特許請求の範囲に記載されている発明の主題をより明確かつ簡潔に説明及び指摘するために、以下の説明及び添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語について、以下の定義を提供する。
本明細書で使用される用語「標的DNA」は、DNA増幅反応において増幅されることが望まれる天然起源又は合成起源のいずれかのDNA配列を指す。核酸増幅反応では、標的DNAは、テンプレートとして作用する。DNA増幅反応では、DNAポリメラーゼによって、標的DNAの一部又は標的DNAの全領域のいずれかを増幅して、1つ以上の増幅産物(アンプリコン)を生産し得る。標的DNAは、インビボ又はインビトロで生物学的サンプル(すなわち、生物学的被験体から得られたサンプル)から得られ得る。標的DNAは、限定されないが、生物学的被験体から、又は生物学的被験体の特定領域(例えば、罹患細胞又は循環腫瘍細胞を含有する領域)から単離された体液(例えば、血液、血漿、血清又は尿)、器官、組織、画分及び切片(例えば、器官又は組織の断面部)及び細胞から得られ得る。標的DNAを含有するか、又は標的DNAを含有すると疑われる生物学的サンプルは、真核生物起源、原核生物起源、ウイルス起源又はバクテリオファージ起源のものであり得る。例えば、標的DNAは、昆虫、原生動物、鳥類、魚類、爬虫類、哺乳動物(例えば、ラット、マウス、ウシ、イヌ、モルモット又はウサギ)又は霊長類(例えば、チンパンジー又はヒト)から得られ得る。標的DNAはまた、cDNA(相補的DNA)であり得る。cDNAは、逆転写酵素を使用してRNAテンプレート(例えば、mRNA、リボソームRNA)から作製され得る。ライゲーション反応、PCR反応などの別の反応によって生成されるDNA産物又は合成DNAも、標的DNAとして機能し得る。標的DNAは、溶液中に分散され得るか、又は固体支持体(例えば、ブロット、アッセイ、アレイ、ガラススライド、マイクロタイター)上に、ビーズもしくはELISAプレート上に固定化され得る。
本明細書で使用される用語「夾雑核酸」は、標的DNAの増幅反応に干渉し得るか、又はDNA増幅反応で標的DNAと競合し得る望ましくない核酸(例えば、標的DNA以外の核酸)を指す。夾雑核酸は、試薬、試薬溶液、又は標的DNAの増幅に使用される装置中に存在し得る。換言すれば、夾雑核酸は、実施すべきアッセイにおいて増幅され、さらに特性評価され、存在することが意図されていない核酸である。夾雑核酸は、RNA又はDNAであり得る。例えば、増幅すべき標的DNAを追加する前に、DNA合成反応を実施するのに使用される試薬又は試薬溶液中に存在するDNAは、夾雑核酸であると考えられる。夾雑核酸はまた、前の増幅反応からの前のアンプリコンであり得る。DNA合成反応における夾雑核酸は、潜在的なDNAテンプレートとして作用し得るか、又はプライマーとして作用し得るので、DNA合成反応に関与して不要な増幅産物をもたらし得る。したがって、夾雑核酸がDNA増幅反応に干渉しないように、標的DNAをDNA増幅反応混合物に追加する前に、このような夾雑核酸を除去することが望ましい。増幅すべきDNAテンプレートが限られた量でしか利用することができない場合には、DNA合成反応中の人工物を減少させるために、試薬及び/又は試薬溶液から夾雑DNAを事前に除去することが特に望まれる。
本明細書で使用される用語「DNA増幅反応混合物」は、DNA増幅反応を実施するのに必須の試薬の混合物を指す。本明細書に開示されるDNA増幅反応混合物は、最小限の1以上のエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーと、1以上の標的DNAと、dNTPと、イノシン残基の3’側の残基において二本鎖DNAのイノシン含有鎖にニックを導入することができる1以上のエンドヌクレアーゼと、鎖置換活性を有する1以上のDNAポリメラーゼとを含む。それは、典型的なDNA増幅反応に必要な試薬、例えば緩衝液、塩及び他の成分(例えば、一本鎖DNA結合タンパク質などのアクセサリータンパク質、尿素、グリセロール又はピロリジンなどの変性剤)をさらに含み得る。
本明細書で使用される用語「デコンタミネーションする」は、溶液又は反応混合物中に存在し得る夾雑核酸が、後のDNA増幅反応で標的DNAに干渉することができないように、及び標的DNAと競合することができないように、それを改変又は修飾することを指す。デコンタミネーションはまた、夾雑核酸を不活性にすること指し得る。デコンタミネーションは、夾雑核酸の化学修飾によって、例えば、夾雑核酸がDNAテンプレート(それがプライマーとして作用する場合)又はDNAポリメラーゼ(それがテンプレートとして作用する場合)と反応することができないように、1つ以上の官能基を除去することによって、作用され得る。また、核酸を分解又は消化することによって、夾雑核酸を不活性にし得る。用いる試薬の性質に応じて、核酸を不活性にする機構は変化し得る。例えば、エキソヌクレアーゼで夾雑核酸を消化して、3’ヒドロキシル基及び5’リン酸基を有する遊離ヌクレオチドを生産することによって、夾雑核酸を不活性にし得る。デコンタミネーションは、夾雑核酸の量の減少、又は夾雑核酸の完全な除去のいずれかをもたらし得る。デコンタミネーションプロセスは、プライマーとして作用し得るか、又は後のDNA増幅反応のテンプレートとして機能し得るヌクレオチド又はヌクレオチド断片をもたらすことが多い。
本明細書で使用される用語「プライマー」は、標的核酸配列(例えば、標的DNA)にハイブリダイズして、核酸合成反応を開始させる短い直鎖状オリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、RNAオリゴヌクレオチド、DNAオリゴヌクレオチド又はキメラ配列であり得る。プライマーは、天然ヌクレオチド、合成ヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドを含有し得る。例えば、プライマーは、天然に存在するヌクレオチド(Gヌクレオチド、Aヌクレオチド、Cヌクレオチド又はTヌクレオチド)又はそれらの類似体を含み得る。プライマー配列の長さの上限及び下限は両方とも、経験的に決定される。プライマーの長さの下限は、核酸増幅反応条件下で、標的核酸とのハイブリダイゼーション時に安定な二重鎖を形成するのに必要な最小の長さである。非常に短いプライマー(通常は、3ヌクレオチド長未満)は、このようなハイブリダイゼーション条件下で標的核酸との熱力学的に安定な二重鎖を形成しない。上限は、標的核酸中の所定の核酸配列以外の領域において二重鎖形成を有する可能性によって決定されることが多い。一般に、適切なプライマーの長さは、約4ヌクレオチド長〜約40ヌクレオチド長の範囲である。ある実施形態では、プライマーは、5ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長の範囲である。用語「フォワードプライマー」は、標的DNAの第1鎖にアニーリングするプライマーを指し、用語「リバースプライマー」は、標的DNAの相補的な第2鎖にアニーリングするプライマーを指す。一般に、DNAポリメラーゼがDNA合成を開始して両鎖が複製され得るように、PCRプライマーと同様の方法で、フォワードプライマー及びリバースプライマーを共に標的DNA配列に配向する。
本明細書で使用される用語「イノシン含有プライマー」は、その配列において1以上のイノシン残基を含むプライマーを指す。イノシン残基は、核酸塩基がヒポキサンチンである2’−デオキシリボヌクレオシド又は2’−リボヌクレオシド残基である。イノシン残基は、チミン、アデニン、シチジン又はウリジン残基と塩基対を形成することができる。イノシン残基はまた、イノシン類似体であり得る。例えば、キサンチン構造は、グアニンの脱アミノ化から生じるイノシン残基の代替構造である。イノシン類似体は、核酸塩基がキサンチン、ウリジン、オキサニン(オキサジン)、他のO−1プリン類似体、N−6−ヒドロキシルアミノプリン、ネブラリン、7−デアザヒポキサンチン、他の7−デアザプリン及び2−メチルプリンなどの修飾塩基を含む2’−デオキシリボヌクレオシド又は2’−リボヌクレオシドを指す。イノシン又はイノシン類似体残基は、多くの場合にプライマー配列の3’末端の最後から2番目のヌクレオチドとして、プライマー配列の3’末端近くに配置され得る。
本明細書で使用される用語「エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマー」は、1以上のイノシン残基を含有するプライマー配列であって、エキソヌクレアーゼ酵素の作用に対して耐性である(すなわち、エキソヌクレアーゼによって分解されない)プライマー配列を指す。ある実施形態では、プライマーは、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性及び5’→3’エキソヌクレアーゼ活性の両方に対して耐性である。ある実施形態では、プライマーは、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性に対して耐性である。化学修飾によって、例えば、1以上のホスホロチオエート結合を適切な位置に導入することによって、イノシン含有プライマーをエキソヌクレアーゼ耐性にするように操作し得る。例えば、3’末端ヌクレオチドと最後から2番目の残基との間にホスホロチオエート結合を含有するイノシン含有プライマーは、3’→5’方向のエキソヌクレアーゼの作用に対して耐性である。3’→5’エキソヌクレアーゼは核酸を3’から5’方向に消化するので、この位置のホスホロチオエート結合は、エキソヌクレアーゼの消化作用を妨げる。イノシン残基がホスホロチオエートの5’側に存在する場合、それは、プライマー中に維持されるであろう。同様に、5’末端ヌクレオチドと最後から2番目の残基との間にホスホロチオエート結合を含有するイノシン含有プライマーは、5’→3’方向のエキソヌクレアーゼの作用に対して耐性である。エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーが標的DNAとハイブリダイズして、二本鎖核酸構造を形成すると、特異的エンドヌクレアーゼが二本鎖構造を認識して、イノシン含有鎖に一本鎖ニックが生じる。例えば、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーが標的DNAにハイブリダイズすると、エンドヌクレアーゼVは、イノシン残基の3’側の位置において二本鎖DNAのイノシン含有鎖にニックを導入することができる。
