CN114807359B - 一种用于检测基因突变的封闭型荧光探针 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种用于检测基因突变的封闭型荧光探针，所述封闭型荧光探针与野生型目标基因序列相互补，且5’端包含待测突变位点对应的野生型碱基，所述封闭型荧光探针一端标记有荧光报告基团，另一端标记有荧光淬灭基团。本发明的封闭型荧光探针将普通的qPCR荧光探针和阻断型探针相结合，同时具有荧光信号探针和非特异信号封闭探针功能，更具有成本优势，且检测体系简单，非特异性信号扩增降低，特异性提高。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种用于检测基因突变的封闭型荧光探针。
背景技术
基因突变是许多癌症和遗传学疾病发生的原因，基因突变检测可以诊断疾病和指导治疗方案等。检测基因突变的主要手段有一代测序、NGS测序和荧光定量PCR检测。一代测序的检测周期长、灵敏度低；NGS测序检测通量高，但是检测周期长、实验操作过程复杂、成本高、难以大规模应用。而荧光定量PCR灵敏度高、操作简洁、检测周期短、成本低、可及性强、能满足大多数医院和患者的应用需求。
荧光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）是在PCR反应中加入荧光基团，通过实时连续监测荧光信号，来分析目的基因的初始量。RT-qPCR一般分为染料法和探针法。在基因突变检测中，一般用Taqman 探针法，即在PCR反应中加入一段能与扩增片段特异性结合的带荧光基团的寡核苷酸序列。在PCR进行过程中，TaqDNA聚合酶有5’到3’端外切酶活性，会将荧光探针降解，探针上的荧光基团和淬灭基团分开，发出荧光信号。荧光信号的累积与PCR产物形成同步，由此来定量PCR产物。
对于识别基因点突变，突变阻滞扩增系统（Amplification refractory mutationsystem，ARMS）被广泛应用。PCR引物3’端的错配可以显著减少退火，从而阻滞扩增。ARMS引物的3’端的第一个碱基应为发生突变的碱基，且与突变型匹配。并且，在ARMS引物的3’端的第2～4位碱基引入错配碱基。该错配碱基与3’末端的碱基共同作用，使引物在与其3’末端不互补的模板中扩增产物率显著降低。ARMS体系和Taqman荧光探针相结合，通过监测PCR扩增产物量的差别，可以区分野生型和突变型模板。
但是普通ARMS体系在一些情况下特异性不好。比如，高GC模板的TERT基因启动子、家族序列同源性较高的RAS基因。这些情况下，只用普通的ARMS引物，常常会产生非特异性的扩增条带。通过增加阻断型探针（blocker）可以封闭野生型模板，增加特异性。但是blocker的添加会使PCR体系更加复杂；并且blocker往往需要用锁核酸（LNA）基团等修饰，成本昂贵。因此，需要更简洁、更平价的方法来提高ARMS体系的特异性。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于检测基因突变的封闭型荧光探针，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种用于与ARMS引物对配合检测基因突变的封闭型荧光探针，所述封闭型荧光探针与野生型目标基因序列相互补，且5’端包含待测突变位点对应的野生型碱基，所述封闭型荧光探针一端标记有荧光报告基团，另一端标记有荧光淬灭基团。
在本发明的某些实施方式中，所述封闭型荧光探针为Taqman探针。
本发明还提供所述封闭型荧光探针在制备基因突变检测产品中的用途。
本发明还提供一种检测基因突变的核苷酸组合物，所述核苷酸组合物包括所述封闭型荧光探针和ARMS引物对。
本发明还提供一种非诊断非治疗目的的检测基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括所述核苷酸组合物、PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs和dUTP。
本发明还提供一种检测基因突变的方法，所述方法包括利用所述的核苷酸组合物或所述试剂盒，对待测DNA模板进行qPCR扩增，根据qPCR扩增结果判断待测DNA模板为野生型或突变型。
本发明还提供一种所述封闭型荧光探针的装置，所述装置包括：
1）目标基因序列提供模块，用于提供野生型目标基因序列、突变型目标基因序列及待测突变位点；
2）探针生成模块，用于生成封闭型荧光探针，所述封闭型荧光探针与野生型目标基因序列相互补，且5’端包含待测突变位点对应的野生型碱基，所述封闭型荧光探针一端标记有荧光报告基团，另一端标记有荧光淬灭基团。
