CN102925471B - 非限制性构建无缝质粒表达载体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种非限制性构建无缝质粒表达载体的方法，属于基因工程或分子生物学技术领域。在构建重组质粒实验过程中，经常遇到需要将两个基因片段融合并确保得到的质粒能正确表达所需要的氨基酸序列，但因所使用的载体中无合适的酶切位点，导致常规的内切酶处理-连接酶连接的方法不适用。本发明通过USER酶的使用，分别在目的片段与载体两端产生粘性末端，可以将目的基因片段非限制性的插入或置换任何载体的任何部位，无需额外加入任何碱基；同时确保融合基因开放阅读框的正确性。本发明的优势为：构建重组质粒时不受到载体质粒和目的基因片段酶切位点的限制，为非限制性载体构建，并且获得阳性重组子的效率高。
Description
技术领域：
本发明专利涉及一种非限制性构建无缝质粒表达载体的方法，重组质粒构建的方法，属于基因工程或分子生物学技术领域。
技术背景：
在构建重组质粒实验过程中，经常需要两个基因片段融合并确保得到的质粒能正确表达所需要的氨基酸序列。对于此类的质粒构建，经常遇到所使用的质粒载体中无合适的酶切位点，导致常规的内切酶处理-连接酶连接的方法不适用。目前构建这一类重组质粒的主要方法有PCR定点突变产生酶切位点法，细菌体内同源重组法，平齐末端连接法，PCR与T4DNA聚合酶结合产生粘性末端连接法，In-Fusion法等。通过DNA突变产生酶切位点的方法是利用氨基酸编码序列的简并性产生酶切位点同时又保证氨基酸序列正确，该方法非常繁琐从而限制了其广泛使用。体内同源重组法是利用位于目的片段两端与受体质粒同源的序列在细菌细胞内与受体质粒发生同源重组而得到所需的质粒；这一方法虽然简单，但效率低，不能确保成功。平齐末端连接法的缺点为连接效率低，且重组质粒有50％的几率含有反向连接的目的片段。PCR与T4DNA聚合酶结合产生粘性末端连接法简单易行，但要求在目的片段末端12个碱基中不含四种碱基中的其中一种。In-Fusion法的缺点为构建重组质粒成功率与序列有关。近年来，Bitinaite等人发现了一种新的构建重组质粒的方法，即利用USER(Uracil-SpecificExcision Reagent)酶产生粘性末端，将多个DNA片段“无缝”连接，然后插入载体中。这一方法的缺点是需要特定的载体pNEB206A。
发明内容：
本发明的目的在于提供了一种非限制性构建无缝质粒表达载体的方法，该方法实现了将目的DNA片段插入任何质粒载体或置换质粒载体的任何部位，在构建融合基因后确保融合基因开放阅读框的正确性；构建过程操作简单，构建重组质粒的效率高。
技术解决方案：
本发明是利用化学合成两对含有dU的PCR引物，用于分别放大目的DNA片段和质粒载体，然后使用USER酶酶切放大的目的DNA片段和质粒载体PCR产物使其末端产生互补的粘性末端，再将其产物的混合物转入感受态E.coli细胞，利用细胞内的重组机制产生所要的质粒。
方法步骤如下：
(1)依据目的片段的DNA序列和载体质粒的DNA序列，写出重组质粒的DNA序列；
(2)PCR引物设计：设计两对含有dU的PCR引物；
a.第一对引物用于扩增目的DNA片段：
设计方法是根据重组质粒DNA序列在插入目的DNA片段与质粒载体之间5′端和3′端靠近接缝处各找一长度为6-11个碱基序列作为5′粘性末端搭接区和3′粘性末端搭接区；5′粘性末端搭接区和3′粘性末端搭接区是第一个碱基为A，最后一个碱基为T的DNA序列；设计正向引物使其5′端的DNA序列与5′粘性末端搭接区一致，正向引物对应粘性末端搭接区3′T的位置用dU替换，正向引物其它部分的DNA序列需跨入目的片段部位DNA序列至少10个碱基，与其一致；设计反向引物使其5′端的DNA序列与3′粘性末端搭接区反向互补，反向引物对应粘性末端搭接区5′A互补的位置的T用dU替换，反向引物其余部分的DNA序列需跨入目的片段部位DNA序列至少10个碱基，与其反向互补；
