KR20160014202A

KR20160014202A - 암의 진단 장치 및 방법

Info

Publication number: KR20160014202A
Application number: KR1020140095983A
Authority: KR
Inventors: 기창석; 김선욱; 임현숙; 김유리
Original assignee: 사회복지법인 삼성생명공익재단; 주식회사 바이오세움
Priority date: 2014-07-28
Filing date: 2014-07-28
Publication date: 2016-02-11
Also published as: KR101676838B1; WO2016018047A1

Abstract

본 발명은 암 세포의 핵산과 혼성화되는 특정 서열의 암 검출용 올리고뉴클레오타이드 군, 특정 서열의 올리고뉴클레오타이드 군을 포함하는 암 진단 키트 및 암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 기존의 gDNA를 이용하여 체세포 돌연변이(somatic mutation)를 검사하던 것과는 달리, RNA를 이용하여 특정 유전자의 돌연변이 여부에 따른 특정 암에 대한 조기 진단을 가능하게 한다. 본 발명의 방법에 따르면, gDNA로는 검출되지 않았던 돌연변이의 검출이 가능한바 한번의 RNA 추출로 모든 암 관련 유전자 돌연변이 검사가 가능하여 정확하고 신속하게 진단을 할 수 있는 이점이 있다. 특히, 본 발명의 방법은 갑상선암과 관련된 모든 돌연변이를 동시에 검사가 가능한바, 갑상선암의 진단을 신속하고 정확히 할 수 있는 효과가 있다.

Description

암의 진단 장치 및 방법{An Apparatus for Diagnosing Cancer and an Method for The Same}

본 발명은 암의 신규한 진단 장치 및 진단 방법에 관한 것이다.

세계보건기구(WHO) 산하 국제암연구소(IARC)의 보고서에 의하면 전세계 184개 국가의 신규 암 발생 건수가 2008년 1270만건이며, 2030년에는 2220만건으로 늘어날 것이라고 전망되고 있다. 현재 임상에서 암의 진단은 문진과 신체검사, 임상병리검사를 거쳐 일단 의심이 되면 방사선검사 및 내시경 검사로 진행되며, 최종적으로는 조직검사로 확인된다. 그러나 현재 사용되고 있는 임상검사법으로는 암의 세포 수가 10억 개, 암의 직경이 1 cm 이상이 되어야 진단이 가능하고, 이런 경우 이미 암세포는 전이능력을 갖고 있으며, 실제 절반 이상의 암이 이미 전이되어 있는 경우가 많아 정확하면서도 조기 진단하는 방법에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다.

특히, 최근 10년 동안 갑상선암은 매우 빠른 속도로 그 수가 증가하고 있는데, 1999년부터 2005년까지 발표된 국가암등록 사업 연례보고서에 의하면 전체 암 중 갑상선암의 발생률은 1999년 3.3%(7위)에서 2005년 8.9%(5위)로 증가하였으며, 특히 여성에서는 1999년 6.5%(7위)에서 2005년 16.7%(1위)로 유방암을 제치고 여성 암 중 가장 흔한 암이 되었다.

갑상선암은 다른 암에 비해 발병률이 높기는 하지만 진단이 조기에 이루어져 조기에 수술을 할 수 있다면 생존률이 높은 편에 속하는바, 조기에 정확하게 진단하는 방법을 구축하는 것 또한 매우 중요하다.

종래 갑상선암을 진단하는 방법은 초음파 판독 또는 갑상선 세포나 갑상선 조직의 병리조직학적 판독이 이용되었으나, 판독이 어렵거나 불분명한 경우가 많은 문제점이 있었다.

또한, 암과 관련된 유전자 돌연변이를 검출하여 진단하는 방법은 암 세포 또는 조직으로부터 DNA를 분리하여 BRAF(갑상선암, 흑색종, 대장암, 난소암, 모발상 세포 백혈병에서 돌연변이가 나타남), KRAS(갑상선암, 췌장암, 대장암, 폐암, 유방암, 전립선암에서 돌연변이가 나타남), NRAS(갑상선암, 급성백혈병, 만성백혈병, 뇌종양에서 돌연변이가 나타남) 또는 HRAS(갑상선암, 위암, 방광암, 전립선암에서 돌연변이가 나타남) 유전자 돌연변이 여부를 확인하고, DNA를 이용하여 검사가 불가능한 RET/PTC 또는 PAX8/PPARγ 유전자 재배열 돌연변이(갑상선암 특이적 돌연변이임)는 따로 RNA를 분리하여 검사를 진행하여야 하므로 DNA와 RNA를 각각 분리해야하는 불편함이 따르고, 진단에 장시간이 소요되며, 상기 유전자 중 하나의 유전자의 돌연변이만 검출할 경우 암진단에 정확도가 낮아지는 문제점이 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 암 진단을 정확하고 편리하게 하기 위한 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명의 특정 서열을 가진 프라이머 및 프로브의 올리고뉴클레오타이드 군을 이용하는 경우 암 세포 또는 조직으로부터 추출한 RNA 또는 이를 역전사시킨 cDNA를 주형으로 하여 BRAF, KRAS, NRAS 및 HRAS 유전자의 돌연변이 검출 뿐만 아니라 RET/PTC 및 PAX8/PPARγ 유전자의 재배열 검출까지 모두 가능하여 암의 진단을 정확하고 편리하게 할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 암 세포의 핵산과 혼성화되는 암 검출용 올리고뉴클레오타이드 군을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 특정 올리고뉴클레오타이드 군을 포함하는 암 진단 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 서열목록 제1서열 및 제2서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; (ⅱ) 서열목록 제4서열 내지 제7서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제8서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; (ⅲ) 서열목록 제10서열 내지 제12서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제13서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; (ⅳ) 서열목록 제15서열, 제16서열 및 제17서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; (ⅴ) 서열목록 제18서열의 프라이머, 및 서열목록 제19서열 또는 제20서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; (ⅵ) 서열목록 제23서열 및 제25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; (ⅶ) 서열목록 제24서열 및 제25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; 그리고 (ⅷ) 서열목록 제28서열, 제29서열 및 제30서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군으로 구성된 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오타이드 군으로, 상기 올리고뉴클레오타이드 군은 암 세포의 핵산과 혼성화되는 암 검출용 올리고뉴클레오타이드 군을 제공한다.