如上所述，本发明的用于检测基因突变的封闭型荧光探针，具有以下有益效果：将普通的qPCR荧光探针和阻断型探针（blocker）相结合，使它同时具有荧光信号探针和非特异信号封闭探针功能。其与野生型模板完全匹配，会优先结合到野生型模板，进一步降低ARMS引物与野生型模板结合的概率。相比传统的设计方案，可以显著降低非特异性信号扩增，显著提高检出信号的特异性。尤其是在有较高野生型模板的背景下，准确检测到低拷贝的突变模板。同时由于该探针具有双重功能，相比单独设计探针加阻断探针更具有成本优势，且检测体系简单，效果更好。并且该探针不需要额外的基团修饰，比一般用锁核酸等修饰的blocker成本大幅下降。本发明对于特异性较差的复杂基因位点的检测具有良好效果，可以显著改善靶标信号的特异性，具有重要的应用价值。
附图说明
图1-1显示为ARMS引物和封闭型荧光探针primer-blocker在扩增突变型模板时设计示意图。
图1-2显示为ARMS引物和封闭型荧光探针primer-blocker在扩增野生型模板时设计示意图。
图2显示为引物和探针的序列，其中加粗T和G为突变位点，其中T为突变型，G为野生型；斜体T为FAM基团修饰位点；下划线T为ARMS引物的错配碱基；+为LNA基团修饰位点。
图3显示为各检测液的组成，其中括号里面标注的为终浓度。
图4显示为反应液的组成。
图5显示为反应体系的组成。
图6显示为实施例1中组1和组4的Ct值数据，NoCt为没有信号。
图7显示为实施例1中Probe-B和Probe-N体系的扩增曲线图；其中，A对应Probe-B体系，B对应Probe-N体系。
图8显示为实施例1中组1、组2和组3的Ct值，NoCt为没有信号。
图9显示为实施例1中不同浓度的Probe-B对扩增反应的影响；其中，A对应800 nMProbe-B体系，B对应1000 nM Probe-B体系，C对应1200 nM Probe-B体系。
图10显示为实施例1中组3和组5的Ct值，NoCt为没有信号。
图11显示为实施例1中Probe-B和Blocker体系的扩增曲线图；其中，黑色线代表Probe-B体系的扩增曲线，灰色线代表Blocker体系的扩增曲线。
图12显示为实施例1中组3和组6的Ct值，NoCt为没有信号。
图13显示为实施例2中未知样品的检测结果。
图14显示为引物和探针的序列，其中加粗G和A为突变位点，其中A为突变型互补链上碱基，G为野生型互补链上碱基；斜体T为FAM基团修饰位点；下划线T为ARMS引物的错配碱基。
图15显示为各检测液的组成，其中括号里面标注的为终浓度。
图16显示为实施例3中组7、组8和组9的Ct值，NoCt为没有信号。
具体实施方式
本发明提供一种用于与ARMS引物对配合检测基因突变的封闭型荧光探针，所述封闭型荧光探针与野生型目标基因序列相互补，且5’端包含待测突变位点对应的野生型碱基，所述封闭型荧光探针一端标记有荧光报告基团，另一端标记有荧光淬灭基团。
所述ARMS引物对根据现有技术中的方法设计得到。ARMS引物对中包括突变ARMS引物，以所述ARMS引物对中3’端碱基与突变型目标基因序列相互补的引物为突变ARMS引物，该引物3’端第一个碱基与突变型模板上的突变碱基互补，与野生型模板不互补，从而将野生型模板和突变型模板区分开。突变ARMS引物3’端的第2～4位，优选第2~3位的任一碱基为错配碱基。
在本发明的某些实施方式中，所述突变ARMS引物的靶序列为突变型目标基因序列上待测突变位点至5’端，且覆盖待测突变位点的片段。为方便说明，将目标基因序列上首先发生突变的单链上的突变位点确定为0位；突变位点5’方向为负方向，突变位点3’方向为正方向；从突变位点向负方向的碱基的位数依次称为-1，-2，-3位……（如图1-1所示），所述突变ARMS引物的靶序列为第0位起始至负方向上的区域，且突变ARMS引物的3’端的第1位碱基为突变型目标基因序列上的第0位碱基。
所述突变ARMS引物可以作为上游引物，也可以作为下游引物。
所述ARMS引物对的另一条引物的靶序列为正方向上的区域。
所述封闭型荧光探针5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光猝灭基团。
所述荧光报告基团可以标记在5’端与突变型目标基因序列互补探针区域的正方向上，并且保证两个荧光标记基团之间的碱基序列对总的Tm值高于ARMS引物对的Tm值5~10℃。所述荧光猝灭基团可以标记在3’端的第一个碱基上。
所述荧光报告基团选自以下中的一种：FAM、HEX、VIC、CY3、ROX、TEXAS RED、CY5。所述荧光淬灭基团选自以下中的一种：TAMRA、BHQ1、Dabcyl、QYS-7、BHQ2。较佳的，所述荧光报告基团为FAM荧光基团，所述荧光淬灭基团为TAMRA。
所述封闭型荧光探针的Tm高于所述ARMS引物对的Tm。因此，封闭型探针优先结合在野生型模板上，实现对野生型模板的封闭作用。优选地，封闭型探针的Tm比ARMS引物对的Tm高5~15℃。具体的，封闭型探针的Tm比ARMS引物对的Tm高5~6℃、6~7℃、7~8℃、8~9℃、9~10℃、10~12℃、12~13℃或13~15℃。