b.第二对引物是用来扩增质粒载体：
正向引物设计方法是使其5′端的DNA序列与3′粘性末端搭接区一致，正向引物对应粘性末端搭接区3′T的位置用dU替换，正向引物其它部分的DNA序列需跨入质粒载体部位DNA序列至少10个碱基，与其一致；设计反向引物使其5′端的DNA序列与5′粘性末端搭接区反向互补，反向引物对应粘性末端搭接区5′A互补的位置的T用dU替换，反向引物其余部分的DNA序列需跨入质粒载体部位DNA序列至少10个碱基，与其反向互补；
(3)PCR扩增：使用上述设计的两对引物，分别以含有目的DNA片段的质粒和载体质粒作为模板，采用高保真度DNA聚合酶进行PCR扩增分别得到目的片段DNA和质粒载体DNA；PCR产物用1μl(20个酶活单位)Dpn I酶37℃水浴1-2h以去除模板DNA；
(4)用USER酶处理PCR产物：取1μl(10个酶活单位)USER酶加入步骤(3)Dpn I酶处理后的产物(无需纯化)中，37℃水浴1-2h后6-11个碱基的DNA片段会自动脱落，产生目的DNA片段和质粒载体相匹配的粘性末端；
(5)酶切产物转化感受态细胞：将酶切后目的DNA片段6μl与质粒载体2μl混合转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化的细胞涂到含抗生素的培养基平板上筛选阳性菌落。
(6)用菌落PCR方法鉴定阳性菌落，挑取阳性克隆子送测序中心测序。
本发明具有不受内切酶位点限制且无需酶连接，将目的DNA片段插入任何质粒载体或置换质粒载体的任何部位，无需额外加入任何碱基；在构建融合基因后确保融合基因开放阅读框的正确性；构建重组质粒成功率与序列无关；构建过程操作简单，构建重组质粒的效率高，最大程度上增加了质粒构建的灵活性、随意性及应用的广泛性。
附图说明：
图1是目的DNA片段电泳图。M为100bp Marker，1为空白对照，2-4为扩增片段；
图2是质粒载体电泳图。M为1kb Marker，1-2为扩增片段；
图3是重组质粒电泳图。M为1kb Marker，1-2为重组质粒；
图4是鉴定阳性克隆子电泳图。M为DL 3000Marker，1-6为扩增出的目的片段HIV gp41。
具体实施方式：
实例1：
目的：构建在大肠杆菌中表达HIV-1gp 41保守片段与BLS融合基因的载体，要求保持开放阅读框正确。
材料：载体质粒p1531携带有HIV-1外壳蛋白基因gp 41、质粒pET-28a-BLS是大肠杆菌表达载体携带有BLS编码蛋白基因(以上两质粒均来自本实验室质粒库)、高保真度DNA聚合酶(Pfu)、dNTP、10×Buffer、Dpn I、DNA Marker(以上试剂均购自TaKaRa Biotechnology)，USER酶(购自New England Bio Labs)，大肠杆菌DH5α用CaCl2法自制感受态。
方法：以pET-28a-BLS为基础，使用载体质粒p1531携带的HIV-1外壳蛋白基因gp 41替代pET-28a-BLS质粒中编码蛋白BLS前27个氨基酸的81个碱基。替代的结果将产生一个具有正确阅读框的HIV-1外壳蛋白gp 41基因与编码蛋白BLS基因的融合蛋白基因。为了获得正确的氨基酸序列，目的基因片段必须与质粒载体在接缝处衔接，不能引入其它序列。在pET-28a-BLS质粒的BLS基因和gp 41目的基因片段中，都未能找到可利用的酶切位点以实现这一基因融合。
1、引物的设计：根据目的基因片段和载体质粒的DNA序列，写出重组质粒的DNA序列；
5’端接缝
↓
载体序列：ATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGT
目的序列：GAGTGGGAGAGAGAAATTGACAATTACACAAAC
重组序列：ATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTGAGTGGGAGAGAGAAATTGACAATTACACAAAC
