CN112795672A - 引物组及多重pcr检测体系 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种引物组及多重PCR检测体系。本发明的引物组以鸭疫里默氏杆菌的ompa基因、禽源大肠埃希杆菌的ompa基因、禽源巴氏杆菌的kmt1基因和禽源沙门氏菌沙门氏菌的inva基因为靶基因。具有上述引物组的多重PCR检测体系，能够一步到位在临床上快速检测出病源菌，对禽源沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、禽源巴氏杆菌和禽源大肠杆菌的混合感染的鉴别诊断具有重要应用价值。对于临床可疑样品进行细菌划板初分离后，挑取疑似单菌菌，置于相应培养基中进行增殖培养3‑4小时，即可进行多重PCR检测，能快速判断是否禽源的4种常见细菌，极大地提高了检测的时效性。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及引物组及多重PCR检测体系。
背景技术
禽源沙门氏菌沙门氏菌(Salmonella enteriditis)、鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)、禽源巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、禽源大肠埃希杆菌(Escherichia coli)是引发家禽细菌性疫病的常见病原菌，感染后引起的临床症状相似，并可能发生混合感染，临床上鉴别诊断难度较大，常导致较高发病率和死亡率，给养禽业带来了巨大的经济损失。目前还主要采取传统方法鉴别病原菌，需经过细菌的富集培养，形态观察，生理生化等繁琐的过程，操作复杂，检测周期长。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种引物组，能够同管复合扩增鸭疫里默氏杆菌、禽源大肠埃希菌、禽源巴氏杆菌和禽源沙门氏菌的基因片段。
现有技术中未见可以同时鉴别鸭疫里默氏杆菌、禽源大肠埃希菌、禽源巴氏杆菌和禽源沙门氏菌4混合感染的多重PCR检测方法，建立能同时鉴别四种病原菌的多重PCR检测方法，对于临床上快速检测病源菌有重大意义。
基于鸭疫里默氏杆菌的ompa基因、禽源大肠埃希杆菌的ompa基因、禽源巴氏杆菌的kmt1基因和禽源沙门氏菌沙门氏菌的inva基因的保守性和特异性，本发明以上述基因作为靶基因进行引物设计
所述引物的具体序列如表1所示：
表1
本发明的一个方面，还提供了一种具有上述引物组的多重PCR检测体系，能够一步到位在临床上快速检测出病源菌，对禽源沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、禽源巴氏杆菌和禽源大肠杆菌的混合感染的鉴别诊断具有重要应用价值。对于临床可疑样品进行细菌划板初分离后，挑取疑似单菌菌，置于相应培养基中进行增殖培养3-4小时，即可进行多重PCR检测，能快速判断是否禽源的4种常见细菌，极大地提高了检测的时效性。
进一步，所述引物组包括浓度为10pmol/μl的Ra上下游引物各0.7μl丶Ecoli上下游引物各0.5μl丶Pm上下游引物各自0.3μl丶Sal上下游引物各0.7μl，所述PCR Mix 12.5μl。扩增时以超纯水补足25μl。经优化后的扩增程序为：94℃预变性5min；94℃40s，52℃45s，72℃40s，共30个循环；72℃延伸8min，4℃反应结束。
进一步，所述多重PCR检测体系还包括1μl阳性对照品。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为多重PCR检测体系对22株鸭疫里默氏杆菌的验证结果图，图中泳道1为DNA分子质量标准，泳道2为阳性对照品，泳道3～24为鸭疫里默氏杆菌，泳道25为空白样(阴性对照品)；
图2为多重PCR检测体系对22株禽源大肠埃希菌的验证结果图，图中泳道1为DNA分子质量标准，泳道2为阳性对照品，泳道3～24为禽源大肠埃希菌，泳道25为空白样(阴性对照品)；
图3为多重PCR检测体系对22株禽源巴氏杆菌的验证结果图，图中泳道1为DNA分子质量标准，泳道2为阳性对照品，泳道3～24为禽源巴氏杆菌，泳道25为空白样(阴性对照品)；
