CN110551801A

CN110551801A - 一种鉴定2型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的方法

Info

Publication number: CN110551801A
Application number: CN201910860869.6A
Authority: CN
Inventors: 万春和; 程龙飞; 黄瑜; 傅光华; 刘荣昌; 施少华; 陈红梅; 傅秋玲
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-09-11
Filing date: 2019-09-11
Publication date: 2019-12-10

Abstract

本发明提供一种鉴定2型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的方法及其应用，属于禽病学研究领域，采用了引物和内切酶（EcoRV酶），建立能够鉴定2型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的方法，该方法的敏感性和PCR相当，仅仅只需对PCR产物进行EcoRV酶酶切后再进行常规琼脂糖凝胶电泳，即可根据电泳条带鉴定2型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药，建立的方法简单实用、方便快捷、无需进行药敏试验，为在家禽中开展2型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药提供快速检测方法，将指导临床科学用药，具有十分重要的研究意义。

Description

一种鉴定2型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的方法

技术领域

本发明属于禽病学研究领域，具体涉及一种鉴定2型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的方法及其应用。

背景技术

2型鸭疫里默氏菌可侵害雏鸭、雏鹅、雏火鸡，引起的特征性病变是肝周炎、心包炎和腹膜炎等，俗称传染性浆膜炎。1932年发现，现在仍然在全世界流行，也是危害我国水禽养殖的常见细菌病之一。氟喹诺酮类药物（诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星等）属第三代喹诺酮类，由于其抗菌谱广、抗菌活性高、组织穿透性强等特点，广泛应用于治疗家禽的全身性感染，在国内兽医临床的使用量仅次于β内酰胺类抗生素。近年来，2型鸭疫里默氏菌对氟喹诺酮类药物的耐药性多有报道，如何快速测定该细菌对氟喹诺酮类药物的敏感性、指导药物的选择显得非常迫切。细菌对氟喹诺酮类药物耐药的机制有多种，其中DNA促旋酶（氟喹诺酮类药物的作用靶点）的突变是重要原因之一。

前期研究发现，2型鸭疫里默氏菌的DNA促旋酶A亚基基因的喹诺酮类药物耐药决定区（quinolone resistance-determining region, QRDR）第247-249位碱基，如果由AGC突变为ATC，则该细菌对氟喹诺酮类药物肯定耐药。基于此特征，本发明设计一对引物跨过QRDR的该差异性位点，建立PCR方法，对其进行扩增，两类细菌（指对氟喹诺酮类药物耐药或不耐药的2型鸭疫里默氏菌）的PCR扩增产物均为548 bp。由于该扩增区域内核苷酸序列存在EcoRV酶限制性片段长度差异，由AGC突变为ATC会导致该区域的增加一个EcoRV酶位点（GAT↓ATC）。也就是说，该细菌对氟喹诺酮类药物不耐药的菌株（此处为GATAGC）PCR产物可以被EcoRV酶酶切为大小不变（仍然是548 bp）；而该细菌对氟喹诺酮类药物耐药的菌株（此处为GAT↓ATC），其PCR产物PCR产物被EcoRV酶酶切为不同的两段（442 bp和106 bp）。该方法的敏感性和PCR相当，仅仅只需对PCR产物进行额外EcoRV酶酶切（无需对产物进行胶回收）后再进行电泳，简单实用、无需进行药敏试验、方便快捷，当前尚未见基于类似原理的鉴定2型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的方法的报道，本研究可填补相关研究领域空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鉴定2型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的方法，该方法的敏感性和PCR相当，仅仅只需对PCR产物进行EcoRV酶酶切后再进行常规琼脂糖凝胶电泳，即可根据电泳条带鉴定2型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药，建立的方法简单实用、方便快捷、无需进行药敏试验，为在家禽中开展2型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药提供快速检测方法，将指导临床科学用药，具有十分重要的研究意义。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种鉴定2型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的引物，所述引物序列如下：

R2F：5’- CGCGTATTATTTGCGATGCACGAA -3’，

R2R：5’- ATCCCTTTGCGACCATTGATTAAT -3’。

一种鉴定2型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的方法，包括以下步骤：

（1）菌株基因组提取；

（2）PCR扩增基因组；

（3）利用EcoRV酶进行PCR产物酶切鉴定。

本发明的有益效果在于：本发明方法的敏感性和PCR相当，仅仅只需对PCR产物进行额外EcoRV酶酶切（无需对产物进行胶回收）后再进行电泳，简单实用、无需进行药敏试验、方便快捷，当前尚未见基于类似原理的鉴定2型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的方法的报道，本研究可填补相关研究领域空白。

附图说明

图1为 PCR扩增的电泳图；其中M：DL2000分子量标准；1：R125株；2：R86株；3：DEV；4：MDPV；5：DuCV；6：GPV；7：灭菌去离子水。

图2为PCR扩增产物的酶切鉴定；其中M：DL2000分子量标准；1：R125株；2：R86株。

图3为纸片法药物敏感试验。

具体实施方式

实施例1

1、材料

1.1 毒株和菌株

试验用菌株2型鸭疫里默氏菌R125（该菌株对氟喹诺酮类药物不耐药），鸭疫里默氏菌R86（该菌株对氟喹诺酮类药物耐药）由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存。

试验用对照毒株鸭肠炎病毒（DEV）、番鸭细小病毒（MDPV）、鸭圆环病毒（DuCV）、鸭源鹅细小病毒（GPV）均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存。