5’粘性末端搭接区
3’端接缝
↓
载体序列：TCCTTTAAAATCGCATTCATTCAGGCCC
目的序列：TTTTTACTGTGCTTTCTATAGTGAATAGA
重组序列：TTTTTACTGTGCTTTCTATAGTGAATAGATCCTTTAAAATCGCATTCATTCAGGCCC
3’粘性末端搭接区
所设计引物序列如下：
01(gp160-f)：AGCAAATGGGUGAGTGGGAGAGA
02(gp160-r)：AAAGGATCUATTCACTATAGAAA
03(pET-28a-f)：AGATCCTTUAAAATCGCATTCAT
04(pET-28a-r)：ACCCATTTGCUGTCCACCAGTCA
在两个接缝附近分别选AGCAAATGGGT和AGATCCTTT作为5′粘性末端搭接区和3′粘性末端搭接区。由此设计的引物01和02用于通过PCR放大目的DNA片段。其中引物01的5′端DNA序列与5′粘性末端搭接区一致，01引物对应粘性末端搭接区3′T的位置在化学合成时用dU替换，01引物其余部分的DNA序列与目的DNA片段一致；引物02的5′端DNA序列与3′粘性末端搭接区反向互补，02引物对应粘性末端搭接区5′A互补的位置的T在化学合成时用dU替换，02引物其余部分的DNA序列与目的DNA片段反向互补。设计的引物03和04用于通过PCR放大质粒载体，引物03的5′端的DNA序列与3′粘性末端搭接区一致，03引物对应粘性末端搭接区3′T的位置在化学合成时用dU替换，03引物其余部分的DNA序列与质粒载体一致；引物04的5′端DNA序列与5′粘性末端搭接区反向互补，04引物对应粘性末端搭接区5′A互补的位置的T在化学合成时用dU替换，04引物其余部分的DNA序列与质粒载体反向互补。粘性末端搭接区碱基数通常为6-11个。
2、PCR扩增：PCR的体积是25μl。两个PCR管中的底物分别是携带gp 41基因的质粒p1531(01/02做引物)和载体质粒pET-28a-BLS(03/04做引物)。先使用40℃退火温度放大10个循环，然后取1μl产物为模板，在60℃退火温度放大25个循环。
A、目的DNA片段PCR反应体系和程序为：
目的DNA片段的PCR反应体系(25μl体系)：
目的DNA片段的PCR反应程序：(先用退火温度为40℃扩增10个循环)
扩增结束后取1μl反应产物为模板，用退火温度为60℃，25个循环进行PCR扩增。反应体系和反应条件如下：
PCR反应体系(25μl体系)：
PCR反应程序：
B、质粒载体PCR反应体系和程序为：
质粒载体的PCR反应体系(25μl体系)：
质粒载体的PCR反应程序：(先用退火温度为40℃扩增10个循环)
扩增结束后取1μl反应产物为模板，用退火温度为60℃，25个循环进行PCR扩增。反应体系和反应条件如下：
PCR反应体系(25μl体系)：
PCR反应程序：
PCR扩增结束后，分别取p1531质粒和pET-28a-BLS质粒的PCR反应产物17μl加入1μl(20个酶活单位)Dpn I酶和2μl 10×Buffer 37℃水浴2h除去模板DNA。
3、用USER酶处理PCR产物：取1μl(10个酶活单位)USER酶加入上述步骤Dpn I酶处理后的产物(无需纯化)中，37℃水浴2h后6-11个碱基的DNA片段会自动脱落，产生目的DNA片段和质粒载体相匹配的粘性末端；
4、酶切产物转化感受态细胞：将酶切后目的DNA片段6μl与质粒载体2μl混合转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化的细胞涂到含卡那霉素的培养基平板上筛选阳性菌落。
5、用菌落PCR方法鉴定阳性菌落，挑取阳性克隆子送测序中心测序。
结果：
由于目的DNA片段采用了非限制性构建无缝质粒表达载体的构建方法，其片段中无限制性酶切位点，所以不能使用酶切的方法鉴定结果。先采用菌落PCR的方法进行结果初筛，将得到的阳性克隆子送山东省农业科学院甘心技术研究中心测序，序列均正确。