图4为多重PCR检测体系对22株禽源沙门氏菌的验证结果图，图中泳道1为DNA分子质量标准，泳道2为阳性对照品，泳道3～24为禽源沙门氏菌，泳道25为空白样(阴性对照品)；
图5为实施例2中对多重PCR检测体系的引物优化测试结果图，图中泳道M为DNA分子质量标准，泳道1～9为实验设置组1～9；
图6为实施例2中对多重PCR检测体系的退火温度优化测试结果图，图中泳道1为DNA分子质量标准，泳道2～13的退火温度分别为：50.0℃、50.3℃、50.9℃、52.0℃、53.1℃、54.4℃、55.6℃、56.9℃、58.1℃、59.1℃、59.7℃、60.0℃；
图7为实施例3中对鸭疫里默氏杆菌敏感性试验结果图，图中泳道M为DNA分子质量标准，泳道1～10的稀释浓度分别为：101、102、103、104、105、106、107、108、109、1010，泳道11为空白样(阴性对照品)；
图8为实施例3中对禽源大肠埃希杆菌敏感性试验结果图，图中泳道M为DNA分子质量标准，泳道1～10的稀释浓度分别为：101、102、103、104、105、106、107、108、109、1010，泳道11为空白样(阴性对照品)；
图9为实施例3中对禽源巴氏杆菌敏感性试验结果图，图中泳道M为DNA分子质量标准，泳道1～10的稀释浓度分别为：101、102、103、104、105、106、107、108、109、1010，泳道11为空白样(阴性对照品)；
图10为实施例3中对禽源沙门氏菌敏感性试验结果图，图中泳道M为DNA分子质量标准，泳道1～10的稀释浓度分别为：101、102、103、104、105、106、107、108、109、1010，泳道11为空白样(阴性对照品)；
图11为实施例4中对多重PCR检测体系的特异性试验结果图，图中泳道1为DNA分子质量标准，泳道2为禽源沙门氏菌沙门氏菌与鸭疫里默氏杆菌与禽源巴氏杆菌与禽源大肠埃希杆菌，泳道3为鸭疫里默氏杆菌，泳道4为禽源大肠埃希杆菌，泳道5为禽源巴氏杆菌，泳道6为禽源沙门氏菌，泳道7为禽源葡萄球菌，泳道8为禽源鸭源鸡杆菌，泳道9为禽源粪球菌，泳道10为禽源不动杆菌，泳道11为禽源邻丹胞菌，泳道12为禽源爱德华菌，泳道13为禽源志贺氏菌，泳道14为禽源链球菌，泳道15为空白样(阴性对照品)。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
试验材料：
29株禽源大肠埃希菌、29株禽源巴氏杆菌、29株禽源沙门氏菌、29株鸭疫里默氏杆菌、1株禽源葡萄球菌、1株鸭源鸡杆菌、1株禽源粪球菌、1株禽源不动杆菌、1株禽源邻丹胞菌、1株禽源爱德华菌、1株禽源志贺杆菌、1株禽源链球菌。将-20℃保存的菌株分别接种于血琼脂平板培养基复苏后，将单个菌落在普通LB液体培养基中培养，将禽源链球菌、鸭疫里默氏杆菌和禽源巴氏杆菌单个菌落在含10％血清LB液体培养基中培养，置于37℃摇床中培养过夜。
2X Accurate Taq Master Mix、GL DNA Marker 100Ladder购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；蛋白胨、酵母浸出粉、营养琼脂培养基均购自广东环微生物科技有限公司；LB液体培养基、血琼脂平板培养基均按常规方法配制。其它试剂均为分析纯。
实施例1.多重PCR检测体系的构建
1-1引物的设计
基于鸭疫里默氏杆菌的ompa基因、禽源大肠埃希杆菌的ompa基因、禽源巴氏杆菌的kmt1基因和禽源沙门氏菌沙门氏菌的inva基因的保守性和特异性，从Genbank数据库中下载上述基因，选取上述4个基因的保守区域，并尽量要求PCR产物长度差异100bp以上，设计4对适用于多重PCR检测的特异性异物。设计的引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。
1-2多重PCR检测体系的验证
对禽源大肠埃希菌、禽源沙门氏菌、禽源巴氏杆菌、鸭疫里默氏杆菌分别进行22个平行样本的多重PCR检测，确定单独引物是能够正确检出阳性样本。采用25μl的PCR体系，PCR反应体系如下：菌液模板1μl，所有引物均为0.5μl，PCR Mix12.5μl，超纯水补至25μl；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃40s，55℃45s，72℃40s，共30个循环；72℃延伸8min，4℃反应结束。
