KR20170051544A - 개선된 핵산 정량화 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 핵산의 정량화 방법에 관한 것이며, 특히 하우스키핑 유전자 또는 관심 합성 유전자에 대한 데이터를 표준화할 필요 없이 유전자 발현 연구를 위한 핵산을 정량화하는 개선된 보편적 방법에 관한 것이다.

Description

개선된 핵산 정량화 방법{IMPROVED NUCLEIC ACID QUANTITATION METHOD}

본 발명은 핵산의 정량화 방법에 관한 것이며, 특히 하우스키핑 유전자 또는 관심 합성 유전자에 대한 데이터를 표준화할 필요 없이 유전자 발현 연구를 위한 핵산을 정량화하는 개선된 보편적 방법에 관한 것이다. 이 방법은 진단적, 법의학적 및 연구적 용도에 적용가능하지만, 본 발명이 이들 특정 용도 분야로 제한되지 않는 것으로 인식될 것이다.

본 명세서를 통한 선행 기술의 임의의 논의는 선행 기술이 널리 알려져 있고 또는 본 분야의 통상적인 일반적 지식의 부분을 형성한다는 용인으로서 고려되어서는 안 된다.

유전자 발현의 정량화를 위한 PCR 기법은 빠른 열순환기의 개발 및 각각의 사이클 후 증폭된 생성물의 형광 모니터링(실시간 PCR)의 도입을 통해 개선되었다. 유전자 발현의 정량화는 염료, 특히 형광 염료의 사용, 및 반응의 시작시 샘플 중에서 핵산의 양과 비례하는 PCR 증폭의 대수기 동안 증가하는 형광의 검출을 통해 일어난다. 정량화는 역치 주기(threshold cycle), 즉 검출가능한 형광이 있는 제 1 주기를 기준으로 하며, 외부 표준(보통 합성 유전자)에 의한 절대적 방식 또는 내부 캘리브레이터로서 역할을 하는 기준 유전자(즉, 하우스키핑 유전자)를 비교 표준화하는 상대적 방식으로 수행될 수 있다. 제어 유전자 또는 하우스키핑 유전자는 상이한 샘플들 사이의 mRNA 수준을 표준화하기 위해 사용된다.

유전자 발현의 미미한 변형조차 표적 유전자의 상대적인 정량화 프로필을 변경할 것이므로 선택된 기준 유전자가 변동을 거듭하지 않는 것이 중요하다. 피펫팅 및 희석 오차는 또한 증폭 수준을 변경하며, 따라서 정량화 프로필을 변경한다.

글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH), 포르포빌리노겐 데스아미나아제(PBGD), 베타2-마이크로글로빈 또는 베타-액틴과 같은 유전자는 실시간 PCR에서 내부 캘리브레이터로서 종종 사용된다. 그러나, 앞서 언급한 유전자들은 실험 조건 또는 처리에 응하여 바뀌는 것으로 나타났다. 18S와 같은 풍부하게 발현된 유전자들은 또한 이상적인 기준 유전자가 아닌데, PCR 조건이 반응을 무력화시키지 않도록 제한될 필요가 있기 때문이다.

따라서, 적당한 하우스키핑 유전자들은 관심 조직에서 적당하게 발현되어야 하고, 가장 중요하게는 샘플간 및 사용한 실험 조건 또는 처리 하 발현중 최소의 가변성을 나타내어야 한다.

그러나 다수의 이런 제어 유전자는 발현 중 허용할 수 없는 가변성을 나타낼 수 있다. 이러한 유전자의 발현 수준은 조직 또는 세포들 중에서 다양할 수도 있고 특정 환경, 즉 상이한 처리 하에서 변할 수도 있는 것으로 나타났다. 따라서, 임의의 신규 실험 시스템에서 하우스키핑 유전자를 입증하는 것은 중요하다. 구체적 실험 시스템에서 용도에 적당한 하우스키핑 유전자 또는 기준 유전자를 찾는 것은 종종 시간 소모적이고, 어려운 작업이다. 일부 상황에서 이것은 가능하지 않을 수도 있다.

유전자 발현 연구에서 외부 표준(즉, 합성 서열)의 사용은 일반적으로 관심 유전자가 클로닝되어 합성 기준 유전자를 제공하는 것을 필요로 한다. 이 방법에서, 알려진 양의 합성 기준 유전자 서열은 연속적으로 희석된 다음 증폭되어 표준 곡선을 만든다. 이 방법을 위한 클로닝된 서열의 생성은 일반적으로 시간 소모적이고, 노동 집약적인 작업이며, 희석 오차는 기하급수적으로 확대되는데, 이는 핵산 수준의 부정확한 평가를 유발할 수 있다. 또한 많이 희석된 클로닝된 서열의 안정성 및 보존은 어려움을 야기할 수 있다.

따라서, 임의의 실험 상황 또는 처리 조건에 적용할 수 있고, 데이터를 표준화하기 위한 관심 하우스키핑 유전자 또는 합성 유전자의 사용을 필요로 하지 않는, 핵산을 정량화하는 빠르고 효율적인 보편적 방법에 대한 필요가 남아 있다.

본 발명의 목적은 선행 기술의 단점 중 적어도 하나를 극복하거나 완화하고, 또는 유용한 대안을 제공하는 것이다.

넓은 양태에서, 본 발명은 핵산 발현 데이터를 표준화하기 위해 하우스키핑 유전자 또는 합성 기준 유전자의 사용을 필요로 하지 않는 핵산의 정량화 방법에 관한 것이다. 오히려 본 발명의 방법은 적당한 염료와 조합하여 보편적인 기준 올리고뉴클레오티드를 이용하는데(또는 한 개 이상의 이러한 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다), 이는 샘플 중의 증폭된 표적 핵산의 절대적 수준으로부터 계산될 수 있는 표준 곡선을 만드는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 동일한 기준 올리고뉴클레오티드를 사용하여 이러한 관심 핵산을 개별적으로 또는 혼합물로 상이한 관심 핵산을 정량화할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에서의 사용을 위한 키트에 관한 것이다. 제 1 양태에서, 다음 단계들을 포함하는 표적 핵산을 정량화하는 방법이 제공된다:

a) 검출가능한 마커로 사전결정된 길이를 가지는 기준 올리고뉴클레오티드를 표지하는 단계;

b) 표지된 기준 올리고뉴클레오티드의 농도에 대해 검출가능한 마커의 강도를 플롯팅하는 것에 의해 표지된 기준 올리고뉴클레오티드의 연속 희석물을 사용하여 표준 곡선을 만드는 단계;

c) 증폭된 표적 핵산을 표지하는 검출가능한 마커의 존재 하에서 표적 핵산을 증폭시키는 단계; 및

d) 표지된 증폭된 표적 핵산과 결합된 검출가능한 마커의 강도를 표준곡선과 비교하고, 증폭된 표적 핵산의 양을 결정하는 단계(상기 기준 올리고뉴클레오티드는 증폭되거나 표적핵산과 공동증폭되지 않는다).

제 2 양태에서, 다음 단계들을 포함하는 표적 핵산을 정량화하는 방법이 제공된다:

a) 검출가능한 마커로 사전결정된 길이를 가지는 기준 올리고뉴클레오티드를 표지하는 단계;

b) 표지된 기준 올리고뉴클레오티드의 농도에 대해 검출가능한 마커의 강도를 플롯팅하는 것에 의해 표지된 기준 올리고뉴클레오티드의 연속 희석물을 사용하여 표준 곡선을 만드는 단계;

c) 표적 핵산을 증폭시키는 단계;

d) 검출가능한 마커로 증폭된 표적 핵산을 표지하는 단계; 및

e) 표지된 증폭된 표적 핵산과 결합된 검출가능한 마커의 강도를 표준곡선과 비교하고, 증폭된 표적 핵산의 양을 결정하는 단계(상기 기준 올리고뉴클레오티드는 증폭되거나 표적핵산과 공동증폭되지 않는다).

기준 올리고뉴클레오티드 서열은 표적 핵산과 또는 임의의 하우스키핑 유전자 서열과 임의의 상동성을 가질 필요는 없다. 그러나 기준 올리고뉴클레오티드가 본 발명의 방법에서 사용되는 특정 방법 때문에(즉, 기준 올리고뉴클레오티드의 연속 희석 후 표준 곡선을 만드는 것), 기준 올리고뉴클레오티드 서열은 표적 핵산 서열 또는 하우스키핑 유전자, 또는 그것의 더 작은 부분과 어느 정도의 상동성 또는 심지어 동일성을 가질 수 있다. 본 발명의 이점은 상기 방법이 동일한 하나의 기준 올리고뉴클레오티드를 사용하여 상이한 표적 핵산을 정량화할 수 있다는 것이다. 실제는 기준 올리고뉴클레오티드는 특정의 고정된 길이 및 GC 함량, 통상적으로 100bp 및 50% GC 함량의 올리고뉴클레오티드를 가지는 보편적인 것일 수 있다.

