CN118006686A - 一种全长小鼠ryr1基因外源性表达质粒及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒及其构建方法和应用，属于生物工程领域，解决了现有技术难以扩增得到全长RYR1基因，无法满足对于RYR1基因表达及功能的体外研究需要的问题。所示构建方法，包括将pcDNA3.1‑3Myc‑His质粒进行双酶切，得到线性化载体；获取小鼠RYR1基因片段，将基因片段分别连接到线性化载体中，构建含有基因片段的重组表达质粒；采用PCR扩增体系对含有基因片段的重组表达质粒进行扩增，得到PCR产物，采用电泳回收PCR产物，得到扩增后的RYR1基因片段；通过无缝克隆的方式将扩增后的RYR1基因片段连接到线性化载体上，构建得到全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒及其构建方法和应用。
背景技术
RYR1基因编码骨骼肌肌浆网上的I型兰尼碱受体，I型兰尼碱受体是由4个分子量约为560 kDa的亚基组成的同源四聚体，调节肌浆网内钙离子的释放，参与骨骼肌兴奋-收缩偶联过程。RYR1基因的遗传性突变与恶性高热、横纹肌溶解、中央轴空病等一系列神经肌肉疾病有关。
RYR1基因编码哺乳动物体内最大的钙通道蛋白，编码RYR1蛋白氨基酸的mRNA序列超过15kb。组织聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种常用的分子生物学技术，近年来用于检测和放大组织样本中的特定DNA或RNA序列，方法操作方便、实验室污染风险低；但是尽管现有各种PCR技术不断升级改良，然而现有技术手段仍很难从复杂的基因组中特异性扩增出超大片段的DNA，因而限制了对RYR1基因功能的研究；此外，随着合成生物学的不断发展，人类能够通过实验室手段在体外合成DNA序列，但限于扩增能力不足，合成DNA片段通常在3-4 kb，无法满足对于RYR1基因表达及功能的体外研究需要。因而，亟需提供一种RYR1基因表达质粒及其构建方法，可以用于全长RYR1基因的扩增。
发明内容
鉴于上述的分析，本发明实施例旨在提供一种全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒及其构建方法和应用，用以解决现有技术难以扩增得到全长RYR1基因，无法满足对于RYR1基因表达及功能的体外研究需要的问题。
本发明的目的主要是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒的构建方法，包括以下步骤：
S1：将pcDNA3.1-3Myc-His质粒通过HindIII和BamHI酶切质粒反应体系进行双酶切，得到线性化载体；
S2：获取小鼠RYR1基因片段RYR1-A、RYR1-B、RYR1-C和RYR1-D，将RYR1-A、RYR1-B、RYR1-C和RYR1-D分别连接到线性化载体中，分别构建含有RYR1-A基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-B基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-C基因片段的重组表达质粒和含有RYR1-D基因片段的重组表达质粒；
S3：采用PCR扩增体系对含有RYR1-A基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-B基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-C基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-D基因片段的重组表达质粒进行扩增，得到PCR产物，采用电泳回收PCR产物，得到扩增后的RYR1基因片段；
S4：通过无缝克隆的方式将扩增后的RYR1基因片段连接到线性化载体上，构建得到全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒。
进一步地，步骤S2包括以下步骤：
S21：获取小鼠骨骼肌组织RNA；
S22：小鼠骨骼肌组织RNA逆转录合成小鼠骨骼肌组织cDNA；
S23：以小鼠骨骼肌组织cDNA为模板，将小鼠全长RYR1基因分成4段，分别为RYR1-A、RYR1-B、RYR1-C和RYR1-D，经PCR反应分段扩增；
S24：通过同源重组的方式，分别将扩增后的RYR1-A、RYR1-B、RYR1-C、RYR1-D基因片段，连接到步骤S1中得到的线性化载体中，构建分别含有RYR1-A、RYR1-B、RYR1-C、RYR1-D的重组表达质粒。
进一步地，步骤S23中，
所述RYR1-A基因片段PCR反应的上游引物序列如SEQ ID No.3所示；
所述RYR1-A基因片段PCR反应的下游引物序列如SEQ ID No.4所示；
所述RYR1-B基因片段PCR反应的上游引物序列如SEQ ID No.5所示；
所述RYR1-B基因片段PCR反应的下游引物序列如SEQ ID No.6所示；