본 발명자들은 암 진단을 정확하고 편리하게 하기 위한 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명의 특정 서열을 가진 프라이머 및 프로브의 올리고뉴클레오타이드 군을 이용하는 경우 암 세포 또는 조직으로부터 추출한 RNA 또는 이를 역전사시킨 cDNA를 주형으로 하여 BRAF, KRAS, NRAS 및 HRAS 유전자의 돌연변이 검출 뿐만 아니라 RET/PTC 및 PAX8/PPARγ 유전자의 재배열 검출까지 모두 가능하여 암의 진단을 정확하고 편리하게 할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 명세서에서 용어 "프라이머(primer)"는 핵산 증폭 반응시에 증폭되는 타깃 핵산 부위의 5'말단 서열 또는 3'말단 서열에 각각 상보적이며 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소)하에서 주형-지시 핵산의 중합효소반응의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B.D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

본 명세서에서 용어 “핵산”은 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 서열목록 제1서열, 제4서열 내지 제7서열, 제10서열 내지 제12서열, 제15서열, 제16서열, 제18서열, 제23서열, 제24서열, 제28서열 및 제29서열은 포워드 프라이머(forward primer)이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 서열목록 제2서열, 제8서열, 제13서열, 제17서열, 제19서열, 제20서열, 제25서열 및 제30서열은 리버스 프라이머(reverse primer)이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 암은 갑상선암, 흑색종(melanoma), 대장암, 난소암, 모발상 세포 백혈병(hairy cell leukemia), 췌장암, 폐암, 유방암, 전립선암, 급성백혈병, 만성백혈병, 뇌종양, 위암 또는 방광암이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 암은 갑상선암이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (i)은 갑상선암, 흑색종(melanoma), 대장암, 난소암 또는 모발상 세포 백혈병(hairy cell leukemia) 세포의 핵산과 혼성화된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅱ)는 갑상선암, 췌장암, 대장암, 폐암, 유방암 또는 전립선암 세포의 핵산과 혼성화된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅲ)은 갑상선암, 급성백혈병, 만성백혈병 또는 뇌종양 세포의 핵산과 혼성화된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅳ) 또는 (ⅴ)는 갑상선암, 위암, 방광암 또는 전립선암의 핵산과 혼성화된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (i)이 서열목록 제3서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅱ)가 서열목록 제9서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅲ)이 서열목록 제14서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅳ)가 서열목록 제21서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅴ)가 서열목록 제22서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅵ)이 서열목록 제26서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅶ)이 서열목록 제27서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 또는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅷ)이 서열목록 제31서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (i)이 서열목록 제3서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅱ)가 서열목록 제9서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅲ)이 서열목록 제14서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅳ)가 서열목록 제21서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅴ)가 서열목록 제22서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅵ)이 서열목록 제26서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅶ)이 서열목록 제27서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 그리고 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅷ)이 서열목록 제31서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함한다.

본 명세서에서 용어 "프로브(probe)"는 단일쇄 핵산 분자이며, 타깃이 되는 염기서열에 상보적인 서열을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브의 이점, 즉 혼성화 특이성이 손상되지 않는 범위내에서 본 발명의 프로브를 변형할 수 있다. 예를 들어, 리포터(reporter) 형광물질 또는 형광억제물질(quencher)이 프로브 올리고뉴클레오타이드의 말단에 태깅(tagging)되어 프로브 표지로 사용될 수 있다. 본 발명의 프로브 서열에서 프로브의 표지는 당업계에서 사용하는 다양한 표지로 변경될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 서열목록 제1서열 및 제2서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; (ⅱ) 서열목록 제4서열 내지 제7서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제8서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; (ⅲ) 서열목록 제10서열 내지 제12서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제13서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; (ⅳ) 서열목록 제15서열, 제16서열 및 제17서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; (ⅴ) 서열목록 제18서열의 프라이머, 및 서열목록 제19서열 또는 제20서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; (ⅵ) 서열목록 제23서열 및 제25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; (ⅶ) 서열목록 제24서열 및 제25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; 그리고 (ⅷ) 서열목록 제28서열, 제29서열 및 제30서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군으로 구성된 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오타이드 군을 포함하는 암 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 갑상선암, 흑색종(melanoma), 대장암, 난소암 또는 모발상 세포 백혈병(hairy cell leukemia) 진단 키트는 올리고뉴클레오타이드 군 (i)을 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 갑상선암, 췌장암, 대장암, 폐암, 유방암 또는 전립선암 진단 키트는 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅱ)를 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 갑상선암, 급성백혈병, 만성백혈병 또는 뇌종양 진단 키트는 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅲ)을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 갑상선암, 위암, 방광암 또는 전립선암 진단 키트는 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅳ) 및/또는 (ⅴ)를 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 진단 키트는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (i)이 서열목록 제3서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅱ)가 서열목록 제9서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅲ)이 서열목록 제14서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅳ)가 서열목록 제21서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅴ)가 서열목록 제22서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅵ)이 서열목록 제26서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅶ)이 서열목록 제27서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 또는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅷ)이 서열목록 제31서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 진단 키트는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (i)이 서열목록 제3서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅱ)가 서열목록 제9서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅲ)이 서열목록 제14서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅳ)가 서열목록 제21서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅴ)가 서열목록 제22서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅵ)이 서열목록 제26서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅶ)이 서열목록 제27서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 그리고 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅷ)이 서열목록 제31서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 진단 키트는 역전사 효소(Reverse transcriptase)를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 인간으로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 얻는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 핵산의 (ⅰ) BRAF 유전자의 돌연변이 검출, (ⅱ) KRAS 유전자의 돌연변이 검출, (ⅲ) NRAS 유전자의 돌연변이 검출, (ⅳ) HRAS 유전자의 돌연변이 검출, (ⅴ) RET/PTC 유전자의 재배열 검출 및 (ⅵ) PAX8/PPARγ 유전자의 재배열 검출로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출을 실시하는 단계를 포함하는 암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a) : 인간으로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산 획득

본 발명에 따르면, 우선 인간으로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 얻는다.

본 명세서에서 용어 “생물학적 시료”는 체외로 분리된 동물의 생체 시료로서, 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 골수, 세포, 모발 또는 조직 시료를 의미하며, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 생물학적 시료는 특정 세포 또는 조직 시료이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 생물학적 시료는 갑상선 세포 또는 조직 시료이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 핵산은 RNA이다.

단계 (b) : 특정 유전자 돌연변이 및/또는 유전자 재배열 검출

단계 (a) 실시 후, 상기 단계 (a)에서 획득한 핵산의 (ⅰ) BRAF 유전자의 돌연변이, (ⅱ) KRAS 유전자의 돌연변이, (ⅲ) NRAS 유전자의 돌연변이, (ⅳ) HRAS 유전자의 돌연변이, (ⅴ) RET/PTC 유전자의 재배열 및/또는 (ⅵ) PAX8/PPARγ 유전자의 재배열 검출을 실시한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 검출은 증폭반응을 이용하여 실시한다.