바람직하게, 표적 핵산의 증폭은 중합효소 연쇄 반응(PCR) 방법에 의해 수행된다. 통상적으로 표적 핵산은 15주기에 걸쳐 증폭되지만, 이것은 본 발명의 방법에서 중요하지 않다. 한 반응에서 다수의 관심 표적 핵산의 동시 증폭이 또한 수행될 수 있다(즉, 다중 PCR).

기준 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 서열과 동일한 또는 유사한 길이일 수 있지만, 이것은 그럴 필요가 없다. 기준 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산보다 더 길거나 더 짧을 수 있다. 바람직하게 하나의 표준 곡선은 한 개의 기준 올리고뉴클레오티드를 이용하여 만들어지거나 다수의 표적 핵산 증폭 및 정량화에 사용된다. 다수의 표적 핵산 증폭 및 정량화는 각각 원한다면 상이한 시간에 수행될 수 있다.

바람직하게 검출가능한 마커는 dsDNA와 결합하는 염료이고, 인터칼레이팅(intercalating) 염료일 수 있다. 바람직하게, 염료는 형광 염료이다. 사용되는 염료는 SYBR Green I, SYBR Green II, SYBR Gold, Evagreen, 옥사졸 옐로우, 티아졸 오렌지, Picogreen, TOTO 또는 BEBO, Deep Purple^TM 중 임의의 하나로부터 선택될 수 있지만, 다른 적당한 염료가 또한 사용될 수 있고 당업자에게 알려져 있기 때문에 염료의 선택은 중요하지 않다. 바람직하게 염료 화학양론은 1 대 1이지만, 더 높을 수도 있다.

제 3 양태에서, 하나 이상의 기준 올리고뉴클레오티드 및 형광 염료를 포함하는 제 1 또는 제 2 양태의 방법에서의 사용을 위한 키트가 제공된다. 바람직하게, 한 개의 기준 올리고뉴클레오티드만 키트에 존재한다. 한 개 초과의 올리고뉴클레오티드가 존재한다면, 각각은 동일하거나 상이한 길이를 가질 수 있다.

제 4 양태에서, 형광염료로 표지된 한 개 이상의 기준 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 1 또는 제 2 양태의 방법에서의 사용을 위한 키트가 제공된다.

제 5 양태에서, 형광염료로 표지된 한 개 이상의 기준 올리고뉴클레오티드의 연속 희석물을 포함하는 제 1 또는 제 2 양태의 방법에서의 사용을 위한 키트가 제공된다.

기준 올리고뉴클레오티드는 바람직하게 60bp초과의 길이를 가질 것이고, 통상적으로 약 60bp 내지 약 170bp의 범위에 있을 것이다. 가장 바람직하게는 기준 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산을 정량화하는데 사용될 수 있는 100bp의 길이를 가질 것이며, 통상적으로 길이는 약 60bp 내지 약 210bp의 범위에 있다. 기준 올리고뉴클레오티드의 길이의 상한은 중요하지 않으며, 실제 고려사항에 의해 좌우될 것이다.

기준 올리고뉴클레오티드의 GC 함량은 45% 이상인 것이 바람직하다. 통상적으로 기준 올리고뉴클레오티드의 GC 함량은 약 45% 내지 약 75%의 범위에서 선택될 수 있고, 가장 바람직하게 GC 함량은 50%이다. GC함량의 상한은 중요하지 않다.

기준 올리고뉴클레오티드는 공지된 기술을 사용하여 생물학적 공급원, 천연 공급원 또는 다른 공급원으로부터 얻을 수도 있고, 또는 합성에 의해 제조될 수 있다.

문맥에서 달리 명확하게 요구하지 않는다면, 상세한 설명 및 특허청구범위를 통해서, 단어 "포함하다", "포함하는" 등은 배타적이거나 또는 완전한 의미가 아니라 포괄적인 의미로 해석되어야 하며, 다시 말해서, "제한하는 것은 아니지만 포함하는"의 의미이다.

도 1: 15주기에 걸쳐 변하는 농도에서 기준 올리고뉴클레오티드 표준의 형광. 각각의 수평선은 하나의 농도를 나타낸다. 반응 혼합에서 효소의 결핍은 형광이 여러 번의 주기에 걸쳐 변하지 않는다는 것을 보장한다. 그래프는 반복된 변성 및 어닐링 주기를 통해 기준 올리고뉴클레오티드 염료 복합체의 안정성 및 재현성을 추가로 나타낸다.
도 2: 도 1에서 나타낸 형광 데이터로부터 산출한 표준 곡선.
도 3: 6가지 유전자에 대한 주기 곡선(괄호에 의해 정해짐). 3가지의 주어진 형광 수준 f1, f2, f3(예를 들어, 65, 60 및 55)을 얻기 위해 각각의 유전자에 대해 필요로 하는 주기를 이 데이터로부터 얻는다.
도 4: SHR 래트의 심장에서 5가지 관심 유전자의 발현. 각각의 관심 유전자의 발현을 기준 올리고뉴클레오티드(속 빈 막대), 기준 올리고뉴클레오티드 + 20개 염기쌍(빗금 막대) 및 기준 올리고뉴클레오티드 + 100개 염기쌍(속 찬 막대)을 사용하여 계산하였다. 기준 올리고뉴클레오티드 길이의 증가는 관심 유전자의 발현의 계산에 유의하게 영향을 미치지 않았다. 기준 올리고뉴클레오티드 대 기준 올리고뉴클레오티드 + 20개 및 100개 염기쌍에 대해, TNFα p=0.3946; TGFβ p=0.7151; Ang0 p=0.6158; CTGF p=0.4955 및 AT1a p=0.5589 (ANOVA).
도 5: 3개의 실험 군에서 고염식 중인 WKY 래트의 심장에서 5가지 관심 유전자의 발현 - 제로 타임 대조군(14 주령) 속 빈 막대, 4주 후 대조군 비히클 주입 (18 주령) 빗금 막대 및 4주 후 혈관활성성장관폴리펩티드(Vasoactive Intestinal Polypeptide, VIP)로 처리(18 주령) 속 찬 막대.
도 6: 3주에 걸쳐 산출한 표준 곡선. 기준 올리고뉴클레오티드 염료 반응 혼합물을 냉동시켰고, 각각의 실행을 위해 해동되는 실행과 재냉동 사이에 -20℃에서 저장하였다. 산출된 표준 곡선에서 볼 수 있는 바와 같이 시간에 따라 그리고 반복되는 냉동과 재해동에서 안정하다.
도 7a 내지 도 7f: 길이가 70개 내지 170개의 염기쌍의 범위에 있고, GC 함량이 50% 내지 74%로 변하는 5가지 기준 올리고뉴클레오티드를 사용하는 6가지 관심 유전자(앤지오텐시노겐, TGFβ, TNFα, CTGF, At1a 및 NONO)에 대한 정량화 결과. 이 예에서 나타내는 기준 올리고뉴클레오티드는 CTGF 70개 염기쌍, 50% GC 함량(CTGF 70/50), CTGF 73개 염기쌍, 74% GC 함량(CTGF73/74), β 액틴 90개 염기쌍, 50% GC 함량(액틴 90/50), CTGF 90개 염기쌍, 50% GC 함량(CTGF 90/50) 및 CTGF 170개 염기쌍, 52% GC 함량(CTGF 170/52).
도 8a 내지 도 8f: 길이가 50개 내지 144개의 염기쌍의 범위에 있고, GC 함량이 40% 내지 50%로 변하는 4가지 기준 올리고뉴클레오티드를 사용하는 6가지 관심 유전자(앤지오텐시노겐, TGFβ, TNFα, CTGF, At1a 및 NONO)에 대한 정량화 결과를 나타냄. 이들 예에서 나타내는 기준 올리고뉴클레오티드는 액틴 144/40(β 액틴 144 개 염기쌍, 40% GC 함량), CTGF 50/50(CTGF 50개 염기쌍, 50% GC 함량), 액틴 90/50(β액틴 90개 염기쌍, 50% GC 함량) 및 CTGF 90/50(CTGF 90개 염기쌍, 50% GC 함량). * p<0.005, ** p<0.0005 대 액틴 90/50; # p<0.01, ## p<0.005, ### p<0.001 및 #### p<0.0005 대 CTGF 90/50.
도 9a: SHR 에서 앤지오텐시노겐(AGT), TGFβ 및 CTGF 발현 상의 VIP 또는 에날라프릴을 이용한 처리의 효과, 제로 타임 대조군(속 빈 막대), 비히클 대조군(빗금 막대), VIP 주입(속 찬 막대) 및 에날라프릴 처리(교차 빗금 막대). VIP 또는 에날라프릴 대 비히클 대조군에 대해 * p<0.05, ** p<0.025, *** p<0.0005. VIP 또는 에날라프릴 대 제로 타임 대조군에 대해 # p<0.001, ## p<0.0005.
도 9b: SHR에서 NF Kappa B, TNF α 및 AT1a 수용체 발현 상의 VIP 또는 에날라프릴을 이용한 처리의 효과. VIP 또는 에날라프릴 대 비히클 대조군에 대해 * p<0.01, ** p<0.0005; VIP 또는 에날라프릴 대 제로 타임 대조군에 대해 # p<0.05, ## p<0.0005.
도 9c: SHR에서 메탈로프로테이나아제 상의 VIP 또는 에날라프릴 및 TIMP 발현을 이용한 처리의 효과. VIP 또는 에날라프릴 대 비히클 대조군에 대해 *p<0.025, ** p<0.0005; VIP 또는 에날라프릴 대 제로 타임 대조군에 대해 # p<0.01, ## p<0.001, ### p<0.0005. 값은 n=6인 래트에 대해 평균±표준오차.

