CN1514019A

CN1514019A - 炭疽菌抗多菌灵的检测基因及其试剂盒

Info

Publication number: CN1514019A
Application number: CNA031318339A
Authority: CN
Inventors: 李红霞; 周明国; 王建新
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2003-06-10
Filing date: 2003-06-10
Publication date: 2004-07-21

Abstract

本发明是炭疽菌(Colletotrichum gloeosporiodies)抗多菌灵的检测基因及其检测试剂盒，专用于抗苯并咪唑类杀菌剂的炭疽菌的检测。基因是炭疽菌β－微管蛋白基因片段，包含需检测的抗药性突变位点。试剂盒包括10×PCR缓冲液、MgCl₂溶液、dNTP(Mixture)、上游引物CGR1和CGS2与下游引物CGrev、TaqDNA聚合酶。使用该试剂盒达到对抗多菌灵的炭疽菌的快速、简便、准确、灵敏的检测效果，与传统的检测方法——菌落直径法相比，准确率达95.71％。图为：引物CGR1/Cgrev对19个菌株的扩增结果电泳图。

Description

炭疽菌抗多菌灵的检测基因及其试剂盒

一、技术领域

本发明炭疽菌(Colletotrichum gloeosporiodies)抗多菌灵的检测基因及其检测试剂盒，属于植物病原菌生理小种的检测方法，专用于抗苯并咪唑类杀菌剂的炭疽菌的检测。

二、技术背景

炭疽菌能引起多种植物病害，严重影响作物的产量和品质。长期以来采用苯并咪唑类杀菌剂或以这类药剂为主的复配剂进行化学防治。苯并咪唑类杀菌剂作为一类高效、广谱内吸性杀菌剂在生产上应用，解决了保护性杀菌剂的环境毒性问题，提高了人类控制该病害的能力。苯并咪唑类杀菌剂包括多菌灵、苯菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵等。这些杀菌剂具有相同的抗菌谱和抗菌机制，他们也具有相同的抗药性机制，相互之间存在正交互抗药性。由于这类药剂的高度专化性，作用位点单一，加上施用频率高，使用2～3年后许多植物病原真菌群体中就会出现抗药性优势生理小种，使药剂防治完全失去效果。本专利发明人研究证明核盘菌对多菌灵的抗药性产生是因为细胞中β-微管蛋白基因发生突变，使编码的蛋白质三维构象改变，从而失去了与药剂分子的亲和性。近年研究证明，β-微管蛋白基因编码198或200位氨基酸的密码子发生点突变是导致大多数病原菌产生田间抗药性的主要原因。

早期检测病原群体中抗药性生理小种/抗药性基因的频率，及早实施抗药性治理策略，是延缓抗药性生理小种的发展，防止抗药性病害流行危害最有效的措施。传统的检测方法需要分离培养病原菌，然后在含药培养基上培养，再根据药剂对菌丝生长的效应鉴别抗药性。这种对药剂的敏感性测定方法通常需要几周时间，因为炭疽菌生长较慢，工作量大，测定样本数量有限，难以早期发现抗药性生理小种的存在，也不能用于当年的抗药性短期预测。在抗药性机制研究基础上，根据基因点突变的原理，应用核酸技术如ASO-PCR技术等检测病原真菌对多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂的抗药性则能快速、准确检测大量样本，使在早期检测低频率的抗药性基因成为可能。但现有技术中炭疽菌对多菌灵敏的敏感性测定方法通常需要几周时间，工作量大，测定样本数量有限，难以早期发现抗药性生理小种的存在，也不能用于当年的抗药性短期预测。目前还没有快速、准确的炭疽菌抗多菌灵的核酸检测技术。

三、发明内容

技术问题本发明的目的在于提供炭疽菌抗多菌灵的检测基因及其检测试剂盒。克服现有技术中炭疽菌对多菌灵敏的敏感性测定方法需要时间长，工作量大等缺陷，能快速、准确检测大量样本，检测准确率达到95％以上，对及时采取有效措施控制当季抗药性病害流行，具有实用价值。

技术方案

本发明炭疽菌抗多菌灵的检测基因及其检测试剂盒的技术方案是：

炭疽菌抗多菌灵的检测基因，长度为366 bp，相应的编码β-微管蛋白的第192～313位氨基酸，包含第198位氨基酸的抗药性突变位点(GAG→GCG)，序列见SEQ ID NO.1。

