WO2016018047A1 - 암의 진단 장치 및 방법 - Google Patents

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WO2016018047A1
WO2016018047A1 PCT/KR2015/007880 KR2015007880W WO2016018047A1 WO 2016018047 A1 WO2016018047 A1 WO 2016018047A1 KR 2015007880 W KR2015007880 W KR 2015007880W WO 2016018047 A1 WO2016018047 A1 WO 2016018047A1
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WO
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seq
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cancer
primers
probe
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PCT/KR2015/007880
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English (en)
French (fr)
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기창석
김선욱
임현숙
김유리
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사회복지법인 삼성생명공익재단
주식회사 바이오세움
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Definitions

  • the present invention relates to a novel diagnostic apparatus and diagnostic method of cancer.
  • Thyroid cancer has a higher incidence than other cancers, and if it is diagnosed early, if it is possible to operate early, it is also very important to establish a method for early and accurate diagnosis that belongs to a high survival rate.
  • Methods for detecting and diagnosing genetic mutations associated with cancer include the separation of DNA from cancer cells or tissues to reveal BRAF (mutant in thyroid, melanoma, colorectal cancer, ovarian cancer, and hairy cell leukemia), K.RAS (Mutant appears in thyroid cancer, pancreatic cancer, large intestine-, lung cancer, breast , and prostate cancer), NRAS ( ' mutation appears in thyroid cancer, acute leukemia, chronic leukemia, brain tumor) or HR AS (thyroid, delegation-, RET / PTC or PAX8 / PPAR Y gene rearrangement mutations (which are thyroid cancer-specific mutations) that can be identified for mutations in the bladder and prostate cancer, and can be tested using [) NA.
  • BRAF mutant in thyroid, melanoma, colorectal cancer, ovarian cancer, and hairy cell leukemia
  • K.RAS Metant appears in thyroid cancer, pancreatic cancer, large intestine-, lung cancer, breast , and prostate cancer
  • NRAS
  • RNA extracted from cancer cells or tissues or cDNA reverse-transcribed as a template is used for BRAF.
  • KRAS, NRAS and mutant detection of HRAS gene as a - by ensuring that shall RET / PTC and to be i both to re-align detect the PAX8 / PPAR ⁇ gene can be accurately and conveniently for the diagnosis of cancer, thereby completing the present invention It became.
  • an object of the present invention is to detect cancer that is common with nucleic acids of cancer cells. To provide a group of oligonucleotides.
  • Another object of the present invention to provide a cancer diagnostic kit comprising a specific oligonucleotide group.
  • Another object of the present invention is to provide a method for providing information necessary for the diagnosis or prognosis of cancer.
  • Other objects and advantages of the present invention, washing of the invention to ⁇ - become apparent from the description, claims, and drawings - sehin.
  • the present invention (i) the oligonucleotide group consisting of the primers of SEQ ID NO: 1 and 2; (ii) a group of oligonucleotides consisting of a primer selected from the group consisting of the primers of SEQ ID NO: Low Sequence l -Sequence 7 and a primer of SEQ ID NO: 8; (Hi) oligonucleotide group consisting of a primer selected from the group consisting of primers of SEQ ID NO: 10 to 12 and a primer of SEQ ID NO: 13; (iv) a group of oligonucleotides consisting of primers of SEQ ID NO: 15, 16, and 17; (V) A primer of SEQ ID NO: 18 sequence.
  • oligonucleotide groups consisting of primers of SEQ ID NO: 19 or 20; ( V1 ) a group of erygonucleotides consisting of primers of SEQ ID NO: 23 and 25; (vii) a group of oligonucleotides consisting of the primers of SEQ ID NO: 24 and 25; And (viii) to a ligonucleotide-group prepacked from the group consisting of a ligonucleotide group consisting of primers of SEQ ID NO: 28, 29, and 30.
  • the oligonucleotide group provides a group of oligonucleotides for detecting cancer-nucleated cancer cells of cancer cells.
  • RNA extracted from cancer cells or tissues or cDNA reverse-transcribed as a template Therefore, the detection of mutations in the BRAF, KRAS, NR.AS and HRAS genes, as well as rearrangement detection of the RET / PTC and PAXS / PPAR Y genes, were possible, thereby making it possible to accurately and conveniently diagnose cancer.
  • the term "pnmer” 1 is complementary to the 5 'or 3' terminal sequence of the target nucleic acid site to be amplified during the nucleic acid amplification reaction, respectively, and is suitable conditions in a suitable buffer at a suitable temperature (ie Means a single-stranded oligonucleotide that can act as a starting point for the polymerase reaction of the template-indicating nucleic acid under four different nucleoside triphosphates and polymerization reaction enzymes.
  • a suitable temperature ie Means a single-stranded oligonucleotide that can act as a starting point for the polymerase reaction of the template-indicating nucleic acid under four different nucleoside triphosphates and polymerization reaction enzymes.
  • variations in temperature and use of the primers typically 15-30 nucleotides—short primer molecules generally require lower temperatures to form a sufficiently stable hybridization complex with the template.
  • Primers used in the invention are hybridized or annealed to one site of the template to form a double chain structure.
  • Conditions for nucleic acid hybridization suitable for forming one double-chain structure are described by Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laborator-Manual.Cold Spring Harbor Labor tory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001) and Haymes, BD, et al., Nucleic acid Hybridization, a Practical Approach, IRL Press, Washington, discloses a DC (1985) the term "nucleic acid" in the present specification were have a DNMgDNA and cDNA) and means comprising the RNA molecule comprehensively, basic in haeksin, molecular Nucleotide as a constituent unit includes not only natural nucleotides but also analogs in which sugar or base sites are modified (Schei t, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90 543-584 (1990).
  • SEQ ID NO: 1, G 4 to 7 sequence of the present invention. 10th to L2 sequences, 15th sequences, 16th sequences, 18th sequences. SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24. Sequences 28 and 29 are forward primers.
  • SEQ ID NO: 2, 8, 13, 13, 17, 13 ⁇ 4, 20, 25, and 30 of the sequence list are reverse primers. primer).
  • the cancer of the present invention is thyroid cancer, melanoma, colon cancer, ovarian cancer, hairy eel 1 leukemia, pancreatic cancer. Lung cancer. Ice-Lim, a prostate cancer, acute leukemia, chronic leukemia, brain cancer, gastric cancer, or bladder cancer. .
  • the cancer of the present invention is thyroid cancer.
  • the oligonucleotide group (i) of the present invention hybridizes with nucleic acids of thyroid cancer, melanoma, colon cancer, ovarian cancer or hairy cell leukemia cells.
  • the group of loligonucleotides (H) of the present invention is-thyroid cancer, pancreatic cancer. Colon cancer, a lung cancer, breast cancer or prostate Im 'of the cell nucleic acid and di torch common -
  • the group of loligonucleotides of the present invention is a group of loligonucleotides of the present invention
  • (iii) is common with nucleic acids of thyroid cancer, acute leukemia, chronic leukemia or brain tumor cells.
  • the oligonucleotide group of the invention is a oligonucleotide group of the invention.
  • (iv) or (V) is common with nucleic acids of thyroid cancer, gastric cancer, bladder cancer, or prostate cancer.
  • the group of loligonucleotides of the present invention further comprises a probe in which the oligonucleotide group (i) of the present invention has the SEQ ID NO: 3; Or further comprising a probe having an oligonucleotide group SEQ ID NO: 9 sequence of the present invention;
  • the oligonucleotide group (iii) of the present invention has a sequence of SEQ ID NO: 1.4.
  • oligonucleotide of the present invention the nucleotide-containing probes having the group ( ⁇ ) 7 SEQ ID No. 21 sequence, or addition. This 3 ⁇ 4] ⁇ name ⁇ _ 'oligo nucleotide group (V) the sequence listing SEQ ID NO: 22 Or further comprising; a group of loligonucleotides of the present invention
  • oligonucleotide group (vii) of the present invention further comprises a probe having SEQ ID NO: 27;
  • the oligonucleotide group (viii) of the present invention further comprises a probe having SEQ ID NO: 31.
  • the ligonucleotide of the present invention comprises a probe of loligonucleotide group of the present invention (0 further comprises a probe having SEQ ID NO: 3; the oligonucleotide group (ii) of the present invention further comprises a probe having SEQ ID NO: 9; hitting a further include a ⁇ lobe nucleotide group (Hi) having a SEQ ID NO. 14 sequence, and; a probe having the foot, who raise the nucleotide group (iv) SEQ ID No.
  • the oligonucleotide group (V) further comprises a probe having SEQ ID NO: 22; the oligonucleotide group (vi) of the present invention further comprises a probe having SEQ ID NO: 26; an oligonucleotide group of the present invention ( vii) further comprises a probe with SEQ ID NO: 27; and an oligo of the present invention
  • Nucleoside and Tide group (viii) comprises a probe having the sequence listing SEQ ID NO: 31 further.
  • the term "probe” is a single chain nucleic acid molecule. Contains sequences complementary to the target nucleotide sequence. According to one embodiment of the invention, may, be modified to the name, the probe in this respect, die-specific hybridization range that does not damage the probe of the present invention. E.g . Reporter fluorophores or quenchers may be tagged at the ends of the probe oligonucleotides and used as probe labels. The label of the probe in the probe sequence of the present invention can be changed to various labels used in the art.
  • Suitable labels include fluorophores (e.g., fluorescein, phycoerythr i ⁇ , rhodamine 'samine, and Cy3 and Cy5 (Pharmacia), chromophores, chemilumines, magnetic particle. Radioactive isotopes (P32 and S35), mass labels, electron dense particles. Enzymes (alkaline phosphatase or horseradish peroxidase). Article recognition -, 'for a substrate to an enzyme, a heavy metal (e.g., gold), and antibodies, host system streptavidin, biotin. Hapten with specific binding partners such as digoxigenin and chelating groups, including but not limited to.
  • fluorophores e.g., fluorescein, phycoerythr i ⁇ , rhodamine 'samine, and Cy3 and Cy5 (Pharmacia)
  • chromophores e.g., phycoerythr i ⁇ , r
  • Labeling is carried out in a variety of methods conventionally practiced in the art, such as nick translation methods, random priming methods (Multiprime DNA labeling systems booklet, "Amersham” (1989)) and chination methods (Maxam & Gi lbert, Methods in Enzymology, 65: 499 (1986)). Labels fluorescence, radioactivity, color measurement, ⁇ ' Gravimetric, X-ray diffraction or absorption magnetism, enzymatic activity, mass analysis. Binding affinity, a common torch provides a high frequency, the detection 3 ⁇ 4 by nanocrystalline signal that ⁇ .
  • the present invention provides an oligonucleotide group comprising (i) the primers of SEQ ID NO: 1 and 5 of the second sequence: (ii) the group consisting of primers of SEQ ID NOs: 4-7 Oligonucleotide group consisting of primers selected from primers and primers of SEQ ID NO: 8; (iii) a primer and a sequence listing selected from the group consisting of the primers of SEQ ID NOs: 10-12
  • oligonucleotide group consisting of primers; (vii) a group of ligonucleotides consisting of the primers of SEQ ID NO: 24 and 25, and (viii) the oligonucleotide group consisting of the primers of SEQ ID NO: 28, 29, and 30
  • a cancer diagnostic kit comprising a group of oligonucleotides selected.
  • a cancer of the present invention are thyroid lump saekjong (melanoma), colorectal cancer, ovarian cancer, hair on cell leukemia (hai ry ce! 1 leukemia) , pancreatic cancer, lung cancer, Drift, cancer, prostate Cancer, acute leukemia, chronic leukemia, brain tumors, delegation ⁇ , or bladder cancer.
  • the cancer of the present invention is thyroid cancer.
  • Diagnosis-Cancer, ovarian cancer or hairy eel 1 leukemia diagnostic kits include ligation nucleotide group (i).