本明細書で使用される用語「dNTP」は、DNAポリメラーゼがDNA合成に必要とする前駆体として作用するデオキシヌクレオチド三リン酸の混合物を指す。dNTP混合物中の各デオキシヌクレオチド三リン酸は、デオキシリボース糖、有機塩基及び三リン酸形態のリン酸塩を含む。dNTP混合物は、天然に存在する各デオキシヌクレオチド三リン酸(例えば、dATP、dTTP、dGTP、dCTP又はdUTP)を含み得る。ある実施形態では、天然に存在する各デオキシヌクレオチド三リン酸は、合成類似体で代替又は補完され得るが、ただし、イノシン塩基は、dNTP混合物中のグアノシン塩基(G)を代替及び補完し得ない。dNTP中の各デオキシヌクレオチド三リン酸は、10μM〜20,000μM、100μM〜1000μM又は200μM〜300μMの最終濃度で反応混合物中に存在し得る。
本明細書で使用される用語「アンプリコン」は、標的核酸の増幅から生じる核酸増幅産物を指す。アンプリコンは、増幅産物の混合物(例えば、混合アンプリコン集団)、増幅産物のいくつかの優勢種(例えば、複数の別個のアンプリコン)、又は増幅産物の単一の優勢種を含み得る。アンプリコンの単一種は、当技術分野で認められている技術、例えばアフィニティー精製又は電気泳動を使用して、混合アンプリコン集団から単離され得る。使用される反応スキームに応じて、アンプリコンは、一本鎖又は二本鎖のDNA、DNA:RNAハイブリッド又はRNAを含み得る。アンプリコンは、主に一本鎖の、又は部分的に二本鎖の、又は完全に二本鎖のDNA、DNA:RNAハイブリッド又はRNAであり得る。
本明細書で使用される用語「末端ヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチド又はプライマー配列の末端に位置するヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチド配列の3’末端位置に位置する末端ヌクレオチドは3’末端ヌクレオチドと称され、5’末端位置に位置する末端ヌクレオチドは5’末端ヌクレオチドと称される。最後から2番目の位置に位置するヌクレオチドは、末端ヌクレオチドに直接隣接するヌクレオチドを指す。例えば、NNNNNNIAは、イノシン残基(I)が最後から2番目の3’位置にあり、アデノシン残基が3’末端ヌクレオチドであるヌクレオチド配列(オクタマー)を示す。
本明細書で使用される用語「突然変異型エンドヌクレアーゼ」又は「人工エンドヌクレアーゼ」は、遺伝子工学又はタンパク質工学によって作製されたエンドヌクレアーゼ酵素であって、1つ以上のアミノ酸残基が野生型エンドヌクレアーゼから改変されているエンドヌクレアーゼ酵素を指す。改変としては、1つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入が挙げられ得る。本明細書及び特許請求の範囲を通して、タンパク質配列の1つの特定位置におけるアミノ酸の置換は、「(野生型酵素におけるアミノ酸残基)(野生型酵素におけるアミノ酸の位置)(人工酵素におけるアミノ酸残基)」という表記を使用して言及される。例えば、Y75Aという表記は、野生型酵素の75番目の位置のチロシン(Y)残基の、(突然変異型/人工酵素における)アラニン(A)残基による置換を指す。
本明細書で使用される用語「保存的変異体」は、アミノ酸配列及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、用語「保存的変異体」は、同一又は類似のアミノ酸配列(すなわち、類似の物理化学的特性を有するアミノ酸配列)をコードする核酸であって、縮重配列を含む核酸を指す。例えば、コドンGCA、GCC、GCG及びGCUはすべて、アラニンをコードする。したがって、アラニンが指定されるすべてのアミノ酸位置において、対応するヌクレオチド配列を構築する際に、これらのコドンのいずれかを互換的に使用し得る。(それが配列中の唯一の改変であると仮定すれば)このような核酸変異体は、同じタンパク質をコードするので保存的変異体である。当業者であれば、AUG(メチオニンの唯一のコドン)及びUGG(トリプトファン)を除いて、核酸中の各コドンを保存的に改変して、機能的に同一のペプチド又はタンパク質分子を作製し得ると認識する。アミノ酸配列に関して、当業者であれば、単一のアミノ酸又は少数(典型的には、約10個未満)のアミノ酸の置換、欠失又は付加によるポリペプチド又はタンパク質配列の改変は、改変したポリペプチド又はタンパク質配列の物理化学的特性が元のものと類似である場合には、「保存的変異体」であり得ると認識するであろう。一部の場合では、改変は、化学的に類似のアミノ酸による1個のアミノ酸の置換であり得る。保存的変異体の例としては、限定されないが、ある疎水性残基(例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニン)の相互置換、又はある極性残基による別の極性残基の置換(例えば、アルギニンによるリジンの置換、グルタミンによるアスパラギン酸の置換、又はグルタミンによるアスパラギンの置換)などが挙げられる。遺伝的にコードされたアミノ酸は、一般に、4つのファミリーに分けられ得る:(1)酸性:アスパラギン酸、グルタミン酸、(2)塩基性:リジン、アルギニン、ヒスチジン、(3)非極性:アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、及び(4)非荷電極性:グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。
エンドヌクレアーゼ支援DNA増幅アッセイのための方法及びキットの1つ以上の実施形態は、イノシン残基の3’側の位置において二本鎖核酸のイノシン含有鎖にニックを導入することができる酵素の使用を含む。ある実施形態では、エンドヌクレアーゼは、遺伝子操作エンドヌクレアーゼである。本明細書に記載されるDNA増幅アッセイは、1以上のイノシン残基を含むエキソヌクレアーゼ耐性プライマーをさらに用いる。DNA増幅反応の前に、適切なエキソヌクレアーゼで処理することによって、エキソヌクレアーゼ耐性プライマー溶液をデコンタミネーションし得る。
DNA増幅アッセイについて、特定の標的DNAを含有することが公知の、又は特定の標的DNAを含有すると疑われるサンプルは、様々な供給源から得られ得る。サンプルは、例えば、生物学的サンプル、食品、農業サンプル又は環境サンプルであり得る。サンプルはまた、原核生物又は真核生物起源を含む様々な生物学的被験体に由来し得、ウイルスを含む。サンプルは、生体組織又は体液又は浸出液(例えば、血液、血漿、血清又は尿、乳、脳脊髄液、胸膜液、リンパ液、涙、痰、唾液、便、肺吸引物、咽喉又は生殖器スワブなど)、全細胞、循環腫瘍細胞、細胞画分又は培養物に由来し得る。
核酸アッセイの標的DNAは、溶液中に分散され得るか、又は固体支持体(例えば、ブロット、ペーパーパンチ、アレイ、マイクロタイター又はウェルプレートなど)上に固定化され得る。標的DNAは、一本鎖又は二本鎖のいずれかであり得る。標的DNAテンプレートは、環状DNA、直鎖状DNA又はニック導入DNAであり得る。DNAテンプレートは、ゲノムDNA、プラスミドDNA又はcDNAであり得る。標的DNAを前処理して、それをプライマーとのハイブリダイゼーションに利用可能にし得る。例えば、標的DNAが二本鎖形態である場合、それを変性させて、一本鎖形態の標的DNAを生成し得る。標的二本鎖DNAを熱的もしくは化学的に変性させ得るか、又は熱的かつ化学的に変性させ得る。ある実施形態では、二本鎖DNAの融解温度を低下させる変性剤(例えば、グリセロール、エチレングリコール、ホルムアミド又はそれらの組合せ)を使用して、二本鎖DNAを化学的に変性させる。特定の実施形態では、反応混合物に追加する変性剤の10%(vol/vol)毎に、変性剤は、融解温度を3℃〜6℃低下させる。変性剤又は変性剤の組合せは、反応混合物の1%、5%、10%(vol/vol)、15%(vol/vol)、20%(vol/vol)又は25%(vol/vol)を含み得る。特定の実施形態では、変性剤は、エチレングリコールを含む。代替的な実施形態では、変性剤は、グリセロール(例えば、10%)及びエチレングリコール(例えば、15%〜20%)の組合せである。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを低下させる塩を反応緩衝液に低濃度で含めて、標的DNAを低温で化学的に変性させ得る。標的DNAを熱的に変性させる実施形態では、変性工程は、(例えば、標的DNAを95℃で加熱することによって)標的DNAを熱的に変性させることを含む。
ある実施形態では、エンドヌクレアーゼ支援DNA増幅方法は、標的DNAに基づいて1以上のアンプリコンを生産する。最初に、標的DNAをエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーとハイブリダイズさせ、続いて、イノシン残基の3’側の位置において二本鎖核酸のイノシン含有鎖にニックを導入することができるエンドヌクレアーゼの存在下で、DNAポリメラーゼ(例えば、鎖置換ポリメラーゼ)及びdNTPを使用して、標的DNAを増幅する。dNTPは、DNAポリメラーゼがDNA合成に必要とするデオキシリボヌクレオチドの組合せを提供する。DNAポリメラーゼは、dNTP混合物を使用して、DNAの鋳型鎖に相補的にアニーリングしたプライマーの3’ヒドロキシル末端にヌクレオチドを追加し、標的DNAテンプレートに相補的な新たなDNA鎖(アンプリコン)を作る。ある実施形態では、天然に存在する各デオキシヌクレオチドは、合成類似体で代替又は補完され得る。ただし、デオキシイノシン三リン酸(dITP)は、dNTP混合物中のdGTPを代替及び補完し得ない。DNA増幅反応の産物は、鋳型鎖の末端に伸長することが多い一本鎖又は二本鎖DNAであり得る。イノシン含有プライマー中のイノシンヌクレオチドは、イノシン含有プライマーの5’末端の少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド又は少なくとも10ヌクレオチド下流に配置され得る。例えば、イノシン含有ランダムオクタマープライマーは、NNNINNNN又はNNNNINNなどの配列を有し得る。特定の実施形態では、イノシンヌクレオチドは、プライマーの最後から2番目の3’ヌクレオチドであり得る。代替的な実施形態では、イノシンは、最後から2番目3’残基及び最後の3’残基の両方に存在し得る。