扩增获得上述炭疽菌抗多菌灵菌株的β-微管蛋白基因片段，根据其第198位氨基酸密码子的突变(GAG→GCG)，其引物序列如下：

上游引物CGR1(5’CTGGTCGAGAACTCGGACGC 3’)

CGS2(5’CTGGTCGAGAACTCGGACGA 3’)

下游引物CGrev(5’AGCAGGTCAGGTAGCGACCG 3’)

检测上述炭疽菌抗多菌灵β-微管蛋白基因的检测试剂盒，含有：

1)500mL 10×PCR缓冲液：100mM KCl，80mM(NH₄)₂SO₄，100mM Tris-HCl，pH9.0，0.05％(mg/L)NP-40；

2)400mL 25mM的MgCl₂溶液；

3)100mL 10mM的dNTP(Mixture)；

4)100mL 10μM的上游引物CGR1和CGS2/下游引物CGrev；

5)400U(5U/μL)TaqDNA聚合酶。

PCR扩增上述炭疽菌抗多菌灵β-微管蛋白基因的反应条件如下：

94℃ 3min，1个循环；

60℃ 45s，72℃ 45s，94℃ 35s，30个循环；

72℃延伸5min，1个循环；

4℃保存。

有益效果本发明炭疽菌抗多菌灵的检测基因及其检测试剂盒与现有其他技术相比，具有如下优点和积极效果：

1、本发明在已知炭疽菌抗多菌灵机制的研究基础上，根据基因点突变的原理，应用核酸技术如特异性等位基因寡核苷酸(ASO)-PCR技术等检测病原真菌对多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂的抗药性，则能快速、准确检测大量样本，使在早期检测低频率的抗药性基因成为可能。

2、本发明提供一段炭疽菌抗多菌灵的检测基因及其高效准确的检测试剂盒及扩增条件。应用该试剂盒可在3h、4h和6h内分别从分生孢子、菌丝和病叶中快速、简便、准确、灵敏的检测抗多菌灵的炭疽菌，灵敏度达到8～10ng基因组DNA，检测准确率与传统的检测方法-菌落直径法相比达95.71％以上。

3、步骤简单易操作，不需要太多复杂和高级仪器，这对于农科院和基层植保站的工作有重要意义。因为使用了特异性引物和PCR反应，所以可以达到很高的准确率和灵敏度，可以在3～6h内完成对样品的检测。

四、附图说明

图1引物CGR1/CGrev对19个菌株的扩增结果电泳图谱

M表Marker，1-19依次代表CM1、CM2、CM3、CM4、CM5、YC2、YC3、YC4、YC5、YC6、YC7、YC18、YC35、YC41、HT2、HT10、HK4、HK10、HK23，20以灭菌蒸馏水为对照。

图2引物CGS2/CGrev对19个菌株的扩增结果电泳图谱

图3引物CGR1/CGrev对11个菌株的nested-PCR扩增结果电泳图谱

M表Marker，1-11依次代表F17、F3、D18、C16、F16、R1、C4、F11、F6、S1、S2。

五、具体实施方式

实施例1：江苏省盐城地区炭疽菌(Colletotrichum gloeosporiodies)的特异性引物CGS2/CGrev和CGS2/CGrev的PCR扩增：

2001年从江苏省盐城地区采集辣椒炭疽病果实，室内常规组织分离，获得70个炭疽菌(Colletotrichum gloeosporiodies)菌株。根据植物病原丝状真菌田间抗多菌灵菌株β-微管蛋白198位氨基酸密码子的突变研究，设计了兼并性引物B1/B3[B1：5’-A(AG)AT(CT)ACCCA(CT)TC(CT)CT(CT)GGTGGTGG-3’，B3：5’-CTCCAT(CT)TC(AG)TCCAT(ACT)CC(CT)TC(AG)CC-3’]，分别扩增对多菌灵表现敏感和抗药性的炭疽菌，均得到了一条长度为600bp左右的PCR产物。将PCR产物直接用引物进行双向测序，获得586bp大小的片段。

应用DNAclub分子生物学软件，将所得的序列用BLAST与数据库中已报道序列进行同源性比较。比较炭疽菌对多菌灵表现敏感和抗药性菌株序列的差异，发现高抗菌株YC41的第161个碱基由A突变为C，相应的β-微管蛋白第198位氨基酸由Glu突变为Ala。根据突变位点设计了抗药性检测的特异性引物：

上游引物CGR1(5’CTGGTCGAGAACTCGGACGC 3’)