정의

본원에서 사용되는 용어/어구 "유전자" 또는 "표적 핵산" 또는 "표적 유전자" 또는 "관심 유전자" 또는 "관심 표적 서열" 또는 "관심 표적" 또는 "관심 핵산"은 상호교환적으로 사용되었고, 동일한 개념을 말한다.

용어 "핵산"은 모노머 뉴클레오티드의 사슬로 구성되는 분자들을 말한다. 본원에서 사용되는 용어는 DNA, RNA 및 그것의 변이체 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다.

본원에서 사용되는 "유전자"는 전사 및/또는 번역 조절 서열 및/또는 암호 영역 및/또는 비번역 서열(예를 들어, 인트론, 5'- 및 3'-비번역 서열)을 포함하는 천연(예를 들어, 게놈) 또는 합성 유전자일 수 있다. 유전자의 암호 영역은 아미노산 서열 또는 tRNA, rRNA, 촉매 RNA, siRNA, miRNA 또는 안티센스RNA와 같은 기능성 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 용어 "유전자"는 또한 선택적으로 그것에 연결된 5'- 또는 3'-비번역 서열을 포함하는 암호 영역(예를 들어, 엑손)에 대응하는 cDNA를 포함할 수 있다. 유전자는 또한 암호 영역의 모두 또는 부분 및/또는 그것에 연결된 5'- 또는 3'-비번역 서열을 포함하여 시험관내에서 생성된 증폭된 핵산 분자일 수 있다.

핵산 서열의 "증폭"은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 편리하게 수행될 수도 있지만, 또한 리가아제 연쇄 반응과 같은 다른 적당한 방법에 의해 수행될 수도 있다. 본 명세서의 내용에서, 용어 "중합효소 연쇄 반응" 및 그것의 두문자어 "PCR"은 당업자에 의해 이해되는 그것의 보통의 의미에 따라서 사용된다. PCR 방법의 예는 통상적인 분자 생물학 교재 및 당업계에서 사용되는 참고 매뉴얼에서 찾을 수 있다. 예를 들어 문헌[PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (1989) Ed H A Erlich.　 Stockton Press, New York]을 참조한다. PCR 증폭을 최적화하기 위하여, 프라이머는 상이한 농도와 비율로 사용될 수 있다. 이것과 다른 변수의 선택은 당업자에 의해 인식되고 얻을 수 있다.

본 발명의 내용에서 "증폭절(amplicon)"은 PCR 또는 리가아제 연쇄 반응에 의해 수행되는 것과 같은 증폭 반응에 의해 형성되는 DNA 또는 핵산 생성물의 조각을 말한다. 한 문맥에서, 증폭절은 "표적 핵산" 또는 "관심 유전자" 또는 "관심 핵산" 등의 생성물일 수 있다.

"프라이머"는 "올리고뉴클레오티드"와 상호교환적으로 사용될 수 있고, 천연, 합성, 또는 그것의 변형일 수 있으며, 주형 분자 상의 특이적 뉴클레오티드 서열과 충분히 상보적인 뉴클레오티드 합성의 개시점으로서 작용할 수 있다.

본 발명의 내용에서 사용되는 "기준 올리고뉴클레오티드" 또는 "기준 핵산 서열" 또는 "보편적 기준 올리고뉴클레오티드"는 핵산, 바람직하게는 이중가닥 DNA이고, 표준 곡선의 제조에 유용한 임의의 적당한 크기의 핵산, 또는 관심 표적 핵산의 정량화에 적당한 다른 것을 포함한다. 따라서, 기준 올리고뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드일 수 있지만, 또한 더 짧은 서열일 수도 있다. 적당한 기준 올리고뉴클레오티드 특징은 본원에 기재된다.

기준 올리고뉴클레오티드는 완전히 합성일 수도 있고, 또는 기준 올리고뉴클레오티드로서 적당한 크기의 핵산을 얻기 위한 적당한 제한 효소를 사용하여 DNA의 천연 공급원으로부터 얻을 수도 있다.

적당히 많은 양을 얻기 위해서, 기준 올리고뉴클레오티드는 증폭 반응(예를 들어, PCR 또는 리가아제 연쇄 반응)을 사용하여 증폭될 수 있고, 또는 미생물에서 재조합적으로 발현되고 사용 전에 정제될 수도 있다. 기준 올리고뉴클레오티드의 크기가 허용한다면, 그것은 또한 합성 수단에 의해 다량으로 제조될 수 있다.

"하우스키핑 유전자"는 통상적으로 기본적 세포 기능의 유지에 필요한 구성 유전자이다. 이러한 유전자는 모든 세포에서 발견된다. 일부 하우스키핑 유전자는 상대적으로 일정한 수준으로 발현되지만, 다른 하우스키핑 유전자는 사용된 실험 조건에 따라서 발현이 다양할 수 있다.

"표준 곡선"은 정량적 조사 도구이고, DNA 및 단백질과 같은 물질의 절대 농도를 결정하기 위해 사용되는 분석 데이터를 플롯팅하는 방법이다.

본 발명의 내용에서 사용되는 "정량화"는 본 경우에 "관심 표적 유전자"인 물질의 절대적 양을 검출하는 것을 의미한다.

"연속 희석"은 "표적 핵산"의 양으로부터 정량화될 수 있는 물질(예를 들어, 핵산)의 농도 범위를 다루는 표준 곡선을 만드는데 필요한 임의의 희석 형태를 말한다.

본 발명의 내용에서 "dsDNA"는 이중가닥 DNA를 말하며, "bp"는 염기쌍을 말하고, "dNTP's"는 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 말하며, "RNA"는 리보핵산을 말하고, "tRNA"는 운반 RNA를 말하며, "rRNA"는 리보솜 RNA를 말하고, "siRNA"는 소간섭 RNA를 말하며, "miRNA"는 마이크로 RNA를 말하고, "mRNA"는 전령 RNA를 말하며, "cDNA"는 상보적 DNA를 말한다.

프라이머와 같은 핵산 서열의 "GC 함량"은 그것의 융점(Tm)을 포함하는 프라이머의 다양한 특성에 영향을 미친다.

본 발명의 바람직한 구체예

본 발명은 대조군 및 처리군 동물/인간 그룹에서 핵산 발현을 정량화하기 위한 정확하고 효율적인 수단의 결여에 의해 동기부여를 받았다. 또한 유전자 발현 연구에서 사용되는 알려진 하우스키핑 유전자의 대부분은 실험 조건 또는 처리에 응하여 바뀌고, 따라서 결과를 왜곡한다는 사실에 의해 동기부여를 받았다.

본 발명의 이점은 기재된 방법이 데이터를 표준화하고, 유전자 발현을 정량화하기 위해 사용되는 하우스키핑 유전자 또는 합성 기준 유전자에 대한 필요를 해결한다는 것이다. 본 발명의 다른 이점은 보통 PCR에 의하지만 다른 방법이 사용될 수 있는 표적 핵산의 증폭이 보통 30주기 정도보다는 감소된 주기수(예를 들어, 15주기)에 걸쳐 수행되고, 유전자 발현 연구에 대해 사용되어, 따라서 정량화 분석에서의 사용을 위한 충분한 양의 표적 핵산을 제공하는 반면, 분석 시간과 비용을 상당히 감소시킬 수 있다는 것이다.

본원에 기재된 신규 접근법에서, 유리하게는 관심 표적 핵산과 관련되지 않을 수 있지만, 또한 관심 유전자와 유사하거나 동일할 수 있는 사전결정된 길이의 기준 올리고뉴클레오티드와 조합되는 염료가 표준 곡선을 산출하기 위해 사용된다. 표준 곡선은 본 발명에 따르는 형광으로 표지된 기준 올리고뉴클레오티드를 연속해서 희석하고, 형광 염료의 강도 대 표지된 기준 올리고뉴클레오티드의 농도를 플롯팅하는 것에 의해 산출된다. 기준 올리고뉴클레오티드의 증폭은 표준 곡선을 만드는데 필요하지 않다. 이것은 유전자 발현을 평가하기 위한 현재 방법과 대조되며, 이에 의해 시험 샘플과 하우스키핑 유전자/합성 기준 유전자는 둘 다 단계적으로 또는 하나의 반응 혼합물에서 조합되어 증폭된다.

