CN109355369B - 用于检测酒精代谢基因多态性的引物组、试剂盒及其应用 - Google Patents

用于检测酒精代谢基因多态性的引物组、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酒精代谢基因多态性检测引物组，包括：(1)针对ADH1B基因(rs1229984，c.143G>A)多态性位点的检测引物：如SEQ ID No.1所示的上游引物、SEQ ID No.2所示的下游引物和SEQ ID No.3所示的探针；(2)针对ALDH2基因(rs671，c.1510G>A)多态性位点的检测引物：如SEQ ID No.4所示的上游引物、SEQ ID No.5所示的下游引物和SEQ ID No.6所示的探针；(3)针对GABRA2基因(rs279845，c.255+4909A>T)多态性位点的检测引物：如SEQ ID No.7所示的上游引物、SEQ ID No.8所示的下游引物和SEQ ID No.9所示的探针。本发明还公开了检测引物组的用途及一种酒精代谢基因多态性检测试剂盒。本发明提供的检测引物可在单管PCR体系中同时完成三个位点的基因分型，操作简单方便，特异性强，灵敏度高，准确性高，结果易于判读。

Description

用于检测酒精代谢基因多态性的引物组、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及基因分型技术领域，尤其是一种用于检测酒精代谢基因多态性的引物组、试剂盒及其应用。
背景技术
乙醇本身并不是致癌物质，但是它的主要代谢产物-乙醛，被认为是乙醇的代谢产物中对人体致癌性最强的物质，已被国际癌症研究机构定义为人类I类致癌物。
研究发现当乙醇被摄入人体后，其先被乙醇脱氢酶代谢为乙醛，然后乙醛又被乙醛脱氢酶氧化为乙酸。乙醇脱氢酶-1B(ADH1B)和乙醛脱氢酶2(ALDH2)的活性分别决定了人体中乙醇转化为乙醛和乙醛转化为乙酸的效率。ADH1B基因在第3外显子处变异(rs1229984，c.143G>A)，由野生等位基因GG型变异为GA杂合型和AA纯合突变型均可增加酶活性；而ALDH2基因第12外显子处变异(rs671，c.1510G>A)由野生等位基因GG型变异为GA杂合型和AA纯合突变型，可显著降低酶活性，是个体间乙醇代谢差异主要遗传影响因子。
再者，已有研究表明GABRA2与酒精依赖密切相关，编码GABRA2的基因位于染色体4p12，不同GABRA2基因型(rs279845，c.255+4909A>T，表示编码区第255个碱基后的第4909个内含子位置的碱基A突变为T)，其酒精成瘾风险不同，基因型AA和AT人群酒精成瘾风险较高，基因型TT人群酒精成瘾风险较低。
另外，ALDH在硝酸甘油生物转化过程中起重要作用，线粒体ALDH2是使硝酸甘油活化并释放NO的关键酶。研究数据表明rs671位点野生型基因GG患者硝酸甘油治疗心绞痛的疗效明显优于杂合型基因GA和纯合突变型基因AA患者。
由此可见，通过检测ADH1B、ALDH2和GABRA2基因多态性，对人群进行基因分型，可以从分子水平评估个体对酒精代谢程度和对酒精的成瘾程度，同时可预测硝酸甘油治疗心绞痛的疗效。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种酒精代谢基因多态性检测引物组，其在用于酒精代谢基因多态性检测时具有可在单管PCR体系中同时完成ADH1B基因(rs1229984，c.143G>A)多态性位点、ALDH2基因(rs671，c.1510G>A)多态性位点和GABRA2基因(rs279845，c.255+4909A>T)多态性位点三个位点的基因分型，具有操作简单方便，特异性强，灵敏度高，准确性高等优点。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：在第一个方面，本发明提供了一种酒精代谢基因多态性检测引物组，包括以下引物：
(1)针对ADH1B基因(rs1229984，c.143G>A)多态性位点的检测引物：如SEQ IDNo.1所示的上游引物、SEQ ID No.2所示的下游引物和SEQ ID No.3所示的探针；
(2)针对ALDH2基因(rs671，c.1510G>A)多态性位点的检测引物：如SEQ ID No.4所示的上游引物、SEQ ID No.5所示的下游引物和SEQ ID No.6所示的探针；
(3)针对GABRA2基因(rs279845，c.255+4909A>T)多态性位点的检测引物：如SEQID No.7所示的上游引物、SEQ ID No.8所示的下游引物和SEQ ID No.9所示的探针；