1.2 引物设计

根据美国国家生物技术信息中心（National Center of BiotechnologyInformation，NCBI）数据库的1型鸭疫里默氏菌DNA促旋酶A亚基（DNA gyrase subunit A）基因，利用Lasergene DNAStar进行核苷酸系列分析比对，利用引物设计软件Oligo 7.0设计一套引物，如下：

R2F：5’- ATGCATAAAGAAGGAGAAA-3’，

R2R：5’- AATAGCATTACGGTTTCCAA-3’。

上述引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

需要指出的是，在使用R2F/ R2R对R125株和R86株进行扩增时，R125株和R86株的PCR产物目的条带大小均是548 bp（常规琼脂糖电泳无法有效区分）。但是在该扩增区域内R125株和R86株存在特征性的EcoRV酶（GAT↓ATC）酶切位点差异，其中R86株在该扩增区域存在GAT↓ATC序列（可被EcoRV酶酶识别），而R125株没有（通常耐药的序列为GATAGC，没有EcoRV酶酶切识别位点）。

1.3 主要试剂

2×TransTaq-T PCR SuperMix、EasyPure Viral DNA/RNA Kit、EasyPure BacteriaGenomic DNA Kit、DNA分子量标准DL2000、FlyCut EcoRV酶均购自北京全式金生物技术有限公司。

2 试验方法的建立

2.1 基因组DNA的提取

试验对照毒株DEV、MDPV、DuCV、GPV按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit试剂盒的方法提取相应的基因组DNA，-80℃冻存备用。

R125株和R86株按照 EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit试剂盒的方法提取相应的基因组DNA，-80℃冻存备用。

2.2 反应液的配置和退火温度的优化

按照2×TransTaq-T PCR SuperMix 试剂盒推荐的的50μL体系进行扩增，其中2×PCRMaster Mix扩增反应液25 μL、引物R2F/ R2R（10μM）分别为1.0 μL、提取的基因组DNA模板为1.0 μL、补充灭菌去离子水至终体积50μL，混匀后进行PCR扩增。

扩增条件为94 ℃预变性5 min后进入循环，94 ℃变性30 s 、△T（52 ℃-62 ℃）退火30 s、72 ℃延伸45s，30个循环结束后，72℃终延伸10 min，反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。△T（52 ℃-62 ℃）表示退火温度在此区间进行优化，经优化后的最佳退火温度为56 ℃。

结果可见（图1），当模板仅加入R125株时，出现大小为548 bp的条带（第1泳道）；当模板仅加入R86株时，出现大小为548 bp的条带（第2泳道），常规琼脂糖电泳肉眼无法区分。

2.3 特异性试验

将优化后的PCR体系和扩增条件，对DEV、MDPV、DuCV、GPV以及灭菌去离子水对照进行扩增，均未见扩增条带，结果见图1，DEV（第3泳道）、MDPV（第4泳道）、DuCV（第5泳道）、GPV（第6泳道）和灭菌去离子水（第7泳道），表明建立的方法特异性强，对常见水禽病原均无交叉反应。

2.4 酶切鉴定

将PCR产物利用FlyCut EcoRV酶进行酶切鉴定，酶切体系为20 μL体系：其中10×FlyCut Buffer 2 μL、FlyCut EcoRV酶2 μL、PCR产物10 μL，补充灭菌去离子水至终体积20μL。轻轻混匀后瞬时离心，37 ℃水浴反应15 min。结果可见图2，R86株产物有两条，大小分别为442 bp和106 bp（第2泳道）；R125株酶切产物大小不变，仍然是548 bp（第1泳道）。说明2型鸭疫里默氏菌R125对氟喹诺酮类药物不耐药，鸭疫里默氏菌R86对氟喹诺酮类药物耐药。

2.5 细菌药敏试验

纸片扩散法进行细菌的药敏试验，鸭疫里默氏菌R125对氧氟沙星的抑菌圈直径为22mm，判定为敏感；鸭疫里默氏菌R86对氧氟沙星的抑菌圈直径为11 mm，判定为耐药。见图3。

3 临床应用

对38份临床分离的2型鸭疫里默氏菌，提取相应的核酸DNA，利用优化后的方法进行鉴定是否对氟喹诺酮类药物耐药。将其利用R2F/ R2R进行PCR扩增后进行EcoRV酶酶切鉴定，结果可见产物大小为548 bp有11株，表明这11株均对氟喹诺酮类药物不耐药，占比28.9%；可见产物大小为442 bp和106 bp两个片段有27株，表明这27株均对氟喹诺酮类药物耐药，占比71.1%。和2.5中的药敏试验进行对照，结果可见经本发明的方法鉴定的27株均对氟喹诺酮类药物耐药的菌株，经药敏试验均对氟喹诺酮类药物耐药，符合率为100%；经本发明的方法鉴定的，11株均对氟喹诺酮类药物不耐药的菌株，经药敏试验均对氟喹诺酮类药物不耐药，符合率为100%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种鉴定2型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的方法

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgcgtattat ttgcgatgca cgaa 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atccctttgc gaccattgat taat 24

Claims

1.一种鉴定2型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的引物，其特征在于，所述引物序列如下：

R2F：5’- CGCGTATTATTTGCGATGCACGAA -3’，

R2R：5’- ATCCCTTTGCGACCATTGATTAAT -3’。

2.一种鉴定2型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）菌株基因组提取；

（2）PCR扩增基因组；

（3）利用EcoRV酶进行PCR产物酶切鉴定。