하나 초과의 관심 표적 핵산을 정량화하기 위해 필요하다면, 일단 만들어진 동일한 표준 곡선이 여러 번 사용될 수 있다. 표준 곡선의 제조를 위해 사용한 희석된 기준 올리고뉴클레오티드 용액은 시간에 걸쳐, 예를 들어 약 1개월의 기간에 걸쳐 안정하고, 용액의 냉동과 해동이 반복된다. 이것은 임의의 실험적 필요조건에 앞서 기준 올리고뉴클레오티드 용액의 제조 및 저장을 가능하게 한다.

기준 올리고뉴클레오티드는 완전히 합성 서열, 증폭된 서열(예를 들어, PCR 생성물), 또는 천연 공급원으로부터 분리된 더 큰 핵산의 적당한 크기 제한 단편일 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용된 기준 올리고뉴클레오티드는 "하우스키핑 유전자" 또는 "합성 기준 유전자"로서 기재된 것이 아니며, 즉 관심 유전자와 함께 증폭될 필요가 없다.

상이한 길이의 표적 핵산을 정량화하기 위한 표준 곡선을 만들기 위해 상이한 길이의 기준 올리고뉴클레오티드를 설계하는 것이 바람직할 수 있지만, 본 발명의 방법에서 중요하지 않다. 그러나, 본 발명의 특정 이점은 특정의 고정된 길이의 한 개의 기준 올리고뉴클레오티드가 상이한 핵산 서열을 가질 뿐만 아니라, 기준 올리고뉴클레오티드보다 더 긴 또는 더 짧은 표적 핵산을 정량화하기 위한 표준 곡선에서 사용될 수 있다는 것이다.

기준 올리고뉴클레오티드는 바람직하게 60bp 초과의 길이를 가질 것이고, 통상적으로 약 60bp 내지 약 170bp(즉, 약 60bp, 70bp, 80bp, 90bp, 100bp, 110bp, 120bp, 130bp, 140bp, 150bp, 160bp 또는 약 170bp)의 범위에 있을 것이며, 길이가 약 80bp 내지 약 210bp의 범위에서, 더 통상적으로는 길이가 약 80bp 내지 약 150bp의 범위에서 표적 핵산을 정량화하기 위해 사용될 수 있다. 더 나아가, 상기 언급한 범위의 길이를 가지는 임의의 기준 올리고뉴클레오티드는 상기 언급한 범위 길이의 임의의 하나 이상의 표적 핵산 생성물을 정량화하기 위해 사용될 수 있다. 본 방법을 사용하는 것에 의해 관심 핵산(또는 관심 다수 핵산)으로서 선택되기 때문에, 표적 서열의 길이는 본 발명의 방법에서 중요하지 않은 것으로 이해될 것이다.

기준 올리고뉴클레오티드 길이의 상한은 중요하지 않으며, 실제 고려사항에 의해 좌우될 것이다. 따라서 원한다면, 표적 핵산의 정량화에 나쁜 영향을 미치지 않고 본 발명의 방법에서 170bp 초과의 기준 올리고뉴클레오티드가 사용될 수 있다 (예를 들어, 약 170bp~180bp, 180bp~200bp, 200bp~220bp, 220bp~240bp, 240bp~260bp, 260bp~280bp, 280bp~300bp, 300bp~320bp, 320bp~340bp, 340bp~360bp, 360bp~380bp, 380bp~400bp 등의 길이).

기준 올리고뉴클레오티드의 GC함량은 45% 또는 그 이상인 것이 바람직하다. GC 함량의 상한은 중요하지 않다. 따라서 GC 함량이 75%인 기준 올리고뉴클레오티드는 GC 함량이 더 낮은 기준 올리고뉴클레오티드와 유사한 결과를 낸다. 통상적으로, 기준 올리고뉴클레오티드의 GC 함량은 약 45% 내지 약 75%의 범위(예를 들어, 약 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 약 75%)에서 선택될 수 있다.

기준 올리고뉴클레오티드 서열은 표적 핵산 또는 임의의 하우스키핑 유전자 서열과 어떤 상동성을 가질 필요는 없다. 그러나, 기준 올리고뉴클레오티드가 본 발명의 방법에서 사용되는 특정 방법 때문에(즉, 기준 올리고뉴클레오티드의 연속 희석 후 표준 곡선을 설정하는 것), 기준 올리고뉴클레오티드 서열은 표적 핵산 서열 또는 하우스키핑 유전자, 또는 그것의 더 작은 부분과 어느 정도의 상동성 또는 심지어 동일성을 가질 수 있다. 본 발명의 이점은 상기 방법이 동일한 기준 올리고뉴클레오티드를 사용하여 상이한 표적 핵산을 정량화할 수 있다는 것이다. 실제는 기준 올리고뉴클레오티드는 특정의 고정된 길이 및 GC 함량, 통상적으로 100bp 및 50% GC 함량의 올리고뉴클레오티드를 가지는 보편적인 것일 수 있다. 통상적으로 측정될 전체 범위의 유전자(핵산) 크기를 정량화할 수 있도록 상기 기재된 범위에서 적어도 3개의 상이한 기준 올리고뉴클레오티드가 키트에 포함되어 있는 것으로 예상된다.

기준 올리고뉴클레오티드가 적당한 크기의 단편을 얻기 위해 제한 효소를 사용하여 생물학적 공급원, 천연 공급원 또는 다른 공급원으로부터 얻어진다면, GC 함량은 당업자에게 잘 알려진 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 결정될 수 있으며, 적당한 크기의 단편을 선택하고 결정하기 위해 단순하지 않은 분석 과정을 필요로 하지 않는다(Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y). 합성 기준 올리고뉴클레오티드가 또한 편리하게 사용될 수 있고, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 및 Roe et al. DNA Isolation and Sequencing" (Essential Techniques Series) (1996) John Wiley & Sons, Inc., N.Y.]에 기재된 것과 같은 알려진 기법에 의해 간단히 제조될 수 있다. 합성 기준 올리고뉴클레오티드의 원하는 길이 및 GC 함량은 합성 동안 용이하게 선택될 수 있다.

본 발명의 방법은 형광 프로브(염료) 뿐만 아니라 인터칼레이팅 (intercalating) 염료와의 사용에 적당하다. 인터칼레이팅 염료에 대해, 기준 올리고뉴클레오티드의 길이가 60bp 이상이라면, 기준 올리고뉴클레오티드의 길이는 기준 올리고뉴클레오티드의 주어진 농도에 대한 형광 강도에 영향을 미치지 않는다. 형광 강도에 영향을 주는 기준 올리고뉴클레오티드 길이의 상한은 없는 것으로 나타난다. 그 결과, 하나의 기준 올리고뉴클레오티드는 상이한 길이, GC 함량 및/또는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있는 임의의 수의 관심 핵산 표적 서열에 대해 참고 표준으로서의 사용에 적당하다. 형광 프로브에 대해, 동일한 형광단이 사용된다면, 동일한 기준 올리고뉴클레오티드는 연속적으로 연구된 수많은 핵산 표적에 대해 사용될 수 있다. 대안적으로 다수의 표준 곡선은 하나의 기준 올리고뉴클레오티드를 사용하여 산출될 수 있지만, 다른 형광단은 다중 rt-PCR 생성물에 대해 정량적인 프레임워크를 제공한다.

따라서, 본 발명의 방법은 각각의 실험에서 하우스키핑 유전자를 증폭시키고 하우스키핑 유전자 또는 합성 기준 유전자에 대한 분석을 일정하게 실행하여 핵산 발현 데이터를 표준화하기 위한 필요를 해결하기 때문에 유리하다. 하나의 표준 곡선은 크기 및 서열이 다양할 수 있는 하나 초과의 관심 표적 핵산을 정량화하기 위한 시간의 기간에 걸쳐 제조되고 사용될 수 있으며, 이에 의하여 전통적인 유전자 발현 분석법과 비교할 때 비용 및 시간이 절감된다.

본 발명의 방법은, 관심 표적 핵산을 증폭하고, 특정 시간 기간에 증폭 반응의 샘플을 취하거나 또는 시간에 따른(실시간) 형광의 증가를 모니터링하고, 이로부터 얻은 정보를 저장된 표준 곡선 정보와 관련시키기 전에, 컴퓨터 기반 시스템에 기준 올리고뉴클레오티드 표준 곡선 정보를 저장함으로써 실시간으로 표적 핵산 증폭 및 정량화를 모니터링할 뿐만 아니라 자동화에 적합하도록 한다. 이러한 방식으로 상기 방법을 작동시킬 때, 표준 곡선은 정기적으로, 예를 들어 주1회 또는 월1회로 산출될 수 있고, 이 정보는 새로운 표준 곡선을 제공할 필요 없이 시간의 기간에 걸쳐 관심 표적 핵산을 정량화하기 위해 저장되고 사용될 수 있다.