본 명세서에서 용어 “증폭반응”이란 유전자(gene) 또는 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

중합효소연쇄반응(PCR)은 가장 잘 알려진 유전자 또는 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 본 발명의 진단방법에는 전통적인 PCR 방법 뿐 아니라, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시킨, 터치다운(touchdown) PCR(24), 핫 스타트(hot start) PCR(25, 26), 네스티드(nested) PCR(2) 및 부스터(booster) PCR(27)을 이용할 수 있다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR을 사용할 수도 있다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 검출은 실-시간 PCR을 이용하여 실시한다. 실-시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실-시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다(Levak KJ, et al., PCR Methods Appl ., 4(6): 357-62(1995)). PCR 생산물의 증가가 타겟 템플레이트의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 Ct 값(threshold cycle)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다. 종래의 PCR 방법에 비해, 실-시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실-시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.

PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실-시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 한계치(threshold)를 설정하면 한계치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 Ct 값이 산출된다. 실-시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 interchelating 방법(SYBR 그린 I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. interchelating 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트는 TaqMan 프로브 방법을 이용한다.

먼저, interchelating 방법은 이중 가닥 DNA 결합 다이를 이용하는 방법으로, 비-서열 특이적 형광 intercalating 시약(SYBR 그린 I 또는 ethidium bromide)을 이용하여 비-특이적 증폭 및 프라이머-다이머 복합체를 포함하는 앰플리콘 생산을 정량하는 것이다. 상기 시약은 ssDNA와는 결합하지 않는다. SYBR 그린 I은 이중 가닥 DNA의 마이너 그루브(minor groove)에 결합하는 형광성 다이로, 용액 상에서는 거의 형광을 보이지 않지만 이중 가닥 DNA와 결합하면 강한 형광을 나타내는 시약(interchelator)이다(Morrison TB, Biotechniques., 24(6): 954-8, 960, 962(1998)). 따라서 SYBR 그린 I과 이중 가닥 DNA 간의 결합을 통해 형광을 방출하기 때문에 증폭 산물의 생성량을 측정할 수 있다. SYBR 그린 실-시간 PCR은 앰플리콘 동정을 위해 융해점(melting point) 또는 해리 곡선(dissociation curve) 분석과 같은 최적화 과정을 동반한다. 정상적으로 SYBR 그린은 싱글플렉스(singleplex) 반응에 이용되지만, 융해곡선(melting curve) 분석이 동반되면 멀티플렉스(multiplex) 반응에 이용될 수 있다(Siraj AK, et al., Clin Cancer Res ., 8(12): 3832-40(2002); 및 Vrettou C., et al., Hum Mutat ., Vol 23(5): 513-521(2004)).

Ct(cycle threshold) 값은 반응에서 발생된 형광이 역치(threshold)를 넘어서는 사이클 수를 의미하며, 이는 초기 카피 수의 대수에 반비례한다. 그러므로, 특정 웰에 할당된 Ct 값은 반응에서 앰플리콘의 충분한 수가 축적된 사이클의 수를 반영한다. Ct 값은 ΔRn의 증가가 처음으로 검출된 사이클이다. Rn은 각 시점에서 PCR 동안 발생된 형광 시그널의 크기를 의미하며, ΔRn은 레퍼런스 다이의 형광 방출 강도로 나뉘어진 리포터 다이의 형광방출 강도(표준화된 리포터 시그널)를 의미한다. Ct 값은 LightCycler에서는 Cp(crossing point)로도 명명된다. Ct 값은 시스템이 로그-선형 단계(log-linear phase)에서 PCR 생산물의 지수성장과 관련된 형광 시그널의 증가를 검출하기 시작하는 시점을 나타낸다. 이 시기는 반응에 대한 가장 유용한 정보를 제공한다. 로그-선형 단계의 기울기는 증폭 효율(amplification efficiency, Eff)을 나타낸다(http://www.appliedbiosystems.co.kr/).

한편, TaqMan 프로브는 전형적으로 5'-말단에 형광물질(fluorophore) 및 3'-말단에 퀀처(quencher; 예컨대, TAMRA 또는 비-형광 퀀처(NFQ))를 포함하는 프라이머(예컨대, 20-30 뉴클레오타이드) 보다 더 긴 올리고뉴클레오타이드이다. 여기된 형광물질은 형광을 내기 보다는 근처의 퀀처에 에너지를 전달한다(FRET = Frster or fluorescence resonance energy transfer; Chen, X., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94(20): 10756-61(1997)). 그러므로, 프로브가 정상인 경우, 어떠한 형광도 발생되지 않는다. TaqMan 프로브는 PCR 생산물의 내부 부위에 어닐링할 수 있도록 고안된다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 TaqMan 프로브는 서열목록 제3서열, 서열목록 제9서열, 서열목록 제14서열, 서열목록 제21서열, 서열목록 제22서열, 서열목록 제26서열, 서열목록 제27서열 또는 서열목록 제31서열을 포함하는 서열로 고안될 수 있다.

TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서 템플레이트 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브 상에 퀀처에 의해 형광발색이 억제된다. 연장 반응 시에 Taq DNA 폴리머라제가 갖는 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 템플레이트에 혼성화한 TaqMan 프로브가 분해되어 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 퀀처에 의한 억제가 해제되어 형광은 나타낸다. 이 때, TaqMan 프로브의 5'-말단은 상기 연장 프라이머의 3'-말단의 다운스트림에 위치하여야 한다. 즉, 연장 프라이머의 3'-말단이 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 연장되는 경우, 이 중합효소의 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 TaqMan 프로브의 5'-말단이 절단되어 리포터 분자의 형광 시그널이 발생하게 된다.

TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 형광성 물질 및 비형광성 물질을 포함한다. 본 발명에 이용될 수 있는 형광성 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있으며, 그 예는 다음과 같다(괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다): Cy2^TM(506), YOPRO^TM-1(509), YOYO^TM-1(509), Calcein(517), FITC(518), FluorX^TM(519), Alexa^TM(520), Rhodamine 110(520), 5-FAM(522), Oregon Green^TM500 (522), Oregon Green^TM488(524), RiboGreen^TM(525), RhodamineGreen^TM(527), Rhodamine 123(529), Magnesium Green^TM(531), Calcium Green^TM(533), TO-PRO^TM-1(533), TOTO1(533), JOE(548), BODIPY530/550(550), Dil(565), BODIPY ^TMR(568), BODIPY558/568(568), BODIPY564/570(570), Cy3^TM(570), Alexa^TM546(570), TRITC(572), Magnesium Orange^TM(575), Phycoerythrin R&B(575), Rhodamine Phalloidin(575), Calcium Orange^TM(576), Pyronin Y(580), RhodamineB(580), TAMRA(582), Rhodamine Red^TM(590), Cy3.5^TM(596), ROX(608), Calcium Crimson^TM(615), Alexa^TM594(615), Texas Red(615), Nile Red(628), YO-PRO^TM-3(631), YOYO^TM-3(631), R-phycocyanin(642), CPhycocyanin(648), TO-PRO^TM-3(660), TOTO3(660), DiD DilC(5)(665), Cy5^TM(670), Thiadicarbocyanine(671), Cy5.5(694), HEX(556), TET(536), VIC(546), BHQ-1(534), BHQ-2(579), BHQ-3(672), BiosearchBlue(447), CAL Fluor Gold 540(544), CAL Fluor Orange 560(559), CAL Fluor Red 590(591), CAL FluorRed 610(610), CAL Fluor Red 635(637), FAM(520), Fluorescein(520), Fluorescein-C3(520), Pulsar 650(566), Quasar 570(667), Quasar 670(705) 및 Quasar 705(610). 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 VIC 및 FAM 표지를 포함한다.

적합한 리포터-퀀처 쌍(pairs)은 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al., editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY(Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2nd EDITION (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES(Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, INDICATORS(Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS(Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE(Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; U.S. Pat. Nos. 3,996,345 and 4,351,760.

또한, TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자에 이용되는 비형광성 물질은 마이너 그루브 결합 모이어티(minor groove binding(MGB) moiety)를 포함할 수 있다. 본 명세서의 용어 "MGB-컨쥬게이트 프로브(MGB-conjugate probe)"는 프로브의 3'-말단에 MGB와 컨쥬게이션된 프로브를 의미한다. MGB는 높은 친화도로 DNA의 마이너 그루브에 결합하는 물질로서, 네트롭신(netropsin), 디스타마이신(distamycin), 렉시트롭신(lexitropsin), 미트라마이신(mithramycin), 크로모마이신(chromomycin) A3, 올리보마이신(olivomycin), 안트라마이신(anthramycin), 시비로마이신(sibiromycin), 펜타미딘(pentamidine), 스틸바미딘(stilbamidine), 베레닐(berenil), CC-1065, Hoechst 33258, DAPI(4-6-diamidino-2-phenylindole), CDPI의 다이머, 트리머, 테트라머 및 펜타머, MPC(N-methylpyrrole-4-carbox-2-amide) 및 이의 다이머, 트리머, 테트라머 및 펜타머를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

프로브와 MGB의 컨쥬게이션(conjugation)은 프로브와 이의 타겟 간에 형성되는 하이브리드의 안정성을 현저하게 증가시킨다. 보다 상세하게는, 증가된 안정성(즉, 혼성화 정도의 증가)는 정상 프로브와 비교하여 MGB-컨쥬게이트 프로브에 의해 형성된 하이브리드 듀플렉스의 증가된 Tm(melting temperature)을 유발한다. 따라서, MGB는 반데르발스 힘을 안정화시켜 프로브 길이의 증가 없이 MGB-컨쥬게이트 프로브의 Tm(melting temperature)를 증가시킴으로써 보다 엄격 조건 하의 Taqman 실-시간 PCR에서 더 짧은 프로브(예컨대, 21개 이하의 뉴클레오타이드)의 이용을 가능하게 해 준다.

또한, MGB-컨쥬게이트 프로브는 백그라운드 형광을 보다 효율적으로 제거시켜 준다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브의 5'-말단은 VIC 또는 FAM의 형광물질(fluorophore)로 표지되며, 3'-말단은 MGBNFQ 및 IntZEN-3IABIK로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 퀀처(quencher)로 변형될 수 있다.

보다 구체적으로는, 본 발명의 서열목록 제3서열, 제14서열, 제27서열, 제31서열 및 제37서열은 5'-말단의 형광물질로 VIC 및 3'-말단에 퀀처로 MGBNFQ를 이용하고, 본 발명의 서열목록 제9서열은 5'-말단의 형광물질로 FAM 및 3'-말단에 퀀처로 MGBNFQ를 이용하며, 본 발명의 서열목록 제21서열, 제22서열, 제26서열 및 제34서열은 5'-말단의 형광물질로 FAM 및 3'-말단에 퀀처로 IntZEN-3IABIK를 이용한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 핵산이 RNA인 경우 본 발명의 단계 (b)는 상기 RNA를 cDNA로 전사시키는 역전사 단계 (pre-b)를 추가적으로 포함한다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (pre-b)는 45-55℃에서 20-40분 동안 실시한다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명이 단계 (pre-b)를 추가적으로 포함하는 경우 본 발명의 검출은 중합효소연쇄반응을 이용하여 실시한다. 본 발명의 검출은 역전사 중합효소연쇄반응에 의하여서도 실시할 수 있는데, 상기 역전사 중합효소연쇄반응은 상기 단계 (pre-b)와 중합효소연쇄반응을 결합한 반응과 동일하다.

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 중합효소연쇄반응은 (a') 90-100℃에서 5분-15분 동안 지속시키는 단계; (b') 90-100℃에서 10-20초 및 55-65℃에서 40-50초 동안 지속시키는 단계; 및 (c') 상기 단계 (b')를 40-50회 반복하는 단계를 포함한다.

본 발명의 검출은 상술한 유전자 증폭방법 이외에 혼성화법(hybridization), 면역분석법(immunoassay) 또는 마이크로어레이(microarray)를 이용하여 실시할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, (i) 본 발명의 BRAF 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제1서열 및 제2서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나; (ⅱ) 본 발명의 KRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제4서열 내지 제7서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제8서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나; (ⅲ) 본 발명의 NRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제10서열 내지 제12서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제13서열의 의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나; (ⅳ) 본 발명의 HRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제15서열, 제16서열 및 제17서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; 또는 서열목록 제18서열의 프라이머, 및 서열목록 제19서열 또는 제20서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나; (ⅴ) 본 발명의 RET/PTC 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제23서열 및 제25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; 또는 서열목록 제24서열 및 제25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나; 또는 (ⅵ) 본 발명의 PAX8/PPARγ 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제28서열, 제29서열 및 제30서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, (i) 본 발명의 BRAF 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제1서열 및 제2서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나; (ⅱ) 본 발명의 KRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제4서열 내지 제7서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제8서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나; (ⅲ) 본 발명의 NRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제10서열 내지 제12서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제13서열의 의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나; (ⅳ) 본 발명의 HRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제15서열, 제16서열 및 제17서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; 또는 서열목록 제18서열의 프라이머, 및 서열목록 제19서열 또는 제20서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나; (ⅴ) 본 발명의 RET/PTC 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제23서열 및 제25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; 또는 서열목록 제24서열 및 제25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나; 그리고 (ⅵ) 본 발명의 PAX8/PPARγ 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제28서열, 제29서열 및 제30서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, (i) 본 발명의 BRAF 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제3서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나; (ⅱ) 본 발명의 KRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제9서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나; (ⅲ) 본 발명의 NRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제14서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나; (ⅳ) 본 발명의 HRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제21서열 또는 제22서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나; (ⅴ) 본 발명의RET/PTC 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제26서열 또는 제27서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나; 또는 (ⅵ) 본 발명의 PAX8/PPARγ 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제31서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용한다.