  • the thyroid cancer, pancreas-cancer, colorectal cancer, lung cancer, breast cancer or prostate cancer diagnostic kit of the present invention is provided.
  • thyroid cancer, acute leukemia, Chronic leukemia or brain tumor diagnostic kits include oligonucleotide groups ( ⁇ ).
  • Bladder cancer or prostate cancer diagnostic kits include ligonucleotide groups (iv) and / or (V).
  • the diagnostic kit of the present invention further comprises a probe in which the oligonucleotide group (i) of the present invention has a sequence listing 13;
  • the oligonucleotide group () of the present invention further comprises a probe having SEQ ID NO: 9;
  • the oligonucleotide group (iii) of the present invention further comprises a probe having the sequence number 14;
  • the oligonucleotide group (iv) of the present invention further comprises a probe having SEQ ID NO: 21;
  • Oligonucleotides of the invention are you doing nucleotide group (V) is further comprises ⁇ a probe having the sequence SEQ ID No.
  • the oligonucleotide group (VI.) Of the present invention further comprises a probe having SEQ ID NO: 26; Oligonucleotide group (vii) of the present invention further comprises a probe having SEQ ID NO: 27; Or the oligonucleotide group (viii) of the present invention further comprises a probe having SEQ ID NO: 31.
  • the diagnostic kit of the present invention further comprises a probe in which the oligonucleotide group (i) of the present invention has 3 sequences;
  • the oligonucleotide group (ii) of the present invention further comprises a probe having SEQ ID NO: 9, wherein the oligonucleotide group of the present invention () further comprises a probe having SEQ ID NO: 14; Includes the name Bill i oligonucleotide group ⁇ the probes having SEQ ID NO.
  • a group of nucleotides (V) comprises a probe having the sequence listing SEQ ID NO: 22 further;
  • the oligonucleotide group (vi) of the present invention further comprises a probe having SEQ ID NO: 26;
  • the oligonucleotide group (vii) of the present invention additionally comprises a probe having the SEQ ID NO: 27 sequence; and
  • the oligonucleotide group (viii) of the present invention further comprises a probe having the SEQ ID NO: 31 sequence.
  • the aphidine-kit of the present invention additionally reverses the reverse transcriptase (Reverse t ranscr it ase).
  • the present invention comprises the steps of (a) obtaining a nucleic acid from a biological sample isolated from human; And (b) detecting the mutation of (i) the BRAF gene of the nucleic acid of step (a), (ii) detecting the mutation of the KRAS gene, ⁇ ) detecting the mutation of the NRAS gene, (iv) detecting the mutation of the HRAS gene, and (V)
  • a method is provided for providing information necessary for the diagnosis or prognosis of a cancer comprising performing a detection selected from the group consisting of rearrangement detection of the RET / PTC gene and (vi) rearrangement detection of the PAX8 / PPARy gene.
  • the cancer of the present invention is thyroid cancer.
  • Hawke saekjong (melanoma), daejing - cancer, ovarian, Im, hair washing-cell leukemia (hair 'y eel 1 leukemia) , pancreatic cancer, pyeim - and breast cancer.
  • Prostate cancer Acute leukemia. Chronic leukemia, brain tumor, gastric cancer or bladder cancer
  • the cancer of the present invention is thyroid cancer. The method of the present invention will be described in detail for each step as follows: Step (a): Obtaining Nucleic Acids from Biological Samples Isolated from Humans
  • nucleic acids are first obtained from biological samples isolated from humans.
  • biological sample is a biological sample of the isolated animal in vitro, Hi represents the blood, hyeoljing ⁇ , serum, urine, bone marrow, cells, hair or tissue samples. It said, according to the bill had one embodiment, the biological sample of the present invention is a specific cell or tissue samples ⁇ . According to a different embodiment of the present invention, the biological sample of the present invention is a thyroid cell or tissue sample.
  • the "nucleic acid is RNA of the present invention.
  • Step (b) detecting specific gene mutations and / or gene rearrangements
  • step (a) (i) mutation of BRAF gene, (ii) mutation of KRAS gene, (iii) mutation of NRAS gene, (iv) mutation of HRAS gene, V) Rearrangement of RET / PTC Genes And / or (vi) detecting rearrangement of the PAX8 / PPAR ⁇ gene.
  • the detection of the present invention is carried out using the amplification banung.
  • amplification reaction means a reaction that amplifies a gene or nucleic acid molecule.
  • Various amplification reactions have been reported in the art, which are called polymerase chain reactions (hereinafter referred to as PCR) (US Pat. Nos. 4, 683, 195, 4,683,202, and 4,800, 159), reverse transcriptase polymerase chain reactions (hereinafter RT).
  • PCR polymerase chain reactions
  • RT reverse transcriptase polymerase chain reactions
  • RT reverse transcriptase polymerase chain reactions
  • CP-PCR Consensus sequence primed polymerase chain reaction
  • AP-PCR optional priming polymerase chain reaction
  • NASBA nucleic acid sequence based amplification
  • PCR Polymerase chain reaction
  • the diagnostic method of the present invention includes not only the traditional> CR method. Touch, a modification of traditional PCR procedures to enhance the specificity or sensitivity of PCR PCR (24), hot start PCR (25, 26). Nested PCR (2) and booster PCR (27) can be used.
  • real time PCR differential display PCR (DD-PCR), rapid amplification of cDNA ends (RACE).
  • IPCR Inverse polymerase chain reaction
  • vectorette PCR vectorette PCR
  • thermal asymmetric interlaced PCR TA I L-PCR
  • multiplex PCR can also be used.
  • Detection of the present invention is carried out using real-time PCR.
  • Sil-Sigin-PCR is a technique that monitors and analyzes the increase of PCR amplification products in real-shigine (Levak KJ, ea I., PCR Methods Appl., 4 (6): 357-62 (1995)).
  • the PCR reaction can be monitored by recording the amount of fluorescence emission in each cycle during the exponential phase, where the increase in PCR product is proportional to the initial amount of the target template. The higher the starting copy number of the nucleic acid target, the faster the fluorescence increase is observed and the lower the Ct value (threshold cycle).
  • a marked increase in fluorescence above the reference value measured between 3-15 cycles means detection of accumulated PCR product.
  • real-time PCR has the following advantages: (a) Conventional PCR is measured in the plateau, whereas silencing-PCR is the exponential growth phase.
  • Detection methods include interchelatmg method (SYBR Green I method) and fluorescent labeling probe method (TaqMan probe method).
  • the interchel at i ng method detects both double-stranded DNA, eliminating the need to prepare gene-specific probes, enabling a cost-effective reaction system. While methods using fluorescently labeled probes are expensive, detection specificity can be detected by distinguishing even high-appearing-sequences. According to certain embodiments of the present invention, the methods and kits of the present invention utilize the TaqMan probe method.
  • the method is an ice-method using double stranded [] NA missing-die, comprising non-specific amplification and primer-di 'mer complexes using non-sequence specific fluorescence intercalaCing reagent (SYBR Green [or ethidium bromide) To quantify amplicon production.
  • SYBR Green [or ethidium bromide)
  • the reagent does not bind to ssDNA.
  • SYBR Green is, when combined with hyeonggoeng, St.
  • SYBR greens are used for smplexplex reactions, but can be used for mult iplex reactions accompanied by melting curve analysis (Si raj AK, et al., Clin Cancer Res , 8 (12): 3832-40 (2002); and Vrettou C .. et al., Hum Mutat., Vol 23 (5): 513-521 (2004).
  • the cycle threshold (Ct) value refers to the number of cycles in which the fluorescence generated in the reaction exceeds the threshold, which is inversely proportional to the logarithm of the initial copy number. Therefore, the Ct value assigned to a particular well is determined by Sufficient number of amplicons reflects the accumulated number of cycles.
  • Ct value is the cycle for the first time the detection of the increase of ⁇ 1 'i.
  • Rn implies ⁇ the amount of fluorescent signal generated during PCR at each time point and, ⁇ refers to "fluorescence emission intensity of the reporter divided dies (normalized reporter signal) of the fluorescent emission intensity of the reference die.
  • the Ct value is also called Cp (crossing point) in LightCycler.
  • the Ct value represents the point in time when the system begins to detect an increase in the fluorescence signal associated with the exponential growth of the PCR product in the log-1 i near phase. This period provided the most useful information about the reaction.
  • the slope of the log-linear phase represents the amplification efficiency (Eff) (h U p: / / www. Appl i eclb i o sys t em s.co.kr/).
  • TaqMan probe is typically 5 "(" ophore and 3 ⁇ 4 !. put to the 3'-end (eu quencher fluorophore ⁇ u a) at the terminal ';
  • Example Konkuk University,' [ 'AMRA or non-hyeonggoeng - 3 ⁇ 4 Oligonucleotides that are longer than primers (eg, 20-30 nucleotides) that contain the excursion i
  • the TaqMan probe of the present invention comprises: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 Or SEQ ID NO: 3]. May be designed as a sequence comprising the sequence.
  • TaqMan probes are buttically activated on template 1) NA in the annealing step. De-i and the fluorescent suppressed by 3 ⁇ 4 processing on the probe. Upon extension reaction, TaqMan probes that were localized on the template were degraded by the 5 'to 3' nuclease activity possessed by Taq DNA pulleymers, and the fluorescent dyes were released from the probes. At this time, the 5 'end of the TaqMan probe is located downstream of this by the 3'-end of the extended primer: and.
  • the 5'-maldine of the TaqMan probe is cleaved by the 5 'to 3' nuclease activity of the polymerase , and the reporter The fluorescent signal of the molecule is generated.
  • the reporter and quencher molecules bound to the TaqMan probe include fluorescent and non-fluorescent materials.
  • Fluorescent reporter molecules and quencher molecules that can be used in the present invention may be any known in the art, for example: (The parentheses in parentheses are the maximum emission wavelength in nanometers): Cy2 TM (506), Y0PR0 TM -1 (509), YOYO TM — 1 (509), Calcein (517), FITCCSIS), FluorX TM (519), Alexa TM (520), Rhodamine 110 (520), 5-FAM (522) Oregon.
  • Green TM 500 (522), Oregon Green TM 488 (524), RiboGreen TM (525), Rhoclam i neGreen TM (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green TM (531), Calcium Green TM (533), T () -PR0 TM -1 (533), T () T () 1 (533), JOE (.548), B0DIPY530 / 550 (550), Di 1 (565).
  • B0DIPY TM R (568), B0DIPY558 / 568 (568), BODIPY564 / 570 (570), Cy3 TM (570), Alexa TM 546 (570), TRI ' rC (572), Magnesium 0range TM (575), Phycoeryth rin R & B (575), Rhoclam i ne Phalloidin (575), Calcium 0range TM (576), Pyronin Y (580), Rhoclam i neB (580), TAMRA (582), Rhodamine Red TM (590), Cy3.5 TM ( 596), R0X (608), Calcium Crimson TM (6.15), Alexa TM 594 (615), Texas Red (6.15), Ni le Red (628), Y (PRO TM — 3 (631), Y0Y0 TM -3 ( 631), R-phycocyan in (642), CPhycocyan in (648), T0-PR0 TM -3 (660), T0T03 (
  • the non-fluorescent material used in the reporter and quencher molecules bound to the TaqMan probe may include a minor groove groove binding (MGB) moiety.
  • MGB-conjugated probe refers to a probe conjugated with MGB at the 3'-end of the probe. MGB is a substance that binds to minor grooves of UNA with high affinity, netropsm.