본 발명의 방법 및 키트는 한 개의 기준 올리고뉴클레오티드를 사용하여 관심 유전자(핵산들)을 정량화하는데에 유리하게 사용될 수 있으며, 여기서 상기 관심 유전자는 분석 및 연구소에서 통상적으로 접하고 길이가 보통 80bp 내지 150bp의 범위에 있고 GC 함량이 30% 내지 60%인 유전자(핵산) 생성물을 가진다. 더 구체적으로, 본 발명의 방법 및 키트는 바람직하게 길이가 100bp이고 GC 함량이 50%인 한 개의 기준 올리고뉴클레오티드를 사용하여 길이가 60bp를 초과하고 GC 함량이 35%를 초과하는 핵산 생성물을 정량화하는 것에 유용하다. 따라서 상기 키트의 바람직한 형태는 이러한 기준 올리고뉴클레오티드 또는 그것의 연속 희석물 및 관심 핵산에 대한 반응에서 사용되는 염료 또는 다른 적당한 검출가능한 표지로 구성된다. 대안적으로, 상기 키트는 염료 또는 다른 적당한 마커로 표지된 기준 올리고뉴클레오티드, 또는 이러한 표지된 기준 올리고뉴클레오티드의 연속 희석물, 및 관심 핵산을 표지하기 위해 사용되는 염료 또는 마커를 포함한다.

본 발명의 방법에서 사용되는 표준 곡선을 만들기 위한 일반적 가이드로서, 기준 올리고뉴클레오티드는 관심 유전자에 대해 사용되는 바와 같이 동일한 반응 버퍼를 사용하여 2회 연속 희석되어, 예를 들어 반응 튜브 당 기준 올리고뉴클레오티드의 약 0.01pmol 내지 약 10pmol의 범위로(더 좁거나 또는 더 넓은 범위일 수 있다) 최종량을 제공하여서, 본원에 기재된 표준(기준) 곡선의 구성을 가능하게 한다. 기준 뉴클레오티드의 농도 범위는 필요조건에 따라서 간단한 시도 및 오차에 의해 결정된다. 이어서 (관심 유전자에 대해 사용되는 것과 동일하고 관심 반응의 유전자에 대해 사용되는 것과 동일한 양으로) 형광염료와 같은 검출가능한 마커가 각각의 반응 튜브에 첨가된다. 통상적으로, 반응 튜브는 실시간 rt-PCR 기계에서 15주기를 겪고(원한다면 더 많은 주기일 수 있다), 주기 조건은 관심 유전자에 대해 사용되는 것을 반영한다. 따라서, 관심 유전자에 대한 초기 변성 조건이, 예를 들어 94℃에서 2분이라면, (표준 곡선을 구성하기 위해 사용되는) 기준 올리고뉴클레오티드의 연속 희석물을 함유하는 튜브는 94℃에서 2분 동안 초기 변성을 겪는다. 다음 15주기는 관심 유전자의 것과 유사하여, 관심 유전자 주기 조건이, 예를 들어 95℃에서 30초 동안 변성된 다음 60℃에서 30초 동안 어닐링된다면, 기준 올리고뉴클레오티드의 연속 희석물을 함유하는 튜브는 또한 95℃에서 30초 동안(변성) 및 60℃에서 30초 동안(어닐링) 순환된다. 형광 염료가 표지 또는 마커로서 사용된다면, 형광은 도 1 및 도 2에서 입증되는 바와 같은 각각의 어닐링 단계 동안 획득될 수 있다. 그 다음 형광 대 핵산(예를 들어 DNA)의 양의 표준(기준) 곡선은 본원에 기재된 바와 같이 구성된다.

본 발명이 한 예로서 기재되었지만, 본 발명의 범주로부터 벗어나지 않고 변형 및 변경이 이루어질 수 있다는 것을 인식하여야 한다. 더 나아가, 알려진 동등물이 구체적 특징으로 존재하는 경우, 이러한 동등물은 본 명세서에서 구체적으로 언급되는 것과 같이 포함된다.

실시예

실시예 1

계산

복제 효율이 100%이고 각각의 주기에서 유전자의 각각의 복제가 반복된다면, 사전결정된 횟수의 주기(c) 후 rt-PCR에서, 존재하는(R) 관심 유전자 양은 재현할 수 있는 방식으로 PCR 증폭(n)의 개시 시 존재하는 유전자의 양과 관련된다.

R = n x 2^c

n = 시간 0에서 존재하는 복제물

c= 사전결정된 형광에서 주기의 수

R= c 주기 후 존재하는 복제물

효율이 100% 미만일 때, 모든 유전자의 복제가 각각의 주기에서 반복되지는 않으며, 상기 식은 복제 효율에서 이러한 감소를 고려하여 변형되는데, 그러면

R = n x e^c

e = 복제 효율

c= 사전결정된 형광에서 주기의 수

R= c 주기 후 존재하는 복제물

실시예 2

기준 올리고뉴클레오티드의 제조

인용된 실시예가 결합조직 성장인자(CTGF)에 대해 RNA를 사용하여 기준 올리고뉴클레오티드를 만들지만, 표준으로서 사용을 위한 기준 올리고뉴클레오티드는 임의의 유전자에 대한 RNA 또는 DNA를 암호화 또는 비암호화하는 것으로부터 만들어질 수 있다는 것이 인식되어야 한다.

길이가 70개, 90개 및 170개인 염기쌍의 기준 올리고뉴클레오티드를 다음과 같이 본태성 고혈압 래트(SHR)의 심장 조직으로부터 CTGF 유전자의 절편의 증폭에 의해 제조하였다:

1) RNA 추출

페놀 및 구아니딘 이소티오시아네이트에 의해(Chomczynski 및 Sacchi 1987) 변형이 있는 전체 RNA 추출을 위해 SHR 동물로부터 조직을 수집하였다. 액체 질소 냉동된 SHR 심장을 Mixer Mill MM300(Retsch GmbH, Germany)에 의해 균질화하였다. 각각 100mg의 극저온의 샘플들을 Tungsten Carbide Beads 3mm(Qiagen)가 있는 1.5mL Safe-Lock 마이크로 테스트 튜브(Eppendorf Biopur, Hamburg, Germany) 중의 1mL Trizol Reagent(Invitrogen)에 첨가하였고, 30Hz의 주파수로 분쇄하였다. 그 다음에 RNA 추출은 제조업자의 권고(Invitrogen)를 따랐다. RNA를 위해 샘플을 파열시킨 후, 상분리를 진행시켜서 200mL의 클로로포름(Lab-Scan Analytical Sciences, Lomb Scientific, Taren Point, NSW, Australia)을 첨가하였고, 샘플을 손으로 15초 동안 격렬하게 진탕한 다음, 실온(23℃~30℃)에서 5분 동안 인큐베이팅한 후, Sigma 1-15PK 원심분리기(John Morris Scientific, Chatswood, NSW, Australia)를 사용하여 20분 동안 4℃에서 12,000rpm(13,201g)으로 원심분리하였다 (브레이크 꺼짐). 300mL의 상부 수층을 새 것인 1.5mL 에펜도르프 튜브에 수집하였고, 500 mL의 사전냉각한 프로판-2-올(이소프로판올)(Lab-Scan Analytical Sciences, Lomb Scientific, Taren Point, NSW, Australia)을 첨가하였으며, 샘플을 손으로 몇 번 뒤집어서 혼합하였다. 혼합물을 10분 동안 실온에서 인큐베이팅하여 RNA를 침전시켰다. 20분 동안 4℃에서 12,000rpm으로 원심분리에 의해 펠렛을 형성하였다(John Morris Scientific, Chatswood, NSW, Australia). 상청액을 버린 다음, 펠렛을 디에틸 피로카르보네이트(DEPC)(Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia) 중에서 희석한 1mL의 75% (v/v) 절대 분자 등급 에탄올(Lab-Scan Analytical Sciences, Lomb Scientific, Taren Point, NSW, Australia)로 세척하였고, 10분 동안 4℃에서 10,000rpm으로 교반하였다(John Morris Scientific, Chatswood, NSW, Australia). 펠렛을 수집하였고, 퓸 후드에서 몇 분동안 공기 건조시킨 다음, DEPC 처리된 Milli-Q 수 중에 용해시키고, -80℃에서 저장하였다. 전체 RNA 농도를 260nm (A₂₆₀)에서 Nanodrop 1000 (Nd-1000, Thermo Scientific)을 사용하여 분광광도계 흡광도에 의해 결정하였고, A₂₆₀:A₂₈₀의 할당량이 약 2.0이라면 RNA의 순도는 만족스러운 것으로 간주하였다.

2) 디옥시리보뉴클레아제1 ( DNase -1) 처리

RNA 샘플을 DNase-1(Invitrogen)로 처리한 후 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)으로 이중 및 단일 가닥 DNA를 제거하였다. 0.5mL DNase 및 RNase가 없는 에펜도르프 튜브에서, DEPC 처리한 물과 함께 전체 10μL의 부피로 최대 1μL의 RNA를 1유닛/μL DNase-1 및 1μL 의10X DNase-1 반응 버퍼를 이용하여 분해하였다. 샘플을 15분 동안 실온에서 인큐베이션한 후 용액 혼합물 중에서 1μL의 25mM EDTA를 이용하여 칼슘 및 마그네슘 이온을 킬레이트화하고, 65℃에서 10분 동안 가열함으로써 DNase-1를 불활성화하였다. 샘플을 얼음 위에서 냉각시켰고 -80℃에서 저장하였다. 혼합물의 모든 구성요소는 DNase-1 키트(Invitrogen)에서 공급하였다.