在本发明的某些实施方式中，所述封闭型荧光探针为Taqman探针。
本发明中，封闭型荧光探针的靶序列与ARMS引物对的靶序列有重叠区域，有重叠区域是指二者在目标基因序列上的位置有重叠，由于封闭型荧光探针是以野生型目标基因序列设计的，ARMS引物对是以突变型目标基因序列设计的，而二者的靶序列中均包括突变位点，因此二者的靶序列重叠部分的碱基并不一定相同。
在本发明的某些实施方式中，所述封闭型荧光探针的5’端的第1位或第2位碱基为待测突变位点对应的野生型碱基。即所述封闭型荧光探针的靶序列为野生型目标基因序列上待测突变位点或待测突变位点沿5’方向的前一位点至3’端的区域，且封闭型荧光探针的5’末端与突变ARMS引物的3’末端有1~2bp的重叠区域。亦即，封闭型荧光探针的5’端的第一个碱基与突变ARMS引物的3’端的第一个碱基位置重叠，或封闭型荧光探针的5’端的前两个碱基与突变ARMS引物的3’端的前两个碱基位置重叠。
如图1-2所示，方向与图1-1相同，所述封闭型荧光探针的靶序列为第-1位或0位起始至正方向上的区域，且封闭型荧光探针的5’端的第1位或第2位碱基为野生型目标基因序列上的第0位碱基。
所述封闭型荧光探针的长度为20-30bp。
所述封闭型荧光探针的GC含量为30-80%。
所述基因突变为一个或多个核苷酸的替换。
本发明还提供所述封闭型荧光探针在制备基因突变检测产品中的用途。
本发明还提供一种检测基因突变的核苷酸组合物，所述核苷酸组合物包括所述封闭型荧光探针和ARMS引物对。
所述封闭型荧光探针的使用浓度为800~1200nM。所述封闭型荧光探针的使用浓度选自以下任一范围：800~900nM、900~1000nM、1000~1100nM或1100~1200nM。
封闭型荧光探针在使用浓度下，野生型模板的非特异扩增被完全抑制，能达到封闭野生型模板的目的，但依然能检出临界突变型样本；并且野生型样本和临界阳性样本的Ct值重复性好。
所述ARMS引物对的使用浓度为200~1200nM。所述ARMS引物对的使用浓度选自以下任一范围：200~300nM、300~400nM、400~600nM、600~800nM、800~1000nM或1000~1200nM。
本发明还提供一种检测基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括所述核苷酸组合物、PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs和dUTP。
所述PCR缓冲液通常可以向PCR体系提供最合适的酶催反应的条件。所述缓冲液只要起到上述作用即可。所述PCR缓冲液中包括其他各种核酸扩增所需要的试剂。例如，所述PCR缓冲液中包括镁离子。所述镁离子通常可以作为PCR体系中的催化剂，其可以与dNTP形成dNTP-Mg与核酸骨架相互作用，并能影响Polymerase的活性。
所述dNTPs通常作为DNA合成中的原料，具体可以包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP等。
所述试剂盒中还包括UDG酶。UDG酶用于防止实验室扩增产物气溶胶地污染。
在本发明的某些实施方式中，Taq DNA聚合酶和UDG酶的使用量（U）比值为10:1。
所述试剂盒中还包括从样品中提取基因组DNA的试剂。所述从样品中提取基因组DNA的试剂可以采用现有的试剂盒。
所述试剂盒中还包括阳性对照品、阴性对照品。在本发明的某些实施方式中，阳性对照品为待测突变位点的突变频率在30%以上的突变型模板。所述阴性对照为野生型模板。
本发明还提供一种检测基因突变的方法，所述方法包括将利用所述的核苷酸组合物或所述试剂盒，对待测DNA模板进行qPCR扩增，根据qPCR扩增结果判断待测DNA模板为野生型或突变型。
所述qPCR扩增的程序为一般qPCR程序，只要是能够不影响扩增效率和扩增曲线形态的程序均可适用。在本发明的某些实施方式中，所述扩增程序为：第一阶段：50℃ 15min，1个循环；第二阶段：95℃ 15min，1个循环；第三阶段95℃ 15s，66℃ 40s，15个循环；第四阶段95℃ 15s，60℃ 40s，35个循环。其中第一阶段用于防污染；第二阶段用于预变性；第三和四阶段用于扩增。第三阶段的退火温度较高，有利于封闭型探针优先结合到模板上，增加特异性。第四阶段60℃时收集荧光信号。
所述qPCR扩增结果选自Ct值的大小或扩增曲线。Ct值的含义是qPCR反应液中荧光信号达到所设定的阈值时的循环数。当待测样本与阴性对照品的Ct值差值小于等于2时，判定该待测样本为野生型；否则，判定该待测样本为突变型；若阴性对照品未检出Ct，则将阴性对照品的Ct值按照35计算Ct值差值。因为若阴性对照品未检出Ct，则其实际Ct必然大于35，实际的Ct值差值也必然大于按照Ct值为35计算的差值，因此该计算方法合理。