  • Distamycin distamycin (dist amyc in), rexitlopsin (1 ex 11 r ops in), mithramycin, chromomycin (chromc yc i ⁇ ) A3, olibomycin (o] ivomycin), anthranicin i ⁇ ), sibi roniycin 'pentamidine (pentami di ne), stilbamidine, berenyl (bereni l), CC-1065, Hoechst 33258, DAP ⁇ (4-6-di am idi ⁇ -2-pheny 1 i nclo 1 e), dimer of CDPI, trimmer, te.
  • Conjugation of the MGB of the probe significantly increases the stability of the hybrid formed between the probe and its target. More specifically, increased stability (ie, increased degree of localization) results in increased melting temperature (Tm) of the hybrid duplexex formed by the MGB-conjugate probe compared to the normal probe.
  • Tm melting temperature
  • MGB stabilizes van der Waals forces to increase the nimbing temperature (Tm) of the MGB—conjugated probe without increasing probe length, thereby shortening probes (eg, up to 21) in Taqman real-time PCR under more stringent conditions. Nucleotides) to enable the use of.
  • MGB conjugated probes provide more efficient background fluorescence Remove it.
  • the 5'-terminus of the probe of the invention is labeled with a f luorophore of VIC or FAM, and the 3'-terminus is one selected from the group consisting of MGBNFQ and IntZEN-3IABIK. It can be transformed into a quencher of.
  • SEQ ID NO: 3, 1.4, 27, 31 and 37 of the present invention uses MGBNFQ as a quencher at the end of ViC and 3 'at the end of the 5 1 — terminal.
  • SEQ ID NO: 9 sequence of the present invention uses a 5'-end fluorescent material FAM and 3 1 -terminal MGBNFQ as a quencher, SEQ ID NO: 21, column 22 of the present invention.
  • Sequence 26 and Sequence 34 are the 5 1 -terminal fluorescent material with IntZEN—3iAR [K using 3-AR] at the FAM and 3 ′ 1-terminus.
  • step (b) of the present invention when the nucleosin of the present invention is RNA, step (b) of the present invention further includes a pretranscriptional step (pre-b i-) that transcribes the RNA into cDNA.
  • step (pre-b) of the present invention is carried out for 20-40 minutes at 45-55T:
  • the present invention further comprises step (pre-b)
  • the detection of the present invention is carried out using a polymerase chain reaction, and the detection of the present invention can also be carried out by reverse transcription polymerase chain reaction, and the reverse transcription polymerase chain reaction is performed in a single phase ( ⁇ 6 polymerization). Same as the enzyme chain reaction.
  • the polymerase chain reaction of the present invention comprises: (a 1 ) lasting 9 minutes at .00 ° (: 5 minutes to 15 minutes; (b ') 9 () K) 0 ° Dean-based, lasting 40-20 seconds at 1.0-20 seconds and 55-65 at C; And (c 1 ) repeating step (b 1 ) 40-50 times.
  • Detection of the present invention can be carried out using hybridization, imn inoassay, or microarray in addition to the above-described gene amplification methods.
  • Mutation detection of the BRAF gene of the present invention is carried out using a group of ligonucleotides consisting of primers of SEQ ID NO: l and 2nd SEQ ID NO:-(ii) ⁇ Mutation detection of the gene of the present invention is sequence With primers in sequences 14 to 7 It is carried out using a group of oligonucleotides consisting of primers selected from the group consisting of primers and the primers of SEQ ID NO: 8 .
  • (iii) Mutation detection of the NRAS gene of the present invention is carried out using an oligonucleotide group consisting of a primer selected from the group consisting of primers of SEQ ID NO: 10 to 12 and primers of SEQ ID NO: 13 ;
  • the mutation detection of the HRAS gene of the present invention comprises a group of larygonucleotides consisting of primers of SEQ ID NO: 1.5, 16, and 17; Or _ using an oligonucleotide group consisting of a primer of SEQ ID NO: 18, and a primer of SEQ ID NO: 1.9 or 20;
  • (V) rearrangement detection of the RET / PTC genes of the present invention is carried out with primers of the 23rd and 25th sequences; Or by using an oligonucleotide group consisting of primers of SEQ ID NO: 24 and 25; Or (vi) rearrangement detection of the PAX8 / PPAR Y gene of the present invention is carried out using a group
  • (i) 1 " mutation detection of the BRAF gene of the present invention is carried out using a group of oligonucleotides consisting of primers of SEQ ID NO: 1 and 2; Mutation detection of the KR.AS gene of the present invention is carried out using a primer group selected from the group consisting of the primers of SEQ ID NO: 4 to SEQ ID NO: 7 and a primer of an oligonucleotide consisting of the primers of SEQ ID NO: 8; (iii) Mutation detection of the NRAS gene of the present invention is carried out using a group selected from the group consisting of primers of SEQ ID NO: 10 to L2, and primers of SEQ ID NO: 13 (iv) Mutation detection of the HRAS gene of the present invention is performed by the sequence of SEQ ID NO: 15, 16, and 17 (V) reconstitution of the RET / PTC gene of the present invention using oligonucleotide group consisting of primers; or primer group of SEQ
  • (i) mutation detection of the BRAF gene of the present invention can additionally be performed using a probe having SEQ ID NO: 3 ( ⁇ ) to detect mutation of the KRAS gene of the present invention.
  • detection of a mutation 'NRAS gene of the present invention take advantage of a probe having the sequence listing SEQ ID NO: 14 further: ⁇ ;
  • Mutation extraction of the HRAS gene of the present invention is further performed using a probe having SEQ ID NO: 21 or 22:
  • (V) Rearrangement detection of the RET / PTC gene of the present invention is SEQ ID NO: 26 Or further using a probe having a 27th sequence;
  • rearrangement detection of the PAX8 / PPAR Y gene of the present invention further employs a probe having SEQ ID NO: 31-.
  • the present invention is a group of oligonucleotides for cancer detection of specific sequences that are common with nucleic acids of cancer cells.
  • Group of ligonucleotides of a specific sequence are common with nucleic acids of cancer cells.
  • 1.8 It provides a cancer diagnostic kit comprising and a method for providing information necessary for the diagnosis or prognosis of the cancer.
  • the method of the present invention enables the early diagnosis of a specific cancer according to whether a specific gene is mutated using RNA, unlike conventional somatic mutations using gDNA.
  • the method of the present invention there is hyogoe i in the test all the possible mutations at the same time, the bar, can be quickly and accurately diagnosis of thyroid cancer associated with thyroid cancer.
  • gonorrhea eg, thyroid cancer
  • Figure 3 shows a primer and probe design method for detecting KRAS mutations.
  • Figure 4 shows a primer and probe design method for detecting NRAS mutations.
  • Figure 5 shows a primer and probe design method for detecting HRAS mutations.
  • Figure 6 shows a primer and probe design for detection of RET / PTC1 mutations.
  • Figure 7 shows a primer and probe design method for detecting RET / PTC3 mutations.
  • RNA Isolation Ki Roche (Switzerland) from each positive cell line containing the KRAS G12S / G12C / G12 [) / G12A / G12V / G1.3D, NRAS Q61R / Q61 / Q61L, HRAS G12V / Q61R, BRAF V600E mutations) RNA was used after separation. Sources of the positive cell lines are listed in Table 1 below.
  • RET / PTC1 For RET / PTC1, RET / PTC3, PAX8 / PPA g, .RAS G12R, and HRAS G13R / Q61K mutations that did not acquire positive cell lines, the gene was artificially engineered through the Integrated DNA Techno 1 ogi es to include some of these mutations.
  • the plasmid ⁇ ) ⁇ which was synthesized (gBlock Gene Fragment)-introduced into the pGEM ⁇ -T easy Vector (I ⁇ romega, Mad i son, USA) was used.
  • the synthesized gene sequence includes SEQ ID NO: 38 (RET / PTC 1.
  • SEQ ID NO: 39 (RET / PTC3 mutant), SEQ ID NO: 40 (PAX8 / PPARg exon 7 mutant) Sequence (PAX8 / PPARg exon 9 mutation), SEQ ID NO: 42 sequence (KRAS G12R mutation) and SEQ ID NO: 43 sequence (HiMS G13R / Q61K mutation).
  • RNA of the cell line isolated in Example 1 was synthesized by cDNA using Transcr iptor First Strand cDNA Synthesis it (oche A Switzerland).
  • Example 3 Primer and Probe Coupling for Mutation Detection
  • RNA designed by the presence of forward primers (NR.AS Q6.1L-F6, NRAS Q61K-F6 or NRAS Q61R-F8), reverse primer (NRAS R1) and fluorescent probe (NRAS Probe (VIC)) in NRAS gene exon 3
  • forward primers NR.AS Q6.1L-F6, NRAS Q61K-F6 or NRAS Q61R-F8
  • reverse primer NRAS R1
  • fluorescent probe NRAS Probe (VIC)
  • RET / PTC rearrangement mutations In case of RET / PTC rearrangement mutations, RET / ⁇ : Cl mass-type can be classified.
  • the RF ⁇ T / PTC.L rearrangement mutation is a forward primer (K / P.1.-) in axon 1 of CCDC6 gene. F1) and the fluorescence probe ( ⁇ ( ⁇ ).) Are located .
  • Reverse primers R / Pl, P3-R2 were designed to be located at exon .12 of the RET gene to enable CCDC6 / RET reassortant mutation testing.
  • the RE17PTC3 rearrangement mutant allows forward primers (R / R3-F1) and hover-probe (MGB-P3) to be placed in exon 11 of the NC0M gene, and reverse primers (R / P1.P3-R2) result in axon of the RET gene. It was designed to be located at 12 to allow NC0A4 / R.ET rearrangement mutation testing.
  • exons 9 of the PAX8 gene and exons 1 of PPAR ⁇ are rearranged . It can be distinguished by exon 7 rearrangement of PPAR x and exon 7 of ⁇ 8 gene.
  • the forward primers are located in two positions, exon 7 (PASX8-7-F2.) And axon 9 ( ⁇ 8 ⁇ 9—F3— 3 (K IS)) of the ⁇ 8 gene and the fluorescent probe (PAX8 MGB (VIC)).
  • reverse primer PPARg- LR
  • Example 4 Real time reverse transcription polymerase chain reaction ⁇ £ is a real time polymerase chain react ion
  • Real-time reverse-switching primer and probe sequences used in polymerase chain reaction or real-time polymerase chain reaction are the same as in Example 3.
  • RNA extracted from cells is well autopsy-confirmed that it contains a suitable amount and has no problem with the polymerase chain banung Hi, i to 7 were carried out KRT7 or real-time reverse transcription polymerase chain banung of the GAPDH gene as a control.
  • Primer and probe sequences for the RT7 or GAPDH gene are shown in Table 8.
  • Table 8 The probe was attached with floresin (Fluorescein, FAM) or VKXApplied Biosystems) to confirm the size of the amplification product.
  • both KRT7 and GAPDH are amplified within the range of Ct (Threshold cycle, the number of cycles of the fluorescent signal indicating the threshold and the junction). It was confirmed that, if less than Q 38 can be judged as a positive mutation.
  • the KRAS mutant cell line was amplified in the range of KRAS Ct-22.7-26.2 to confirm the positive KRAS mutation.
  • NRAS Ct was amplified in the range of 25.8-30.5 to confirm positive NRAS mutations.
  • HRAS Ct was amplified in the range of 23.3-31.5 to confirm the positive HRAS mutation.