3) RNA 품질 및 농도의 평가

DNase-1 처리한 RNA 샘플을 리보솜 RNA(rRNA) 18S 및 28S 서브유닛의 순도, 크기 및 농도에 대해 MCE-202 MultiNA 마이크로칩 자동화된 전기영동 기기 (Shimadzu Biotech, Rydalmere, NSW, Australia) 상에서 분석하였다. 모든 단계를 부수적인 변형과 함께 제조업자의 권고에 따라서 수행하였다. 간단히, 3μL의 각각의 샘플을 96웰 플레이트에서 동일한 부피의 내부 RNA 마커(Shimadzu Biotech, Rydalmere, NSW, Australia)와 혼합하였고, 접착성 PCR 알루미늄 호일(Thermo Scientific, Integrated Sciences, NSW, Australia)로 밀봉하였다. 알려진 농도 및 크기의 내부 표준 마커(하부 및 상부의 분자 크기 마커)와 마찬가지로 RNA는 RNA 샘플의 자동적 크기 예측 및 정량화에 대한 정확한 전기영동 결과를 자동으로 수정한다. RNA-6000 래더(Applied Biosystems, Victoria, Australia)를 DEPC 처리한 물을 이용하여 1:5(v/v)의 비율로 희석하였고, 이어서 용액 혼합물을 RNA 마커 용액과 1:1(v/v)로 혼합하였다. 샘플과 래더 둘 다의 혼합물을 65℃에서 5분 동안 열변성시켰고, 즉시 5분 동안 얼음 위에서 냉각시켰다. 이들 크기 범위 분리를 10,000X 형광 인터칼레이팅 염료 SYBR Green II(Invitrogen)를 함유하는 RNA 분리 버퍼 (Shimadzu Biotech, Rydalmere, NSW, Australia) 중의 MultiNA 마이크로칩(Shimadzu Biotech, Rydalmere, NSW, Australia)에서 수행하였고, TE(10mM Tris-HCl, 1mM 디소듐 EDTA, pH8.0)(Sigma-Aldrich), 및 20%(v/v) 포름아미드 (Invitrogen)를 이용하여 1:99로 희석하였다.

4) 역전사

첫번째 가닥 상보적 DNA(cDNA)를 제조업자의 설명서에 따라서 SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix 키트(Invitrogen)의 Moloney-Murine Leukaemia Virus Reverse Transcriptase(M-MLV RT)를 사용하여 단일 가닥 RNA 주형으로부터 합성하였다. 모든 반응을 0.2mL 얇은 벽의 에펜도르프 튜브에서 수행하였고, 모든 인큐베이션 단계를 Rotor-Gene 6000(Corbett Research, Sydney, Australia; Qiagen)에서 수행하였다. 최대 5μg의 전체 RNA를 DEPC 처리된 물과 함께 전체 8μL의 부피로 1μL의 50μM 올리고(dT)₂₀ 및 1μL의 어닐링 버퍼를 이용하여 65℃에서 5분 동안 열변성시켰다. 샘플을 적어도 1분 동안 얼음 위에서 해동시킨 후 10μL의 2X 첫번째 가닥 반응 혼합물 및 2μL SuperScript III/RNaseOUT 효소 혼합물에 첨가하였다. 샘플을 간단히 교반하여 혼합한 다음, 펄스 스피닝에 의해 수집하고, 이어서 cDNA 합성을 위해 50℃에서 50분 동안 인큐베이션하였다. 반응을 종결시키기 위해 RT 효소를 85℃에서 5분 동안 변성시켰으며, 샘플을 즉시 얼음 위에서 냉각시키고, -20℃에서 저장하였다. DNA 오염이 없다는 것을 증명하기 위해 RT 효소 또는 RNA가 없는 음성 대조군 샘플을 포함시켰다.

5) 프라이머

결합조직 성장인자(CTGF)에 대한 래트 mRNA에 대해 NCBI GenBank에 의해 공개된 서열(수탁 번호 AB023068)을 기반으로 70bp, 90bp 및 170bp 길이의 PCR 생성물을 만드는 프라이머 쌍을 설계하였다. 탈염 동결건조 생성물로서 합성을 위해 (Invitrogen) 프라이머 서열(프라이머 서열 그 자체는 길이가 21개 내지 24개의 염기이다)을 제외시켰다. 프라이머를 TE(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA) (Invitrogen)로 50μM의 농도에서 복원하였고 -20℃에서 저장하였다.

래트 CTGF에 대한 프라이머 서열
센스 서열(5' -3')	안티센스 서열(5' -3' )	mRNA 범위	생성물 크기 (bp)
AAAGATGGTGCACCCTGTGTCTTC	TGCAACTGCTTTGGAAGGACTC	499-568	70
AAAGATGGTGCACCCTGTGTCTT	CAGGCAAGTGCACTGGTATTTG	499-588	90
AATGCTGTGAGGAGTGGGTGT	CATCCCACAGGTCTTAGAACAGG	683-852	170

6) PCR

각각의 프라이머가 정량의 EvaGreen과 결합하는 상이한 농도의 dsDNA를 결정하도록 설정하여 SHR 심장에서 PCR을 수행하였다. 이 PCR에 사용되는 모든 시약은 Invitrogen으로부터 구입하였으며, 키트 또는 개별 물품으로 공급되었다. 1마이크로리터의 cDNA를 5μL의 10X PCR 버퍼, 1μL의 10mM dNTP 혼합물, 1.5μL의 50mM MgCl₂, 2μL의 각각의 프라이머쌍 혼합체(각각 10μM), 0.2μL Platinum Taq DNA 폴리머라아제 및 39.3μL DEPC 처리된 물을 함유하는 전체 50μL의 반응 혼합체 중에서 증폭시켰다. PCR을 Rotor-Gene 6000(Corbett Research, Sydney, Australia; Qiagen)에 의해 수행하였다. 증폭을 위한 조건은 처음에 94℃에서 2 분 동안 변성; 95℃에서 10초 동안 변성을 30주기 내지 35 주기; 60℃에서 20초 동안 어닐링 및 72℃에서 20초 동안 합성하는 것이었다. cDNA가 없는 음성 대조군을 모든 실행에 포함하였다.

7) PCR 생성물의 농도

최대 4μL의 풀(pool) PCR 생성물을 30K Amicon Ultra-4 필터 유닛 (Millipore, North Ryde, NSW, Australia), DNA를 농축하기 위한 셀룰로오스 막에 첨가하였고, 22℃에서, 5000rpm(4025g)으로 10분 동안 Sigma 2-16PK 스윙 버켓 (swinging bucket) 로터(John Morris Scientific, Chatswood, NSW, Australia) 상에서 회전시켰다. 농축된 용질을 필터 유닛의 바닥에서 수집하였고, 후속의 PCR을 위해 -20℃에서 저장하였다.

8) DNA 크기 배치 및 정량화

농축된 PCR 생성물을 밴드 크기 배치 및 농축을 위해MCE-202 MultiNA 마이크로칩 자동화된 전기영동 기기(Shimadzu Biotech, Rydalmere, NSW, Australia) 상에서 분석하였다. 모든 단계는 부수적인 변형과 함께 제조업자의 설명서에 따랐다. 간단하게, 농축된 PCR 생성물(DEPC 처리된 물 중에서 희석)의 1/10 희석물(v/v) 6μL를 96웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였고, 접착성 PCR 알루미늄 호일(Thermo Scientific, Integrated Sciences, NSW, Australia)로 밀봉하였다. 이어서 TE(10mM Tris-HCl, 1mM 디소듐 EDTA, pH 8.0)(Sigma-Aldrich) 중의 1/100 희석으로 희석된 10,000X SYBR Gold(Invitrogen)로 이루어지는 DNA-500 분리 버퍼(Shimadzu Biotech, Rydalmere, NSW, Australia)를 사용하여 마이크로칩(Shimadzu Biotech, Rydalmere, NSW, Australia)을 통해 DNA 샘플을 분리하였다. DNA 밴드 크기 및 농도를 25bp DNA 래더(Invitrogen)와 함께 분석하였고, 각각 TE(10mM Tris-HCl, 1mM 디소듐 EDTA, pH 8.0)(Sigma-Aldrich), 및 DNA-500 내부 마커(Shimadzu Biotech, Rydalmere, NSW, Australia) 중에서 1:49로 희석하였다.

참고문헌:

Chomczynski, P., 및 Sacchi, N. (1987) Anal. Biochem . 162, 156.