所述检测基因突变的方法为非疾病诊断或治疗目的的方法。所述检测基因突变的方法例如为研究某个基因的耐药突变或药物敏感突变，从而用于药物研发中。
本发明还提供一种设计所述封闭型荧光探针的装置，所述装置包括：
1）目标基因序列提供模块，用于提供野生型目标基因序列、突变型目标基因序列及待测突变位点；
2）探针生成模块，用于生成封闭型荧光探针，所述封闭型荧光探针与野生型目标基因序列相互补，且5’端包含待测突变位点对应的野生型碱基，所述封闭型荧光探针一端标记有荧光报告基团，另一端标记有荧光淬灭基团。
在本发明的某些实施方式中，所述探针生成模块中，所述封闭型荧光探针的5’端的第1位或第2位碱基为待测突变位点对应的野生型碱基。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例 1
实施例中以本发明方法设计一对引物和封闭型荧光探针来检测KRAS G12C基因突变。
引物、探针设计
根据COSMIC数据库公布的KRAS (Exon 2) G12C 突变(GGT>TGT)的野生型序列和突变序列（COSM516）（序列号分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，其中下划线处为突变位点），设计封闭型荧光探针Probe-B和Probe-B2，普通探针Probe-N，ARMS上游引物Primer-F、下游引物Primer-R，普通Blocker。
野生型序列：
TTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTAATATGCATATTACTGGTGCAGGACCATTCTTTGATACAGATAAAGGTTTCTCTGACCATTTTCATGAGTACTTATTACAAGATAATTATGCTGAAAGTTAAGTTATCTGAA（SEQ ID NO：1）
突变型序列：
TTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTTGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTAATATGCATATTACTGGTGCAGGACCATTCTTTGATACAGATAAAGGTTTCTCTGACCATTTTCATGAGTACTTATTACAAGATAATTATGCTGAAAGTTAAGTTATCTGAA（SEQ ID NO：2）
所设计ARMS引物长度为18-25bp，且GC含量为30-80%，产物片段在50-150bp之间。ARMS引物Primer-F在-2位引入了一个错配。
所设计探针长度为20-30bp，且GC含量为30-80%，5’端添加荧光报告基团FAM，3’端添加荧光猝灭基团TAMRA。Probe-B按照本发明中的探针设计方法设计，核苷酸序列如SEQID NO：3所示，其5’端和Primer-F的 3’端有1bp重叠，与野生型模板完全匹配；FAM基团添加在5’端第三位的T碱基上。Probe-B2按照本发明中的探针设计方法设计，核苷酸序列如SEQID NO：4所示，其5’端和Primer-F的 3’端有2bp重叠，与野生型模板完全匹配；FAM基团添加在5’端第四位的T碱基上。
引物和探针具体序列如图2。
模板
将KRAS G12C的标准品用野生型样本稀释到5ng/µL，1%突变频率，作为临界阳性样本（PL）；稀释到5ng/µL，30%突变频率，作为阳性样本（PC）。并选择了若干个野生型样本稀释到20ng/µL（WT）。
检测液
配制如图3所示的检测液，包括上下游引物、探针和（或）blocker。每条引物浓度为200-300nM。本实施例中，上下游引物浓度分别为300nM。
检测体系
配制如图4所示的反应液，包括反应所需的Taq DNA聚合酶、UDG酶、dNTPs、dUTP和缓冲液。本实施例中所述的检测酶可通过商业化购买得到，如Vazyme Champagne TaqTMDNAPolymerase, Vazyme HiScript® II Reverse Transcriptase, Vazyme heat-labile UDG酶。所述缓冲液为Taq DNA聚合酶对应2×缓冲液，里面含有Mg2+。
配制如图5所示的反应体系，包括上述所配制检测液、反应液和模板。
qPCR反应程序第一阶段：50℃ 15min，1个循环；第二阶段：95℃ 15min，1个循环；第三阶段95℃ 15s，66℃ 40s，15个循环；第四阶段95℃ 15s，60℃ 40s，35个循环。信号收集：第四阶段60℃时收集荧光信号。其中第一阶段用于防污染；第二阶段用于预变性；第三和四阶段用于扩增。使用ABI 7500 System进行检测。qPCR检测结果用Ct值来表示。Ct值的确定过程包括：以扩增过程前3-15个循环的荧光值的10倍标准差为阈值，以荧光信号达到所设定得阈值时的循环数为Ct值。