实例2：
目的：构建在大肠杆菌中表达猪型布鲁氏菌S2的外壳蛋白Omp31抗原决定簇与BLS融合基因的载体，要求保持开放阅读框正确。
材料：载体质粒pET 28a携带有猪型布鲁氏菌S2的外壳蛋白Omp31抗原决定簇基因、质粒pET-28a-BLS是大肠杆菌表达载体携带有BLS编码蛋白基因(以上两质粒均来自本实验室质粒库)、高保真度DNA聚合酶(Pfu)、dNTP、10×Buffer、Dpn I、DNA Marker(以上试剂均购自TaKaRa Biotechnology)，USER酶(购自New England Bio Labs)，大肠杆菌DH5α用CaCl2法自制感受态。
方法：以pET-28a-BLS为基础，使用载体质粒pET 28a携带的猪型布鲁氏菌S2的外壳蛋白Omp31抗原决定簇基因替代pET-28a-BLS质粒中编码蛋白BLS前27个氨基酸的81个碱基。替代的结果将产生一个具有正确阅读框的猪型布鲁氏菌S2的外壳蛋白Omp31抗原决定簇基因与编码蛋白BLS基因的融合蛋白基因。为了获得正确的氨基酸序列，目的基因片段必须与质粒载体在接缝处衔接，不能引入其它序列。在pET-28a-BLS质粒的BLS基因和pET 28a携带的Omp31抗原决定簇基因片段中，都未能找到可利用的酶切位点以实现这一基因融合。
1、引物的设计：根据目的基因片段和载体质粒的DNA序列，写出重组质粒的DNA序列。
5’端接缝
↓
载体序列：ATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGT
目的序列：TATGCCATCAACAACAACTGGACGCT
重组序列：ATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTTATGCCATCAACAACAACTGGACGCT
5’粘性末端搭接区
3’端接缝
↓
载体序列：TCCTTTAAAATCGCATTCATTCAGGCCC
目的序列：TTGACAATAGCTTCCTTGAGAGCAAGGTC
重组序列：TTGACAATAGCTTCCTTGAGAGCAAGGTCTCCTTTAAAATCGCATTCATTCAGGCCC
3’粘性末端搭接区
所设计引物序列如下：
01(omp31-f)：AGCAAATGGGUTATGCCATCAACAAC
02(omp31-r)：AAGGAGACCUTGCTCTCAAGGAAGC
03(pET 28a-BLS-f)：AGGTCTCCTUTAAAATCGCATTCAT
04(pET 28a-BLS-r)：ACCCATTTGCUGTCCACCAGTCA
在两个接缝附近分别选AGCAAATGGGT和AGGTCTCCTT做为5′粘性末端搭接区和3′粘性末端搭接区。由此设计的引物01和02用于通过PCR放大目的DNA片段；其中引物01的5′端DNA序列与5′粘性末端搭接区一致，01引物对应粘性末端搭接区3′T的位置在化学合成时用dU替换，01引物其余部分的DNA序列与目的DNA片段一致；引物02的5′端DNA序列与3′粘性末端搭接区反向互补，02引物对应粘性末端搭接区5′A互补的位置的T在化学合成时用dU替换，02引物其余部分的DNA序列与目的DNA片段反向互补。设计的引物03和04用于通过PCR放大质粒载体，引物03的5′端的DNA序列与3′粘性末端搭接区一致，03引物对应粘性末端搭接区3′T的位置在化学合成时用dU替换，03引物其余部分的DNA序列与质粒载体一致；引物04的5′端DNA序列与5′粘性末端搭接区反向互补，04引物对应粘性末端搭接区5′A互补的位置的T在化学合成时用dU替换，04引物其余部分的DNA序列与质粒载体反向互补。粘性末端搭接区碱基数通常为6-11个。
2、PCR扩增：PCR的体积是25μl。两个PCR管中的底物分别是携带Omp 31抗原决定簇基因的质粒pET 28a(01/02做引物)和载体质粒pET-28a-BLS(03/04做引物)。先使用40℃退火温度放大10个循环，然后取1μl产物为模板，在60℃退火温度放大25个循环。