실시예 3

i) 표준 곡선 제조

7마이크로리터의 농축된 DNA 샘플(즉, 70bp, 90bp 또는 170bp 생성물)을 50μL TE(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)(Invitrogen)의 반응 부피를 함유하는 0.2mL PCR 튜브에서 아무것도 없는 것 내지 1/32 희석의 범위에 있는 1:1(v/v)의 TE(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)(Invitrogen) 및 1.25μM의 EvaGreen 염료 (Biotium Inc, Hayward, CA; Jomar Biosciences, SA, Australia) 중에서 2회 연속 희석하였다. 적정을 Rotor-Gene 6000(Corbett Research, Sydney, Australia; Qiagen)에서 수행하였다. 주기에 대한 조건은 처음에 94℃에서 2분 동안 변성; 95℃에서 30초 동안 변성을 15주기이었으며, 모든 어닐링 단계 동안 60℃에서 30초 동안 형광 신호를 획득하였다. 두 음성 대조군을 Evagreen 염료 없이 가장 높은 농도에서 각각의 표준 곡선 실행-비주형 대조군 및 올리고뉴클레오티드에 포함하였다. DNA 혼합물은 후속하는 형광 반복 측정을 위해 -20℃에서 저장하였다.

기준 올리고뉴클레오티드의 각각의 농도에 대한 형광을 얻었다(도 1 참조). 그 다음에 데이터를 형광(Y축) 대 피코몰로 존재하는 기준 올리고뉴클레오티드(X축)로서 플롯팅하였으며(도 2 참조), 최적의 곡선을 최소 제곱 선형 회귀에 의해 산출하였고, 표준곡선 식을 산출하였다.

ii) 계산

표준 곡선식으로부터, 형광 f1, f2, f3(즉, 3개의 역치를 선택)의 3가지 수준에 대한 피코몰 당량을 계산한다. 도 3을 참조한다.

시험/표적 샘플의 RT-PCR로부터 다음을 얻는다:

- 관심 유전자에 대한 효율(e)

- 형광(f1, f2, f3)의 3가지 수준의 각각에 대한 주기(c₁, c₂, c₃)

- 표준 곡선식을 사용하여 f1, f2, f3에 대응하는 샘플[DNA(pmol)i]에 존재하는 관심 유전자의 p몰을 산출.

다음으로부터 n(반응의 시작시 존재하는 관심 유전자의 p몰)을 계산한다.

- DNA(pmol)i = ni x e^ci

- 즉, ni = DNAi / e^ci

샘플에 존재하는 관심 유전자의 몰을 얻기 위한 평균 n_i

각각의 반응에 존재하는 전체 RNA에 대하여 보정하고, pmole/100ng 전체 RNA로서 n_i를 표현한다. 아보가드로수의 곱은 복제물/100ng RNA로서 대안적으로 표현되도록 한다(도 4 참조).

실시예 4

따라서, 도 1은 2회 수행한 기준 올리고뉴클레오티드의 각각의 농도에 대한 형광을 나타낸다. 도 2에서 형광(y축) 대 pmol(x 축)로 표현한 존재하는 기준 올리고뉴클레오티드로서 플롯팅한 데이터는 최소 제곱 회귀에 의해 이 관계를 정의하는 식을 계산하도록 한다. 표준 곡선식으로 f1, f2, f3의 치환은(각각의 관심 유전자의 형광 대 주기 수에 대한 플롯으로부터 얻음. 도 3 참조) 주기 c1, c2, c3에서 존재하는 관심 유전자의(DNA_i) 계산된 pmole을 가져온다. 0시간에 존재하는 관심 유전자의 pmole은 이어서 상기와 같이 계산될 수 있고 전체 RNA에 대해 보정되며 아보가드로수를 곱한 후 복제물로서 표현된다.

n의 계산을 위한 표준으로서 상이한 길이의 기준 올리고뉴클레오티드의 비교 길이가 20개 및 100개 염기쌍으로 상이한 3개의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 i) 표준 곡선 제조 방법 하에서 기재한 3개의 표준 곡선을 산출하기 위해 사용하였다. 이어서 5개의 관심 유전자를 ii) 계산 하에서 차례로 기재한 각각의 표준 곡선을 사용하여 독립적으로 정량화하였다. 3개의 곡선에 의해 각각의 유전자에 대해 얻은 결과를 ANOVA에 의해 비교하였고, 0.05 수준으로 유의차를 설정하였다(도 4 참조). 관심 유전자의 발현은 3개 그룹 간에 유의하게 다르지 않았다. 따라서 최대 100개의 염기쌍으로 기준 올리고뉴클레오티드의 길이 변형은 관심 유전자의 계산에 영향을 미치지 않는다.

실험적 상황에 대한 적용(도 5 참조).

5개의 관심 유전자를 상기 기재한 방법을 사용하여 3개의 실험군 - 제로 타임 대조군(속 빈 막대), 비히클 대조군(빗금 막대) 및 VIP로 처리 후(속 찬 막대)의 WKY 래트의 심장에서 측정하였다.

표준 곡선의 안정성 및 재현가능성

다양한 농도의 기준 올리고뉴클레오티드 및 EvaGreen 염료를 함유하는 튜브를 3주의 기간에 걸쳐 냉동 해동을 반복한 후 그것의 형광을 측정하였다. 형광의 수준은 각각의 농도에 대해 안정하였다. 따라서 한 표준은 다수의 rt-PCR실행에 대한 정량화 표준으로서 사용될 수 있으며, 단 동일한 배치(batch)의 염료가 이용되고 염료 농도는 실행들 사이에서 변하지 않았다(도 6 참조).

실시예 5

길이가 50개 내지 170개의 염기쌍으로, GC 함량이 40% 내지 75%로 변화하는 기준 올리고뉴클레오티드를 다양한 섹션의 CTGF, α 액틴 및 β 액틴으로부터 만들었다. 기준 올리고뉴클레오티드를 실시예 2 하에서 기재한 바와 같이 제조하였고, 표준 곡선을 실시예 3 하에서 기재한 바와 같이 제조하였다. 기준 올리고뉴클레오티드(50bp 내지 170bp)를 만드는 프라이머를 CTGF에 대한 래트 mRNA (수탁 번호 AB023068) 및 α 액틴 및 β 액틴에 대한 래트 mRNA (각각 수탁번호 NM_019183 및 BC063166)에 대해 NCBI Genbank에 의해 공개된 서열을 기반으로 설계하였다, 표 2 참조.

6개의 관심 유전자(AT1a, 앤지오텐신, TGFβ, TNFa, NONO 및 CTGF)를 ii) 계산 하에서 차례로 기재한 바와 같은 각각의 표준 곡선을 사용하여 독립적으로 정량화하였다. 3개 곡선에 의해 각각의 유전자에 대해 얻은 결과를 ANOVA에 의해 비교하였다.

PCR에 대해 사용한 프라이머 서열 및 표준 곡선의 구성
프라이머	서열(5' 에서 3' )	기준 (NCBI GenBank Locus)
144bp α액틴 (40%GC)	ATGCAAAAGGAAATAACTGCAC (정방향) TTGCTTGCTGATCCACATTT (역방향)	NM_019183
90bp β액틴 (50%GC)	ttcctgggtatggaatcctg (정방향) ggcatagaggtctttacggatg (역방향)	BC063166
50bp CTGF (50%GC)	agagtcgtctctgcatggtc (정방향) gttttcctctaggtcagcttc (역방향)	AB023068
70bp CTGF (50%GC)	AAGATGGTGCACCCTGTGTCTTC (정방향) TGCAACTGCTTTGGAAGGACTC (역방향)	AB023068
90bp CTGF (50%GC)	AAAGATGGTGCACCCTGTGTCTT (정방향) CAGGCAAGTGCACTGGTATTTG (역방향)	AB023068
170bp CTGF (52%GC)	AATGCTGTGAGGAGTGGGTGT (정방향) catcccacaggtcttagaacagg (역방향)	AB023068
73bp CTGF (74%GC)	tgcctggatggggccgtgggctg (정방향) aggggcagtcagggctgggcagg (역방향)	AB023068
120bp CTGF (70%GC)	tcggtgggtccgtgtaccgcagc (정방향) tgggcaggcgcacgtccatgctg (역방향)	AB023068

결과를 도 7a 내지 도 7f 및 도 8a 내지 도 8f에 나타낸다. 이들 실험에서, 관심 유전자의 정량화는 단지 길이가 50bp이고 GC 함량이 40%인 기준 올리고뉴클레오티드에 의해 영향을 받는다(관심 유전자의 복제물의 상당히 더 높은 값을 초래한다). 변수의 상한에 관해서 모두 명백한 제한이 없는 더 긴 길이 및 더 높은 GC 함량의 기준 올리고뉴클레오티드는 모두 관심 유전자의 정확한 정량화를 제공하였다. 이들 실험으로부터 본 발명의 방법에서 유용한 기준 올리고뉴클레오티드 길이의 하한은 60bp이고 GC 함량은 45%인 것으로 결론을 내릴 수 있다. 이 값들은 이 값들의 유용한 범위의 하한을 나타낼 수 있다. 상한은 필요조건에 따라서 설정될 수 있다. 하나의 보편적인 기준 올리고뉴클레오티드가 사용된다면, 편의를 위해 길이는 100bp이고 GC 함량은 50%로 설정될 수 있다. 본원에서 제공되는 데이터로부터, 기준 올리고뉴클레오티드에 대한 임의의 대안적인 적당한 길이 및 GC 함량이 또한 선택될 수 있다.

