。
【００１１】（Ｂ）試験結果および考察
検体としてマヨネーズを用いたＰＣＲの電気泳動のバンドを図２に示した。実施例１と同様に、マヨネーズ１では、陽性コントロールと同じ位置に鮮明なバンドを認めた。一方、マヨネーズ２では、陽性コントロールの位置にバンドは認めなかった。このように、プライマーとしてＴｒａｎｓ１とＴｒａｎｓ２のペアーを用いてＰＣＲを行うことによって、マヨネーズなど食品中におけるＱ熱菌の検出を精度よく迅速に検査することを可能にした。
【発明の効果】
上述したとおり、ＰＣＲ用プライマーとしてＣＢ１とＣＢ２のペアあるいはＴｒａｎｓ１とＴｒａｎｓ２のペアを用いることによって、Ｑ熱菌を特異的で精度よくかつ迅速に検出することを可能にした。
【図面の簡単な説明】
【図１】プライマーとしてＣＢ１とＣＢ２のペアを用いてＰＣＲを行った電気泳動の図である。
【図２】プライマーとしてＴｒａｎｓ１とＴｒａｎｓ２のペアを用いてＰＣＲを行った電気泳動の図である。

Claims

Ｑ熱菌のＰＣＲ法による検査法としてプライマーの塩基配列がＣＢ１（５‘−ＡＣＴＣＡＡＣＧＣＡＣＴＧＧＡＡＣＣＧＣ−３’）とＣＢ２（５‘−ＴＡＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＡＴＴＣＧＣＣ３’）のペアーを用いた高精度で迅速な検出法である。試料としては、血液、卵、乳汁、糞、塵埃、各種動物臓器・体毛・体液・骨などを用いることができる。
Ｑ熱菌のＰＣＲ法による検査法としてプライマーの塩基配列がＴｒａｎｓ１（５‘ＴＡＴＧＴＡＴＣＣＡＣＣＧＴＡＧＣＣＡＧＴＣ−３’）とＴｒａｎｓ２（５‘ＣＣＣＡＡＣＡＡＣＡＣＣＴＣＣＴＴＡＴＴＣ−３’）のペアーを用いた高精度で迅速な検出法である。試料としては、血液、卵、乳汁、糞、塵埃、各種動物臓器・体毛・体液・骨などを用いることができる。