所述SEQ ID No.3所示的探针、SEQ ID No.6所示的探针和SEQ ID No.9所示的探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有非荧光淬灭基团。
其中，引物和探针具体的碱基序列如下所示：
ADH1B rs1229984引物F：
AGGGAAGGTAGAGAAGGGCTTT(SEQ ID No.1)；
ADH1B rs1229984引物R：
AACCACACGTGTTCCCTGAG(SEQ ID No.2)；
ADH1B rs1229984探针P：
5’ROX-CTGTAGGAATCTGTCGCACATATGACCACGT-3’BHQ2(SEQ ID No.3)；
ALDH2rs671引物F：
GTCACCCTTTGGTGGCTACA(SEQ ID No.4)；
ALDH2rs671引物R：
AGGCTGGGTCTTTACCCTCT(SEQ ID No.5)；
ALDH2rs671探针P：
5’CY5-AGGCATACACTGAAGGGAAAACTGTG-3’BHQ2(SEQ ID No.6)；
GABRA2rs279845引物F：
TGCCATGTTTGTCACAGGTT(SEQ ID No.7)；
GABRA2rs279845引物R：
GGCTAAGAAGCAGGCAGTCT(SEQ ID No.8)；
GABRA2rs279845探针P：
5’FAM-AGTAGCTTCTGGAGATTCTAAGAGATAAT-3’BHQ1(SEQ ID No.9)。
优选地，所述SEQ ID No.3所示的探针5’端连接的荧光报告基团为ROX，3’端连接的非荧光淬灭基团为BHQ2；
所述SEQ ID No.6所示的探针5’端连接的荧光报告基团为CY5，3’端连接的非荧光淬灭基团为BHQ2；
所述SEQ ID No.9所示的探针5’端连接的荧光报告基团为FAM，3’端连接的非荧光淬灭基团为BHQ1。
优选地，所述引物组的工作浓度为：SEQ ID No.1所示的上游引物0.01-0.15umol/L、SEQ ID No.2所示的下游引物0.1-1.5umol/L、SEQ ID No.3所示的探针0.02-0.6umol/L；
SEQ ID No.4所示的上游引物0.01-0.15umol/L、SEQ ID No.5所示的下游引物0.2-3.0umol/L、SEQ ID No.6所示的探针0.05-0.7umol/L；
SEQ ID No.7所示的上游引物0.02-0.3umol/L、SEQ ID No.8所示的下游引物0.2-3.0umol/L、SEQ ID No.9所示的探针0.01-0.2umol/L。
在第二个方面，本发明提供了第一个方面的检测引物组在制备酒精代谢基因多态性检测试剂中的用途。
在第三个方面，本发明提供了一种酒精代谢基因多态性检测试剂盒，包含第一个方面的检测引物组。
优选地，所述试剂盒还包含以下组分：PCR缓冲液、Mg2+、dNTPs和DNA聚合酶；所述PCR缓冲液包含Tris-HCl和KCl。更优选地，所述PCR缓冲液的pH值为8.2-9.3；优选地，所述Mg2+由MgCl2提供；优选地，所述dNTPs包含dATP、dGTP、dTTP和dCTP，且所述dATP、dGTP、dTTP和dCTP的浓度相同。
优选地，所述组分反应时的终浓度为：Tris-HCl 1-25mmol/L、KCl15-90nmol/L、Mg2+1.3-5.8mmol/L、dNTPs 0.16-0.7mmol/L和DNA聚合酶0.02-0.28U/ul。
优选地，各组分反应时的终浓度为：Tris-HCl 10mmol/L、KCl 50nmol/L、Mg2+3.75mmol/L、dNTPs 0.3125mmol/L、SEQ ID No.1所示的上游引物0.025umol/L、SEQ IDNo.2所示的下游引物0.25umol/L、SEQ ID No.3所示的探针0.1umol/L、SEQ ID No.4所示的上游引物0.025umol/L、SEQ ID No.5所示的下游引物0.5umol/L、SEQ ID No.6所示的探针0.25umol/L、SEQ ID No.7所示的上游引物0.05umol/L、SEQ ID No.8所示的下游引物0.5umol/L、SEQ ID No.9所示的探针0.025umol/L和DNA聚合酶0.05U/ul。