실시예 6

유전자 생성물이 80개 내지 120개의 염기쌍으로 변하는 9개의 관심 유전자 (앤지오텐시노겐, TNFα, TGFβ, CTGF, NONO MMP2, MMP9 및 TIMP1)를 차례로 정량화하기 위해 각각의 이들 기준 올리고뉴클레오티드를 사용하였다(증폭절 서열에 대해 표 3을 참조).

관심 유전자에 대한 증폭절 서열
관심 유전자	증폭절	크기 (bp)
앤지오텐시노겐 (AGT)	TCTTCCCTCGCTCTCTGGACTTATCCACTGACCCAGTTCTTGCTGCCCAGAAAATCAACAGGTTTGTGCAGGCTGTGACAGG	82
TNF-α	TGTCTGAGACCAACTCAACCCAGAAAAACAAAATGGCCCTTAACTCTTCTGCTGAAGATGGTATCAAAAGAATCCAAGATGACTGCCCCA	82
TGF-β1	CTACTGCTTCAGCTCCACAGAGAAGAACTGCTGTGTACGGCAGCTGTACATTGACTTTAGGAAGGACCTGGGTTGGAAGT	80
CTGF	CTGTTGGCGAACAAATGGCCTTTATTAAGAAATGGCTTGCTCAGGGTAACTGGTCAGATTTCCACGAGGAAGTGTTTGCTGCTTCTTTGACTATGACT	98
NFκB	TCTGATGAACATACACCAGTAGAGGATGAAGAACCAAAGAAAAGCACTACTTCAGCATCTAGTTCGGAAGATGATAAGAAGAAGAAAAGGAAATCTAGTCGTTCAAAAGAAAGAGCCAAG	120
AT1a	TGTCTGAGACCAACTCAACCCAGAAAAACAAAATGGCCCTTAACTCTTCTGCTGAAGATGGTATCAAAAGAATCCAAGATGACTGCCCCA	90
NONO	AAGCAGGCGAAGTTTTCATTCATAAGGATAAAGGCTTTATTCGCTTGGAAACACGAACCCTAGCGGAAATTGCCAAAGTGGAGCTGGAC	95
MMP2	CTGGCACTTTTACTACTTTAGCTGTTTGCTTTGTTTGCCCTTTGCTGTTTGGTTCAACCTTTTCAGTTTTCCACCACACTGCATTTTTCTCACCG	95
MMP9	CCCCCAACCTTTACCAGCTACTCGAACCAATCAGCTTGTCTGTAGTTGTATACACATCCAAGCCTGTGGTTGGTCAGAAGACAACTTTGTAGG	93
TIMP1	GGGTGTGCACAGTGTTTCCCTGTTCAGCCATCCCTTGCAAACTGGAGAGTGACAGTCATTGCTTGTGGACAGATCAGATCCTCATGGGCT	90

상기 기재한 방법을 사용하여 9개의 관심 유전자를 4개의 실험 군 - 제로 타임 대조군(속 빈 막대), 비히클 대조군(빗금 막대) 및 VIP로 처리 후(속 찬 막대) 및 에날라프릴 처리(교차 빗금 막대)의 SHR 래트(n=6)의 심장에서 측정하였다.

결과는 도 9a 내지 도 9c에 나타낸다. 이 결과는 기준 올리고뉴클레오티드 방법의 능력이 핵산 생성물의 양을 정확하게 정량화한다는 것을 입증하며, 따라서 VIP 및 에날라프릴과 같은 화합물로 고혈압 래트의 처리에 의해 유발되는 유전자 발현의 변화를 정확하게 설명한다. 본 방법은 상이한 처리에 의한 유전자 발현의 조절에 관하여 상이한 처리의 효능뿐만 아니라 처리군 동물과 대조군 동물 사이에 통계적으로 유의한 차이를 기술하기 위한 민감성을 제공한다. 특정 동물 연구가 본 방법이 특정 실험 상황에서 어떻게 수행하는지의 편리한 예로서 사용되는 반면, 하우스키핑 유전자 등의 어떤 원치 않는 변화에 의해 영향을 받지 않는 핵산 생성물의 정확한 정량화가 필요되는 임의의 상황에 동일한 정량화 원칙 및 방법이 적용가능하다.

SYBR Green I, SYBR Green II, CYBR Gold, Evagreen, 옥사졸 옐로우, 티아졸 오렌지, Picogreen, TOTO 및 BEBO염료를 사용하여 유사한 실험을 수행하였으며, 프로토콜은 상기 기재하였고, 유사한 결과를 얻었다.

예시한 방법이 하우스키핑 유전자 또는 합성 유전자를 표준화하지 않고 또는 표적 서열이 있는 하우스키핑/합성 기준 유전자를 공동 증폭시킬 필요 없이 유전자 발현 생성물을 정량화하는 개선된 방법을 제공한다는 것이 인식될 것이다.

본 발명이 특정 예와 관련하여 기술되었지만, 당업자는 본 발명을 다수의 다른 형태로 포함시킬 수 있다는 것을 인식할 것이다.

Claims (19)

1. a) 검출가능한 마커로 기준 올리고뉴클레오티드를 표지하는 단계;
   b) 표지된 기준 올리고뉴클레오티드의 연속 희석물을 사용하여 표지된 기준 올리고뉴클레오티드의 농도에 대한 검출가능한 마커의 강도를 플롯팅하여 표준 곡선을 만드는 단계;
   c) 증폭된 표적 핵산을 표지하는 검출가능한 마커의 존재 하에서 표적 핵산을 증폭시키는 단계; 및
   d) 표지된 증폭된 표적 핵산과 결합된 검출가능한 마커의 강도를 표준곡선과 실시간으로 비교하여, 증폭된 표적 핵산의 양을 결정하는 단계를 포함하며,
   상기 기준 올리고뉴클레오티드는 증폭되지 않거나 또는 표적핵산과 공동증폭되지 않으며,
   동일한 표지된 기준 올리고뉴클레오티드를 사용하여 상이한 표적 핵산을 정량화하는 것을 특징으로 하는, 핵산의 정량화 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 검출가능한 마커는 염료인 것을 특징으로 하는, 핵산의 정량화 방법.
3. 제 2항에 있어서, 상기 염료는 dsDNA와 결합하는 것을 특징으로 하는, 핵산의 정량화 방법.
4. 제 3항에 있어서, 상기 염료는 인터칼레이팅 염료인 것을 특징으로 하는, 핵산의 정량화 방법.
5. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염료는 형광 염료인 것을 특징으로 하는, 핵산의 정량화 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 형광 염료는 SYBR 그린 I(SYBR Green I), SYBR 그린 II(SYBR Green II), SYBR 골드(SYBR Gold), 에바그린(Evagreen), 옥사졸 옐로우, 티아졸 오렌지, 피코그린(Picogreen), TOTO, BEBO 또는 딥 퍼플(Deep Purple) 중 어느 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 핵산의 정량화 방법.
7. 제 1항에 있어서, 동일한 표지된 기준 올리고뉴클레오티드는 다수의 상이한 표적 핵산의 동시적 정량화(simultaneous quantitation)를 위해 사용되는 것을 특징으로 하는, 핵산의 정량화 방법.
8. 제 1항에 있어서, 기준 올리고뉴클레오티드는 길이가 60bp 내지 170bp인 것을 특징으로 하는, 핵산의 정량화 방법.
9. 제 1항에 있어서, 기준 올리고뉴클레오티드는 GC 함량이 45% 내지 75%인 것을 특징으로 하는, 핵산의 정량화 방법.
10. 제 1항에 있어서, 기준 올리고뉴클레오티드는 길이가 100bp이고 GC 함량이 50%인 것을 특징으로 하는, 핵산의 정량화 방법.
11. 제 1항에 있어서, 기준 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산보다 더 길거나 또는 더 짧은 것을 특징으로 하는, 핵산의 정량화 방법.
12. 제 1항에 있어서, 표적 핵산의 증폭은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 핵산의 정량화 방법.
13. 제 1항에 있어서, 단일 표준 곡선은 다수의 표적 핵산 증폭 및 정량화를 위해 사용되는 것을 특징으로 하는, 핵산의 정량화 방법.
14. 제 13항에 있어서, 다수의 표적 핵산 증폭 및 정량화는 상이한 시간에 각각 수행되는 것을 특징으로 하는, 핵산의 정량화 방법.
15. 제 1항에 있어서, 표적 핵산은 15주기에 걸쳐 증폭되는 것을 특징으로 하는, 핵산의 정량화 방법.
16. 기준 올리고뉴클레오티드 및 형광 염료를 포함하는, 제 1항의 방법에서 사용하기 위한 키트.
17. 검출가능한 마커로 표지된 기준 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 제 1항의 방법에서 사용하기 위한 키트.
18. 검출가능한 마커로 표지된 기준 올리고뉴클레오티드의 연속 희석물을 포함하는, 제 1항의 방법에서 사용하기 위한 키트.
19. 제 16항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 기준 올리고뉴클레오티드는 길이가 60bp 내지 170bp 이고, GC 함량이 45% 내지 75%인 것을 특징으로 하는, 키트.

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