检测结果如图1～4所示，本发明提供的多重PCR检测体系能够分别检测禽源大肠埃希菌、禽源沙门氏菌、禽源巴氏杆菌和鸭疫里默氏杆菌，检出率100％。
实施例2.多重PCR检测体系的优化
2-1引物工作浓度的优化
把加入的4对引物(引物浓度均为10pmol/μl)的体积分别设置3个水平：0.3ul，0.5ul和0.7ul，设置4因素3水平表(表2)，设置L9(34)正交表(表3)，共设置9个实验方案，每个方案重复3次试验。
表2因素水平表
表3L9(34)正交表
如图5所示，9组25μl体系中，条带最为清晰的最佳引物比例组合为第8组，即RA上下游引物各0.7μl、Ecoli上下游引物各0.5μl、Pm上下游引物各0.3μl、Sal上下游引物各0.7μl，PCR混合物12.5μl。
2-2退火温度优化
确定引物比例后，对PCR反应温度进行优化，PCR退火温度设置如下：50.0℃、50.3℃、50.9℃、52.0℃、53.1℃、54.4℃、55.6℃、56.9℃、58.1℃、59.1℃、59.7℃、60.0℃。
如图6所示，确定条带最为清晰的最佳退火温度为52℃。最佳扩增程序为94℃预变性5min；94℃40s，52℃45s，72℃40s，共30个循环；72℃延伸8min，4℃反应结束。
实施例3.多重PCR检测体系的敏感性试验
禽源大肠埃希菌、禽源巴氏杆菌、禽源沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌共4种细菌分别接种于血琼脂平板培养复苏后，(1)禽源大肠埃希菌和禽源沙门氏菌挑取单个菌落至1mlLB液体培养基，在37℃、200rpm条件下培养16h，取100μl接种至8ml LB液体培养基，在37℃、200rpm条件下培养16h，马上取出放插进冰盘；(2)巴氏杆菌和鸭疫里默氏杆菌挑取单个菌落至1ml 10％血清的液体LB培养基，在37℃、200rpm条件下培养16h，取100μl接种至8ml10％血清的液体LB培养基，在37℃、200rpm条件下培养16h，马上取出放插进冰盘。将(1)(2)调整OD600等于0.5，将其设为起始浓度，稀释101到1010并进行菌落计数(GB4789.2-2016菌落计数[国标法]，每个平板加1ml稀释的菌液，作3个平行样品)，得出OD600等于0.5的菌液作为初始浓度为100分别稀释为101、102、103、104、105、106、107、108、109、1010，以4种菌的梯度菌液作为模板，检测敏感度。
0D600值为0.5时稀释到106的菌数分别为，禽源大肠埃希菌0.3CFU/μl、禽源沙门氏菌0.375CFU/μl、鸭疫里默氏杆菌0.445CFU/μl和禽源巴氏杆菌0.55CFU/μl；在优化的多重PCR条件下，该多重PCR最低能检测细菌数分别为沙门氏菌沙门氏菌3750CFU/μl(102)、鸭疫里默氏杆菌4450CFU/μl(102)、巴氏杆菌550CFU/μl(103)、大肠杆菌300CFU/μl(103)(见图7-10)。
实施例4.多重PCR检测体系的特异性试验
针对4种菌(禽源大肠埃希菌、禽源沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌和禽源巴氏杆菌)的混合液，4种菌的单独液，禽源葡萄球菌、鸭源鸡杆菌、禽源粪球菌、禽源不动杆菌、禽源邻丹胞菌、禽源爱德华菌、禽源志贺氏菌、禽源链球菌菌液作为模板，检测特异性。
采用优化的多重PCR反应条件，禽源沙门氏菌沙门氏菌+鸭疫里默氏杆菌+禽源巴氏杆菌+禽源大肠埃希杆菌菌液混合、禽源沙门氏菌沙门氏菌菌液、鸭疫里默氏杆菌菌液、禽源巴氏杆菌菌液和禽源大肠埃希杆菌菌液以及禽源葡萄球菌、鸭源鸡杆菌、禽源粪球菌、禽源不动杆菌、禽源邻丹胞菌、禽源爱德华菌、禽源志贺氏菌、禽源链球菌分别进行扩增的结果显示，禽源沙门氏菌沙门氏菌+鸭疫里默氏杆菌+禽源巴氏杆菌+禽源大肠埃希杆菌混合液、禽源沙门氏菌沙门氏菌菌液、鸭疫里默氏杆菌菌液、禽源巴氏杆菌菌液和禽源大肠埃希杆菌菌液中均扩增出了相应的目的条带，而其他模板未见扩增产物，表明该多重PCR方法有较好的特异性(见图11)。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山科学技术学院
<120> 引物组及多重PCR检测体系
<130> 2021
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cttggtatcc aaggggatta tgt 23