优选地，所述试剂盒的检测程序为：95℃3min；10个循环：95℃15s、64℃30s、72℃30s；40个循环：95℃15s、54℃30s(收集荧光)、72℃30s；1个循环：95℃3min、50℃2min；1个循环：50℃1min、80℃15s(收集荧光，升温速率0.06℃/s)。需要说明的是，采用上述PCR扩增程序是因为不对称PCR中，上下游引物的浓度比例差距很大，会导致PCR扩增效率降低，因此发明人首先设计一个具有较高退火温度的扩增步骤以保证三个基因ADH1B、ALDH2，GABRA2的特异性扩增，特别是ADH1B在人基因组中有序列同源性较高的基因，需要比较高的退火温度才能保证特异性的扩增，然后在保证序列特异性扩增的提前下，降低退火温度至PCR扩增效率能达到的最佳值(同时收集荧光信号)，以尽可能的获得更多的单链目标DNA，最后通过变性杂交使目标DNA序列与探针结合，进行熔解曲线分析，实现准确判断基因分型结果。
优选地，所述试剂盒在用于检测时的结果判断标准为：
(1)ADH1B基因(rs1229984，c.143G>A)多态性位点野生型：Ct值小于32；Tm值：71.96±0.99℃，单峰；
(2)ADH1B基因(rs1229984，c.143G>A)多态性位点杂合突变型：Ct值小于32；Tm值：(71.96±0.99℃)/(66.31±0.99℃)，双峰；
(3)ADH1B基因(rs1229984，c.143G>A)多态性位点纯合突变型：Ct值小于32；Tm值：66.31±0.99℃，单峰；
(4)ALDH2基因(rs671，c.1510G>A)多态性位点野生型：Ct值小于32；Tm值：68.83±0.99℃，单峰；
(5)ALDH2基因(rs671，c.1510G>A)多态性位点杂合突变型：Ct值小于32；Tm值：(68.83±0.99℃)/(64.13±0.99℃)，双峰；
(6)ALDH2基因(rs671，c.1510G>A)多态性位点纯合突变型：Ct值小于32；Tm值：64.13±0.99℃，单峰；
(7)GABRA2基因(rs279845，c.255+4909A>T)多态性位点野生型：Ct值小于32；Tm值：64.99±0.99℃，单峰；
(8)GABRA2基因(rs279845，c.255+4909A>T)多态性位点杂合突变型：Ct值小于32；Tm值：(64.99±0.99℃)/(60.24±0.99℃)，双峰；
(9)GABRA2基因(rs279845，c.255+4909A>T)多态性位点纯合突变型：Ct值小于32；Tm值：60.24±0.99℃，单峰。
综上所述，本发明的有益效果为：
本发明采用“多重不对称PCR技术”进行扩增，再通过熔解曲线分析，根据熔解曲线特定的Tm值进行基因分型，可在单管PCR体系中同时完成ADH1B基因(rs1229984，c.143G>A)多态性位点、ALDH2基因(rs671，c.1510G>A)多态性位点和GABRA2基因(rs279845，c.255+4909A>T)多态性位点三个位点的基因分型，操作简单方便，特异性强，灵敏度高，准确性高，闭管操作，有效防止产物污染，结果易于判读；可从分子水平评估个体对酒精的代谢能力，根据相关酶的活性程度指导个体性用药，并可预测个体酒精成瘾风险以及硝酸甘油治疗心绞痛的疗效险。
附图说明
图1为本发明试剂盒对ADH1B基因(rs1229984，c.143G>A)多态性位点野生型样本的检测结果图；
图2为本发明试剂盒对ADH1B基因(rs1229984，c.143G>A)多态性位点杂合突变型样本的检测结果图；
图3为本发明试剂盒对ADH1B基因(rs1229984，c.143G>A)多态性位点纯合突变型样本的检测结果图；
图4为本发明试剂盒ALDH2基因(rs671，c.1510G>A)多态性位点野生型样本的检测结果图；
图5为本发明试剂盒ALDH2基因(rs671，c.1510G>A)多态性位点杂合突变型样本的检测结果图；
图6为本发明试剂盒对ALDH2基因(rs671，c.1510G>A)多态性位点纯合突变型样本的检测结果图；
图7为本发明试剂盒GABRA2基因(rs279845，c.255+4909A>T)多态性位点野生型样本的检测结果图；
图8为本发明试剂盒GABRA2基因(rs279845，c.255+4909A>T)多态性位点杂合突变型样本的检测结果图；
图9为本发明试剂盒对GABRA2基因(rs279845，c.255+4909A>T)多态性位点纯合突变型样本的检测结果图。
具体实施方式