ある実施形態では、イノシン含有プライマーは、イノシン類似体を含む。ある実施形態では、DNA増幅方法は、標的DNAと、1以上のエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを含むプライマー溶液とを提供する工程と、標的DNAと、プライマー溶液と、鎖置換活性を有する1以上の5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメラーゼと、イノシン残基の3’側の残基において二本鎖DNAのイノシン含有鎖にニックを導入することができる1以上のエンドヌクレアーゼとを一緒に混合することによって、DNA増幅反応混合物を生成する工程と、DNA増幅反応物を使用して、標的DNAの1以上の部分を増幅し、1以上のアンプリコンを生産する工程とを含む。1以上のエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーは、フォワードプライマー又はリバースプライマー又はその両方の混合物であり得る。エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーとは別に、プライマー溶液は、dNTP及び緩衝液などの他の必須の核酸増幅試薬を含み得る。プライマー溶液はまた、DNA増幅反応を増強又は支援する試薬、例えば一本鎖DNA結合タンパク質(SSBタンパク質)、ホルムアミド、エチレングリコール又はフィコールの1つ以上を含み得る。DNA増幅混合物を生成する前に、適切なエキソヌクレアーゼでプライマー溶液を処理して夾雑核酸を除去することによって、プライマー溶液をデコンタミネーションし得る。さらに、デコンタミネーション反応の後、DNA増幅反応の前に、追加したエキソヌクレアーゼを不活性化し得る。ある実施形態では、等温増幅法を用いることによって、標的DNAを増幅する。
図1は、エンドヌクレアーゼ支援標的DNA増幅の実施形態の概略図を示す。イノシン含有プライマーが標的DNAに結合すると、DNAポリメラーゼ(例えば、5’→3エキソヌクレアーゼ欠損Bst DNAポリメラーゼ)がイノシン含有プライマーを伸長し、それにより、二本鎖DNA(プライマー伸長産物)が生成される。伸長反応は、イノシン残基の3’側の位置において二本鎖DNAのイノシン含有鎖に一本鎖ニックを作ることができるエンドヌクレアーゼのニック導入部位を作る。エンドヌクレアーゼは、このニック導入部位において二本鎖DNAにニックを導入する。ニック導入は、DNAポリメラーゼの新たなDNA合成開始部位を作る。DNAポリメラーゼはこの開始部位に結合し、ニック導入プライマーをさらに伸長する。DNAポリメラーゼは鎖置換活性を有するので、一本鎖DNA産物を置換する一方、二本鎖プライマー伸長産物を再形成する。このサイクルが繰り返されて、標的DNAテンプレートの下流部分に相補的な複数の一本鎖DNAが合成される。さらなるプライマー又は他のオリゴヌクレオチド、さらなる酵素、さらなるヌクレオチド、染色、色素又は他の標識成分を用いることによって、図1に示されている核酸増幅の概略図は変化し得る。例えば、場合により、色素標識ジデオキシヌクレオチドターミネーターを追加することによって、シングルプライマーによる増幅を、ジデオキシ配列決定、各テンプレート分子の多重配列決定産物の生産に使用し得る。mRNAサンプル由来の配列タグ付オリゴdTプライマーを用いて作られた二本鎖cDNAから、標識プローブを作製し得る。シングルプライマーは、同定及び/又は単離を容易にし得るタグ配列の相補体であり得る。この反応では、エンドヌクレアーゼVを適切な酵素として使用し得る。エンドヌクレアーゼVは、イノシン(又はイノシン類似体)を含有するDNAを認識する修復酵素であって、イノシンの3’側の2番目又は3番目のリン酸ジエステル結合を加水分解する(すなわち、イノシンヌクレオチドの2ヌクレオチド3’側の位置(約95%が2番目のリン酸ジエステル結合であり、約5%が3番目のリン酸ジエステル結合である)においてDNAに特異的にニックを導入する)修復酵素であり、3’−ヒドロキシル及び5’−リン酸を有するニックが残る。標的DNAが二本鎖である場合、ニックは、イノシン残基を含む鎖において発生する。
ある実施形態では、鎖置換DNAポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼV及びエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーをDNA増幅反応に用いる。DNA増幅では、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーは、標的DNAとハイブリダイズする。プライマー中のイノシン残基は、ヒポキサンチンがグアニンに代わってシトシンと相補しているか、又はアデニンに代わってチミンと相補している標的DNA中のシチジン残基又はチミジン残基と塩基対を形成し得る。次いで、DNA合成によって、標的DNAテンプレートの相補鎖が生成され、それにより、二本鎖DNAが生成される。次に、二本鎖DNAの生成が、エンドヌクレアーゼVのニック導入部位を生成する。エンドヌクレアーゼVは、この二本鎖DNAのイノシン含有鎖にニックを導入する。次いで、DNAポリメラーゼが、ニック導入位置から相補鎖を再度生成する。この伸長工程が、エンドヌクレアーゼVのニック導入部位を再度生成する。したがって、DNA増幅反応混合物中の必須DNA増幅試薬のいずれか1つが使い果たされるまで、DNAポリメラーゼによる伸長と、それに続くエンドヌクレアーゼVによるニック導入が複数回繰り返される。各サイクルでは、これらの反応に用いられる鎖置換DNAポリメラーゼが、前のサイクルで生成された相補鎖を置換する。ハイブリダイゼーション、伸長、ニック導入及びさらなる伸長の工程は、実質的に同時に起こり得る。したがって、方法の1つ以上の実施形態は、(オリゴヌクレオチドプライマーを介して)イノシン残基を標的核酸の特定位置に導入し、続いて、ポリメラーゼと、生成された二本鎖核酸のイノシン含有鎖にニックを導入して、ポリメラーゼによる2回目の相補鎖生成サイクルを開始させるエンドヌクレアーゼVとを使用して、標的核酸の相補鎖を繰り返し生成すること含む。
図2は、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを使用した、エンドヌクレアーゼ支援増幅反応の実施形態の概略図を示す。増幅反応に使用されるエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーの配列は、典型的には、増幅すべきDNAテンプレートの配列、及び/又は増幅の所望の種類(例えば、ランダム対特異的)に依存する。ある実施形態では、本明細書で使用されるエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーは、5’末端残基の少なくとも4ヌクレオチド下流に位置する1以上のイノシン残基を含む。エキソヌクレアーゼ耐性プライマーは、それらをエキソヌクレアーゼ消化に対して耐性にする修飾ヌクレオチドを含み得る。ある実施形態では、プライマーは、プライマーをエキソヌクレアーゼによる(特に、3’→5’エキソヌクレアーゼによる)分解に対して耐性にする1以上のヌクレオチドを含有する。修飾ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチドであり得る。例えば、エキソヌクレアーゼ耐性プライマーは、配列中のヌクレオチド間に1つ、2つ、3つ又は4つのホスホロチオエート結合を有し得る(例えば、NNNNN*N*N*I*N又はN*NNNN*N*N*I*N)。修飾ヌクレオチドは、一般に、最後から2番目のイノシン残基を有するプライマー配列の3’末端ヌクレオチドである(例えば、(NNN)nNI*N又は(NNN)nNI*I(*は、ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を表し、nの整数値は、使用されるプライマーの長さに応じた範囲であり得、例えば、nの値は、0〜13の範囲であり得る)。しかしながら、ある実施形態では、プライマーは、イノシン残基として修飾ヌクレオチドを有し得る(例えば、NNNNNN*IN)。ある実施形態では、プライマー配列が、修飾残基の隣に位置する1以上のイノシン残基を含有することを条件として、修飾ヌクレオチドは、3’末端位置以外の位置に配置され得る(例えば、NNNNI*NNNN又はNNNN*INNNN)。修飾ヌクレオチドが、プライマー配列の3’末端以外の位置に位置する場合、プライマーの3’末端ヌクレオチドは、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性によって除去され得る。いくつかのエンドヌクレアーゼVは、関連3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を有し得る。チオエートイノシンプライマーは、エンドヌクレアーゼVがイノシンを除去するのを妨げ得る。ヌクレオチド配列をエキソヌクレアーゼ耐性にする当技術分野で公知の他のヌクレオチド修飾も同様に使用し得る。
増幅すべきDNAテンプレートの配列及び性質に応じて、エキソヌクレアーゼ耐性でもある適切なイノシン含有プライマーを設計及び選択し得る。当技術分野で認められている合成技術のいずれかを使用して、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを合成し得る。エキソヌクレアーゼ耐性のイノシン含有シングルプライマー、イノシン含有ペアプライマー又はイノシン含有ネステッドペアプライマーを使用して、アンプリコンを生成し得る。AutoDimer(商標)などのプライマー設計ソフトウェアを用いて、核酸にアニーリングしてポリメラーゼ伸長を容易にすることができるシングルプライマー又はマルチプルプライマーを設計し得る。約6mMの塩濃度でプライマーの融解温度が約50℃になるように、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを設計し得る。ある実施形態では、比較的短いプライマー(例えば、10mer〜20mer、より好ましくは14mer〜18mer、最も好ましくは16mer)を用い得る。エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーは、特異的プライマー又はランダムプライマーのいずれかであり得る。全ゲノム増幅反応では、イノシン残基以外のすべての残基をランダム化することによって作製されたプライマーを含むランダムプライマー混合物を使用し得る。シングルプライマー又はマルチプルプライマーのいずれかを増幅に用い得る。特異的プライマーは、標的DNAテンプレート中に存在する所定の配列に対して、ワトソン−クリックの意味で相補的なヌクレオチド配列を有するか、又はヌクレオチド配列を有するように操作される。