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttaactgaga tgggttaaca cctc 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttcgctggcg gtgttgagta 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
catccagagc agcctgacct t 21
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atccgctatt tacccagtg 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gctgtaaacg aactcgcca 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
caaaaagaag ggtcgtcgt 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggaaggtact gccagaggt 19
Claims (7)
1.一种引物组，其特征在于，包括4对引物，所述引物可特异性符合扩增4种目标微生物的DNA序列，所述目标微生物包括鸭疫里默氏杆菌、禽源大肠埃希菌、禽源巴氏杆菌和禽源沙门氏菌。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物特异性复合扩增所述鸭疫里默氏杆菌的ompa基因、所述禽源大肠埃希杆菌的ompa基因、所述禽源巴氏杆菌的kmt1基因和所述禽源沙门氏菌沙门氏菌的inva基因。
3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述引物如SEQ ID№1～8所示。
4.一种多重PCR检测体系，其特征在于，包括如权利要求1至3任一项所述引物组。
5.根据权利要求4所述的多重PCR检测体系，其特征在于，所述引物组包括浓度为10pmol/μl的Ra上下游引物各0.7μl丶Ecoli上下游引物各0.5μl丶Pm上下游引物各自0.3μl丶Sal上下游引物各0.7μl，以及PCR Mix 12.5μl。
6.根据权利要求5所述的多重PCR检测体系，其特征在于，还包括阳性对照品；优选地，所述阳性对照品为1μl。
7.根据利要求5所述的多重PCR检测体系，其特征在于，所述多重PCR检测体系的扩增程序为：94℃预变性5min；94℃40s，52℃45s，72℃40s，共30个循环；72℃延伸8min，4℃反应结束。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110175653.3A CN112795672A (zh) | 2021-02-07 | 2021-02-07 | 引物组及多重pcr检测体系 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
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| CN (1) | CN112795672A (zh) |
Citations (4)
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| CN112195258A (zh) * | 2020-10-26 | 2021-01-08 | 贵州省畜牧兽医研究所 | 水禽多种致病菌的多重pcr检测试剂盒及其应用 |
-
2021
- 2021-02-07 CN CN202110175653.3A patent/CN112795672A/zh active Pending
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| 王春平;韦强;鲍国连;崔言 顺;刘燕;邵泽香;季权安; 肖琛闻;李建亮;: "鸭疫里默 氏菌病和大肠杆菌病多 重PCR 诊断方法的建立", 中国兽医学报 * |
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