CGS2(5’CTGGTCGAGAACTCGGACGA 3’)

下游引物CGrev(5’AGCAGGTCAGGTAGCGACCG 3’)

使用本发明的试剂盒配方分别用引物对CGR1/CGrev和引物对CGS2/CGrev以炭疽菌的70个菌株的基因组DNA为模板，以灭菌蒸馏水为对照进行PCR扩增。50μL反应体系中含：①10ng基因组DNA为模板；②5μL 10×PCR缓冲液：10mM KCl，8mM(NH₄)₂SO₄，10mM Tris-HCl，pH9.0，0.05％(mg/L)NP-40；③MgCl₂溶液：2mM；④dNTP(Mixture)：0.2mM；⑤上游引物CGR1和CGS2/下游引物CGrev：各0.5μM；⑥TaqDNA聚合酶1U。PCR扩增条件：①94℃ 3min，1个循环；②60℃ 45s，72℃ 45s，94℃ 35s，30个循环；③72℃延伸5min，1个循环；④4℃保存。

炭疽菌高水平抗药性菌株用引物对CGR1/CGrev可以稳定地扩增得到分子量为366bp的特异性产物(图1)，相应的编码β-微管蛋白的第192～313位氨基酸，包含第198位氨基酸的抗药性突变位点(GAG→GCG)，其序列见SEQ ID NO.1。

而敏感菌株用引物对CGR1/CGrev时无扩增产物，但用引物对CGS2/CGrev可以稳定地扩增得到分子量为366bp的特异性产物(图2)。由图1和图2可知，检测的19个菌株中CM4、YC2、YC5、YC6、YC7、YC18、HT10、HK4、HK10属高水平抗药性菌株；而CM1、CM2、CM3、CM5、YC3、YC4、YC35、YC41、HT2、HK23属敏感菌株。与传统的抗药性检测方法-菌落直径法相比，检测准确率达95.71％。4h可完成检测，且检测灵敏度为10ng基因组DNA。

实施例2：炭疽病叶直接用特异性引物CGS2/CGrev和CGS2/CGrev的PCR扩增：

2002年从海南采集回来的具典型炭疽病症状的辣椒叶片直接用于抗药性检测。将每个病斑分成二部分，一部分用于分离培养后，采用菌落直径法进行抗药性检测；另一部分置于1.5mL的离心管中，加入500μL灭菌水90℃加热20min后，置于冰上冷却。取5μL液体(约5ng)作为摸板用引物B1和B3进行第一次扩增。使用本发明中的试剂盒配方，50μL反应体系中含5ng基因组DNA为模板，5μ L10×buffer(10mM Tris-HCl，50mM KCl，0.1％(mg/L)TritonX100)，MgCl₂ 2mM，TaqDNA聚合酶1U(上海Promga)，dNTP 0.2mM，引物各0.5μM。扩增条件：94℃ 5min，1个循环；65℃ 2min，72℃2min，94℃ 1min，30个循环；最后72℃延伸5min结束。

取5μL上述PCR产物作为第二次扩增的模板，用特异性引物CGR1/CGrev进行nested-PCR。使用本发明中的试剂盒配方，50μL反应体系中含：①10ng基因组DNA为模板；②5μL 10×PCR缓冲液：10mM KCl，8mM(NH₄)₂SO₄，10mM Tris-HCl，pH9.0，0.05％(mg/L)NP-40；③MgCl₂溶液：2mM；④dNTP(Mixture)：0.15mM；⑤上游引物CGR1和CGS2/下游引物CGrev：各0.25μM；⑥TaqDNA聚合酶1U。PCR扩增条件：①94℃ 3min，1个循环；②65℃45s，72℃ 45s，94℃ 35s，30个循环；③72℃延伸5min，1个循环；④4℃保存。结果见图3，说明F3、D18、C16、R1、C4、F11、F6。这种用nested-PCR的检测方法与菌落直径法相比、检测准确率达96.12％，且时间短，只需要6h即可完成，检测灵敏度为10ng基因组DNA。