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Abstract

본 발명은 암 세포의 핵산과 혼성화되는 특정 서열의 암 검출용 올리고뉴클레오타이드 군, 특정 서열의 올리고뉴클레오타이드 군을 포함하는 암 진단 키트 및 암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 기존의 gDNA를 이용하여 체세포 돌연변이(somatic imitation)를 검사하던 것과는 달리, RNA를 이용하여 특정 유전자의 돌연변이 여부에 따른 특정 암에 대한 조기 진단을 가능하게 한다. 본 발명의 방법에 따르면, gDNA로는 검출되지 않았던 돌연변이의 검출이 가능한바 한 번의 RNA 추출로 모든 암 관련 유전자 돌연변이 검사가 가능하여 정확하고 신속하게 진단을 할 수 있는 이점이 있다. 특히, 본 발명의 방법은 갑상선암과 관련된 모든 돌연변이를 동시에 검시가 가능한 바 갑상선암의 진단을 신속하고 정확히 할 수 있는 효과가 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
암의 진단 장치 및 방법 【기술분야】
본 특허출원은 2014년 7월 28일애 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 1으2014—0095983호에 대하여 우선권을 주장하며 , 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 암의 신규한 진단 장치 및 진단 방법에 관한 것이다.
【배경기술】
세계보건기구 (WHO) 산하 국제암연구소 ( IARC)의 보고서에 의하면 전세계 184개 국가의 신규 암 발생 건수가 2008년 1270만건이며, 2030년에는 2220만건으로 늘어닐- 것이라고 전망되고 있다. 현재 임상에서 암의 진단은 문진과 신체검사, 임상병리검사를 거쳐 일딘- 의심이 되면 방사선검사 및 내시경 검시-로 진행되며 , 최종적으로는 조직검사로 확인된다. 그러니ᅵ 현재 사용되고 있는 임상검사법으로는 암의 세포 수가 10억 개 , 암의 직경이 1. cm 이싱ᅵ이 되어야 진단이 가능하고, 이런 경우 이미 암세포는 전이능력을 갖고 있으며 실제 절반 이상의 암이 이미 전이되어 있는 경우가 많아 정확하면서도 조기 진단하는 방법에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있디- .
특히 , 최근 10년 동안 .갑상선암은 매우 빠론 속도로 그 수가 증가하고 있는데, 1999년부터 2005년까지 발표된 국가암등톡 사업 연례보고서에 의하면 전체 암 중 갑상선암의 발생률은 1999년 3 .3%( 7위)에서 2005년 8 . 9%( 5위)로 증가하였으며 , 특히 여성에서는 1.999년 6 . 5%( 7위)에서 2005년 丄6 . 7%( 1위)로 유방암을 제치고 여성 암 중 가장 흔한 암이 되었디- .
갑상선암은 다른 암애 비해 발병를이 높기는 하지민 · 진단이 조기에 이루어져 조기에 수술을 할 수 있다면 생존률이 높은 편에 속하는비- , 조기에 정확하게 진단하는 방법을 구축하는 것 또한 매우 중요하다.
종래 갑상선암을 진단하는 방법은 초음파 판독 또는 갑상선 세포나 갑상선 조직의 병리조직학적 판독이 이용되었으나, 판독이 어렵거나 불분명한 경우가 많은 문제점이 있었다.
또한 . 암과 관련된 유전자 돌연변이를 검출하여 진단하는 방법은 암 세포 또는 조직으로부터 DNA를 분리하여 BRAF (갑상선임- , 혹색종, 대장암, 난소암, 모발상 세포 백혈병애서 돌연변이기- 나타남) , K.RAS (갑상선암, 췌장암, 대장임- , 폐암, 유방임 · , 전립선암에서 돌연변이기 나타남) , NRAS (갑상선암, 급성백혈병 , 만성백혈병 , 뇌종양에서 '돌연변이가 나타남) 또는 HR AS (갑상선임 , 위임- , 방광암， 전립선암에서 돌연변이기- 나타님-) 유전자 돌연변이 여부를 확인하고, [)NA를 이용하여 검사가 붙가능한 RET/PTC 또는 PAX8/PPAR Y 유전자 재배열 돌연변이 (갑상선암 특이적 돌연변이임)는 따로 RNA를 분리하여 검사를 진행하여야 하므로 DNA와 RNA를 각긱■ 분리해야하는 불편함이 따르고, 진단에 장시간이 소요되며 , 상기 유전자 중 하나의 유전자의 돌연변이만 검출힐 · 경우 암진단에 정확도가 낮아지는 문제점이 있디- . 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 톡허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다 · . 인용된 논문 및 톡허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 싱-세힌- 설명】
【기술적 과제】
본 발명자들은 암 진단을 정확하고 편리하게 하기 위한 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였디- . 그 결괴- , 본 발명의 특정 서열을 가진 프라이머 및 프로브의 을리고뉴클레오타이드 군을 이용하는 경우 암 세포 또는 조직으로부터 추출한 RNA 또는 이를 역전사시킨 cDNA를 주형으로 하여 BRAF . KRAS , NRAS 및 HRAS 유전자의 돌연변이 검출뿐만 이 -니라 RET/PTC 및 PAX8/PPAR γ 유전자의 재배열 검출까지 모두ᅵ 가능하여 암의 진단을 정확하고 편리하게 할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 암 세포의 핵산과 흔성화되는 암 검출용 올리고뉴클레오타이드 군을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 특정 올리고뉴클레오타이드 군을 포함하는 암 진단 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있디- . 본 발명의 다른 목적 및 이점은■ 하기의 발명의 싱-세힌- 설명 , 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다. 【기술적 해결방법】
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 ( i ) 서열목록 제 1서열 및 제 2서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; ( i i ) 서열목록 저 서열ᅵ 내지 제 7서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제 8서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; ( Hi ) 서열목록 제 10서열 내지 제 12서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제 13서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; ( iv ) 서열목록 제 15서열, 제 16서열 및 제 17서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; ( V ) 서열목록 제.18서열의 프라이머 . 및 서열목록 제 19서열 또는 제 20서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군 ; ( V1 ) 서열목톡 제 23서열 및 제 25서열의 프라이머로 이루어지는 을리고뉴클레오타이드 군 ; ( vii) 서열목톡 제 24서열 및 제 25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; 그리고 ( viii) 서열목록 제 28서열, 제 29서열 및 제 30서열의 프라이머로 이루어지는 을리고뉴클레오타이드 군으로 구성된 군으로부터 선팩되는 을리고뉴클레오타이드- 군으로. 상기 올리고뉴클레오타이드 군은 암 세포의 핵산괴- 흔성화되는 암 검출용 올리고뉴클레오타이드 군을 제공한다.
본 발명자들은 암 진단을 정확하고 편리하게 히-기 위한 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명의 특정 서열을 가진 프라이머 및 프로브의 올리고뉴클레오타이드 군을 이용하는 경우 암 세포 또는 조직으로부터 추출한 RNA 또는 이를 역전사시킨 cDNA를 주형으로 하여 BRAF, KRAS, NR.AS 및 HRAS 유전자의 돌연변이 검출뿐만 아니라 RET/PTC 및 PAXS/PPAR Y 유전자의 재배열 검출까지 모두 가능하여 암의 진단을 정확하고 편리하게 할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 명세서에서 용어 "프라이머 (pnmer)'1는 핵산 증폭 반응시애 증폭되는 타깃 핵산 부위의 5'말단 서열 또는 3'말단 서열에 각각 상보적이며 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건 (즉. 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반웅 효소)하에서 주형 -지시 핵산의 중합효소반응의 개시점으로 작용할 수 있는 단일—가닥의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인지-, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지민- 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이디-. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 흔성화 복합체를 형성히-기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다 . 본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어 . 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laborator - Manual . Cold Spring Harbor Labor tory Press, Cold Spring Harbor , N.Y.(2001) 및 Haymes , B.D. , 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다 본 명세서에서 용어 "핵산" 은 DNMgDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며 , 핵신 · 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다 (Schei t, Nucleotide Analogs, John Wi ley, New York (1980)； Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 발명의 일 구현예에 따르면 , 본 발명의 서열목록 제 1서열, 거 )4서열 내지 제 7서열. 제 10서열 내지 제 L2서열, 제 15서열, 제 16서열， 제 18서열. 제 23서열, 제 24서열. 제 28서열 및 제 29서열은 포워드 프라이머 ( forward pr imer)이다 .
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 서열목록 제 2서열, 제 8서열, 제 13서열, 제 17서열, 제 1¾서열， 제 20서열, 제 25서열 및 제 30서열은 리버스 프라이머 (reverse primer)이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 암은 갑상선암, 혹색종 (melanoma), 대장암, 난소암, 모발상 세포 백혈병 (hairy eel 1 leukemia), 췌장암. 폐암. 유빙-임 ·, 전립선암, 급성백혈병 , 만성백혈병 , 뇌종양 , 위암 또는 방광암이다.. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 암은 갑상선암이디- .
본 발명의 일 구현예에 따르면. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (i)은 갑상선암, 혹색종 (melanoma), 대장암, 난소암 또는 · 모발상 세포 백혈병 (hairy cell leukemia) 세포의 핵산과 혼성화된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 을리고뉴클레오타이드 군 (H)는- 갑상선암, 췌장암. 대장암, 폐암, 유방암 또는 전립선임' 세포의 핵산과 흔성화된디-.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 을리고뉴클레오타이드 군
(iii)은 갑상선암, 급성백혈병 , 만성백혈병 또는 뇌종양 세포의 핵산과 흔성화된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군
(iv) 또는 ( V)는 갑상선암, 위암ᅳ 방광암 또는 전립선암의 핵산과 흔성화된다.
본 발명의 일 구현에에 따르면, 본 발명의 을리고뉴클레오타이드 군은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (i)이 서열목록 제 3서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 서열목록 제 9서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (iii)이 서열목록 제 1.4서열을 갖는 프로. 를 추가적으로 포함하거나； 본 발명의 올리고뉴클레오타이드- 군 (ιν)7 서열목록 제 21.서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나: 본 ¾]·명 ο_' 올리고뉴클레오타이드 군 ( V )가 서열목록 제 22서열을 갖는 를 추가적으로 포함하거나； 본 발명의 을리고뉴클레오타이드 군
(vi)° 서열목록 제 26서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거니ᅳ: 본 발명 올리고뉴클레오타이드 군 (vii)이 서열목록 제 27서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 또는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (viii)이 서열목록 제 31서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 을리고뉴클레오타이드 군은 본 발명의 을리고뉴클레오타이드 군 (0이 서열목록 제 3서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 ( ii )가 서열목록 제 9서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고 ; 본 발명의 을리고뉴클레오타이드 군 (Hi)이 서열목록 제 14서열을 갖는 ΐ로브를 추가적으로 포함하고 ; 본 발 ·명의 올리고뉴클레오타이드 군 (iv)가 서열목록 제 21서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 ( V )가 서열목록 제 22서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고 ; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (vi)이 서열목록 제 26서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (vii)이 서열목록 제 27서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 그리고 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (viii)이 서열목록 제 31서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함한다 .
본 명세서에서 용어 "프로브 (probe)"는 단일쇄 핵산 분자이며. 타깃이 되는 염기서열에 상보적인 서열을 포함한다. 본 발명의 일 구현에에 따르면, 본 발명의 프로브의 이점 , 죽 혼성화 특이성이 손상되지 않는 범위내에서 본 ·명의 프로브를 변형할 수 있다 ·. 예를 들어 . 리포터 (reporter) 형광물질 또는 형광억제물질 (quencher)이 프로브 올리고뉴클레오타이드의 말단에 태깅 (tagging)되어 프.로브 표지로 시 -용될 수 있다. 본 발명의 프로브 서열에서 프로브의 표지는 당업계에서 사용하는 다양한 표지로 변경될 수 있다. 적합한 표지는 형광단 (예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythr i π)， 로다민' 리사민 ( 1 i ssamine) , 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자. 방사능동위원소 (P32 및 S35), 매스 표지 , 전자밀집입자 . 효소 (알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제). 조인지-, 효소에 '대한 기질, 중금속 (예컨대, 금) 그리고 항체, 스트템타비딘, 바이오틴. 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA label l ing systems booklet , "Amersham" ( 1989) ) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gi lbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정， β ' 중량 측정 , X—선 회절 또는 흡수 자기, 효소적 활성, 매스 분석 . 결합 친화도 , 흔성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출 ¾■ 수 있는 시그널을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면 , 본 발명은 (i) 서열목록 제 1서열 및 5 제 2서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군: ( ii) 서열목록 제 4서열 내지 제 7서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선벡되는 프라이머 및 서열목록 게 8서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군 ; (iii) 서열목록 제 10서열 내지 제 12서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록
L0 제 13서열의 프라이머로 이루어지는 을리고뉴클레오타이드 군; (iv) 서열목록 제 15서열, 제 16서열 및 제 17서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; ( V ) 서열목록 제 18서열의 프라이머 . 및 서열목록 제 : 19서열 또는 제 20서열의 프라이머로 이루어지는 을리고뉴클레오타이드 군; (V1) 서열목록 제 23서열 및 제 25서열의
.1.5 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군 ; (vii) 서열목톡 제 24서열 및 ,제 25서열의 프라이머로 이루어지는 을리고뉴클레오타이드 군: 그리고 (viii) 서열목록 제 28서열, 제 29서열 및 제 30서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군으로 구성된 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오타이드 군을 포함하는 암 진단 키트를 제공한다.