ある実施形態では、イノシン残基が、標的DNA中のシトシン残基に相補的なプライマー中の位置に配置されるように、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを設計する。ある実施形態では、イノシンは、プライマーの最後から2番目の3’塩基として現れる。反応条件(例えば、温度及びイオン強度)は、標的DNAに対するプライマーのアニーリングに影響を与えるので、反応条件にしたがって、プライマー中のイノシンの最適な位置を調整し得る。一般に、エンドヌクレアーゼによるニック導入後においても、プライマーが標的DNAにアニーリングし続ける(例えば、核酸アッセイ反応条件下で、ニック導入プライマーの長さが、標的DNAに結合することができるのに十分である)ように、イノシン残基をプライマーの5’末端から離して配置する。したがって、イノシンの5’側のプライマーセグメントは、選択された反応条件で、反応温度にほぼ等しい融解温度を有すべきである。ある実施形態では、イノシン含有プライマーは、複数のイノシン残基又はイノシン類似体を含み得る。2つのテンプレートGsが1列にある場合、2つのイノシンが、最後から2番目の3’残基及び最後の残基の両方としてプライマー中に現れ得る。この場合、エンドヌクレアーゼが、いずれかのイノシン残基の2ヌクレオチド3’側にニックを導入することは、ニック導入DNA鎖を作るのと同じ効果を有するであろう。イノシン残基は、最後から2番目の3’位置及び末端の3’位置の両方に位置し得る。これら2つのイノシンは、ホスホロチオエート結合によって連結され得る。ある実施形態では、イノシン含有プライマーは、反応混合物中で25℃〜80℃、30℃〜65℃又は40℃〜55℃の溶融温度を示し得る。ある実施形態では、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーは、反応混合物中で50℃の融解温度を示す。
シングルフォワードプライマーを用いると、標的DNAの相補的コピーの合成速度は比較的一定であり、相補的コピーの数は時間と共に着実に直線的に増加する。ある実施形態では、1以上のイノシン残基をそれぞれが含有するエキソヌクレアーゼ耐性のマルチプルプライマーを反応混合物中に含めて、増幅プロセスを加速させ得る。プラス鎖及びマイナス鎖の両方が生成される実施形態では、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含むペアプライマーを反応混合物中に含め得る。例えば、フォワードプライマーから所定の距離で標的DNAの相補鎖にアニーリングするリバースプライマー(生成された相補鎖((+)鎖)にアニーリングして、逆方向の(−)鎖をさらに生成するプライマー)を追加すると、増幅プロセスが加速する。これらの各プライマーの標的は元のテンプレート中に存在するので、2つのプライマースキームで両方の鎖を増幅する(「ピン産物」はフォワードプライマーのアンプリコンであり、「ポン産物」はリバースプライマーのアンプリコンである)。マルチプルペアプライマーを含めることにより、反応混合物中の別個の産物の相対的割合を改善し得る。最も内側のフォワードプライマー及び最も内側のリバースプライマーを互いに対して比較的近くに(例えば、約50塩基未満離して)配置して、フォワードアンプリコン((+)鎖)が、エンドヌクレアーゼV切断部位によって規定されるその5’末端に到達するのに必要な時間を最小限にし、それにより、標的DNAからアンプリコンを生成するのに必要な総時間を減少させ得る。ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ又は他の成分の量が限定的になると、反応速度が最大に達する。また、1以上のイノシン残基をそれぞれが含有するエキソヌクレアーゼ耐性のさらなるネステッドプライマーペアを使用して、増幅速度をさらに増加させ得るか、又は反応の特異性を増加させ得る。元の標的において、一連の各プライマーが互いに隣り合ってハイブリダイズするように、ネステッドプライマーを、前のアンプリコンの3’末端又はその近くに結合するように設計し得る。マルチプルネステッドプライマーを使用する場合、濃度1ng〜10μgのSSBタンパク質を容量10μLで反応混合物に含めて、忠実性を増加させ、バックグラウンドを減少させ得る。マルチプルペアプライマーによる増幅は、特定の配列の存在を検出するために、サンプル中に存在する配列の量を定量するために、又はサイズ測定、制限酵素消化、配列決定、ハイブリダイゼーションもしくは他の分子生物学的技術の方法(例えば、電気泳動)による分析のための大量の配列を生産するために有用な迅速かつ大規模な増幅を容易にする。
ある実施形態では、特定のプライマー配列(例えば、ハイブリダイズしたアンプリコンDNAの末端にさらなる配列を追加することを可能にするさらなる5’配列であって、プロモーター配列又は制限エンドヌクレアーゼ部位特異的配列又は新規プライマー結合部位配列を生成するのに使用されるさらなる5’配列を含有するプライマー)である伸長テンプレートを、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーに組み込むことによって、アンプリコンの3’末端にアニーリングさせ得る。アンプリコンの3’末端にアニーリングするように、伸長テンプレートを設計し得る。伸長テンプレートが2つの配列ストレッチ(1つはアンプリコンに相補的であり、1つはアンプリコンに相補的ではない)を含有する場合、ハイブリダイゼーションは、非相補的プライマー配列の5’オーバーハングを作る。次いで、DNAポリメラーゼが、アンプリコンの3’陥凹末端をさらに伸長し得る。この伸長反応を用いて、特定のDNA配列をアンプリコンの3’末端に組み込み得る。ある実施形態では、伸長テンプレートの5’末端は、共鳴エネルギー移動によって蛍光色素が主にクエンチされるように、蛍光色素及びクエンチャーがステムのいずれかのアーム上に位置するヘアピンループを含有し得る。DNAポリメラーゼがアンプリコンの3’陥凹末端を伸長すると、ステム−ループ構造が二本鎖構造に変換され、色素及びクエンチャーのさらなる分離が引き起こされる。これにより、蛍光消光の一部又は全部が排除されて、検出可能なシグナルが生成される。2つ以上の独立した増幅プロセスを同時にモニタリングし得るように、伸長テンプレートの適切な選択及びクエンチされる色素の色によって、このシグナルを多重化し得る。ある実施形態では、伸長テンプレートの5’末端は、RNAポリメラーゼプロモーター配列の相補体を含み得る。したがって、伸長テンプレートをアンプリコンにハイブリダイズさせ、続いて、DNAポリメラーゼがアンプリコンの3’陥凹末端を伸長することによって、二本鎖RNAポリメラーゼプロモーターを生成し得る。RNAポリメラーゼを反応物に含める場合、次いで、一本鎖RNAポリメラーゼテンプレートとしてアンプリコンを転写して、対応するRNAを生成し得る。
エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーは、エキソヌクレアーゼの作用に対して耐性であるので、DNA増幅反応混合物に追加する前に、プライマーを含有する溶液をエキソヌクレアーゼで前処理し得る。エキソヌクレアーゼ処理は、プライマー液中に存在し得る夾雑核酸を除去するか、又は減少させる。エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを含有する溶液は、本明細書に記載されるDNA増幅反応に必要な他の試薬(標的DNAを除く)、例えばdNTP、DNAポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、緩衝液及び/又は一本鎖結合タンパク質をさらに含み得る。DNAポリメラーゼをプライマー溶液に含める場合、それがエキソヌクレアーゼ不活性化工程に耐え得るように選択すべきである。さらに、デコンタミネーション工程において、Phi29 DNAポリメラーゼなどの校正DNAポリメラーゼをエキソヌクレアーゼとして使用する場合、プライマー溶液は、いかなるdNTPも含有すべきではない。プライマー溶液を、エキソヌクレアーゼと、エキソヌクレアーゼが夾雑核酸を不活性にすることを可能にするための二価陽イオンと共にインキュベートすることによって、プライマー溶液のデコンタミネーションを達成することが多い。単一のエキソヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼの組合せを使用して、プライマー溶液をデコンタミネーションし得る。ある実施形態では、エキソヌクレアーゼの1つ以上を反応に使用し得る。本発明に使用され得る適切なエキソヌクレアーゼとしては、限定されないが、Phi29 DNAポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII、エキソヌクレアーゼVII、T7遺伝子−6エキソヌクレアーゼ、脾臓エキソヌクレアーゼ、T5 D15エキソヌクレアーゼ及びラムダエキソヌクレアーゼが挙げられる。一実施形態では、エキソヌクレアーゼI及びエキソヌクレアーゼIIIの組合せをプライマー溶液のデコンタミネーションに使用する。Phi29DNAポリメラーゼを適切なエキソヌクレアーゼとして使用する場合、プライマー溶液を45度でインキュベートすることによって、それを非常に容易に不活性化し得るので、Phi29 DNAポリメラーゼは、DNA増幅に使用される温度で不活性である。