所述RYR1-C基因片段PCR反应的上游引物序列如SEQ ID No.7所示；
所述RYR1-C基因片段PCR反应的下游引物序列如SEQ ID No.8所示；
所述RYR1-D基因片段PCR反应的上游引物序列如SEQ ID No.9所示；
所述RYR1-D基因片段PCR反应的下游引物序列如SEQ ID No.10所示。
进一步地，步骤S24中，
所述含有RYR1-A基因片段的重组表达质粒序列如SEQ ID No.11所示；
所述含有RYR1-B基因片段的重组表达质粒序列如SEQ ID No.12所示；
所述含有RYR1-C基因片段的重组表达质粒序列如SEQ ID No.13所示；
所述含有RYR1-D基因片段的重组表达质粒序列如SEQ ID No.14所示。
进一步地，步骤S3中，
所述含有RYR1-A基因片段的重组表达质粒PCR反应的上游引物序列如SEQ IDNo.15所示；
所述含有RYR1-A基因片段的重组表达质粒PCR反应的下游引物序列如SEQ IDNo.16所示；
所述含有RYR1-B基因片段的重组表达质粒PCR反应的上游引物序列如SEQ IDNo.17所示；
所述含有RYR1-B基因片段的重组表达质粒PCR反应的下游引物序列如SEQ IDNo.18所示；
所述含有RYR1-C基因片段的重组表达质粒PCR反应的上游引物序列如SEQ IDNo.19所示；
所述含有RYR1-C基因片段的重组表达质粒PCR反应的下游引物序列如SEQ IDNo.20所示；
所述含有RYR1-D基因片段的重组表达质粒PCR反应的上游引物序列如SEQ IDNo.21所示；
所述含有RYR1-D基因片段的重组表达质粒PCR反应的下游引物序列如SEQ IDNo.22所示。
进一步地，步骤S4中，所述扩增后的RYR1基因片段包括用于同源重组的RYR1-A基因片段、用于同源重组的RYR1-B基因片段、用于同源重组的RYR1-C基因片段和用于同源重组的RYR1-D基因片段；
所述用于同源重组的RYR1-A基因片段序列如SEQ ID No.23所示；
所述用于同源重组的RYR1-B基因片段序列如SEQ ID No.24所示；
所述用于同源重组的RYR1-C基因片段序列如SEQ ID No.25所示；
所述用于同源重组的RYR1-D基因片段序列如SEQ ID No.26所示。
本发明还提供了一种全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒，根据上述的全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒的构建方法得到，所述全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒全长包括20599个碱基对，第1-10000位碱基如SEQ ID No.1所示，第10001-20599位碱基如SEQ IDNo.2所示。
本发明还提供了一种全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒的应用，根据上述全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒的构建方法得到的全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒在研究恶性高热发病机制上的应用。
本发明还提供了一种RYR1-p.Arg2509Cys质粒的构建方法，包括以下步骤：
步骤1：将pcDNA3.1-3Myc-His质粒通过HindIII和BamHI酶切质粒反应体系进行双酶切，得到线性化载体；
步骤2：获取小鼠RYR1基因片段RYR1-A、RYR1-B、RYR1-C和RYR1-D，将RYR1-A、RYR1-B、RYR1-C和RYR1-D分别连接到线性化载体中，分别构建含有RYR1-A基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-B基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-C基因片段的重组表达质粒和含有RYR1-D基因片段的重组表达质粒；
步骤3：设计引物在含有RYR1-B基因片段的重组表达质粒上引入点突变，使7525-7527位碱基序列由CGA突变为TGC；
步骤4：采用PCR扩增体系对含有RYR1-A基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-B基因片段（带突变位点）的重组表达质粒、含有RYR1-C基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-D基因片段的重组表达质粒进行扩增，得到PCR产物，采用电泳回收PCR产物，得到扩增后的RYR1基因片段；
步骤5：通过无缝克隆的方式将扩增后的RYR1基因片段连接到线性化载体上，构建得到带有突变位点的RYR1-p.Arg2509Cys质粒。
本发明提供了一种RYR1-p.Arg2509Cys质粒在模拟人类恶性高热实验模型的应用。