实施例3：从炭疽菌(Colletotrichum gloeosporiodies)的分生孢子直接扩增

由于炭疽菌很容易在AEA培养基(甘油40mL，酵母20g，无水硫酸镁1g，硝酸钠12g，氯化钾1g，磷酸二氢钾3g，水1000mL)上产孢，因此可以将孢子用灭菌水稀释成107～108个孢子/mL，沸水浴5min，0℃冷却。使用本发明中的试剂盒配方，取5μL(约8ng)作为模板，用特异性引物对CGR1/CGrev和引物对CGS2/CGrev进行PCR扩增。50μL反应体系中含：①8ng基因组DNA为模板；②5μL 10×PCR缓冲液：10mM KCl，8mM(NH₄)₂SO₄，10mM Tris-HCl，pH9.0，0.05％(mg/L)NP-40；③MgCl₂溶液：2mM；④dNTP(Mixture)：0.25mM；⑤上游引物CGR1和CGS2/下游引物CGrev：各0.5μM；⑥TaqDNA聚合酶1.5U。PCR扩增条件：①94℃ 5min，1个循环；②65℃ 45s，72℃ 45s，94℃ 35s，40个循环；③72℃延伸5min，1个循环；④4℃保存。最后的PCR产物虽不如直接从基因组DNA中扩增的量多，但仍然能这种方法在3h内检测是否存在抗药性。若用引物对CGR1/CGrev进行PCR扩增时，有366bp的特异性产条带出现的菌株则为抗药性菌株；而用引物对CGS2/CGrev能扩增出366bp特异性产条带的为敏感菌株。这种方法的检测率可达96.64％，检测灵敏度为8ng基因组DNA。

tanjvjun[1].WorkFile

Organization Applicant

--------------------

Street：卫岗1号

City：南京

State：江苏

Country：中国

PostalCode：210095

PhoneNumber：025-4395725

FaxNumber：025-4396434

Emai 1Address：KJCCGK@NJAU.EDU.CN

<110>OrganizationName：南京农业大学

Application Project

-----------------

<120>Title：炭疽菌(Colletotrichum gloeosporiodies)抗多菌灵的检测基因及其检测试剂盒

<130>AppFileReference：

<140>CurrentAppNumber：

<141>CurrentFilingDate：2003-05-20

Sequece

---------

<213>OrganismName：Colletotrichum gloeosporiodies

<400>PreSequenceString：

ctggtcgaga actcggacgc gaccttctgc attgacaacg aggctctcta cgacatctgc 60

tccgcaccct caagctgtcc aacccctcgt acggcgacct gaaccacctc gtctccgccg 120

tcatgtccgg cgtctccacc tcgctgcgtt tccccggcca gctcaactct gatctgcgca 180

agctcgccgt caacatggtg cccttccccc gtctgcactt cttcatggtc ggcttcgctc 240

ccctgaccag ccgcggcgcc cactcctccc gcgccgtctc ggtccccgag ctcacccagc 300

agatgttcga ccccaagaac atgatggctg cctcggactt ccgcaacggt cgctacctga 360

cctgct 366

<212>Type：DNA

<211>Length：366

SequenceName：SEQ ID NO.1

SequenceDescription：

Feature

----------

Sequence：SEQ ID NO.1：

<221>FeatureKey：exon

<222>LocationFrom：1

<222>LocationTo：366

Other Information：

CDS Join：No

Custom Codon

------------

Sequence Name：SEQ ID NO.1

Claims

1、炭疽菌抗多菌灵的检测基因，其β-微管蛋白基因片段，长度为366bp，相应的编码β-微管蛋白的第192～313位氨基酸，包含第198位氨基酸的抗药性突变位点(GAG→GCG)，序列见SEQ ID NO.1。

2、检测权利要求1所述的炭疽菌抗多菌灵检测基因的试剂盒，其特征在于：

上游引物CGR1(5’CTGGTCGAGAACTCGGACGC 3’)

CGS2(5’CTGGTCGAGAACTCGGACGA 3’)

下游引物CGrev(5’AGCAGGTCAGGTAGCGACCG 3’)

试剂盒含有：

1)500mL 10×PCR缓冲液：100mM KCl，80mM(NH₄)₂SO₄，100mM

Tris-HCl，pH9.0，0.5％(mg/L)NP-40；

2)400mL 25mM的MgCl₂溶液；

3)100mL 10mM的dNTP(Mixture)；

4)100mL 10μM的上游引物CGR1和CGS2/下游引物CGrev；

5)400U(5U/μL)TaqDNA聚合酶。

3、根据权利要求2所述的炭疽菌抗多菌灵的检测试剂盒，其扩增反应条件如下：

94℃3min，1个循环；

60℃45s，72℃45s，94℃ 35s，30个循环；

72℃延伸5min，1个循环；

4℃保存。