エキソヌクレアーゼを活性化し得る二価陽イオンを、デコンタミネーション反応に使用し得る。いくつかの非限定的な例としては、マグネシウム及びマンガンが挙げられる。二価陽イオンの濃度は、エキソヌクレアーゼの濃度に主に依存する。エキソヌクレアーゼの濃度を決定するいくつかパラメータとしては、夾雑核酸の量、特定のエキソヌクレアーゼのターンオーバー、及びエキソヌクレアーゼ活性の他の動態パラメータが挙げられる。ある実施形態では、エキソヌクレアーゼに対してモル過剰の二価陽イオンを、プライマー溶液のデコンタミネーションに使用する。エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを含有するプライマー溶液を、エキソヌクレアーゼ及び二価陽イオンと共に、夾雑核酸を不活性にするのに十分な時間インキュベートする。インキュベーション時間は、使用するエキソヌクレアーゼ及び二価陽イオンの動態特性に応じて変化し得る。インキュベーション時間はまた、インキュベーションを実施する温度に依存し得る。核酸の存在を特性評価するための当技術分野で公知の技術のいずれかを用いて、デコンタミネーションプロセスの効率を分析することによって、インキュベーション時間を最適化し得る。適切なインキュベーション時間は、約5分間〜約3時間の範囲であり得る。ある実施形態では、インキュベーション時間は、約1分間〜約100分間の範囲であり得る。いくつかの特定の実施形態では、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを含有するプライマー溶液を、エキソヌクレアーゼ及び二価陽イオンと共に、37℃で約60分間インキュベートし得る。プライマー溶液のインキュベーションを実施する温度は、使用する特定のエキソヌクレアーゼの性質によって変化し得る。インキュベーションに使用し得る最高温度は、エキソヌクレアーゼの安定性によって制限され、インキュベーションに用い得る最低温度は、その温度におけるエキソヌクレアーゼ活性によって決定される。ある実施形態では、インキュベーションを50℃以下の温度で実施する。ある実施形態では、適切なインキュベーション温度は、約0℃〜約45℃の範囲である。いくつかの特定の実施形態では、インキュベーションを約10℃〜約40℃の温度で実施し得る。
ある実施形態では、デコンタミネーションのために、適切なエンドヌクレアーゼをエキソヌクレアーゼと共にプライマー溶液に追加し得る。夾雑核酸が環状DNAを含み得る実施形態では、又はプライマーの骨格全体がヌクレアーゼ耐性である実施形態では、これは特に有用である。エンドヌクレアーゼは環状DNAに対して作用して、それらにニックを導入する。ニックが作られると、エキソヌクレアーゼが夾雑物のニック導入DNAに対して作用し、それらを分解してそれらを不活性し得る。適切なエンドヌクレアーゼの非限定的な例としては、DNAseIなどのDNAseが挙げられる。
ある実施形態では、SSBタンパク質を、エキソヌクレアーゼと共に、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを含有するプライマー溶液に追加し得る。適切なSSBタンパク質としては、限定されないが、極めて熱安定性の一本鎖DNA結合タンパク質(ET SSB、New England Biolabs,MA製)、recA(例えば、E.coli RecA)、Tth RecA(Thermus thermophilusから単離されたRecAホモログ、New England Biolabs,MA製)、ファージT4遺伝子32タンパク質、T7遺伝子2.5タンパク質、Ncp7及びE.coli SSBタンパク質が挙げられ得る。エキソヌクレアーゼ耐性プライマーを含む溶液へのエキソヌクレアーゼ、二価陽イオン及び/又はSSBの追加を逐次に又は同時に実施し得る。逐次追加を実施する実施形態では、特定の順序で追加を行い得る。例えば、ある実施形態では、最初に、エキソヌクレアーゼ及び二価陽イオンを混合し、次いで、プライマー溶液に追加し、続いて、SSBタンパク質を追加し得る。いくつかの他の実施形態では、最初に、プライマー溶液をSSBタンパク質と接触させ得、次いで、エキソヌクレアーゼ及び二価陽イオンを追加し得る。
エキソヌクレアーゼを使用するデコンタミネーション工程の後、プライマー溶液中のエキソヌクレアーゼを不活性化し得る。当技術分野で利用可能な様々な方法によって、エキソヌクレアーゼを不活性化し得る。特定の一実施形態では、エキソヌクレアーゼの熱変性によって、エキソヌクレアーゼを不活性化し得る。デコンタミネーションしたプライマー溶液を、ヌクレアーゼが安定ではない温度でインキュベートすることによって、これを達成し得る。エキソヌクレアーゼを不活性化するのに十分な特定の時間にわたって、インキュベーションを実施する。ある実施形態では、デコンタミネーションしたプライマー溶液を65℃以上の温度でインキュベートすることによって、これを達成し得る。ある実施形態では、デコンタミネーションしたプライマー溶液を65℃〜約95℃の温度でインキュベートし得る。エキソヌクレアーゼを熱的に不活性化するのに十分な時間は、使用する温度、及び関与するヌクレアーゼの種類に応じて変化し得る。典型的には、熱不活性化を約30秒間〜約2時間実施し得る。ある実施形態では、デコンタミネーションしたプライマー溶液を約85℃で15分間インキュベートし、次いで約95℃で5分間インキュベートし得る。エキソヌクレアーゼを熱的に不活性化するのに必要な期間及び温度を最適化し得る。夾雑核酸を除去するためのエキソヌクレアーゼ処理工程において、プライマー溶液が、他の試薬と共に、DNAポリメラーゼ及び/又はエンドヌクレアーゼVを含有する特定の実施形態では、エキソヌクレアーゼを不活性化して、又はエキソヌクレアーゼを不活性化せずに、DNA増幅反応を実施し得る。不活性化工程を使用しない実施形態では、DNA増幅反応に干渉しないように、エキソヌクレアーゼの量を選択し得る。不活性化工程を実施することが必要な実施形態では、DNAポリメラーゼ及び/又はエンドヌクレアーゼを不活性化せずにエキソヌクレアーゼを選択的に不活性化し得るように、DNAポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼV及びエキソヌクレアーゼを選択するか、又はデコンタミネーションに使用したエキソヌクレアーゼを不活性化した後においてのみ、DNAポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼVを、デコンタミネーションしたプライマー溶液に追加する。
実質的にすべての夾雑核酸を不活性化したら、増幅すべきDNAテンプレートを、デコンタミネーションしたプライマー溶液に追加し得る。デコンタミネーション工程において、鎖置換活性を有する1以上のDNAポリメラーゼと、イノシン残基の3’側の残基において二本鎖DNAのイノシン含有鎖にニックを導入することができる1以上のエンドヌクレアーゼと、遊離ヌクレオチドとがプライマー溶液中にまだ存在していない場合には、それらもプライマー溶液に追加する。分解した夾雑核酸はDNA合成反応に干渉しないので、それらを、デコンタミネーションしたプライマー溶液から除去することは不要であり得る。DNAテンプレートを増幅するのに用い得るDNAポリメラーゼは、校正DNAポリメラーゼ又は非校正DNAポリメラーゼであり得る。いくつかの特定の実施形態では、校正DNAポリメラーゼ及び非校正DNAポリメラーゼの組合せを、DNAテンプレートの効率的な増幅に使用し得る。
ある実施形態では、等温条件下でDNA増幅反応を実施する。等温増幅反応条件中の反応温度は、設定温度から1℃、5℃又は10℃の範囲であり得る。ある実施形態では、DNA増幅の反応温度を45℃(±1℃)に保持する。DNA増幅反応の反応温度に応じて、熱安定性エンドヌクレアーゼ及び熱DNAポリメラーゼを使用し得る。
当技術分野で公知のDNAポリメラーゼのいずれかをDNA増幅に用い得る。本発明の方法に使用するのに適切なDNAポリメラーゼは、以下の特徴の1つ以上示し得る:鎖置換活性、ニックから鎖置換を開始する能力、及び/又は低い一本鎖DNA分解活性。ある実施形態では、用いるDNAポリメラーゼは、1つ以上のエキソヌクレアーゼ活性を欠き得る。例えば、DNAポリメラーゼは、3’→5’エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメラーゼであり得るか、又はDNAポリメラーゼは、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を欠き得る。ある実施形態では、DNAポリメラーゼは、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性及び5’→3’エキソヌクレアーゼ活性の両方を欠き得る(すなわち、エキソ(−)DNAポリメラーゼ)。方法に有用な例示的なDNAポリメラーゼとしては、限定されないが、クレノウ、5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損Bst DNAポリメラーゼ(Bst DNAポリメラーゼの大断片)、5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損デルタTts DNAポリメラーゼ、エキソ(−)クレノウ又はエキソ(−)T7 DNAポリメラーゼ(Sequenase(商標))が挙げられる。
ある実施形態では、校正DNAポリメラーゼをDNA増幅反応に使用し得る。いくつかの特定の実施形態では、デコンタミネーションしたプライマー溶液に追加する前に、校正DNAポリメラーゼを含有する溶液もデコンタミネーションし得る。dNTPの非存在下、二価陽イオン(例えば、Mg2+又はMn2+)で前処理することによって、校正DNAポリメラーゼ溶液のデコンタミネーションを達成し得る。一実施形態では、Phi29 DNAポリメラーゼを用い、テンプレートDNAの増幅を行うために、デコンタミネーションしたプライマー溶液に追加する前に、夾雑核酸を不活性化するのに十分な時間にわたって、Phi29 DNAポリメラーゼ溶液をマグネシウムイオンと共に特定温度でインキュベートすることによって、Phi29 DNAポリメラーゼ溶液をデコンタミネーションする。
ポリメラーゼ酵素は、典型的には、二価陽イオン(例えば、Mg+2、Mn+2、又はそれらの組合せ)を核酸合成に必要とする。したがって、1つ以上の二価陽イオンをDNA増幅反応混合物に追加し得る。例えば、MgCl2を2mM〜6mMの濃度範囲で反応混合物に追加し得る。高濃度(例えば、10pmol超、20pmol超又は30pmol超)のイノシン含有プライマーを反応混合物に含める場合、より高濃度のMgCl2が好ましい場合がある。