结果分析
5.1 Probe-B比Probe-N能够明显抑制非特异性扩增
检测液的组1和组4对比，在相同浓度的探针下，组1的野生型样本的Ct值明显大于组4；其Ct值都在34以上，基本没有扩增信号（数据见图6，扩增曲线图见图7）。并且如图7所示，组1的荧光信号低于组4。由此可见，组1中Probe-B有一部分是作为blocker起作用，封闭了野生型模板。同时，组1能够检测到临界阳性样本，不影响低拷贝阳性样本的检出。即Probe-B能够有效抑制野生型的非特异性扩增，同时不影响低拷贝阳性样本的检出。
增加Probe-B的浓度，抑制效果更强
检测液的组1、2和3对比，Probe-B的浓度从800nM增加到1200nM，对非特异信号抑制越明显（数据见图8，扩增曲线图见图9）。即Probe-B浓度和Ct值有浓度依存关系。因此，进一步说明Probe-B起到了封闭野生型模板的作用。当Probe-B的浓度为1200nM时，野生型模板的非特异扩增被完全抑制，但依然能检出临界阳性样本，符合检测要求；并且WT和PL的Ct值重复性好，说明该体系稳定性高。因此，该反应体系的最佳Probe-B为1200nM。
比普通Blocker起到更好地抑制非特异性扩增信号
检测液的组3中，Probe-B的浓度为1200nM。检测液的组5中，Probe-N浓度为400nM，Blocker浓度为800nM，总浓度为1200nM。在相同总浓度的情况下，组3的野生型没有非特异性扩增信号，而组5有明显的Ct值（数据见图10，扩增曲线图见图11）。由此可见，Probe-B比普通Blocker对非特异信号抑制性更强。并且，Blocker中用到了4个锁核酸（LNA），成本昂贵。因此，Probe-B可以取代普通Blocker的使用，有更好的效果，且降低成本。
和Probe-B有相同的抑制非特异性扩增信号的作用
检测液的组3和组6检测相同的样本，得到了相同的检测结果（数据见图12）。由此可见，封闭型荧光探针的5’端的第2位碱基为待测突变位点对应的野生型碱基时，也能很好地抑制非特异性扩增信号。
综上所述，根据本发明中提出的封闭型荧光探针Probe-B和Probe-B2可以明显抑制KRAS G12C的非特异性扩增信号。其效果不但优于只加Probe的反应体系，也优于同时加Probe和Blocker的反应体系。并且Probe-B和Probe-B2反应体系不影响临界阳性样本的检出。同时，野生型和临界样本的检出Ct重复性好。因此，本发明设计的封闭型荧光探针Probe-Blocker能提高复杂区域的检出信号特异性，并比Probe+ Blocker模式有更低的成本。
实施例2 检测未知样本
本实施例检测KRAS G12C基因突变的未知样本，引物序列同实施例1，检测体系如实施例1中图5所示，其中检测液选用上述效果最好的组3（见图3）。检测模板为6个未知样品中提取的DNA。DNA模板上样量为20ng/µL。用实施例1中PC作为阳性对照品，WT作为阴性对照品。根据图5进行qPCR反应。扩增结果用Ct值表示。为了排除单次实验不稳定因素造成的误差，认为当待测样本与阴性对照品的Ct值差值小于等于2时，该样本为野生型样本；否则，该样本为突变型样本。
结果如图13所示。阴性对照品没有检出Ct值，即为35。由此得知，当待测样本的Ct值大于33时，该样本为野生型样本；否则，该样本为突变型样本。实施例1的5.3结果中，使用了Probe-B的实验组的结果也都符合这个判定系统。因此，该判定系统是适用于实际情况的。
实验结果显示，未知样本1和5的Ct值小于33，判定为阳性；未知样本2、3、4和6的Ct值大于33，判定为阴性。后续将这6个未知样本用高通量测序（NGS）检测，检测结果与图12判读结果一致。
综上所述，本实施例中设计的封闭型荧光探针试剂盒可以用于未知样品的检测，准确区分出阴阳性。
实施例 3
本实施例中以本发明方法设计一对引物和封闭型荧光探针来检测TERT C228T基因突变。
引物、探针设计
根据COSMIC数据库公布的TERT（启动子）C228T的野生型序列和突变序列（序列号分别为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10，其中下划线处为突变位点），设计封闭型荧光探针Probe-BT和Probe-BT2，普通探针Probe-NT，ARMS上游引物Primer-FT、下游引物Primer-RT。
野生型序列：
GCTTCCCACGTGGCGGAGGGACTGGGGACCCGGGCACCCGTCCTGCCCCTTCACCTTCCAGCTCCGCCTCCTCCGCGCGGACCCCGCCCCGTCCCGACCCCTTCCGGGTCCCCGGCCCAGCCCCCTCCGGGCCCTCCCAGCCCCTCCCCTTCCTTTCCGCGGCCCCGCCCTCTCCTCGCGGCGCGAGTTTCAGGCAGCGCTGCGTCCTGCTGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCCCCGGCCACCCCCGCGATGCCGCGCGCTCCCCGCTGCCGAGCCGTGCGCTCCCTG