A、目的DNA片段PCR反应体系和程序为：
目的DNA片段的PCR反应体系(25μl体系)：
目的DNA片段的PCR反应程序：(先用退火温度为40℃扩增10个循环)
扩增结束后取1μl反应产物为模板，用退火温度为60℃，25个循环进行PCR扩增。反应体系和反应条件如下：
PCR反应体系(25μl体系)：
PCR反应程序：
B、质粒载体PCR反应体系和程序为：
质粒载体的PCR反应体系(25μl体系)：
质粒载体的PCR反应程序：(先用退火温度为40℃扩增10个循环)
扩增结束后取1μl反应产物为模板，用退火温度为60℃，25个循环进行PCR扩增。反应体系和反应条件如下：
PCR反应体系(25μl体系)：
PCR反应程序：
PCR扩增结束后，分别取含Omp 31抗原决定簇基因质粒pET 28a和pET-28a-BLS质粒的PCR反应产物17μl加入1μl(20个酶活单位)Dpn I酶和2μl 10×Buffer 37℃水浴2h除去模板DNA。
3、用USER酶处理PCR产物：取1μl(10个酶活单位)USER酶加入上述步骤Dpn I酶处理后的产物(无需纯化)中，37℃水浴2h后6-11个碱基的DNA片段会自动脱落，产生目的DNA片段和质粒载体相匹配的粘性末端；
4、酶切产物转化感受态细胞：将酶切后目的DNA片段6μl与质粒载体2μl混合转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化的细胞涂到含卡那霉素的培养基平板上筛选阳性菌落。
5、用菌落PCR方法鉴定阳性菌落，挑取阳性克隆子送测序中心测序。
结果：
由于目的DNA片段采用了非限制性构建无缝质粒表达载体的构建方法，其片段中无限制性酶切位点，所以不能使用酶切的方法鉴定结果。先采用菌落PCR的方法进行结果初筛，将得到的阳性克隆子送山东省农业科学院甘心技术研究中心测序，序列均正确。
实例3：
目的：用HIV-1毒株WITO的相应区替代真核表达载体p1531所携带的HIV-1SF162外壳蛋白基因(Env)中的C3-C5编码区，要求开放阅读框正确。
材料：载体质粒p1531-WITO携带有HIV-1WITO外壳蛋白基因、基础质粒p1531-SF162携带有编码SF162的外壳蛋白基因(以上两质粒均来自本实验室质粒库)、高保真度DNA聚合酶(Pfu)、dNTP、10×Buffer、Dpn I、DNA Marker(以上试剂均购自TaKaRa Biotechnology)，USER酶(购自New England Bio Labs)，大肠杆菌DH5α用CaCl2法自制感受态。
方法：基础载体质粒携带有HIV-1SF162外壳蛋白基因(Env)。在将要构建的重组质粒中，基础载体质粒中SF162外壳蛋白基因的C3-C5区用另一HIV-1毒株WITO的相应区替代。替代的结果将产生一具有正确阅读框的HIV-1融合蛋白外壳基因。为了获得正确的氨基酸序列，目的基因片段必须与质粒载体在接缝处衔接。在基础质粒载体的Env基因C3-C5区和WITO的目的基因片段中，都未能找到可利用的酶切位点以实现这一基因融合。
1、引物的设计：根据目的基因片段和载体质粒的DNA序列，写出重组质粒的DNA序列。
5’端接缝
↓
目的片段GCCATAATAGGAGATATAAGAAAA
初始载体GTATACATATAGGACCGGGGAGAGCATTTTATACAACAGGT
重组质粒GTATACATATAGGACCGGGGAGAGCATTTTATACAACAGGTGCCATAATAGGAGATATAAGAAAA
5’粘性末端搭接区
3’端接缝
↓
目的片段-CAGTAGCCAGAACGAAACCTTCAGACCTGGAGGAGGAAATATGAAG
初始载体GACAATTGGAGAAGTGAATTAT