본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, (i) 본 발명의 BRAF 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제3서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나; (ⅱ) 본 발명의 KRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제9서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나; (ⅲ) 본 발명의 NRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제14서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나; (ⅳ) 본 발명의 HRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제21서열 또는 제22서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나; (ⅴ) 본 발명의RET/PTC 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제26서열 또는 제27서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나; 그리고 (ⅵ) 본 발명의 PAX8/PPARγ 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제31서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 암 세포의 핵산과 혼성화되는 특정 서열의 암 검출용 올리고뉴클레오타이드 군, 특정 서열의 올리고뉴클레오타이드 군을 포함하는 암 진단 키트 및 암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

(b) 본 발명의 방법은 기존의 gDNA를 이용하여 체세포 돌연변이(somatic mutation)를 검사하던 것과는 달리, RNA를 이용하여 특정 유전자의 돌연변이 여부에 따른 특정 암에 대한 조기 진단을 가능하게 한다.

(c) 본 발명의 방법에 따르면, gDNA로는 검출되지 않았던 돌연변이의 검출이 가능한 바 한번의 RNA 추출로 모든 암 관련 유전자 돌연변이 검사가 가능하여 정확하고 신속하게 진단을 할 수 있는 이점이 있다.

(d) 특히, 본 발명의 방법은 갑상선암과 관련된 모든 돌연변이를 동시에 검사가 가능한바, 갑상선암의 진단을 신속하고 정확히 할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 암(예컨대, 갑상선암)의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 신규한 방법에 대한 개요이다.
도 2는 BRAF V600E 돌연변이 검출을 위한 프라이머 및 프로브 고안방법을 나타낸다.
도 3은 KRAS 돌연변이 검출을 위한 프라이머 및 프로브 고안방법을 나타낸다.
도 4는 NRAS 돌연변이 검출을 위한 프라이머 및 프로브 고안방법을 나타낸다.
도 5는 HRAS 돌연변이 검출을 위한 프라이머 및 프로브 고안방법을 나타낸다.
도 6은 RET/PTC1 돌연변이 검출을 위한 프라이머 및 프로브 고안방법을 나타낸다.
도 7은 RET/PTC3 돌연변이 검출을 위한 프라이머 및 프로브 고안방법을 나타낸다.
도 8은 PAX8/PPARγ 돌연변이 검출을 위한 프라이머 및 프로브 고안방법을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: RNA 시료 준비

KRAS G12S/G12C/G12D/G12A/G12V/G13D, NRAS Q61R/Q61K/Q61L, HRAS G12V/Q61R, BRAF V600E 돌연변이를 포함하고 있는 각각의 양성 세포주로부터 HighPure RNA Isolation Kit(Roche사, 스위스)를 사용하여 RNA를 분리 후 사용하였다. 상기 양성 세포주의 출처는 하기 표 1에 기재하였다.

양성 세포주를 획득하지 못한 RET/PTC1, RET/PTC3, PAX8/PPARg, KRAS G12R, HRAS G13R/Q61K 돌연변이의 경우 상기 돌연변이의 일부를 포함하도록 Integrated DNA Technologies사를 통해 인공적으로 유전자를 합성(gBlock Gene Fragment)한 후 이를 pGEM®-T easy Vector(Promega, Madison, 미국)에 도입한 플라스미드 DNA를 사용하였다. 상기 합성한 유전자 서열은 서열목록 제38서열(RET/PTC1 돌연변이), 서열목록 제39서열(RET/PTC3 돌연변이), 서열목록 제40서열(PAX8/PPARg exon 7 돌연변이), 서열목록 제41서열(PAX8/PPARg exon 9 돌연변이), 서열목록 제42서열(KRAS G12R 돌연변이) 및 서열목록 제43서열(HRAS G13R/Q61K 돌연변이)이다.

* KCLB(Korean Cell Line Bank, 한국세포주은행, 대한민국)

* ATCC(American Type Culture Collection, 미국)

실시예 2: cDNA 시료 준비

Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche사, 스위스)을 이용하여 실시예 1에서 분리한 세포주의 RNA를 cDNA로 합성하였다.

실시예 3: 돌연변이 검출을 위한 프라이머 및 프로브 고안

BRAF 유전자 돌연변이 검출

BRAF 유전자 엑손(exon) 15 내 V600E 돌연변이를 확인을 위하여 엑손 15 내에 포워드 프라이머(BRAF-PF3), 리버스 프라이머(BRAF-PR3-1) 및 형광 프로브(BRAF-PP1)가 존재하도록 고안하여 RNA를 주형으로 검사가 가능하도록 하였다. 프라이머 및 프로브 서열은 표 2과 같다.

KRAS 유전자 돌연변이 검출

KRAS 유전자 엑손 2 내에 포워드 프라이머(KRAS-c34-F10, KRAS-C34T-F1, KRAS-c35-F11 또는 KRAS-c38-F2), 리버스 프라이머(KRAS-1R) 및 형광 프로브(MGB3(FAM))가 존재하도록 고안하여 RNA를 주형으로 검사가 가능하도록 하였다. 프라이머 및 프로브 서열은 표 3와 같다.

NRAS 유전자 돌연변이 검출

NRAS 유전자 엑손 3 내에 포워드 프라이머(NRAS Q61L-F6, NRAS Q61K-F6 또는 NRAS Q61R-F8), 리버스 프라이머(NRAS R1) 및 형광 프로브(NRAS Probe(VIC))가 존재하도록 고안하여 RNA를 주형으로 검사가 가능하도록 하였다. 프라이머 및 프로브 서열은 표 4과 같다.