（SEQ ID NO：9）
突变型序列：
GCTTCCCACGTGGCGGAGGGACTGGGGACCCGGGCACCCGTCCTGCCCCTTCACCTTCCAGCTCCGCCTCCTCCGCGCGGACCCCGCCCCGTCCCGACCCCTTCCGGGTCCCCGGCCCAGCCCCTTCCGGGCCCTCCCAGCCCCTCCCCTTCCTTTCCGCGGCCCCGCCCTCTCCTCGCGGCGCGAGTTTCAGGCAGCGCTGCGTCCTGCTGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCCCCGGCCACCCCCGCGATGCCGCGCGCTCCCCGCTGCCGAGCCGTGCGCTCCCTG
（SEQ ID NO：10）
所设计ARMS引物长度为18-25bp，且GC含量为30-80%，产物片段在50-150bp之间。ARMS引物Primer-FT在-2位引入了一个错配。
所设计探针长度为20-30bp，且GC含量为30-80%，5’端添加荧光报告基团FAM，3’端添加荧光猝灭基团TAMRA。Probe-BT按照本发明中的探针设计方法设计，核苷酸序列如SEQID NO：11所示，其5’端和Primer-F的 3’端有1bp重叠，与野生型模板完全匹配；FAM基团添加在5’端第七位的T碱基上。Probe-BT2按照本发明中的探针设计方法设计，核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示，其5’端和Primer-FT的 3’端有2bp重叠，与野生型模板完全匹配；FAM基团添加在5’端第八位的T碱基上。
引物和探针具体序列如图14。
模板
选择了若干个野生型样本稀释到20ng/µL（WT）。
检测液
配制如图15所示的检测液，包括上下游引物、探针和（或）blocker。每条引物浓度为200-300nM。本实施例中，上下游引物浓度分别为300nM。
检测体系
配制如图4所示的反应液，包括反应所需的Taq DNA聚合酶、UDG酶、dNTPs、dUTP和缓冲液。本实施例中所述的检测酶可通过商业化购买得到，如Vazyme Champagne TaqTMDNAPolymerase, Vazyme HiScript® II Reverse Transcriptase, Vazyme heat-labile UDG酶。所述缓冲液为Taq DNA聚合酶对应2×缓冲液，里面含有Mg2+。
配制如图5所示的反应体系，包括上述所配制检测液、反应液和模板。
qPCR反应程序第一阶段：50℃ 15min，1个循环；第二阶段：95℃ 15min，1个循环；第三阶段95℃ 15s，66℃ 40s，15个循环；第四阶段95℃ 15s，60℃ 40s，35个循环。信号收集：第四阶段60℃时收集荧光信号。其中第一阶段用于防污染；第二阶段用于预变性；第三和四阶段用于扩增。使用ABI 7500 System进行检测。qPCR检测结果用Ct值来表示。Ct值的确定过程包括：以扩增过程前3-15个循环的荧光值的10倍标准差为阈值，以荧光信号达到所设定得阈值时的循环数为Ct值。
结果分析
Probe-BT和Probe-BT2比Probe-NT能够明显抑制非特异性扩增
TERT启动子基因GC含量高，容易形成二级结构，出现非特异性扩增。检测液的组7中使用的是普通探针，其野生型样本会出现明显的Ct值；而组8和组9没有扩增信号（数据见图16）。因此，Probe-BT和Probe-BT2能够有效抑制野生型的非特异性扩增。由此可见，本发明中封闭型探针设计方法也适用于TERT C228T的基因突变检测。
综上所述，本发明设计的封闭型荧光探针Probe-Blocker适用于提高复杂区域的检出信号的特异性，尤其是高GC模板（比如TERT基因启动子）和家族序列同源性较高（比如RAS基因）的基因。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海鹏冠生物医药科技有限公司
上海睿璟生物科技有限公司
<120> 一种用于检测基因突变的封闭型荧光探针
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttatgtgtga catgttctaa tatagtcaca ttttcattat ttttattata aggcctgctg 60
aaaatgactg aatataaact tgtggtagtt ggagctggtg gcgtaggcaa gagtgccttg 120