目的质粒-CAGTAGCCAGAACGAAACCTTCAGACCTGGAGGAGGAAATATGAAGGACAATTGGAGAAGTGAATTAT
3’粘性末端搭接区
所设计引物序列如下：
01(WITO-f)5’-ATACAACAGGUGCCATAATAGGAG
02(WITO-r)5’-AATTGTCCTUCATATTTCCTCCTCC
03(p1531-f)5’-AAGGACAATUGGAGAAGTGAATTAT
04(p1531-r)5’-ACCTGTTGTAUAAAATGCTCTCCC
在两个接缝附近分别选ATACAACAGGT和AAGGACAATT做为5′粘性末端搭接区和3′粘性末端搭接区。由此设计的引物01和02用于通过PCR放大目的DNA片段；其中引物01的5′端DNA序列与5′粘性末端搭接区一致，01引物对应粘性末端搭接区3′T的位置在化学合成时用dU替换，01引物其余部分的DNA序列与目的DNA片段一致；引物02的5′端DNA序列与3′粘性末端搭接区反向互补，02引物对应粘性末端搭接区5′A互补的位置的T在化学合成时用dU替换，02引物其余部分的DNA序列与目的DNA片段反向互补。设计的引物03和04用于通过PCR放大质粒载体，引物03的5′端的DNA序列与3′粘性末端搭接区一致，03引物对应粘性末端搭接区3′T的位置在化学合成时用dU替换，03引物其余部分的DNA序列与质粒载体一致；引物04的5′端DNA序列与5′粘性末端搭接区反向互补，04引物对应粘性末端搭接区5′A互补的位置的T在化学合成时用dU替换，04引物其余部分的DNA序列与质粒载体反向互补。粘性末端搭接区碱基数通常为6-11个。
2、PCR扩增：PCR的体积是25μl。两个PCR管中的底物分别是携带HIV-1WITO外壳蛋白基因质粒p1531-WITO(01/02做引物)和基础质粒p1531-SF162携带编码HIV-1SF162的外壳蛋白基因(03/04做引物)。先使用40℃退火温度放大10个循环，然后取1μl产物为模板，在60℃退火温度放大25个循环。
A、目的DNA片段PCR反应体系和程序为：
目的DNA片段的PCR反应体系(25μl体系)：
目的DNA片段的PCR反应程序：(先用退火温度为40℃扩增10个循环)
扩增结束后取1μl反应产物为模板，用退火温度为60℃，25个循环进行PCR扩增。反应体系和反应条件如下：
PCR反应体系(25μl体系)：
PCR反应程序：
B、质粒载体PCR反应体系和程序为：
质粒载体的PCR反应体系(25μl体系)：
质粒载体的PCR反应程序：(先用退火温度为40℃扩增10个循环)
扩增结束后取1μl反应产物为模板，用退火温度为60℃，25个循环进行PCR扩增。反应体系和反应条件如下：
PCR反应体系(25μl体系)：
PCR反应程序：
PCR扩增结束后，分别取p1531-WITO质粒和质粒p1531-SF162的PCR反应产物17μl加入1μl(20个酶活单位)Dpn I酶和2μl 10×Buffer 37℃水浴2h除去模板DNA。
3、用USER酶处理PCR产物：取1μl(10个酶活单位)USER酶加入上述步骤Dpn I酶处理后的产物(无需纯化)中，37℃水浴2h后6-11个碱基的DNA片段会自动脱落，产生目的DNA片段和质粒载体相匹配的粘性末端；
4、酶切产物转化感受态细胞：将酶切后目的DNA片段6μl与质粒载体2μl混合转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化的细胞涂到含氨苄青霉素的培养基平板上筛选阳性菌落。
5、用菌落PCR方法鉴定阳性菌落、挑取克隆子送测序中心测序。
结果：
由于目的基因片段采用了非限制性构建无缝质粒表达载体的构建方法，其片段中无限制性酶切位点，所以不能使用酶切的方法鉴定结果。先采用菌落PCR的方法进行结果初筛，将得到的阳性克隆子送山东省农业科学院甘心技术研究中心测序，序列均正确。
Claims (2)
1.非限制性构建无缝质粒表达载体的方法，包括如下步骤：