HRAS 유전자 돌연변이 검출

HRAS 유전자 엑손 2 내에 포워드 프라이머(HRAS G12V-F5 또는 HRAS G13R-F4), 리버스 프라이머(HRAS 12,13-R1) 및 형광 프로브(HRAS 12,13_ZEN probe(FAM))가 존재하도록 고안하고, 엑손 3 내에 포워드 프라이머(HRAS 61-F1), 리버스 프라이머(HRAS Q61K-R3 또는 HRAS Q61R-R10) 및 형광 프로브(HRAS 61_ZEN probe(FAM))가 존재하도록 고안하여 RNA를 주형으로 검사가 가능하도록 하였다. 프라이머 및 프로브 서열은 표 5와 같다.

RET / PTC 재배열 돌연변이 유전자 돌연변이 검출

RET/PTC 재배열 돌연변이의 경우 RET/PTC1 형과 RET/PTC3 형으로 구분할 수 있는데, RET/PTC1 재배열 돌연변이는 CCDC6 유전자의 엑손 1에 포워드 프라이머(R/P1-F1) 및 형광 프로브(ZEN(P1))가 위치하게 하고, 리버스 프라이머(R/P1,P3-R2)는 RET 유전자의 엑손 12에 위치하도록 고안하여 CCDC6/RET 재배열 돌연변이 검사가 가능하도록 하였다.

RET/PTC3 재배열 돌연변이는 NCOA4 유전자의 엑손 11에 포워드 프라이머(R/R3-F1) 및 형광 프로브(MGB-P3)가 위치하게 하고, 리버스 프라이머(R/P1,P3-R2)는 RET 유전자의 엑손 12에 위치하도록 고안하여 NCOA4/RET 재배열 돌연변이 검사가 가능하도록 하였다.

프라이머 및 프로브 서열은 표 6와 같다.

PAX8 / PPAR γ 재배열 돌연변이 유전자 돌연변이 검출

RET/PTC 재배열 돌연변이의 경우 PAX8 유전자의 엑손 9와 PPARγ의 엑손 1이 재배열된 것과 PAX8 유전자의 엑손 7과 PPARγ의 엑손 1이 재배열된 것으로 구분할 수 있는데, 포워드 프라이머를 PAX8 유전자의 엑손 7(PASX8-7-F2)과 엑손 9(PAX8-9-F3-3(KIS))의 두 군데 위치에 위치시키고 형광 프로브(PAX8 MGB(VIC))와 리버스 프라이머(PPARg-1R)를 PPARγ 유전자의 엑손 1에 위치하도록 고안함으로써, 한번에 두 가지의 PAX8/PPARγ 재배열 돌연변이 검출이 가능하도록 하였다. 프라이머 및 프로브 서열은 표 7과 같다.

실시예 4: 실시간 역전사 중합효소연쇄반응( Real time reverse transcription polymerase chain reaction ) 또는 실시간 중합효소연쇄반응( Real time polymerase chain reaction )

상기 실시예 3 유전자의 주요 돌연변이를 확인하기 위하여, 상기 대상집단으로부터 분리한 RNA를 이용하여 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(one-step real-time reverse transcription PCR) 또는 상기 RNA를 cDNA로 합성한 후 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 실시하였다. 상기 RNA의 cDNA로의 합성은 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche사, 스위스)를 이용하였다.

실시간 역전사 중합효소연쇄반응 또는 실시간 중합효소 연쇄반응에 사용된 프라이머 및 프로브 서열은 실시예 3과 같다.

세포에서 RNA가 잘 추출되어 검사에 적당한 양으로 포함되어 있는지 및 중합효소연쇄반응에 문제가 없는지를 확인하기 위하여 KRT7 또는 GAPDH 유전자의 실시간 역전사 중합효소연쇄반응을 대조군으로 수행하였다. 상기 KRT7 또는 GAPDH 유전자에 대한 프라이머 및 프로브 서열은 표 8과 같다.

상기 프로브에는 증폭산물의 크기를 확인할 수 있도록 형광물질인 플로레신(Fluorescein, FAM) 또는 VIC(Applied Biosystems)를 부착하였다.

상기 정방향 프라이머 1 μL, 역방향 프라이머 1 μL, RNA 시료 5 μL, 증류수 3.5 μL, 2X RT-PCR 프리믹스(Nanohelix, 대한민국) 12.5 μL, RT-PCR 효소 혼합물(Nanohelix, 대한민국) 1 μL를 혼합하여, ① 50℃(30분, 1 회); ② 95℃(10분, 1회); ③ 95℃(15초)-60℃(45초)(45회)의 조건으로 실시간 역전사 중합효소연쇄반응을 수행하였다. RNA 시료 대신 cDNA 시료를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 경우 상기 단계 ①을 수행하지 않고 단계 ② 및 단계 ③만을 수행하였다.

실시예 5: 돌연변이 확인

양성 세포주를 사용한 결과에서 KRT7과 GAPDH가 모두 Ct(Threshold cycle, Threshold와 접점을 나타내는 형광신호의 사이클 수를 의미함) 11.3-27.4의 범위 내 증폭하여 RNA 추출 및 cDNA 합성에 문제 없음을 확인하였으며, Ct 38 미만인 경우 양성 돌연변이로 판단할 수 있다. KRAS 돌연변이 세포주의 경우 KRAS Ct가 22.7-26.2의 범위 내 증폭하여 KRAS 돌연변이 양성을 확인하였다. NRAS 돌연변이 세포주의 경우 NRAS Ct가 25.8-30.5 의 범위 내 증폭하여 NRAS 돌연변이 양성을 확인하였다. HRAS 돌연변이 세포주의 경우 HRAS Ct가 23.3-31.5 의 범위 내 증폭하여 HRAS 돌연변이 양성을 확인하였다. 양성 플라스미드 DNA를 사용한 경우 KRT7과 GAPDH Ct는 확인할 수 없고, 각 돌연변이별로 Ct 20.7-22.7 로 확인되어 각 돌연변이 양성을 확인하였다.