20 본 발명의 일 구현예에 따르면 , 본 발명의 암은 갑상선 혹색종 (melanoma ) , 대장암, 난소암, 모발상 세포 백혈병 (hai ry ce! 1 leukemia), 췌장암, 폐암, 유빙 ·암, 전립선암, 급성백혈병, 만성백혈병, 뇌종양, 위임■ 또는 방광암이 . 본 발명의 특정 구현예에 따르면 . 본 발명의 암은 갑상선암이다.
25 본 발명의 다른 구현예에 따르면. 본 발명의 갑상선암, 혹색종 (nielanonia) . 대징 -암, 난소암 또는 모발상 세포 백혈병 (hairy eel 1 leukemia) 진단 키트는 을리고뉴클레오타이드 군 (i)을 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 갑상선암, 췌징 -암, 대장암, 폐암, 유방암 또는 전립선암 진단 키트는 을리고뉴클레오타이드 군
30 (ii)를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 , 본 발명의 갑상선암, 급성백혈병 , 만성백혈병 또는 뇌종양 진단 키트는 올리고뉴클레오타이드 군 (ΠΠ을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 갑상선임 ·, 위임 ·. 방광암 또는 전립선암 진단 키트는 을리고뉴클레오타이드 군 (iv) 및 /또는 ( V )를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 진단 키트는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (i)이 서열목록 거 13서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타아드 군 ( )가 서열목록 제 9서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거니-; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (iii)이 서열목톡 제 14서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (iv)가 서열목록 제 21서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 ( V )가 서열목록 제 22서열을 갖는■ 프로브를 추가적으로 포함하거니-; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 ( VI .)이 서열목록 제 26서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (vii)이 서열목록 제 27서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거니- ; 또는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (viii)이 서열목록 제 31서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 진단 키트는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (i)이 서열목톡 게 3서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ii)가 서열목록 제 9서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고: 본 발명의 을리고뉴클레오타이드 군 ( )이 서열목톡 제 14서열을 갖는ᅵ 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 빌ᅵ명의 올리고뉴클레오타이드 군 νΓ가 서열목록 제 21서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고: 본 발명의 을리고뉴클레오타이드 군 ( V )가 서열목록 제 22서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (vi)이 서열목록 제 26서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (vii)이 서열목톡 제 27서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고； 그리고 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (viii)이 서열목록 제 31서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함한다 . 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 진딘- 키트는 역전사 효소 (Reverse t ranscr i t ase)-& 추가적으로 ΐ함한다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 인간으로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 얻는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 핵산의 ( i ) BRAF 유전자의 돌연변이 검출, (ii ) KRAS 유전자의 돌연변이 검출, ΠΠ) NRAS 유전자의 돌연변이 검출, (iv) HRAS 유전자의 돌연변이 검출, ( V ) RET/PTC 유전자의 재배열 검출 및 (vi) PAX8/PPARy 유전자의 재배열 검출로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출을 실시하는 단계를 포함하는 암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 본 발명의 암은 갑상선암. 혹색종 (melanoma) , 대징 -암, 난소임 ·, 모발싱- 세포 백혈병 (hair'y eel 1 leukemia), 췌장암, 폐임-, 유방암. 전립선암. 급성백혈병 . 만성백혈병 , 뇌종양, 위암 또는 방광암이디-. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 암은 갑상선암이디- . 본 발명의 방법을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같디-: 단계 (a): 인간으로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산 획득
본 발명에 따르면, 우선 인간으로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 얻는다.
본 명세서에서 용어 "생물학적 시료" 는 체외로 분리된 동물의 생체 시료로서 , 혈액， 혈징■, 혈청 , 뇨, 골수, 세포, 모발 또는 조직 시료를 의미히.며 , 본 빌명의 일 구현에에 따르면, 본 발명의 생물학적 시료는 특정 세포 또는 조직 시료이다■. 본 발명의 디-른 구현예에 따르면, 본 발명의 생물학적 시료는 갑상선 세포 또는 조직 시료이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 '핵산은 RNA이다. 단계 (b): 특정 유전자 돌연변이 및 /또는 유전자 재배열 검출
단계 (a) 실시 후, 상기 단계 (a)에서 획득한 핵산의 ( i ) BRAF 유전자의 돌연변이, (ii ) KRAS 유전자의 돌연변이， (iii) NRAS 유전자의 돌연변이 , (iv) HRAS 유전자의 돌연변이, ( V ) RET/PTC 유전자의 재배열 및 /또는 (vi) PAX8/PPAR γ 유전자의 재배열 검출을 실시한디-.
'본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 검출은 증폭반웅을 이용하여 실시한다 .
본 명세서에서 용어 "증폭반응" 이란 유전자 (gene) 또는 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며， 이는 중합효소 연쇄반웅 (이하 PCR이라 한다) (미국 특허 제 4, 683, 195, 4,683,202, 및 4,800, 159호)， 역전사ᅳ중합효소 연쇄반웅 (이하 RT-PCRJL 표기한다-) (Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual , 3rd eel. Cold Spring Harbor Press(2001)) , Mi l ler, H. I . (W0 89/06700) 및 Davey, C. 등 (EP 329, 822)의 방법 , 리가아제 연쇄 반응 (l ig'ase cha ι n reaction; LCR)(17, 18). Gap— LCR(W0 90/01069), 복구 연쇄 반웅 (r'epaii- chain react ion; F.P 439, 182) , 전사—중재 증폭 ( t ransc'r ι pt i oii—med i aced ampl ification; T A)(19) (W0 88/10 15), 자가 유지 염기서열 복제. (sel f sustained sequence rep I icat ion) (20) (W0 90/06995) , 티-깃 풀리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭 ( selective ampl i fication of target polynucleotide sequences) (미국 특허 제 6, 410, 276호), 컨^！서스 서열 프라이 중합효소 연쇄 반응 (consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR) (미국 특허 제 4, 437, 975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반웅 (arbi trari ly primed polymerase chain reaction; AP- PCR) (미국 톡허 제 5, 413, 909호 및 제 5 , 861 , 245호) , 핵산 염기서열 기반 증폭 (nucleic acid sequence based ampl i fication; NASBA) (미국 특허 제 5J30.238호, 제 5.409, 818호. 제 5 , 554 , 5.1.7호, 및 제 6 , 063 , 603호), 가닥 치환 증폭 (strand displacement amp 1 i f i cat i on) (21 , 22) 및 고리-중재 항온성 증폭 ( 1 oop-med i a ted i sotherma 1 amp 1 i f icat ion; LAMPj (23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 게 5, 242, 794, 5,494,810, 4, 988,617호 및 미국 특허 제 09/854 ,317호에 기술되어 있다.
중합효소연쇄반응 (PCR)은 가장 잘 알려진 유전자 또는 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 본 발명의 진단방법에는 전통적인 >CR 방법뿐 아니라. PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시킨, 터치다 PCR (24), 핫 스타트 (hot start) PCR (25, 26). 네스티드 (nested) PCR(2) 및 부스터 (booster) PCR(27)을 이용할 수 있다. 또한, 실시간 (rea卜 t inie) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭 (rapid ampl i fication of cDNA ends： RACE) . 인버스 중합효소 연쇄반응 (inverse polymerase chain reaction: IPCR) , 백토레트 (vectorette) PCR, TA I L-PCR( thermal asymmetric interlaced PCR) 및 멀티플렉스 PCR을 사용할 수도 있다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M. j. , 및 Mol ler, S.G. PCR. BIOS Scientific Publ ishers, Springer— Ver lag New York Berl in Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며 , 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된디-.
본 발명의 특정 구현예에 따르면 ,. 본 발명의 검출은 실 -시간 PCR을 이용하여 실시한다. 실-시긴- PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실—시긴'으로 모니터링하여 분석하는 기술이디 -(Levak K.J , e a I . , PCR Methods Appl. , 4(6)： 357-62( 1995)). PCR 생산물의 증가가 타겟 템플레이트의 초기 양과 비례하는 지수기 (exponential phase) 동안 각 사이클에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수톡 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 Ct 값 (threshold cycle)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷힌- 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다. 종래의 PCR 방법에 비해, 실 -시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태 (plateau)에서 측정되는 반면에， 실ᅳ시긴- PCR은 지수성장기 (exponential growth phase) 동인ᅵ 데이터를 얻을 수― 있디-; (b) 리포터 형굉 · 시그널의 증가는 발생된 앰풀리콘 (aniph'cons)의 수와 직접적으로 비례한디-; Cc) 분해된 프로브는 앰폴리콘의 영구적인 기록 증폭 (record ampl i f i cat i on)을 제공한디-: (d) 검출 범위의 증가: (e) 종리 1 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적디-.
PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한디-. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다-. 따라서 , 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실—시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 한계치 (threshold)를 설정하면 한계치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 Ct 값이 산출된디-. 실—시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 interchelatmg 방법 (SYBR 그린 I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법 (TaqMan 프로브 방법 ) 등이 있다. interchel at i ng 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높이- 유시- 서열까지도 구별해서 검출할 수 있디-. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트는 TaqMan 프로브 방법을 이용한다.
먼저 , intercheiating. 방법은 이중 가닥 [)NA 결힙- 다이를 이용하는 빙-법으로, 비-서열 특이적 형광 intercalaCing 시약 (SYBR 그린 [ 또는 ethidium bromide)을 이용하여 비一특이적 증폭 및 프라이머―디 '이머 복합체를 포함하는 앰플리콘 생산을 정량하는 것이다. 상기 시약은 ssDNA와는 결합하지 않는디 ·. SYBR 그린 [은 이중 가닥 DNA의 마이너 그루브 (mi nor groove)에 결합하는 형굉 '성 다이로, 용액 상에서는 거의 형광을 보이지 않지만 이중 가닥 DNA와 결합하면 강한 형광을 나타내는 시익 :( terchelator)이디 -(M이 -rison TB, Biotechniques. , 24(6)： 954-8 , 960 , 962(1998)). 따라서 SYBR 그린 [과 이중 가닥 DNA 간의 결합을 통해 형광을 방출히ᅵ기 때문에 증폭 산물의 생성량을 축정할 수 있디.. SYBR 그린 실—시간 PCR.은 앰폴리콘 동정을 위해 융해점 (melting point) 또는 해리 곡선 (dissociation curve) 분석과 같은 최적화 과정을 동반한디-. 정상적으로 SYBR 그린은 싱글플렉스 (smgleplex) 반웅에 이용되지만, 융해곡선 (melting curve) 분석이 동반되면 멀티폴렉스 (mul t iplex) 반웅에 이용될 수 있다 (Si raj AK, et al . , Clin Cancer Res. , 8(12): 3832- 40(2002)； 및 Vrettou C.. et al. , Hum Mutat. , Vol 23(5)： 513-521(2004)).