本发明中为了得到多色探针熔解曲线，使用了荧光PCR技术、不对称PCR技术、多重PCR技术及熔解曲线分析技术，以实现同一管PCR反应同时检测多个基因突变类型(本发明中为3个多态性位点)。本发明的检测方法具有操作简单、灵敏度高、特异性高、成本低的特点。与现有技术相比，本发明中引物探针序列不同、PCR反应体系不同、PCR程序不同，能在同一管PCR反应中同时检测3个多态性位点，而且结果判读方式不同。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
实施例1
本发明的酒精代谢基因多态性检测引物组的一种实施例，包括以下引物：
(1)针对ADH1B基因(rs1229984，c.143G>A)多态性位点的检测引物：如SEQ IDNo.1所示的上游引物、SEQ ID No.2所示的下游引物和SEQ ID No.3所示的探针；
(2)针对ALDH2基因(rs671，c.1510G>A)多态性位点的检测引物：如SEQ ID No.4所示的上游引物、SEQ ID No.5所示的下游引物和SEQ ID No.6所示的探针；
(3)针对GABRA2基因(rs279845，c.255+4909A>T)多态性位点的检测引物：如SEQID No.7所示的上游引物、SEQ ID No.8所示的下游引物和SEQ ID No.9所示的探针；
其中，SEQ ID No.3所示的探针5’端连接的荧光报告基团为ROX，3’端连接的非荧光淬灭基团为BHQ2；
SEQ ID No.6所示的探针5’端连接的荧光报告基团为CY5，3’端连接的非荧光淬灭基团为BHQ2；
SEQ ID No.9所示的探针5’端连接的荧光报告基团为FAM，3’端连接的非荧光淬灭基团为BHQ1。
引物和探针具体的碱基序列如下所示：
ADH1B rs1229984引物F：
AGGGAAGGTAGAGAAGGGCTTT(SEQ ID No.1)
ADH1B rs1229984引物R：
AACCACACGTGTTCCCTGAG(SEQ ID No.2)
ADH1B rs1229984探针R：
5’ROX-CTGTAGGAATCTGTCGCACATATGACCACGT-3’BHQ2(SEQ ID No.3)
ALDH2rs671引物F：
GTCACCCTTTGGTGGCTACA(SEQ ID No.4)
ALDH2rs671引物R：
AGGCTGGGTCTTTACCCTCT(SEQ ID No.5)
ALDH2rs671探针R：
5’CY5-AGGCATACACTGAAGGGAAAACTGTG-3’BHQ2(SEQ ID No.6)
GABRA2rs279845引物F：
TGCCATGTTTGTCACAGGTT(SEQ ID No.7)
GABRA2rs279845引物R：
GGCTAAGAAGCAGGCAGTCT(SEQ ID No.8)
GABRA2rs279845探针F：
5’FAM-AGTAGCTTCTGGAGATTCTAAGAGATAAT-3’BHQ1(SEQ ID No.9)。
实施例2
本发明的酒精代谢基因多态性检测试剂盒的一种实施例，包括实施例1的引物组，以及以下组分：PCR缓冲液、Mg2+、dNTPs和DNA聚合酶；PCR缓冲液包含Tris-HCl和KCl，dNTPs包含dATP、dGTP、dTTP和dCTP。
其中，dATP、dGTP、dTTP和dCTP的浓度相同；PCR缓冲液的pH值为8.2-9.3；Mg2+由MgCl2提供；其它组分用于PCR反应时的终浓度为：Tris-HCl 1-25mmol/L、KCl 15-90nmol/L、Mg2+1.3-5.8mmol/L、dNTPs 0.16-0.7mmol/L和DNA聚合酶0.02-0.28U/ul；
引物组的工作浓度为：SEQ ID No.1所示的上游引物0.01-0.15umol/L、SEQ IDNo.2所示的下游引物0.1-1.5umol/L、SEQ ID No.3所示的探针0.02-0.6umol/L；
SEQ ID No.4所示的上游引物0.01-0.15umol/L、SEQ ID No.5所示的下游引物0.2-3.0umol/L、SEQ ID No.6所示的探针0.05-0.7umol/L；
SEQ ID No.7所示的上游引物0.02-0.3umol/L、SEQ ID No.8所示的下游引物0.2-3.0umol/L、SEQ ID No.9所示的探针0.01-0.2umol/L。
实施例3利用实施例2的试剂盒对酒精代谢基因多态性进行检测
1、反应体系配置：按照表1所示的组分和组分终浓度配置反应体系。
表1反应体系
Figure BDA0001845287580000091
Figure BDA0001845287580000101
2反应程序
PCR反应程序如表2所示：
表2反应程序