결과적으로 본 발명의 프라이머 및 실시간 중합효소 연쇄반응 조건을 이용하여 상기 유전자의 돌연변이의 양성을 모두 확인할 수 있는바, 각 프라이머 또는 이들의 조합을 이용하여 상기 유전자에 대한 돌연변이를 가지는 암에 대한 진단이 가능함을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION BIOSEWOOM, INC. <120> An Apparatus for Diagnosing Cancer and an Apparatus for The Same <130> PN140031 <160> 43 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF-PF3 <400> 1 atatatttct tcatgaagac ctcacagtaa aa 32 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF-PR3-1 <400> 2 ggacccactc catcgagata cctc 24 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF-PP1 <400> 3 taggtgattt tggtctagct aca 23 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS-c34-F10 <400> 4 cttgtggtag ttggaggth 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS-C34T-F1 <400> 5 cttgtggtag ttggaggtt 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS-c35-F11 <400> 6 ttgtggtagt tggagctch 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS-c38-F2 <400> 7 gtggtagttg gagctggtca 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS-1R <400> 8 ttgttggatc atattcgtcc ac 22 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MGB3(FAM) <400> 9 acgatacagc taattca 17 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NRAS Q61L-F6 <400> 10 actggataca gctggagt 18 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NRAS Q61K-F6 <400> 11 catactggat acagctgtaa 20 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NRAS Q61R-F8 <400> 12 ctggatacag ctggtcg 17 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NRAS R1 <400> 13 ccttcgcctg tcctcatgta tt 22 <210> 14 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NRAS Probe(VIC) <400> 14 cagtgccatg agagac 16 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRAS G12V-F5 <400> 15 ggtggtgggc gcctt 15 <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRAS G13R-F4 <400> 16 tagtgggcgc cgtcc 15 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRAS 12,13-R1 <400> 17 gggtcgtatt cgtccacaaa a 21 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRAS 61-F1 <400> 18 cggaagcagg tggtcattg 19 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRAS Q61K-R3 <400> 19 ggcgctgtac tcctcatt 18 <210> 20 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRAS Q61R-R10 <400> 20 gcgctgtact cctcgc 16 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRAS 12,13_ZEN probe(FAM) <400> 21 tgcgctgacc atccagctga tcc 23 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRAS 61_ZEN probe(FAM) <400> 22 tgtccaacag gcacgtctcc cca 23 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R/P1-F1 <400> 23 ggagacctac aaactgaagt gcaa 24 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R/R3-F1 <400> 24 ccagtggtta tcaagctcct taca 24 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R/P1,P3-R2 <400> 25 aaccaagttc ttccgaggga a 21 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZEN(P1) <400> 26 tggctttgcg caggtcgcg 19 <210> 27 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MGB-P3 <400> 27 ttggataagc cagtcct 17 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PASX8-7-F2 <400> 28 aacctctcga ctcaccagac cta 23 <210> 29 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX8-9-F3-3(KIS) <400> 29 caccagcgga cagggc 16 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPARg-1R <400> 30 caaagttggt gggccagaa 19 <210> 31 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX8 MGB(VIC) <400> 31 ttgacacaga gatgcc 16 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRT7-F1 <400> 32 ccacccacaa tcacaagaag att 23 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRT7-R1 <400> 33 tcactttcca gactgtctca ctgtct 26 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRT7-ZEN probe(FAM) <400> 34 ccacccctgc ctcccatgcc 20 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-F1(020713) <400> 35 ccacccatgg caaattcc 18 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-R1(020713) <400> 36 tgacaagctt cccgttctca 20 <210> 37 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-Probe(020713) <400> 37 tggcaccgtc aagg 14 <210> 38 <211> 400 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RET/PTC1 <400> 38 catctcgccg ttccgcctgg aggagctcac caaccgcctg gcctcgctgc agcaagagaa 60 caaggtgctg aagatagagc tggagaccta caaactgaag tgcaaggcac tgcaggagga 120 gaaccgcgac ctgcgcaaag ccagcgttac catcgaggat ccaaagtggg aattccctcg 180 gaagaacttg gttcttggaa aaactctagg agaaggggaa tttggaaaag tggtcaaggc 240 aacggccttc catctgaaag gcagaggagg gtacaccacg gtggccgtga agatgctgaa 300 agagaacgcc tccccgagtg agcttcgaga cctgctgtca gagttcaacg tcctgaagca 360 ggtcaaccac cctcatgtca tcaaattgta tggggcctgc 400 <210> 39 <211> 480 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RET/PTC3 <400> 39 accattcaaa ttcctgagca cttgatggct catgctagtt cagcaaatat tgggcccttc 60 ctggagaaga gaggctgtat ctccatgcca gagcagaagt cagcatccgg tattgtagct 120 gtccctttca gcgaatggct ccttggaagc aaacctgcca gtggttatca agctccttac 180 atacccagca ccgaccccca ggactggctt atccaaaagc agaccttgga gaacagtcag 240 gaggatccaa agtgggaatt ccctcggaag aacttggttc ttggaaaaac tctaggagaa 300 ggggaatttg gaaaagtggt caaggcaacg gccttccatc tgaaaggcag aggagggtac 360 accacggtgg ccgtgaagat gctgaaagag aacgcctccc cgagtgagct tcgagacctg 420 ctgtcagagt tcaacgtcct gaagcaggtc aaccaccctc atgtcatcaa attgtatggg 480 480 <210> 40 <211> 494 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX8/PPARg exon7 <400> 40 gactcacaga gcagcagcag cggaccccga aagcaccttc gcacggatgc cttcagccag 60 caccacctcg agccgctcga gtgcccattt gagcggcagc actacccaga ggcctatgcc 120 tcccccagcc acaccaaagg cgagcagggc ctctacccgc tgcccttgct caacagcacc 180 ctggacgacg ggaaggccac cctgacccct tccaacacgc cactggggcg caacctctcg 240 actcaccaga cctaccccgt ggtggcagat gaccatggtt gacacagaga tgccattctg 300 gcccaccaac tttgggatca gctccgtgga tctctccgta atggaagacc actcccactc 360 ctttgatatc aagcccttca ctactgttga cttctccagc atttctactc cacattacga 420 agacattcca ttcacaagaa cagatccagt ggttgcagat tacaagtatg acctgaaact 480 tcaagagtac caaa 494 <210> 41 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX8/PPARg exon9 <400> 41 aaagcaggaa acccccgagg tgtccagttc tagctccacc ccttgctctt tatctagctc 60 cgcccttttg gatctgcagc aagtcggctc cggggtcccg cccttcaatg cctttcccca 120 tgctgcctcc gtgtacgggc agttcacggg ccaggccctc ctctcagggc gagagatggt 180 ggggcccacg ctgcccggat acccacccca catccccacc agcggacagg gcagctatgc 240 ctcctctgcc atcgcaggca tggtggcaga tgaccatggt tgacacagag atgccattct 300 ggcccaccaa ctttgggatc agctccgtgg atctctccgt aatggaagac cactcccact 360 cctttgatat caagcccttc actactgttg acttctccag catttctact ccacattacg 420 aagacattcc attcacaaga acagatccag tggttgcaga ttacaagtat gacctgaaac 480 ttcaagagta ccaaa 495 <210> 42 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS G12R <400> 42 ataaggcctg ctgaaaatga ctgaatataa acttgtggta gttggagctc gtggcgtagg 60 caagagtgcc ttgacgatac agctaattca gaatcatttt gtggacgaat atgatccaac 120 aatagaggta aatcttgttt taatatgcat attactggtg caggaccatt ctttgataca 180 gataaaggtt tctctgacca 200 <210> 43 <211> 480 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRAS G13R, Q61K <400> 43 tcgcgcctgt gaacggtggg gcaggagacc ctgtaggagg accccgggcc gcaggcccct 60 gaggagcgat gacggaatat aagctggtgg tggtgggcgc cggccgtgtg ggcaagagtg 120 cgctgaccat ccagctgatc cagaaccatt ttgtggacga atacgacccc actatagagg 180 attcctaccg gaagcaggtg gtcattgatg gggagacgtg cctgttggac atcctggata 240 ccgccggcaa ggaggagtac agcgccatgc gggaccagta catgcgcacc ggggagggct 300 tcctgtgtgt gtttgccatc aacaacacca agtcttttga ggacatccac cagtacaggg 360 agcagatcaa acgggtgaag gactcggatg acgtgcccat ggtgctggtg gggaacaagt 420 gtgacctggc tgcacgcact gtggaatctc ggcaggctca ggacctcgcc cgaagctacg 480 480