Ct(cycle threshold) 값은 반응에서 발생된 형광이 역치 (threshold)를 넘어서는 사이클 수를 의미하며 , 이는 초기 카피 수의 대수에 반비례한다 . 그러므로 , 특정 웰에 할당된 Ct 값은 반응에서 앰플리콘의 충분한 수가 축적된 사이클의 수를 반영한다. Ct 값은 Δ1' 의 증가가 처음으로 검출된 사이클이다ᅵ. Rn은 각 시점에서 PCR 동안 발생된 형광 시그널의 크기를■ 의미하며 , Δί 은 레퍼런스 다이의 형광 방출 강도로 '나뉘어진 리포터 다이의 형광방출 강도 (표준화된 리포터 시그널 )를 의미한다-. Ct 값은 LightCycler에서는 Cp(crossing point)로도 명명된다. Ct 값은 시스템이 로그ᅳ선형 단계 (log- 1 i near phase)에서 PCR 생산물의 지수성장과 관련된 형광 시그널의 증가를 검출하기 시작하는 시점을 나타낸디-. 이 시기는 반웅에 대한 가장 유용한 정보를 제공한디-. 로그 -선형 단계의 기울기는 증폭 효율 (ampl ification efficiency, Eff)을 나타낸다 ( h U p： / / www . appl i eclb i osys t em s.co.kr/).
힌ᅵ편 , TaqMan 프로브는 전형적으로 5'ᅳ말단에 형광물질 ( Π u이' 'ophore) 및 3'-말단에 ¾！.처 (quencher; 예건대, '['AMRA 또는 비—형굉- ¾처( )를 포함하는 프라이머 (예컨대 , 20-30 뉴클레오타이드) 보다 더 긴 올리고뉴클레오타이드이다. 여기된 형광물질은 형광을 내기 보다는 근처의 뭔처에 에너지를 전달한디 -(FRET = Frster or fluorescence resonance energy transfer; Chen , X. , et al . , Proc Natl Acad Sci USA, 94(20)： 10756-61(1997)). 그러므로, 프로브가 정상인 경우, 어떠한 형광도 발생되지 않는디-. TaqMan 프로브는 PCR 생산물의 내부 부위에 어닐링힐- 수 있도록 고안된다. 본 발명의 특정 구현에에 따르면， 본 발명의 TaqMan 프로브는 서열목록 제 3서열, 서열목록 제 9서열, 서열목톡 제 14서열， 서열목록 제 21서열, 서열목록 제 22서열, 서열목록 제 26서열, 서열목록 제 27서열 또는 서열목록 제 3].서열을 포함하는 서열로 고안될 수 있디-.
TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서 템플레이트 1)NA에 톡이적으로 흔성화하지만. 프로브 상에 ¾처에 의해 형광발색이 억제된디ᅵ. 연장 반웅 시에 Taq DNA 풀리머라제가 갖는 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 템플레이트에 흔성화한 TaqMan 프로브가 분해되어 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 퀀처에 의한 억제가 해제되어 형광은 나타낸다. 이 때, TaqMan 프로브의 5'-말단은 상기 연장 프라이머의 3'-말단의 다운스트림에 위치하여이: 한다. 즉, 연장 프라이머의 3'-말단이 주형ᅳ 의존성 핵산 중합효소에 의해 연장되는 경우， 이 중합효소의 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 TaqMan 프로브의 5'—말딘ᅵ이 절단되어 리포터 분자의 형광 시그널이 발생하게 된다.
TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 형광성 물질 및 비형광성 물질을 포함한다. 본 발명에 이용될 수 있는 형광성 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있으며， 그 예는 다음과 같다 (괄호의 슷자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다) : Cy2™(506), Y0PR0™- 1(509), YOYO™— 1(509) , Calcein(517), FITCCSIS), FluorX™(519) , Alexa™(520), Rhodamine 110(520), 5-FAM(522) Oregon . Green™500 (522), Oregon Green™488(524) , RiboGreen™(525) , Rhoclam i neGreen™(527) , Rhodamine 123(529), Magnesium Green™(531), Calcium Green™ (533), T()-PR0™-1(533) , T()T()1(533) , JOE (.548), B0DIPY530/550(550), Di 1(565). B0DIPY ™R(568), B0DIPY558/568(568) , BODIPY564/570(570) , Cy3™(570) , Alexa™546(570) , TRI'rC(572), Magnesium 0range™(575) , Phycoeryth r i n R&B ( 575 ) , Rhoclam i ne Phalloidin(575), Calcium 0range™(576) , Pyronin Y(580), Rhoclam i neB( 580) , TAMRA(582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™(596), R0X(608), Calcium Crimson™(6.15), Alexa™594(615) , Texas Red ( 6.15 ) , Ni le Red (628), Y( PRO™— 3 (631), Y0Y0™-3 ( 631 ) , R-phycocyan i n ( 642 ) , CPhycocyan i n ( 648 ) , T0- PR0™-3(660), T0T03(660), DiD Di 1C(5) (665) , Cy5™(670), Thi acli carbocyani ne(671), Cy5.5(694), HEX (556), TET(536), VIC(546), BHQ— 1(534)， BHQ-2(579), BHQ— 3(672), Bi osearchBI ue(447) , CAL Fluor Gold 540(544), CAL Fluor Orange 560(559), CAL Fluor Red 590(591), CAL, Fiuor ed 610(610), CAL Fluor Red 635(637), FAM(520), Fluorescein(520) . Fluorescein— C3(520), Pulsar 650(566), Quasar 570(667), Quasar 670(705) 및 Quasar 705(610). 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 VIC 및 FAM 표지를 포함한다. '
적합한 리포터 -퀀처 쌍 (pairs)은 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al . , editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY (Ma reel Dekker , New York, 1971)； White et al . , FLUORESCENCE ANALYSIS: A. PRACTICAL APPROACH (Marcel Dekker , New York, 1970)； Berlnian, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2nd EDITION (Academic Press, New York, 1971)； Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC
1.4 M0[£CULES( Academic Press, New York, 1976)； Bishop, editor, INDICATORS(Pergamon Press. Oxford, 1972)： Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALSCMolecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE( Inter sc i ence Publishers, New York, 1949)； Haugland, R. P. , HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RRSEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes , Eugene, Ore.g. , 1996； U.S. Pat . Nos. 3,996,345 and 4,351,760.
또한, TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자에 이용되는 비형광성 물질은 마이너 그루브 결힙- 모이어티 (niinor groove binding (MGB) moiety)를 포함할 수 있다. 본 명세서의 용어 "MGB- 컨쥬게이트 프로브 (MGB— conjugate probe)"는 프로브의 3'-말단에 MGB와 컨쥬게이션된 프로브를 의미한다 . MGB는 높은 친화도로 UNA의 마이너 그루브에 결합하는 물질로서, 네트롭신 (netropsm). 디스타마이신 ( d i s t amyc in) , 렉시트롭신 ( 1 ex 11 r ops i n ) , 미트라마이신 (mithramycin) , 크로모마이신 (chromc yc i π) A3, 올리보마이신 (o] ivomycin) , 안트라마이신 (anthraniyc i η ) , 시비로마이신 (sibi roniycin) ' 펜타미딘 (pentami di ne) , 스틸바미딘 (sti lbamidine), 베레닐 (bereni l), CC-1065, Hoechst 33258, DAP Ϊ ( 4-6-d i am i d i ηο-2-pheny 1 i nclo 1 e ) , CDPI의 다이머 , 트리머 , 테. Εί리-머 및 펜타머 , MPC(N— methylpyrrole-4— carbox-2-amicle) 및 이의 다이머 , 토리머 , 테트라머 및 펜타머를 포함하지민- , 이에 한정되는 것은 아니디- .
프로브의- MGB의 컨쥬게이션 (conjugation)은 프로브와 이의 타겟 간에 형성되는 하이브리드의 안정성을 현저하게 증가시킨다. 보다 싱-세하게는, 증가된 안정성 (즉， 흔성화 정도의 증가)는 정상 프로브와 비교하여 MGB- 컨쥬게이트 프로브에 의해 형성된 하이브리드 듀풀렉스의 증가된 Tm (melting temperature)을 유발한다. 따라서, MGB는 반데르발스 힘을 안정화시켜 프로브 길이의 증가 없이 MGB—컨쥬게이트 프로브의 Tm(nielting temperature)를 증가시킴으로써 보다 엄격 조건 하의 Taqman 실 -시간 PCR에서 더 짧은 프로브 (예컨대 , 21개 이하의 뉴클레오타이드)의 이용을 가능하게 해 준디-.
또한, MGB—컨쥬게이트 프로브는 백그라운드 형광을 보다 효율적으로 제거시켜 준다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브의 5'-말단은 VIC 또는 FAM의 형광물질 (f luorophore)로 표지되며, 3'-말단은 MGBNFQ 및 IntZEN-3IABIK로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 퀀처 (quencher )로 변형될 수 있다.
보다 구체적으로는, 본 발명의 서열목톡 제 3서열, 제 1.4서열, 제 27서열， 제 31서열 및 제 37서열은 51—말단의 형광물질로 ViC 및 3'—말단에 퀀처로 MGBNFQ를 이용하고, 본 발명의 서열목록 제 9서열은 5'-말단의 형광물질로 FAM 및 31-말단에 퀀처로 MGBNFQ를 이용하며 , 본 발명의 서열목록 제 21시열, 제 22서열. 제 26시열 및 제 34서열은 51-말단의 형광물질로 FAM 및 3'一말단에 ¾처로 IntZEN— 3iAR[K를 이용한디-.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 핵신-이 RNA인 경우 본 발명의 단계 (b)는 상기 RNA를 cDNA로 전사시키는 멱전사 단계 (pre-b i- 추가적으로 포함한다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (pre-b)는 45-55T：에서 20-40분 동안 실시한다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명이 단계 (pre-b)를 추가적으로 포함하는 경우 본 발명의 검출은 중합효소연쇄반웅을 이용하여 실시한다. 본 발명의 검출은 역전사 중합효소연쇄반응에 의하여서도 실시힐- 수 있는데， 상기 역전사 중합효소연쇄반응은 싱-기 단계 (^6 중합효소연쇄반응을 결합한 반응과 동일히 -다.
본 발명의 특정 구현에에 따르면, 본 발명의 중합효소연쇄반응은 (a1 ) 9위.00°(：에서 5분— 15분 동안 지속시키는 단계; (b') 9() K)0°C에서 1.0- 20초 및 55-65 :에서 40— 50초 동안 지속시키는 딘-계; 및 (c1) 상기 단계 (b1 )를 40-50회 반복하는 단계를 포함한다.
본 발명의 검출은 상술한 유전자 증폭방법 이외에 흔성화법 (hybridization) , 면역분석법 ( imn inoassay) 또는 마이크로어레이 (microatray)를 이용하여 실시할 수 있디-.
본 발명의 일 구현예에 따르면. (i) 본 발명의 BRAF 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제]서열 및 제 2서열의 프라이머로 이루어지는 을리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거니—: ( ii ) 본 발명의 유전자의 ■연변이 검출은 서열목록 거 14서열 내지 제 7서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제 8서열의 프라이머로 이루어지는 을리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거니. : ( iii ) 본 발명의 NRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제 10서열 내지 제 12서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제 13서열의 의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나; ( iv ) 본 발명의 HRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제 1.5서열, 제 16서열 및 제 17서열의 프라이머로 이루어지는 을리고뉴클레오타이드 군 ; 또는 _ 서열목록 제 18서열의 프라이머, 및 서열목톡 제 1.9서열 또는 제 20서열의 프라이머로 이루어지는 을리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나; ( V ) 본 발명의 RET/PTC 유전자의 재배열 검출은 서일목록 제 23서열 및 제 25서열의 프라이머로 이투어지는- 을리고뉴클레오타이드- 군 ; 또는 서열목록 제 24서열 및 제 25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나; 또는 ( vi ) 본 발명의 PAX8/PPAR Y 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제 28서열, 제 29서열 및 제 30서열의 프라이머로 이루어지는 을리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시한다 .