Figure BDA0001845287580000102
3、结果判断标准
本发明试剂盒可在单管PCR体系中同时完成ADH1B基因(rs1229984，c.143G>A)多态性位点、ALDH2基因(rs671，c.1510G>A)多态性位点和GABRA2基因(rs279845，c.255+4909A>T)多态性位点三个位点的基因分型检测，检测结果判断标准如下：
(1)ADH1B基因(rs1229984，c.143G>A)多态性位点野生型：Ct值小于32；Tm值：71.96±0.99℃，单峰；
(2)ADH1B基因(rs1229984，c.143G>A)多态性位点杂合突变型：Ct值小于32；Tm值：(71.96±0.99℃)/(66.31±0.99℃)，双峰；
(3)ADH1B基因(rs1229984，c.143G>A)多态性位点纯合突变型：Ct值小于32；Tm值：66.31±0.99℃，单峰；
(4)ALDH2基因(rs671，c.1510G>A)多态性位点野生型：Ct值小于32；Tm值：68.83±0.99℃，单峰；
(5)ALDH2基因(rs671，c.1510G>A)多态性位点杂合突变型：Ct值小于32；Tm值：(68.83±0.99℃)/(64.13±0.99℃)，双峰；
(6)ALDH2基因(rs671，c.1510G>A)多态性位点纯合突变型：Ct值小于32；Tm值：64.13±0.99℃，单峰；
(7)GABRA2基因(rs279845，c.255+4909A>T)多态性位点野生型：Ct值小于32；Tm值：64.99±0.99℃，单峰；
(8)GABRA2基因(rs279845，c.255+4909A>T)多态性位点杂合突变型：Ct值小于32；Tm值：(64.99±0.99℃)/(60.24±0.99℃)，双峰；
(9)GABRA2基因(rs279845，c.255+4909A>T)多态性位点纯合突变型：Ct值小于32；Tm值：60.24±0.99℃，单峰。
4、检测结果
采用上述反应体系、反应程序和结果判断标准对多个患者的ADH1B基因(rs1229984，c.143G>A)多态性位点、ALDH2基因(rs671，c.1510G>A)多态性位点和GABRA2基因(rs279845，c.255+4909A>T)多态性位点进行了检测，检测结果与测序结果均一致。其中代表性的基因分型结果如下：
某患者ADH1B基因(rs1229984，c.143G>A)多态性位点野生型检测结果如图1所示：扩增曲线平滑、呈“S”型，CT值为15.07；Tm值：71.88℃，单峰；判断为ADH1B基因(rs1229984，c.143G>A)rs1229984多态性位点野生型(GG)，检测结果与一代测序结果符合；
某患者ADH1B基因(rs1229984，c.143G>A)多态性位点杂合突变型检测结果如图2所示：扩增曲线平滑、呈“S”型，CT值为15.00；Tm值：66.24/71.95℃，双峰；判断为ADH1B基因(rs1229984，c.143G>A)rs1229984多态性位点杂合突变型(GA)，检测结果与一代测序结果符合；
某患者ADH1B基因(rs1229984，c.143G>A)多态性位点纯合突变型检测结果如图3所示：扩增曲线平滑、呈“S”型，CT值为15.43；Tm值：66.32℃，单峰；判断为ADH1B基因(rs1229984，c.143G>A)rs1229984多态性位点纯合突变型(AA)，检测结果与一代测序结果符合；
某患者ALDH2基因(rs671，c.1510G>A)多态性位点野生型检测结果如图4所示：扩增曲线平滑、呈“S”型，CT值为14.79；Tm值：68.64℃，单峰；判断为ALDH2基因(rs671，c.1510G>A)多态性位点野生型(GG)，检测结果与一代测序结果符合；
某患者ALDH2基因(rs671，c.1510G>A)多态性位点杂合突变型检测结果如图5所示：扩增曲线平滑、呈“S”型，CT值为14.82；Tm值：64.07/68.94℃，双峰；判断为ALDH2基因(rs671，c.1510G>A)多态性位点杂合突变型(GA)，检测结果与一代测序结果符合；
某患者ALDH2基因(rs671，c.1510G>A)多态性位点纯合突变型检测结果如图6所示：扩增曲线平滑、呈“S”型，CT值为14.95；Tm值：64.29℃，单峰；判断为ALDH2基因(rs671，c.1510G>A)多态性位点纯合突变型(AA)，检测结果与一代测序结果符合；