(1)依据目的片段的DNA序列和载体质粒的DNA序列，写出重组质粒的DNA序列；
(2)PCR引物设计：设计两对含有dU的PCR引物；
a.第一对引物用于扩增目的DNA片段：
设计方法是根据重组质粒DNA序列在插入目的DNA片段与质粒载体之间5′端和3′端靠近接缝处各找一长度为6-11个碱基序列作为5′粘性末端搭接区和3′粘性末端搭接区；5′粘性末端搭接区和3′粘性末端搭接区是第一个碱基为A，最后一个碱基为T的DNA序列；设计正向引物使其5′端的DNA序列与5′粘性末端搭接区一致，正向引物对应粘性末端搭接区3′T的位置用dU替换，正向引物其它部分的DNA序列需跨入目的片段部位DNA序列至少10个碱基，与其一致；设计反向引物使其5′端的DNA序列与3′粘性末端搭接区反向互补，反向引物对应粘性末端搭接区5′A互补的位置的T用dU替换，反向引物其余部分的DNA序列需跨入目的片段部位DNA序列至少10个碱基，与其反向互补；
b.第二对引物是用来扩增质粒载体：
正向引物设计方法是使其5′端的DNA序列与3′粘性末端搭接区一致，正向引物对应粘性末端搭接区3′T的位置用dU替换，正向引物其它部分的DNA序列需跨入质粒载体部位DNA序列至少10个碱基，与其一致；设计反向引物使其5′端的DNA序列与5′粘性末端搭接区反向互补，反向引物对应粘性末端搭接区5′A互补的位置的T用dU替换，反向引物其余部分的DNA序列需跨入质粒载体部位DNA序列至少10个碱基，与其反向互补；
(3)PCR扩增：使用上述设计的两对引物，分别以含有目的DNA片段的质粒和载体质粒作为模板，采用高保真度DNA聚合酶进行PCR扩增，目的DNA片段和载体DNA片段的PCR反应体系为25μl体系：10×扩增缓冲液2.5μl；DNA模板1μl；浓度为10mM的dNTPMIX0.5μl；浓度为10μM的上游引物1μl；浓度为10μM的下游引物1μl；高保真酶Pfu：1μl即为2.5个酶活单位；ddH2O18μl；其反应程序为：首先对目的DNA和质粒载体DNA进行退火温度为40℃1min扩增10个循环，具体步骤如下：预变性95℃5min；从95℃1min；40℃1min；72℃45s开始循环共扩增10次；然后72℃10min；扩增结束后取1μl反应产物为模板，反应体系同上，用退火温度为60℃1min扩增25个循环，具体步骤如下：预变性95℃5min；从95℃1min；60℃1min；72℃45s开始循环共扩增25次；然后72℃10min；PCR反应结束后分别得到目的片段DNA和质粒载体DNA；PCR产物用20个酶活单位的Dpn I酶37℃水浴1-2h以去除模板DNA；
(4)用USER酶处理步骤(3)产物：取10个酶活单位的USER酶加入步骤(3)Dpn I酶处理后无需纯化的产物中，37℃水浴1-2h后6-11个碱基的DNA片段会自动脱落，产生目的DNA片段和质粒载体相匹配的粘性末端；
(5)将步骤(4)得到的具有粘性末端的目的DNA片段和质粒载体的混合物按体积比3∶1的比例混合转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化的细胞涂到含抗生素的培养基平板上筛选阳性菌落；
(6)用菌落PCR方法鉴定阳性菌落，挑取阳性克隆子送测序中心测序。
2.根据权利要求1所述的非限制性构建无缝质粒表达载体的方法，其特征在于，将目的DNA片段插入任何质粒载体或置换质粒载体的任何部位构建重组质粒。
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| Lindhal,T.等.DNA N-glycosidases-properties of uracil-DNA glycosidase from Escherichia coli.《J.Biol.Chem.》.1977,第252卷(第10期),第3286-3294页. |
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