ある実施形態では、イノシン含有二本鎖DNAにニックを導入するために、突然変異型エンドヌクレアーゼVをDNA増幅反応混合物に含める。部位特異的突然変異誘発又は人工遺伝子合成を含む遺伝子工学技術又はタンパク質工学技術によって、突然変異型エンドヌクレアーゼVを作製し得る。遺伝子工学は、野生型エンドヌクレアーゼVの1つ以上のアミノ酸残基の改変を含み得る。改変としては、野生型エンドヌクレアーゼVの1つ以上のアミノ酸残基の置換、挿入及び/又は欠失が挙げられ得る。タンパク質の合理的な設計によって、又は指向性進化によって、突然変異型エンドヌクレアーゼVを作製し得る。ある実施形態では、合理的に設計された突然変異型エンドヌクレアーゼV酵素であって、基質結合が増加しており、ニック導入の効率が増加しており、ニック導入の特異性が増加しており、及び/又はニック導入の感度が増加している突然変異型エンドヌクレアーゼV酵素を用いる。また、基質結合が可逆的であるように、突然変異型エンドヌクレアーゼVを設計し得る。その結果、突然変異型エンドヌクレアーゼV酵素は、各酵素によって繰り返されるニック導入を支援し得るのに対して、対応する野生型酵素は、わずか1ラウンド(又は、限られた数ラウンド)のニック導入をすることができるにすぎない(例えば、野生型E.coliエンドヌクレアーゼV(配列番号1)は、ニック導入後においても、DNAに結合し続ける)。このような突然変異型エンドヌクレアーゼVを化学量論的量未満で反応混合物に使用して、ニック導入反応を引き起こし得る。ある実施形態では、突然変異型エンドヌクレアーゼVの保存的変異体をDNA増幅反応に使用し得る。例えば、単一のアミノ酸又は少数(典型的には、約10個未満)のアミノ酸の置換、欠失及び/又は付加による突然変異型エンドヌクレアーゼVのさらなる改変は、改変した突然変異型エンドヌクレアーゼVの物理化学的特性が元の突然変異型エンドヌクレアーゼVと類似である場合には、「保存的変異体」であり得る。一部の場合では、改変は、化学的に類似のアミノ酸による1個のアミノ酸の置換であり得る。
ある実施形態では、イノシン残基がシトシン残基とペアリングすると、イノシン残基の3’側の位置において二本鎖DNAのイノシン含有鎖に選択的にニックを導入する突然変異型エンドヌクレアーゼVを使用し得る。いくつかの他の実施形態では、イノシン残基がチミン残基とペアリングすると、イノシン残基の3’側の位置において二本鎖DNAのイノシン含有鎖に選択的にニックを導入する突然変異型エンドヌクレアーゼVを使用し得る。イノシン残基がシトシン又はチミンとペアリングすると、突然変異型エンドヌクレアーゼVは、野生型エンドヌクレアーゼVよりも高い効率で、二本鎖DNAのイノシン含有鎖にニックを導入し得る。さらに、DNA増幅反応に用いる突然変異型エンドヌクレアーゼVは、イノシン含有一本鎖DNAよりも、二本鎖DNAのイノシン含有鎖に選択的にニックを導入し得る。例えば、Y75A E.coli突然変異型エンドヌクレアーゼV(配列番号2)は、イノシン残基を含む一本鎖DNAよりも、イノシン残基を含む二本鎖DNAにニックを導入する。対照的に、Y80A Tma突然変異型エンドヌクレアーゼV(配列番号6)は、イノシン残基を含む二本鎖DNAよりも、イノシン残基を含む一本鎖DNAにニックを導入する。いくつかの突然変異型エンドヌクレアーゼは、イノシン残基を含有するDNA配列以外の構造にニックを導入し得るが、いくつかの他のものは、イノシンを含有するDNA配列に対して非常に特異的であり得る。例えば、Tma及びAfuエンドヌクレアーゼ(配列番号3及び配列番号5)は、フラップ及び偽Y構造などの構造にニックを導入しない。ある実施形態では、複数のイノシン残基が二本鎖DNA中に存在する場合、用いるエンドヌクレアーゼV突然変異体は、チミン残基とペアリングしているイノシン残基よりも、シトシン残基とペアリングしているイノシン残基(多くの場合、イノシン残基の1ヌクレオチド又は2ヌクレオチド3’側)に選択的にニックを導入し得る。いくつかの態様では、エンドヌクレアーゼV突然変異体は、塩基対ミスマッチを含有する二本鎖DNAにニックを導入し得る。ニック導入は、塩基対ミスマッチの位置において、又は1つ以上の塩基によって分離された塩基対ミスマッチの3’側の位置において起こり得る。
ある実施形態では、熱安定性エンドヌクレアーゼVをDNA増幅反応に使用する。例えば、標的DNAの熱変性(部分的な変性又は完全な変性のいずれか)を実施するDNA増幅アッセイでは、熱安定性エンドヌクレアーゼV又は熱安定性エンドヌクレアーゼV突然変異体が好ましい場合がある。標的DNAの熱変性が不要である他の実施形態では、野生型エンドヌクレアーゼV、又は比較的低い温度(例えば、45℃)で最大酵素活性を有するエンドヌクレアーゼV突然変異体(例えば、Y75A突然変異型E.coliエンドヌクレアーゼV)を使用し得る。例えば、Y75A E.ColiエンドヌクレアーゼV突然変異体は、50℃でインキュベートすることによって不活性化されるのに対して、それは、37〜45℃でその酵素活性を保持している。AfuエンドヌクレアーゼV(野生型(配列番号3)及びY75A突然変異型(配列番号4)の両方)又はTmaエンドヌクレアーゼV(野生型(配列番号5)及びY80A突然変異型(配列番号6)の両方)は、一般に、E.coliエンドヌクレアーゼV(野生型(配列番号1)及びY75A突然変異型(配列番号2)の両方)よりも熱安定性である。高温でインキュベートすることによって、DNAポリメラーゼによる鎖置換DNA合成を増加させ得るある実施形態では、高温(例えば、45〜80℃)で機能するエンドヌクレアーゼVを使用し得る。
ある実施形態では、突然変異型E.coliエンドヌクレアーゼVをDNA増幅反応に用いる。突然変異型E.coliエンドヌクレアーゼは、配列番号2に対応するY75A突然変異型E.coliエンドヌクレアーゼVであり得る。野生型E.coliエンドヌクレアーゼV(配列番号1)の75番目の位置のチロシン(Y)残基をアラニン(A)残基で置換することによって、この突然変異体を作製する。ある実施形態では、突然変異型AfuエンドヌクレアーゼY74A(配列番号4)及び/又はその保存的変異体を用いる。野生型AfuエンドヌクレアーゼV(配列番号3)の75番目の位置のチロシン(Y)残基をアラニン(A)残基で置換することによって、突然変異型Y74A Afuエンドヌクレアーゼを作製する。
表1は、野生型エンドヌクレアーゼ及び突然変異型エンドヌクレアーゼV酵素の配列を提供する。
ある実施形態では、標的DNAに基づいて1以上のアンプリコンを生産するための方法は、(a)標的DNAを提供する工程と、(b)エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーから本質的になるプライマー溶液を提供する工程と、(c)エキソヌクレアーゼでプライマー溶液を処理して、プライマー溶液から夾雑核酸を除去する工程と、(d)デコンタミネーション工程(c)の後に、プライマー溶液中のエキソヌクレアーゼを不活性化する工程と、(e)標的DNAと、デコンタミネーションしたプライマー溶液と、鎖置換活性を有する1以上の5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメラーゼと、イノシン残基の3’側の残基においてDNAにニックを導入することができる1以上のエンドヌクレアーゼとを一緒に混合することによって、DNA増幅反応混合物を生成する工程と、(f)工程(e)のDNA増幅反応混合物を使用して、標的DNAの1以上の部分を増幅し、1以上のアンプリコンを生産する工程とを含む。プライマー溶液は、dNTP及び増幅緩衝液などの他の核酸増幅試薬をさらに含み得る。プライマー溶液は、ホルムアミド、SSBタンパク質、エチレングリコール又はフィコールなどの試薬の1つ以上をさらに含み得る。しかしながら、プライマー溶液が、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーから本質的になる実施形態では、プライマー溶液は、前の増幅反応物に由来するアンプリコン、エキソヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチド、イノシン含有オリゴヌクレオチド又はエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマー(例えば、前の増幅反応物からの核酸夾雑物)を欠く。
核酸増幅反応のためのDNA増幅反応混合物は、界面活性剤(例えば、洗浄剤)、ブロッキング試薬(例えば、アルブミン)、トポイソメラーゼ、還元剤又は緩衝液などの1つ以上の試薬をさらに含み得る。一般に、デコンタミネーション工程の前に(例えば、エキソヌクレアーゼでプライマー溶液を処理して夾雑核酸を除去する前に)、これらの試薬を、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを含有するプライマー溶液に追加する。エキソヌクレアーゼ処理の後、次いで、(他の追加試薬と共にDNA増幅に使用すべきエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを含有する)デコンタミネーションしたプライマー溶液を、(デコンタミネーションに用いたエキソヌクレアーゼを不活性化して、又はエキソヌクレアーゼを不活性化せずに)核酸増幅反応混合物を生成するのに使用する。いくつかの特定の実施形態では、エキソヌクレアーゼでプライマー溶液を処理する前に、DNA増幅に必要なすべての試薬(標的DNAそれ自体を除く)をプライマー溶液に追加する。このような実施形態では、夾雑DNAのほとんどすべて(標的DNA溶液から生じたものを除く)をDNA増幅反応混合物から除去し、それにより、標的DNAの増幅をコンタミネーションフリーにし得る。