某患者GABRA2基因(rs279845，c.255+4909A>T)多态性位点野生型检测结果如图7所示：扩增曲线平滑、呈“S”型，CT值为14.26；Tm值：64.95℃，单峰；GABRA2基因(rs279845，c.255+4909A>T)多态性位点野生型(TT)，检测结果与一代测序结果符合；
某患者GABRA2基因(rs279845，c.255+4909A>T)多态性位点杂合突变型检测结果如图8所示：扩增曲线平滑、呈“S”型，CT值为18.67；Tm值：59.98/64.98℃，双峰；判断为GABRA2基因(rs279845，c.255+4909A>T)多态性位点杂合突变型(AT)，检测结果与一代测序结果符合；
某患者GABRA2基因(rs279845，c.255+4909A>T)多态性位点纯合突变型检测结果如图9所示：扩增曲线平滑、呈“S”型，CT值为14.80；Tm值：60.45℃，单峰；判断为GABRA2基因(rs279845，c.255+4909A>T)多态性位点纯合突变型(AA)，检测结果与一代测序结果符合。
实施例4反应体系和反应程序对检测结果的影响
(1)反应体系中Mg2+终浓度对检测结果的影响
PCR反应体系其他组分的终浓度同表1，反应程序同表2，在不同Mg2+终浓度下进行某患者ADH1B基因(rs1229984，c.143G>A)多态性位点检测。分别配置以下Mg2+终浓度的反应体系：1.3mmol/L、2.5mmol/L、3.4mmol/L、4.5mmol/L和5.8mmol/L。结果表明，当Mg2+在反应体系中的终浓度在1.3-5.8mmol/L时均能实现检测，其中，当Mg2+在反应体系中的终浓度为3.75mmol/L时，检测结果最佳。
(2)反应体系中dNTPs终浓度对检测结果的影响
PCR反应体系其他组分的终浓度同表1，反应程序同表2，在不同dNTPs终浓度下进行某患者ALDH2基因(rs671，c.1510G>A)多态性位点的检测。分别配置以下dNTPs终浓度的反应体系：0.16mmol/L、0.25mmol/L、0.3125mmol/L、0.4375mmol/L、0.55mmol/L和0.7mmol/L。结果表明，当dNTPs在反应体系中的终浓度在0.16～0.7mmol/L时均能实现检测，其中，当dNTPs在反应体系中的终浓度为0.3125mmol/L时，检测结果最佳。
(3)以GABRA2基因(rs279845，c.255+4909A>T)多态性位点为例，研究反应体系中上、下游引物比例对检测结果的影响
PCR反应体系其他组分的终浓度同表1，反应程序同表2，在不同上、下游引物终浓度比例下进行某患者GABRA2基因(rs279845，c.255+4909A>T)多态性位点的检测。分别配置某患者GABRA2基因(rs279845，c.255+4909A>T)多态性位点的上、下游引物终浓度不同比例的反应体系。结果表明，当某患者GABRA2基因(rs279845，c.255+4909A>T)多态性位点的上、下游引物在反应体系中的终浓度在(0.02：0.2)-(0.3：3.0)umol/L时均能实现检测，其中，当GABRA2基因(rs279845，c.255+4909A>T)的上、下游引物在反应体系中的终浓度比例为(0.05：0.5)umol/L时，检测结果最佳。
(4)与上述(1)～(3)类似，分别采用单因素试验研究了以下几个方面对检测结果的影响，结果表明：
当ADH1B基因(rs1229984，c.143G>A)多态性位点的探针在反应体系中的终浓度在0.02-0.6umol/L时均能实现检测，其中，当ADH1B基因(rs1229984，c.143G>A)多态性位点的探针在反应体系中的终浓度为0.1umol/L时，检测结果最佳。
当DNA聚合酶在反应体系中的终浓度在0.02-0.28U/ul时均能实现检测，其中，当DNA聚合酶在反应体系中的终浓度为0.05U/ul时，检测结果最佳。
当步骤2退火温度在58～68℃时均能实现检测，其中，当步骤2退火温度为64℃时，检测结果最佳。
当步骤3退火温度在53～57℃时均能实现检测，其中，当步骤3退火温度为54℃时，检测结果最佳。
当步骤4退火温度在45～55℃时均能实现检测，其中，当步骤4退火温度为50℃时，检测结果最佳。
类似地，经过单因素试验发现，SEQ ID No.1所示的上游引物0.01-0.15umol/L、SEQ ID No.2所示的下游引物0.1-1.5umol/L、SEQ ID No.3所示的探针0.02-0.6umol/L时，均能实现检测；
SEQ ID No.4所示的上游引物0.01-0.15umol/L、SEQ ID No.5所示的下游引物0.2-3.0umol/L、SEQ ID No.6所示的探针0.05-0.7umol/L时，均能实现检测；