본 발명의 다른 구현예에 따르면, ( i ) 본 발명의 BRAF 유전자의 1"연변이 검출은 서열목록 제 1서열 및 제 2서열의 프라이머로 이루어지는 을리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하 1 ; ( ϋ ) 본 발명의 KR.AS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제 4:서열 내지 제 7서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제 8서열의 프라이머로 이루어지는 을리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하고； ( iii ) 본 발명의 NRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제 10서열 내지 제 L2서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선텍되는 프라이머 및 서열목록 제 13서열의 의 프라이머로 이루어지는 을리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하고; ( iv ) 본 발명의 HRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제 15서열, 제 16서열 및 제 17서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; 또는 서열목록 제 18서열의 프라이머 , 및 서열목록 제 1.9서열 또는 제 20서열의 프라이머로 이루어지는 을리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하 ( V ) 본 발명의 RET/PTC 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제 23서열 및 제 25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군 ; 또는 서열목록 제 24서열 및 제 25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시혜 그리고 (vi) 본 발명의 PAX8/PPARY 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제 28서열, 제 29서열 및 제 30서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시한다 .
본 발명의 다른 구현예에 따르면, (i) 본 발명의 BRAF 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제 3서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나ᅵ; (；1- ) 본 발명의 KRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제 9서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거니■: (iii) 본 발명의 NRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제 14서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거니-: ( ίν) 본 발명의 HRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제 21'서열 또는 제 22서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거니. ; ( V ) 본 발명의 RET/PTC 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제 26서열 또는 제 27서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나; 또는 (vi) 본 발명의 PAX8/PPAR.X 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제 31서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용한다.
본 발명의 어떠힌- 구현예에 따르면, (i) 본 발명의 BRAF 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제 3서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하 ( Π ) 본 발명의 KRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제 9서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용히-: (iii) 본 발명의' NRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제 14서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하: Ϊ ; ( iv ) 본 발명의 HRAS 유전자의 돌연변이 ¾출은 서열목록 제 21.서열 또는 제 22서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하: ( V ) 본 발명의 RET/PTC 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제 26서열 또는 제 27서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하고; 그리고 (vi) 본 발명의 PAX8/PPARY 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제 31서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용한다-.
【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 암 세포의 핵산과 흔성화되는 특정 서열의 암 검출용 올리고뉴클레오타이드 군. 특정 서열의 을리고뉴클레오타이드 군을
1.8 포함하는 암 진단 키트 및 암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
(b) 본 발명의 방법은 기존의 gDNA를 이용하여 체세포 돌연변이 (somatic mutation)를 검사하던 것과는 달리 , RNA를 이용하여 특정 유전자의 돌연변이 여부에 따른 특정 암에 대한 조기 진단을 가능하게 한다
(c) 본 발명의 방법에 따르면 , gDNA로는 검출되지 않았던 돌연변이의 검출이 가능한 바 한번의 RN.A 추출로 모든 암 관련 유전자 돌연변이 검사가 가능하여 정확하고 신속하게 진단을 할 수 있는 이점이 있다-.
(d) 특히 , 본 발명의 방법은 갑상선암과 관련된 모든 돌연변이를 동시에 검사가 · 가능한바, 갑상선암의 진단을 신속하고 정확히 할 수 있는 효괴ᅵ가 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 임- (예컨대, 갑상선암)의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 신규한 방법에 대한 개요이디- .
도 2는 BRAF V600E 돌연변이 검출을 위한 프라이머 및 프로브 고안방법을 나타낸다.
도 3은 KRAS 돌연변이 검출을 위한 프라이머 및 프로브 고안방법을 나타낸다.
도 4는 NRAS 돌연변이 검출을 위한 프라이머 및 프로브 고안방법을 나타낸다.
도 5는 HRAS 돌연변이 검출을 위한 프라이머 및 프로브 고안방법을 나타낸다.
도 6은 RET/PTC1 돌연변이 검출을 위한 프라이머 및 프로브 고안방법을 나타낸다.
도 7은 RET/PTC3 돌연변이 검출을 위한 프라이머 및 프로브 고안방법을 나타낸다.
도 8은 PAX8/PPARY 돌연변이 검출을 위한 프라이머 및 프로브 고안방법을 나타낸다.
【발명의 실시를 위한 형태】 이히 ·, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한디-. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이디- . 실시예
실시예 1: RNA 시료 준비
KRAS G12S/G12C/G12[)/G12A/G12V/G1.3D, NRAS Q61R/Q61 /Q61L , HRAS G12V/Q61R, BRAF V600E 돌연변이를 포함하고 있는 각각의 양성 세포주로부터 HighPure RNA Isolation Ki Roche시- 스위스)를 사용하여 RNA를 분리 후 사용하였 . 상기 양성 세포주의 출처는 하기 표 1에 기재하였다.
양성 세포주를 획득하지 못한 RET/PTC1, RET/PTC3 , PAX8/PPA g, .RAS G12R, HRAS G13R/Q61K 돌연변이의 경우 상기 돌연변이의 일부를 포함하도록 Integrated DNA Techno 1 ogi es사를 통해 인공적으로 유전자를 합성 (gBlock Gene Fragment)한 - 이를 pGEM©-T easy Vector (I^romega, Mad i son , 미국)에 도입한 플라스미드 ί)ΝΑ를 사용하였다. 상기 합성한 유전자 서열은 서열목록 제 38서열 (RET/PTC 1. 돌연변이), 서열목록 제 39서열 (RET/PTC3 돌연변이), 서열목록 제 40서열 (PAX8/PPARg exon 7 돌연변이), 서열목록 거 i서열 (PAX8/PPARg exon 9 돌연변이), 서열독톡 제 42서열 (KRAS G12R 돌연변이 ) 및 서열목록 제 43서열 (HiMS G13R/Q61K 돌연변이 )이다.
【표 1】
유전자 포주 /Gene
fragment 출처
sBlock Gene
RET/PTC1 CCDC6/RET IntegratedD Teclmo logies
fragment
gB 1 o ck Gene
RET PTC3 NC0A RET Integrat ed腿 Techno logies
fragment
PAX 8 gBlock Gene
Integrated DMA Technologies -
PAX8 PPA exon7/PPARg fragiiient
Eg 扁 gBlock Gene
Integrated DNA 'Technologies e};on9/PPARg fr gment
Q\2 A549 CLB
G12C KCLB
G12D SNU-C2B KCLB
G12A SW-1116 KCLB
KRAS
G12V S'i-620 KCLB
G13D LOVO KCLB
gBlock Gene
G12R Integrated DNA Teclino logies
fragment
Q61R S -MEL-2 KCLB
Q61K H9 KCLB:
NRAS
Q61 L HL-60 KCLB
GI2V T24 KCLB
gBlock Gene
G13R Integrated DNA Technologies
fragment
匪
Q61 R MC/C ATCC
gBlock Gene
Q61 Integrated
f ragmen, t 腿 Techno logies
BEAF V600E ATCC
* KCLBCKorean Cel l Line Bank, 한국세포주은행. 대한민국)
* ATCC(Amer i can Type Culture Col lection, 口 1국) 실시예 2: cDNA 시료 준비
Transcr iptor First Strand cDNA Synthesis i t( ocheA 스위스)을 이용하여 실시예 1ᅵ에서 분리한 세포주의 RNA를 cDNA로 합성하였다. 실시예 3: 돌연변이 검출을 위한 프라이머 및 프로브 고인ᅳ
BRAF유전자 돌연변이 검출
BRAF 유전자 엑손 (exon) 15 내 V600E 돌연변이를 확인을 위하여 엑손 15 내에 포워드 프라이머 (BR.AF-PF3), 리버스 프라이머 (BRAF— PR.3-1) 및 형광 프로브 (BRAF— PP1)가 존재하도록 고안하여 RNA를 주형으로 검사가 가능하도록 하였다. 프라이머 및 프로브 서열은 표 2과 같다. 【표 2]
Figure imgf000024_0001
KRAS유전자 돌연변이 검출
RAS 유전자 엑손 2 내에 포워드 프라이머 (KR.AS-C34— F10. KRAS-C34T-
Fl. KRAS-C35-F11 또는 KRAS— c38-F2) , 리버스 프라이머 (KRASᅳ 1.R) 및 형광 프로브 (MGB3(FAM))가 존재하도록 고안하여 RNA를 주형으로 검사가 가능하도록 하였디-. 프라이머 및 프로브 서열은 표 3와 같다..
【표 3】
Figure imgf000024_0002
MAS유전자 돌연변이 검출
NRAS 유전자 엑손 3 내에 포워드 프라이머 (NR.AS Q6.1L-F6, NRAS Q61K- F6 또는 NRAS Q61R-F8), 리버스 프라이머 (NRAS R1) 및 형광 프로브 (NRAS Probe(VIC))가 존재하도록 고안하여 RNA를 주형으로 검사가 가능하도록 하였다. 프라이머 및 프로브 서열은 표 4과 같다.
【표 4]
Figure imgf000024_0003
腿 S유전자 돌연변이 검출
HRAS 유전자 엑손 2 내에 포워드 프라이머 (HRAS G12V-F5 또는 IIRAS G13R-F4), 리버스 프라이머 (HRAS 12,13-Rl) 및 형광 프로브 (HRAS 12, 13_ZEN probe(FAM))가 존재하도톡 고안하고, 엑손 3 내에 포워드 프라이머 (HRAS 61-F1), 리버스 프라이머 (HRAS Q61K- 3 또는 HRAS Q61R-R10) 및 형광 프로브 (HRAS 6LZEN probe(FAM))가 존재하도록 고안하여 RNA를 주형으로 검사가 가능하도록 하였다.. 프라이머 및 프로브 서열은 표 5와 같다.
【표 5】
Figure imgf000025_0001
RET/FTC재배열 돌연변이 유전자 돌연변이 검출
RET/PTC 재배열 돌연변이의 경우 RET/ᅵ : C.l 형괴- 형으로 구분힐- 수 있는데, RFᅳ T/PTC.L 재배열 돌연변이는 CCDC6 유전자의 액손 1에 포워드 프라이머 (K/P.1.-F1) 및 형광 프로브 (ΖΕΝ(Ρ].))가 위치히.게 하고 , 리버스 프라이머 (R/Pl, P3-R2)는 RET 유전자의 엑손 .12에 위치하도록 고안하여 CCDC6/RET 재베열 돌연변이 검사가 가능하도록 하였다.
RE17PTC3 재배열 돌연변이는 NC0M 유전자의 엑손 11에 포워드 프라이머 (R/R3-F1) 및 형굉- 프로브 (MGB-P3)가 위치하게 하고, 리버스 프라이머 (R/P1.P3-R2)는 RET 유전자의 액손 12에 위치하도록 고안하여 NC0A4/R.ET 재배열 돌연변이 검사가 가능하도록 하였다.
프라이머 및 프로브 서열은 표 6와 같다.