6〜9の反応pHをもたらす緩衝液(例えば、トリス緩衝液、HEPES緩衝液)をDNA増幅反応に使用し得る。ある実施形態では、核酸増幅反応混合物のpHは、7.7である。ある実施形態では、DNAの安定性を増強する緩衝液(例えば、HEPES)を使用し得る。デコンタミネーション工程の後に、標的DNAの熱変性又はエキソヌクレアーゼの熱変性を用いるいくつかの特定のDNA増幅反応では、トリス−ホウ酸緩衝液、HEPES緩衝液及びMOPS緩衝液などの熱不安定性緩衝液は好ましくない場合がある。反応混合物の第1の成分を導入する前に、界面活性剤を反応チューブにアプライし得る。或いは、他の試薬と同様に、エキソヌクレアーゼによるデコンタミネーション工程の前に、界面活性剤をプライマー溶液に追加し得る。ある実施形態では、界面活性剤は、Tween−20、NP−40、Triton−X−100又はそれらの組合せから選択される洗浄剤であり得る。ある実施形態では、0.05%NP−40及び0.005%Triton X−100を反応に使用する。いくつかの特定の実施形態では、DNA増幅反応緩衝液は、25mMトリス−ホウ酸塩、5mM MgCl2、0.01%Tween、及び20%エチレングリコールを含み得る。アルブミン(例えば、BSA又はHSA)などのブロッキング剤をDNA増幅反応混合物に含めて、反応容器(例えば、プラスチック製マイクロ遠心チューブ又はマイクロタイタープレート)の表面に結合させ、それにより、ヌクレアーゼ又はポリメラーゼとの反応に利用可能な標的DNAの相対量を増加させ得る。DNA増幅反応混合物は、1以上のトポイソメラーゼ(例えば、1型トポイソメラーゼ)を含み得る。トポイソメラーゼは、少なくとも0.1ng/μLの最終濃度で反応混合物中に存在し得る。ある実施形態では、DNA増幅反応混合物は、1以上の一本鎖DNA結合タンパク質(例えば、E.coli SSB、T4遺伝子32タンパク質(T4g32p)、T7遺伝子2.5タンパク質、Ncp7、recA又はそれらの組合せ)を含み得る。一本鎖DNA結合タンパク質は、少なくとも0.1ng/μLの最終濃度で反応混合物中に存在し得る。DNA増幅反応混合物はまた、反応混合物中の酵素の酸化を軽減する1つ以上の還元剤であって、生産されるアンプリコンの品質及び収量を改善する1つ以上の還元剤、例えばジチオスレイトール(DTT)、2−メルカプトエタノール(βME)、トリス(カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)又は2−メルカプトエチルアミン(MEA)を含み得る。
本DNA増幅方法の様々な実施形態によって生産されるアンプリコンを、既存技術のいずれかによって定性的又は定量的に決定し得る。例えば、定性的又は定量的なアッセイでは、発色のために、DNA増幅反応後/DNA増幅反応中に、末端リン酸標識リボヌクレオチドをホスファターゼと組合せて使用し得る。このような実施形態では、dNTP又はデオキシヌクレオシド四リン酸の末端リン酸メチルエステルを使用することによって、末端リン酸を脱リン酸化から保護し得る。
ある実施形態では、アンプリコン生産キットは、1以上のエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーと、鎖置換活性を有する1以上の5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメラーゼと、イノシン残基の3’側の残基においてDNAにニックを導入することができる1以上のエンドヌクレアーゼとを含む。イノシン含有プライマーのイノシン残基は、5’末端残基の少なくとも4ヌクレオチド下流に位置する。ある実施形態では、イノシン残基は、プライマー配列の最後から2番目の3’位置に位置する。ある実施形態では、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーは、最後から2番目の3’位置のイノシン残基と3’末端残基との間に、1以上のホスホロチオエート結合を含む。ある実施形態では、キットは、DNA合成反応を実施するのに必要な試薬又は試薬溶液をさらに含み得る。キットに含まれるエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーは、特異的プライマー、部分ランダムプライマー又はランダムプライマーのいずれかであり得る。ある実施形態では、キットは、複数のエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを含む。ある実施形態では、キットは、1以上のエンドヌクレアーゼVを含む。エンドヌクレアーゼVは、野生型エンドヌクレアーゼV又は突然変異型エンドヌクレアーゼVのいずれかであり得る。ある実施形態では、キットは、Y75A突然変異型E.coliエンドヌクレアーゼVを含む。キットに含まれるDNAポリメラーゼは、クレノウ、5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損Bst DNAポリメラーゼ(Bst DNAポリメラーゼの大断片)、5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損デルタTts DNAポリメラーゼ、エキソ(−)クレノウ又はエキソ(−)T7 DNAポリメラーゼ(Sequenase(商標))であり得る。
キットは、SSBタンパク質をさらに含み得る。キットに含まれ得る適切なSSBタンパク質としては、限定されないが、極めて熱安定性の一本鎖DNA結合タンパク質(ET SSB、New England Biolabs,MA製)、recA(例えば、E.coli RecA)、Tth RecA(Thermus thermophilusから単離されたRecAホモログ、New England Biolabs,MA製)、ファージT4遺伝子32タンパク質、T7遺伝子2.5タンパク質、Ncp7及びE.coli SSBタンパク質が挙げられる。
キットは、1以上のエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを含むプライマー液をデコンタミネーションするのに使用し得るエキソヌクレアーゼをさらに含み得る。キットが含み得る適切なエキソヌクレアーゼは、例えば限定されないが、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII、エキソヌクレアーゼVII、T7遺伝子−6エキソヌクレアーゼ、脾臓エキソヌクレアーゼ、T5 D15エキソヌクレアーゼ及びラムダエキソヌクレアーゼである。ある実施形態では、キットは、エキソヌクレアーゼIIIを含む。いくつかの他の実施形態では、キットは、エキソヌクレアーゼI及びエキソヌクレアーゼIIIの混合物を含み得る。一緒にパッケージされた単一の容器又は複数の容器で、エキソヌクレアーゼの組合せを提供し得る。キットは、キットに含まれる特定の成分を詳述する取扱説明書と、デコンタミネーション反応又はDNA増幅反応又はその両方にそれらを使用するためのプロトコールとをさらに含み得る。
本発明の実施は、以下の実施例からさらに詳細に理解されよう。これらは、本明細書では例示のために提示されているにすぎず、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例のセクションで使用されるいくつかの略語は、以下のように展開される:「mg」:ミリグラム、「ng」:ナノグラム、「pg」:ピコグラム、「fg」:フェムトグラム、「mL」:ミリリットル、「mg/mL」:ミリグラム/ミリリットル、「mM」:ミリモル、「mmol」:ミリモル、「pM」:ピコモル、「pmol」:ピコモル、「μL」:マイクロリットル、「min.」:分及び「h.」:時間。
本明細書で提供されるすべての融解温度値は、式100.5+(41*(yG+zC−16.4)/(wA+xT+yG+zC))−(820/(wA+xT+yG+zC))+16.6*LOG10([Na+]+[K+])−0.56(%EG)−0.32(%G)−0.62(%F)(式中、w、x、y及びzは、プライマーに含まれるそれぞれアデノシン残基、シトシン残基、グアノシン残基及びチミジン残基の数を指し、Na+は、ナトリウム濃度(mM)を指し、K+は、カリウム濃度(mM)を指し、EGは、エチレングリコール濃度(%)を指し、Gは、グリセロール濃度(%)を指し、Fは、ホルムアミド濃度を指す)にしたがって決定される。
トリス−HCl及びTween20は、Sigma Aldrichから入手し、dNTPは、GE Healthcareから入手し、NaClは、Ambionから入手した。特に指示がない限り、以下の表に示されている容量は、マイクロリットル単位である。当技術分野で認められている技術(例えば、サンプル中の種を分離し、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ又はプロフラビンなどのインターカレート色素を使用して観察するための電気泳動)のいずれかを使用して、アンプリコンを可視化及び/又は定量し得る。光学的方法(例えば、ABI Series 7500 Real−Time PCR machine)及びインターカレート色素(例えば、SYBR Green I)を使用して、アンプリコンの生産を追跡し得る。以下の実施例で生産したアンプリコンを、電気泳動又は光学的技術を使用して可視化した。
HET緩衝液は、10mM HEPES緩衝液(pH8)、0.1mM EDTA及び0.1%(v/v)Tween20である。10×変性緩衝液は、100mM HEPES緩衝液(pH8.0)、1mM EDTA、0.1%(v/v)Tween20及び10mg/ml BSAである。10×反応緩衝液は、150mM HEPES緩衝液(pH8)、30mM塩化マグネシウム、1mM硫酸マンガン、2.5mM dATP、2.5mM dCTP、2.5mM dGTP、2.5mM dTTP、50mM硫酸アンモニウム、10mM TCEP及び0.1%(v/v)Tween20である。酵素希釈緩衝液は、10mM HEPES(pH8)、1mM TCEP、0.5mM EDTA、0.01%(v/v)Tween20及び50%(v/v)グリセロールである。5%(w/v)フィコール400は、5g/100mlの水と同等である。
実施例1:テンプレートDNAのエンドヌクレアーゼ支援等温増幅:
エンドヌクレアーゼ支援等温増幅反応では、3つの試薬ミックスを別個に調製し、次いで一緒に混合して、最終的な増幅反応物を作る。これら3つの試薬ミックスを変性ミックス、酵素ミックス及び反応ミックスとする。
0.5μlの10×変性緩衝液と、1μlの適切な濃度の所望の標的DNAテンプレートと、0.5μlの25%(v/v)ホルムアミドと、ヌクレアーゼ耐性プライマーを含有する1μlの適切なオリゴミックスと、2μlのヌクレアーゼフリー水とを最終容量5μlで混ぜ合せることによって、変性ミックスを調製する。変性ミックスを95℃で2分間加熱し、次いで室温で放置する。
0.34μlの大断片のBst DNAポリメラーゼ(120単位/μl)と、0.2μlのE.coli SSB(5μl/μl)と、0.041μlの突然変異型E.coliエンドヌクレアーゼV(6.23mg/ml)と、0.419μlの酵素希釈緩衝液とを最終容量1μlで混ぜ合せることによって、酵素ミックスを調製する。
1μlの10×反応緩衝液と、2μlのエチレングリコールと、1μlの50%(v/v)フィコール400と、1μlの酵素ミックスとを最終容量5μlで混ぜ合せることによって、反応ミックスを調製する。
変性ミックス及び反応ミックスの両方を別個に45℃で30秒間予熱することによって、完全なピンポン反応物をアセンブルする。次いで、これらの両ミックスを混ぜ合せて、45℃で1時間インキュベートする。