SEQ ID No.7所示的上游引物0.02-0.3umol/L、SEQ ID No.8所示的下游引物0.2-3.0umol/L、SEQ ID No.9所示的探针0.01-0.2umol/L时，均能实现检测；
PCR缓冲液的pH值为8.2-9.3时，均能实现检测；
Tris-HCl 1-25mmol/L、KCl 15-90nmol/L时，均能实现检测。
综合分析上述单因素试验结果，PCR反应体系各个组分的最优终浓度如表1所示，PCR反应最优程序如表2所示。
另外，本发明是通过溶解曲线的Tm值判断基因型，因而Tm值是否稳定对本试剂盒的性能是最为关键的要素。通过以上单因素实验发现，在10*PCR Buffer(缓冲液)成分固定的条件下，反应体系中对溶解曲线Tm值影响最大的三个试剂成分分别是：镁离子、dNTPs和PCR缓冲液的pH值。因此，试剂配制前应特别关注镁离子、dNTPs和PCR缓冲液的pH值。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 江门市妇幼保健院
<120> 用于检测酒精代谢基因多态性的引物组、试剂盒及其应用
<130> 2018
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agggaaggta gagaagggct tt 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaccacacgt gttccctgag 20
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctgtaggaat ctgtcgcaca tatgaccacg t 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtcacccttt ggtggctaca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
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<212> DNA
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<400> 6
aggcatacac tgaagggaaa actgtg 26
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<211> 20
<212> DNA
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tgccatgttt gtcacaggtt 20
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ggctaagaag caggcagtct 20
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
agtagcttct ggagattcta agagataat 29

Claims (6)

1.一种酒精代谢基因多态性检测试剂盒，其特征在于，包含以下引物：
(1)针对ADH1B基因rs1229984，c.143G>A多态性位点的检测引物：如SEQ ID No.1所示的上游引物、SEQ ID No.2所示的下游引物和SEQ ID No.3所示的探针；
(2)针对ALDH2基因rs671，c.1510G>A多态性位点的检测引物：如SEQ ID No.4所示的上游引物、SEQ ID No.5所示的下游引物和SEQ ID No.6所示的探针；
(3)针对GABRA2基因rs279845，c.255+4909A>T多态性位点的检测引物：如SEQ ID No.7所示的上游引物、SEQ ID No.8所示的下游引物和SEQ ID No.9所示的探针；
所述SEQ ID No.3所示的探针、SEQ ID No.6所示的探针和SEQ ID No.9所示的探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有非荧光淬灭基团；
所述SEQ ID No.3所示的探针5’端连接的荧光报告基团为ROX，3’端连接的非荧光淬灭基团为BHQ2；
所述SEQ ID No.6所示的探针5’端连接的荧光报告基团为CY5，3’端连接的非荧光淬灭基团为BHQ2；
所述SEQ ID No.9所示的探针5’端连接的荧光报告基团为FAM，3’端连接的非荧光淬灭基团为BHQ1；