acgatacagc taattcagaa tcattttgtg gacgaatatg atccaacaat agaggtaaat 180
cttgttttaa tatgcatatt actggtgcag gaccattctt tgatacagat aaaggtttct 240
ctgaccattt tcatgagtac ttattacaag ataattatgc tgaaagttaa gttatctgaa 300
<210> 2
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttatgtgtga catgttctaa tatagtcaca ttttcattat ttttattata aggcctgctg 60
aaaatgactg aatataaact tgtggtagtt ggagcttgtg gcgtaggcaa gagtgccttg 120
acgatacagc taattcagaa tcattttgtg gacgaatatg atccaacaat agaggtaaat 180
cttgttttaa tatgcatatt actggtgcag gaccattctt tgatacagat aaaggtttct 240
ctgaccattt tcatgagtac ttattacaag ataattatgc tgaaagttaa gttatctgaa 300
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtggcgtag gcaagagtgc ctt 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggtggcgta ggcaagagtg cctt 24
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tggcgtaggc aagagtgcct t 21
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgaataaact tgtggtagtt ggagttt 27
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aatggtcctg caccagtaat atg 23
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tggagctggt ggcgtag 17
<210> 9
<211> 287
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcttcccacg tggcggaggg actggggacc cgggcacccg tcctgcccct tcaccttcca 60
gctccgcctc ctccgcgcgg accccgcccc gtcccgaccc cttccgggtc cccggcccag 120
ccccctccgg gccctcccag cccctcccct tcctttccgc ggccccgccc tctcctcgcg 180
gcgcgagttt caggcagcgc tgcgtcctgc tgcgcacgtg ggaagccctg gccccggcca 240
cccccgcgat gccgcgcgct ccccgctgcc gagccgtgcg ctccctg 287
<210> 10
<211> 287
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcttcccacg tggcggaggg actggggacc cgggcacccg tcctgcccct tcaccttcca 60
gctccgcctc ctccgcgcgg accccgcccc gtcccgaccc cttccgggtc cccggcccag 120
ccccttccgg gccctcccag cccctcccct tcctttccgc ggccccgccc tctcctcgcg 180
gcgcgagttt caggcagcgc tgcgtcctgc tgcgcacgtg ggaagccctg gccccggcca 240
cccccgcgat gccgcgcgct ccccgctgcc gagccgtgcg ctccctg 287
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gggggctggg ccggggaccc ggga 24
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agggggctgg gccggggacc cggga 25