【표 6】
Figure imgf000025_0002
ΡΑΧδ/ΡΡΑΚγ 재배열 돌연변이 유전자 돌연변이 검출 RET/PTC 재배열 돌연변이의 경우 PAX8 유전자의 엑손 9와 PPAR γ의 엑손 1이 재배열된 것괴. ΡΑΧ8 유전자의 엑손 7과 PPAR x의 엑손 재배열된 것으로 구분할 수 있는데. 포워드 프라이머를 ΡΑΧ8 유전자의 엑손 7(PASX8-7-F2.)과 액손 9(ΡΛΧ8ᅳ 9— F3— 3(K IS) )의 두 군데 위치에 위치시키고 형광 프로브 (PAX8 MGB(VIC))외- 리버스 프라이머 (PPARg- LR)를 ᅡPAR χ 유전자의 엑손 1에 위치하도록 고안함으로씨 , 한번에 두 가지의
PAX8/PPAR γ 재배열 돌연변이 검출이 가능하도록 하였다■. 프라이머 및 프로브 서열은 표 7과 같
【표 7】
Figure imgf000026_0001
실시예 4: 실시간 역전사 중합효소연쇄반응 (Real time reverse transcription polymerase chain reaction) Ξ£는 실시간 중합효소연쇄반웅 (Real time polymerase chain react ion)
상기 실시에 3 유전자의 주요 돌연변이를 확인하기 위하여 , 상기 대상집단으로부터 분리한 RNA를 이용하여 실시간 역전사 중합효소연쇄반웅 (one— step real-t ime reverse transcription PCR) 또는 상기 k'NA를 cDNA로 합성한 후 실시간 중합효소연쇄반웅 (rea卜 time PCR)을 실시하였다. 상기 RNA의 cDNA로의 합성은 Transcr iptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche시., 스위스)를 이용하였디-.
실시간 역전시- 중합효소연쇄반웅 또는 실시간 중합효소 연쇄반응에 사용된 프라이머 및 프로브 서열은 실시예 3과 같다.
세포에서 RNA가 잘 추출되어 검시-에 적당한 양으로 포함되어 있는지 및 중합효소연쇄반웅에 문제가 없는지를 확인히 ·7ᅵ 위하여 KRT7 또는 GAPDH 유전자의 실시간 역전사 중합효소연쇄반웅을 대조군으로 수행하였다. 상기 RT7 또는 GAPDH 유전자에 대한 프라이머 및 프로브 서열은 표 8과 같다. 【표 8】
Figure imgf000027_0001
상기 프로브에는 증폭산물의 크기를 확인할 수 있도록 형광물질인 플로레신 (Fluorescein, FAM) 또는 VKXAppl ied Biosystems)를 부착하였다. 상기 정방향 프라이머 1 uL 역방향 프라이머 1 ill, RNA 시료 5 μ L, 증류수 3.5 n L, 2X RT--PCR 프리믹스 (Nanohel ix 대한민국) 1.2.5 μ L, RT-PCR 효소 흔합물 (Nanohel ίχ, 대한민국) 1 μ L를 흔합하여 , ① 50°C(30분- 1. 회); ② 95°C(10분, 1.회); ③ 95°C(15초 )-60°C(45초) (45희)의 조건으로 실시간 역전사 중합효소연쇄반웅을 수행하였다-. RNA 시료 대신 cDNA 시료를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 경우 · 상기 단계 ①을 수행하지 않고 단계 ② 및 단계 ③만을 수행하였다. 실시예 5: 돌연변이 확인
양성 세포주를 사용한 결과에서 KRT7과 GAPDH가 모두 Ct (Threshold cycle, Threshold와 접점을 나타내는 형광신호의 사이클 수를 의미함) 1丄3—27.4의 범위 내 증폭하여 R.NA 추출 및 cDNA 합성애 문제 없음을 확인하였으며 , Q 38 미만인 경우 양성 돌연변이로 판단할 수 있다. KRAS 돌연변이 세포주의 경우 KRAS Ct기- 22.7-26.2의 범위 내 증폭하여 KRAS 돌연변이 양성을 확인하였다. NR.AS 돌연변이 세포주의 경우 NRAS Ct가 25.8-30.5 의 범위 내 증폭하여 NRAS 돌연변이 양성을 확인하였다. HRAS 돌연변이 세포주의 경우 HRAS Ct가 23.3-31.5 의 범위 내 증폭하여 HRAS 돌연변이 양성을 확인하였다. 양성 플라스미드 DNA를 사용한 경우 KRT7과 GAPDH 는 확인할 수 없고, 각 돌연변이별로 Ct 20.7-22.7로 확인되어 각 돌연변이 양성을 확인하였다.
결과적으로 본 발명의 프라이머 및 실시간 중합효소 연쇄반응 조건을 이용하여 상기 유전자의 돌연변이의 양성을 모두 확인할 수 있는바, 각 프리-이 ι 또는 이들의 조합을 이용하여 상기 유전자에
가지는 ' HI 대한 진단이 가능함을 확인할 수 있었다.
【표 9】
Figure imgf000028_0001
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바 , 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 일 구현 예일 뿐이며, 이에 본ᅵ 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하ᅵ디- . 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이디 · .

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
(!') 서열목록 게 1서열 및 거] 2서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군;
(ii) 서열목톡 제 4서열 내지 제 7서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 게 8서열의 프라이머로 이루어지는 을리고뉴클레오타이드 군;
(iii) 서열목록 제 10서열 내지 제 12서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제 13서열의 프라이머로 이루어지는 을리고뉴클레오타이드 군;
(iv) 서열목톡 제 15서열, 제 16서열 및 제 17서열의 프라이머로 이루어지는 을리고뉴클레오타이드 군;
( V ) 서열목록 제 18서열의 프라이머 . 및 서열목톡 제 19서열 또는 저 120서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군;
(vi) 서열목록 제 23서열 및 제 25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군;
(vii) 서열목록 제 24서열 및 제 25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; 그리고
(ᅳ viii) 서열목록 제 28서열， 제 29서열 및 제 30서열의 프라이머로 이루어지는 을리고뉴클레오타이드 군으로 구성된 군으로부터 선벡되는 을리고뉴클데오타이드 군으로,
상기 올리고뉴클레오타이드 군은 암 세포의 핵산괴- 흔성화되는 암 검출용 을리고뉴클레오타이드 군. '
【청구항 2】
제 1 항에 있어서 상기 암은 갑상선암, 흑색종 (melanoma), 대장암, 난소암, 모발상 세포 백혈병 (hairy cell leukemia), 췌장암, 폐암, 유방암, 전립선암, 급성백혈병 , 만성백혈병, 뇌종양, 위암 또는 방광암인 것을 특징으로 하는 을리고뉴클레오타이드 군.
【청구항 3] (I) 서열목록 제 1서열 라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군;
(ii) 서열목록 제 4서열 제 7서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 서열목록 제 8서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드
(Hi) 서열목록 제 10서열 제 12서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되 XE라이머 서열목톡 제 13서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군;
(iv) 서열목록 제 15서열, 제 16서열 및 제 17서열의 프라이머로 이루어지는 을리고뉴클레오타이드 군;
( V ) 서열목록 제 18서열의 프라이머 , 및 서열목록 제 19서열 또는 제 20서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군:
( vi ) 서열목록 제 23서열 및 제 25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군;
(vii) 서열목록 제 24서열 및 제 25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; 그리고
(viii) 서열목록 제 28서열, 제 29서열 및 제 30서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군으로. 구성된 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오타이드 군을 포함하는 암 진단 키트.
【청구항 4】
제 3 항에 있어서 싱-기 암은 갑상선임-, 혹색종 (melanoma), 대징ᅵ암 , 난소암, 모발상 세포 백혈병 (hairy cell leukemia), 췌장암, 폐암, 유빙-암, 전립선암, 급성백혈병 , 만성백혈병, 뇌종양, 위암 또는 방광암인 것을 특징으로 하는 암 진단 키트.
【청구항 5】
제 3 항에 있어서 , 싱ᅵ기 암 진단 키트는 올리고뉴클레오타이드 군 (1 )이 서열목톡 지 13서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나;
상기 을리고뉴클레오타이드 군 (ii )기- 서열목록 제 9서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거니- ; 상기 올리고뉴클레오타 c 드 군 서열목록 제 14서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나
상기 올리고뉴클레오타 ΰ 드 군 (iv)가 서열목록 제 21.서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나
상기 을리고뉴클레오타 ο ( V )가 서열목록 제 22서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나
상기 을리고뉴클레오타 ο 드 군 (vi )이 서열목록 제 26서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거니
싱-기 올리고뉴클레오타 ο 드 군 (vii 서열목톡 제 27서열을 갖 프로브를 추가적으로 포함하거니； 또는
상기 올리고뉴클레오타이드 (viii)이 서열목록 제 31서열을 프로브를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단 키트.
【청구항 6】
제 3 항에 있어서, 싱-기 진단ᅵ 키트는 역전사 효소 (Reverse transcriptase)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단 키트.
【청구항 7]
다움 단계를 포함하는 암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법 :
(a) 인간으로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 얻는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 핵산의 ( i ) BRAF 유전자의 돌연변이 검출. ( ii ) AS 유전자의 돌연변이 검출, (iii) NRAS 유전자의 돌연변이 검출, (iv) HRAS 유전자의 돌연변이 검출, ( V ) RET/PTC 유전자의 재배열 검출 및 (vi) PAX8/PPAR γ 유전자의 재배열 검출로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출을 실시하는 단계 .
【청구항 8】
제 7 항에 있어서, 상기 암은 갑상선암, 혹색종 (melanoma), 대장임 \ 난소암, 모발상 세포 백혈병 (hairy eel 1 leukemia), 췌징 -암, 폐임-. 유방임-. 전립선암, 급성백혈병 , 만성백혈병 , 뇌종양, 위암 또는 방광암인 것을 특징으로 하는 방법
【청구항 91
제 7 항에 있어서, 상기 핵산은 RNA인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 10]
제 9 항에 있어서 , 상기 단계 (1 는 상기 腿를 cDNA로 전사시키는 역전시- 단계 (pre-b)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 11】
제 10 항에 있어서, 상기 단계 (pre-b)는 45-55 °C에서 20—40분 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 12】 - 제 10 항에 있어서 , 상기 검출은 중합효소연쇄반응을 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 13]
제 12 힝 -에 있어서 . 싱-기 중합효소연쇄반응은 다음 단계를 포함하는 것을 톡징으로 하는 방법：
' (a' ) 9()— 100°C에서 5분— 15분 동안 지속시키는 단계;
(b' ) 90- 100 °C에서 1으 20초 및 55ᅳ65 °C에서 40-50초 동안 지속시키는 단계 ; 및
(c' ) 상기 단계 0〕')를 4으50회 반복하는 단계 .
.
【청구항 14】
제 7 힝-에 있어서, (i) 상기 BRAF 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제 1서열 및 제 2서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거니- ;
( ϋ ) 상기 KR.AS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제 4서열 내지 제 7서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제 8서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나;
(iii) 상기 NRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제 10서열 내지 제 12서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제 13서열의 의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나;
(iv) 상기 HRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제 15서열. 제 16서열 및 제 :17서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군: 또는- 서열목록 제 J8서열의 프라이머 , 및 서열목록 제ᅵ 9서열 또는 제 20서열의 프라이머로 이루어지는 을리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나;
( V ) 상기 RET/PTC 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제 23서열 및 제 25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; 또는 서열목록 제 24서열 및 제 25서열의. 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나; 또는
(vi.) 상기 PAX8/PPAR Y 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제 28서열. 제 29서열 및 제 30서열의 프라이머로 이루어지는 을리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법 . 【청구항 15】
제 14 항에 있어서, (0 상기 BRAF 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제 3서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거니 ·; ^
( ii ) 싱-기 KRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제 9서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거니- ;
(iii) 상기 NRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제 14서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거니 ·;
.(iv) 상기 HRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제 21서열 또는 제 22서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나;
( V ) 상기 RET/PTC 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제 26서열 또는 제 27서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나; 또는
(vi) 상기 PAX8/PPAR y 유전자의 재배열 검출은 서열목톡 제 31서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하는 것을 특징으로 하는 방법 .
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