Claims

(i) 서열목록 제1서열 및 제2서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군;
(ⅱ) 서열목록 제4서열 내지 제7서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제8서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군;
(ⅲ) 서열목록 제10서열 내지 제12서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제13서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군;
(ⅳ) 서열목록 제15서열, 제16서열 및 제17서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군;
(ⅴ) 서열목록 제18서열의 프라이머, 및 서열목록 제19서열 또는 제20서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군;
(ⅵ) 서열목록 제23서열 및 제25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군;
(ⅶ) 서열목록 제24서열 및 제25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; 그리고
(ⅷ) 서열목록 제28서열, 제29서열 및 제30서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군으로 구성된 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오타이드 군으로,
상기 올리고뉴클레오타이드 군은 암 세포의 핵산과 혼성화되는 암 검출용 올리고뉴클레오타이드 군.
제 1 항에 있어서 상기 암은 갑상선암, 흑색종(melanoma), 대장암, 난소암, 모발상 세포 백혈병(hairy cell leukemia), 췌장암, 폐암, 유방암, 전립선암, 급성백혈병, 만성백혈병, 뇌종양, 위암 또는 방광암인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드 군.
(i) 서열목록 제1서열 및 제2서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군;
(ⅱ) 서열목록 제4서열 내지 제7서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제8서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군;
(ⅲ) 서열목록 제10서열 내지 제12서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제13서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군;
(ⅳ) 서열목록 제15서열, 제16서열 및 제17서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군;
(ⅴ) 서열목록 제18서열의 프라이머, 및 서열목록 제19서열 또는 제20서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군;
(ⅵ) 서열목록 제23서열 및 제25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군;
(ⅶ) 서열목록 제24서열 및 제25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; 그리고
(ⅷ) 서열목록 제28서열, 제29서열 및 제30서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군으로 구성된 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오타이드 군을 포함하는 암 진단 키트.
제 3 항에 있어서 상기 암은 갑상선암, 흑색종(melanoma), 대장암, 난소암, 모발상 세포 백혈병(hairy cell leukemia), 췌장암, 폐암, 유방암, 전립선암, 급성백혈병, 만성백혈병, 뇌종양, 위암 또는 방광암인 것을 특징으로 하는 암 진단 키트.
제 3 항에 있어서, 상기 암 진단 키트는 올리고뉴클레오타이드 군 (i)이 서열목록 제3서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나;
상기 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅱ)가 서열목록 제9서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나;
상기 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅲ)이 서열목록 제14서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나;
상기 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅳ)가 서열목록 제21서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나;
상기 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅴ)가 서열목록 제22서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나;
상기 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅵ)이 서열목록 제26서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나;
상기 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅶ)이 서열목록 제27서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 또는
상기 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅷ)이 서열목록 제31서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단 키트.
제 3 항에 있어서, 상기 진단 키트는 역전사 효소(Reverse transcriptase)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단 키트.
다음 단계를 포함하는 암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법:
(a) 인간으로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 얻는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 핵산의 (ⅰ) BRAF 유전자의 돌연변이 검출, (ⅱ) KRAS 유전자의 돌연변이 검출, (ⅲ) NRAS 유전자의 돌연변이 검출, (ⅳ) HRAS 유전자의 돌연변이 검출, (ⅴ) RET/PTC 유전자의 재배열 검출 및 (ⅵ) PAX8/PPARγ 유전자의 재배열 검출로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출을 실시하는 단계.
제 7 항에 있어서, 상기 암은 갑상선암, 흑색종(melanoma), 대장암, 난소암, 모발상 세포 백혈병(hairy cell leukemia), 췌장암, 폐암, 유방암, 전립선암, 급성백혈병, 만성백혈병, 뇌종양, 위암 또는 방광암인 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 핵산은 RNA인 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 상기 RNA를 cDNA로 전사시키는 역전사 단계 (pre-b)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 단계 (pre-b)는 45-55℃에서 20-40분 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 검출은 중합효소연쇄반응을 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응은 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(a') 90-100℃에서 5분-15분 동안 지속시키는 단계;
(b') 90-100℃에서 10-20초 및 55-65℃에서 40-50초 동안 지속시키는 단계; 및
(c') 상기 단계 (b')를 40-50회 반복하는 단계.
제 7 항에 있어서, (i) 상기 BRAF 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제1서열 및 제2서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나;
(ⅱ) 상기 KRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제4서열 내지 제7서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제8서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나;
(ⅲ) 상기 NRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제10서열 내지 제12서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제13서열의 의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나;
(ⅳ) 상기 HRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제15서열, 제16서열 및 제17서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; 또는 서열목록 제18서열의 프라이머, 및 서열목록 제19서열 또는 제20서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나;
(ⅴ) 상기 RET/PTC 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제23서열 및 제25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; 또는 서열목록 제24서열 및 제25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나; 또는
(ⅵ) 상기 PAX8/PPARγ 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제28서열, 제29서열 및 제30서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항에 있어서, (i) 상기 BRAF 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제3서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나;
(ⅱ) 상기 KRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제9서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나;
(ⅲ) 상기 NRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제14서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나;
(ⅳ) 상기 HRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제21서열 또는 제22서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나;
(ⅴ) 상기 RET/PTC 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제26서열 또는 제27서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나; 또는
(ⅵ) 상기 PAX8/PPARγ 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제31서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.