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgcctcctcc gcgcggaccc 20
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcctgcccct tcaccttcca gct 23
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggctgggagg gcccgtaa 18
Claims (17)
1.一种用于与ARMS引物对配合检测基因突变的封闭型荧光探针，所述封闭型荧光探针与野生型目标基因序列相互补，且5’端包含待测突变位点对应的野生型碱基，所述封闭型荧光探针一端标记有荧光报告基团，另一端标记有荧光淬灭基团，且所述封闭型荧光探针的 Tm 比所述 ARMS 引物对的 Tm高5~15℃，所述封闭型荧光探针的5’端的第1位或第2位碱基为待测突变位点对应的野生型碱基；以所述ARMS引物对中3’端碱基与突变型目标基因序列相互补的引物为突变ARMS引物，所述突变ARMS引物3’端的第1位碱基为突变型目标基因序列中待测突变位点对应的突变型碱基。
2.根据权利要求1所述的封闭型荧光探针，其特征在于，所述突变ARMS引物3’端的第2～4位任一碱基为错配碱基。
3.根据权利要求1所述的封闭型荧光探针，其特征在于，所述封闭型荧光探针5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光猝灭基团。
4.根据权利要求1所述的封闭型荧光探针，其特征在于，所述荧光报告基团选自以下中的一种：FAM、HEX、VIC、CY3、ROX、TEXAS RED、CY5；和/或，所述荧光淬灭基团选自以下中的一种：TAMRA、BHQ1、Dabcyl、QYS-7、BHQ2。
5.根据权利要求1所述的封闭型荧光探针，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM荧光基团，所述荧光淬灭基团为TAMRA。
6.根据权利要求1所述的封闭型荧光探针，其特征在于，所述封闭型荧光探针为Taqman探针。
7.根据权利要求1所述的封闭型荧光探针，其特征在于，所述封闭型荧光探针的长度为20-30bp，和/或，所述封闭型荧光探针的GC含量为30-80%。
8.根据权利要求1所述的封闭型荧光探针，其特征在于，所述基因突变为一个或多个核苷酸的替换。
9.权利要求1-8任一所述的封闭型荧光探针在制备基因突变检测产品中的用途。
10.一种检测基因突变的核苷酸组合物，其特征在于，所述核苷酸组合物包括权利要求1-9任一所述的封闭型荧光探针和ARMS引物对。
11.根据权利要求10所述的核苷酸组合物，其特征在于，所述封闭型荧光探针的使用浓度为800~1200nM；和/或，所述ARMS引物对的使用浓度为200~1200nM。
12.一种检测基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求10-11任一所述的核苷酸组合物、PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs和dUTP。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括UDG酶，阳性对照品和/或阴性对照品。
14.一种非诊断非治疗目的的检测基因突变的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求10-11任一所述的核苷酸组合物或权利要求12-13任一所述的试剂盒，对待测DNA模板进行qPCR扩增，根据qPCR扩增结果判断待测DNA模板为野生型或突变型。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述qPCR扩增结果选自Ct值的大小，当待测样本与阴性对照品的Ct值差值小于等于2时，则判定待测样本为野生型；否则，判定待测样本为突变型；若阴性对照品未检出Ct，则将阴性对照品的Ct值按照35计算Ct值差值。
16.一种用于设计权利要求1-8任一所述封闭型荧光探针的装置，其特征在于，所述装置包括：
1）目标基因序列提供模块，用于提供野生型目标基因序列、突变型目标基因序列及待测突变位点；
2）探针生成模块，用于生成封闭型荧光探针，所述封闭型荧光探针与野生型目标基因序列相互补，且5’端包含待测突变位点对应的野生型碱基，所述封闭型荧光探针一端标记有荧光报告基团，另一端标记有荧光淬灭基团。
17.根据权利要求16所述的装置，其特征在于，所述探针生成模块中，所述封闭型荧光探针的5’端的第1位或第2位碱基为待测突变位点对应的野生型碱基。
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