所述引物组的工作浓度为：SEQ ID No.1所示的上游引物0.01-0.15μmol/L、SEQ IDNo.2所示的下游引物0.1-1.5μmol/L、SEQ ID No.3所示的探针0.02-0.6μmol/L；
SEQ ID No.4所示的上游引物0.01-0.15μmol/L、SEQ ID No.5所示的下游引物0.2-3.0μmol/L、SEQ ID No.6所示的探针0.05-0.7μmol/L；
SEQ ID No.7所示的上游引物0.02-0.3μmol/L、SEQ ID No.8所示的下游引物0.2-3.0μmol/L、SEQ ID No.9所示的探针0.01-0.2μmol/L。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，还包含以下组分：PCR缓冲液、Mg2+、dNTPs和DNA聚合酶；所述PCR缓冲液包含Tris-HCl和KCl。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述组分反应时的终浓度为：Tris-HCl 1-25mmol/L、KCl 15-90nmol/L、Mg2+1.3-5.8mmol/L、dNTPs0.16-0.7mmol/L和DNA聚合酶0.02-0.28U/μl。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，各组分反应时的终浓度为：Tris-HCl 10mmol/L、KCl 50nmol/L、Mg2+3.75mmol/L、dNTPs0.3125mmol/L、SEQ ID No.1所示的上游引物0.025μmol/L、SEQ ID No.2所示的下游引物0.25μmol/L、SEQ ID No.3所示的探针0.1μmol/L、SEQ ID No.4所示的上游引物0.025μmol/L、SEQ ID No.5所示的下游引物0.5μmol/L、SEQ ID No.6所示的探针0.25μmol/L、SEQ ID No.7所示的上游引物0.05μmol/L、SEQID No.8所示的下游引物0.5μmol/L、SEQ ID No.9所示的探针0.025μmol/L和DNA聚合酶0.05U/μl。
5.根据权利要求1～4任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测程序为：95℃3min；10个循环：95℃15s、64℃30s、72℃30s；40个循环：95℃15s、54℃30s收集荧光、72℃30s；1个循环：95℃3min、50℃2min；1个循环：50℃1min、80℃15s，收集荧光，升温速率为0.06℃/s。
6.根据权利要求1～4任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在用于检测时的结果判断标准为：
(1)ADH1B基因rs1229984，c.143G>A多态性位点野生型：Ct值小于32；Tm值：71.96±0.99℃，单峰；
(2)ADH1B基因rs1229984，c.143G>A多态性位点杂合突变型：Ct值小于32；Tm值为71.96±0.99℃或者Tm值为66.31±0.99℃，双峰；
(3)ADH1B基因rs1229984，c.143G>A多态性位点纯合突变型：Ct值小于32；Tm值：66.31±0.99℃，单峰；
(4)ALDH2基因rs671，c.1510G>A多态性位点野生型：Ct值小于32；Tm值：68.83±0.99℃，单峰；
(5)ALDH2基因rs671，c.1510G>A多态性位点杂合突变型：Ct值小于32；Tm值为68.83±0.99℃或者Tm值为64.13±0.99℃，双峰；
(6)ALDH2基因rs671，c.1510G>A多态性位点纯合突变型：Ct值小于32；Tm值：64.13±0.99℃，单峰；
(7)GABRA2基因rs279845，c.255+4909A>T多态性位点野生型：Ct值小于32；Tm值：64.99±0.99℃，单峰；
(8)GABRA2基因rs279845，c.255+4909A>T多态性位点杂合突变型：Ct值小于32；Tm值为64.99±0.99℃或者Tm值为60.24±0.99℃，双峰；
(9)GABRA2基因rs279845，c.255+4909A>T多态性位点纯合突变型：Ct值小于32；Tm值：60.24±0.99℃，单峰。
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