インキュベーション後、15%アクリルアミドTBE尿素ゲル(Invitrogen)を使用してゲル電気泳動によって、増幅を分析する。ゲルローディングの直前に、3μlの完了ピンポン反応物を6μlのゲルローディング緩衝液II(Invitrogen)と混ぜ合せ、95℃で2分間熱変性し、続いて氷上で直ぐにクエンチする。次いで、5μlのこの熱変性ピンポン反応物をゲルの1つのウェルにロードする。製造業者(Invitrogen)を説明書にしたがって、電気泳動を行う。電気泳動が完了したら、SYBR Gold(Invitrogen)の20×溶液でゲルを15分間染色し、次いで、Typhoon 9410 Variable Mode Imager(GE Healthcare)によってフルオレセインをスキャンする。
実施例2:エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを使用した、テンプレートDNAのエンドヌクレアーゼ支援等温増幅。
エンドヌクレアーゼ支援等温増幅に使用したプライマーは、最後から2番目の3’塩基としてイノシンを含有する。エンドヌクレアーゼVは、イノシンを非天然塩基と認識するので、この異常部位の1塩基3’側において、イノシン残基を含有するDNA鎖にニックを導入する。本実施例では、イノシン残基と末端3’塩基との間のリン酸結合がホスホロチオエート化されているヌクレアーゼ耐性プライマーを使用した、増強された増幅動態を実証する。
Mycobacterium tuberculosis rpoB遺伝子の5’領域において、6個のフォワードプライマー及び5個のリバースプライマーの配列を同定した。2セットのこれら11個のプライマー(一方のセットはホスホロチオエート化されておらず、他方のセットは、各プライマーのイノシンと末端3’塩基との間でホスホロチオエート化されている)を合成した。表2及び表3は、実施例で使用した様々なプライマーの配列を提供する。
非ホスホロチオエート化プライマーセットを作製するために、4.00μLのIA TBrpoB F1(629pmol/μL)、3.16μLのIA TBrpoB F2(793pmol/μL)、3.64μLのIA TBrpoB F3n(686pmol/μL)、3.50μLのIA TBrpoB R2(715pmol/μL)、3.28μlのIA TBrpoB R3(762pmol/μL)、5.74μLのIA TBrpoB F4(436pmol/L)、2.84μLのIA TBrpoB F5(880pmol/μL)、4.17μLのIA TBrpoB F6(599pmol/μL)、4.94μLのIA TBrpoB R4(506pmol/μL)、4.15μLのIA TBrpoB R5(602pmol/μL)及び5.63μLのIA TBrpoB R6(444pmol/μL)を204.95μLのHE(0.1)T緩衝液(総容量=250μL)と混合した。
ホスホロチオエート化プライマーセットを作製するために、3.32μLのIA TBrpoB F1*(754pmol/μL)、2.72μLのIA TBrpoB F2*(920pmol/μL)、2.83μLのIA TBrpoB F3*(883pmol/μL)、4.68μLのIA TBrpoB F4*(534pmol/μL)、1.72μLのIA TBrpoB F5*(1451pmol/μL)、1.76μLのIA TBrpoB F6*(1417pmol/μL)、2.72μLのIA TBrpoB R2*(920pmol/μL)、1.80μLのIA TBrpoB R3*(1392pmol/μL)、1.51μLのIA TBrpoB R4*(1652pmol/μL)、1.79μLのIA TBrpoB R5*(1398pmol/μl)及び7.00μLのIA TBrpoB R6*(358pmol/μL)を218.15μLのHE(0.1)T緩衝液(総容量=250μL)と混合した。
次いで、実施例1のように調製及び分析したエンドヌクレアーゼ支援等温増幅反応に各プライマーセットを使用した。ピンポン反応の各オリゴヌクレオチドプライマーの最終濃度は、10pmolであった。図3に示されているように、ヌクレアーゼ耐性プライマー(すなわち、ホスホロチオエート化を含有するプライマーセット)の使用は、エンドヌクレアーゼ支援等温増幅反応産物の収量を約2倍増加させる。
実施例3:コンタミネーションフリー試薬を使用した、テンプレートDNAのエンドヌクレアーゼ支援等温増幅。
本実施例では、DNAポリメラーゼ、突然変異型エンドヌクレアーゼV及びヒトゲノムDNAテンプレートを除くすべてのピンポン試薬をデコンタミネーションして、エキソヌクレアーゼとの増幅前インキュベーション工程によって外来性DNAを除去する。本実施例の実施形態では、11ngのヒトゲノムDNAをテンプレートとして増幅反応に使用し、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用する。本実施例では、最初に、エキソヌクレアーゼI(Exo I)及びエキソヌクレアーゼIII(Exo III)を適切な試薬と共に一定時間間隔でインキュベートし、次いで加熱によって失活させた。次いで、クリーニングした試薬をピンポン反応物に組み込んだ。
1.25μLのエキソヌクレアーゼI(New England Biolabs、0.25単位/μL)、1μLのエキソヌクレアーゼIII(New England Biolabs、1単位/μL)及び97.95μLの酵素希釈緩衝液を含有する混合物を調製した。1マイクロリットルのこのエキソヌクレアーゼ混合物を、0.5μLの変性緩衝液、1μLの10×反応緩衝液、0.5μLの25%(v/v)ホルムアミド、0.2μLのSSB、0.419μLの酵素希釈緩衝液、2μLのエチレングリコール、1μLの50%(v/v)フィコール400、1μLのp53オリゴミックス(表2に記載されているp53増幅に用いたホスホロチオエート化プライマー)及び1μLの水に最終容量8.619μLで追加した。クリーニング反応物を37℃で30分間インキュベートして、エキソヌクレアーゼが夾雑DNAを分解することを可能にし、次いで、80℃で30分間インキュベートしてエキソヌクレアーゼを不活性化した。クリーニングした試薬を必要になるまで+4℃で保存した。
p53遺伝子セグメントを増幅するためのホスホロチオエート化プライマーセットを作製するために、5.96μLのIA p53 F1*(839pmol/μL)、6.05μLのIA p53 F2*(826pmol/μL)、7.40μLのIA p53 F3*(676pmol/μL)、6.55μLのIA p53 F4*(763pmol/μL)、10.99μLのIA p53 F5*(455pmol/μL)、8.50μLのIA p53 F6*(588pmol/μL)、6.17μLのIA p53 R1*(811pmol/μL)、11.24μLのIA p53 R2*(445pmol/μL)、15.38μLのIA p53 R3*(325pmol/μL)、4.81μLのIA p53 R4*(1040pmol/μL)、4.68μLのIA p53 R5*(1069pmol/μL)、8.05μLのIA p52 R6*(621pmol/μL)を404.22μLの0.01%Tween20(総容量=500μL)と混合した。
0.34μLの大断片のBst DNAポリメラーゼ及び0.041μLの突然変異型エンドヌクレアーゼVを、1μl(11ng、約1500コピー)のヒトゲノムDNA又は水(テンプレートなしのコントロール(NTC))のいずれかと共に、クリーニングした試薬に追加した。クリーニングしていないコントロール反応物を実施例2のように調製した。実施例2のように、すべての反応物をインキュベート及び分析した。図1は、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを含むピンポン試薬をエキソヌクレアーゼでクリーニングすることにより、非特異的な増幅産物が排除されることを示している。
上記詳細な説明は例示であり、本出願の発明及び本発明の使用を限定するものではない。本明細書を通して、特定の用語の例示は、非限定的な例とみなされるべきである。文脈上明確な指示がない限り、単数形「a」、「an」及び「the」は、複数形の指示対象を含む。本明細書及び特許請求の範囲を通して本明細書で使用される近似的な文言を使用して、許容範囲で変化し得る定量的表現を、それが関係する基本的機能を変化させずに修飾し得る。したがって、「約」などの用語によって修飾された値は、指定された正確な値に限定されるものではない。特に指示がない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される分子量、反応条件などの成分、特性の量を表すすべての数字は、すべての場合において、用語「約」によって修飾されると理解されるべきである。したがって、特に反対の指示がない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載されている数値パラメータは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、そして均等論を特許請求の範囲に適用しようとするものではないが、報告されている有効数字の数を考慮し、通常の丸め技術を適用することによって、各数値パラメータを少なくとも解釈すべきである。必要であれば、範囲が提供されており、これらの範囲は、その間のすべての部分範囲を含む。
本発明は、その精神及び本質的な特徴から逸脱せずに、他の特定の形態で具体化され得る。上記実施形態は、多種多様なすべての可能な実施形態又は実施例から選択された実施形態又は実施例である。したがって、上記実施形態は、すべての点において、本明細書に記載される本発明を限定するものではなく、例示であるとみなされるべきである。本発明の特定の特徴のみを本明細書で例示及び説明したが、本開示の利益を鑑みれば、当業者であれば、これらの及び他の種類の用途に適切であり、本発明の原理にしたがって方法を使用するための適切な条件/パラメータを特定、選択、最適化又は改変することができるであろうことを理解すべきである。正確な使用、試薬の選択、変数、例えば濃度、容量、インキュベーション時間、インキュベーション温度の選択などは、それが意図される特定の用途に大きく依存し得る。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神の範囲内にあるすべての改変及び変更をカバーするものであると理解すべきである。さらに、特許請求の範囲の均等の意味及び範囲内にあるすべての変更は、その中に包含されるものである。