与现有技术相比，本发明至少可实现如下有益效果之一：
1、本发明提供了一种全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒及其构建方法和应用，该构建方法可获得RYR1基因的全长表达质粒，操作简易、可重复性强、蛋白表达量高、结果稳定，可以用于全长RYR1基因的扩增。
2、本发明的全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒及其构建方法，为实现RYR1基因的分子克隆、点突变实验提供了可能，可满足对于RYR1基因表达及功能的体外研究的需要以及基因突变在疾病模型中的应用。
3、本发明的全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒及其构建方法，通过在小鼠RYR1基因表达质粒上做点突变引入相应的突变位点，构建了RYR1-p.Arg2509Cys质粒，可以模拟人类恶性高热实验模型，检测RYR1基因上某种碱基序列的变化是否具有致病性，以及研究该突变导致恶性高热的发病机制。
本发明中，上述各技术方案之间还可以相互组合，以实现更多的优选组合方案。本发明的其他特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分优点可从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过说明书以及附图中所特别指出的内容中来实现和获得。
附图说明
附图仅用于示出具体实施例的目的，而并不认为是对本发明的限制，在整个附图中，相同的参考符号表示相同的部件；
图1为RYR1-A重组质粒图谱；
图2为RYR1-B重组质粒图谱；
图3为RYR1-C重组质粒图谱；
图4为RYR1-D重组质粒图谱；
图5为全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒图谱。
具体实施方式
下面结合附图来具体描述本发明的优选实施例，其中，附图构成本申请一部分，并与本发明的实施例一起用于阐释本发明的原理，并非用于限定本发明的范围。
一种全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒，所述质粒全长包括20599个碱基对，第1-10000位碱基如SEQ ID No.1所示，第10001-20599位碱基如SEQ ID No.2所示；
一种全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒的构建方法，用于构建上述全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒，包括以下步骤：
S1：将pcDNA3.1-3Myc-His质粒通过HindIII和BamHI酶切质粒反应体系进行双酶切，得到线性化载体；
S2：获取小鼠RYR1基因片段RYR1-A、RYR1-B、RYR1-C和RYR1-D，将RYR1-A、RYR1-B、RYR1-C和RYR1-D分别连接到线性化载体中，分别构建含有RYR1-A基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-B基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-C基因片段的重组表达质粒和含有RYR1-D基因片段的重组表达质粒；
S3：采用PCR扩增体系对含有RYR1-A基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-B基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-C基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-D基因片段的重组表达质粒分别进行扩增，得到PCR产物，采用电泳回收所述PCR产物，得到扩增后的RYR1基因片段；
S4：通过无缝克隆的方式将扩增后的RYR1基因片段连接到线性化载体上，构建得到全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒。
具体的，步骤S1中，
pcDNA3.1-3Myc-His质粒来源于北京大学生命科学院膜生物学国家重点实验室王世强教授课题组提供的大肠杆菌，从大肠杆菌中提取获得；
将pcDNA3.1-3Myc-His质粒通过HindIII和BamHI酶切质粒反应体系进行双酶切，HindIII和BamHI酶切质粒反应体系的总体系为20 μL，所述HindIII和BamHI酶切质粒反应体系中成分和成分用量如表1所示。
所述HindIII和BamHI酶切质粒反应体系的反应条件为：37℃，4h。
反应结束后，从反应液中回收酶切产物（DNA回收试剂盒，美基生物，广州）。
具体的，步骤S2包括以下步骤：
S21：获取小鼠骨骼肌组织RNA
取C57BL/6J小鼠骨骼肌组织50 mg， 将小鼠骨骼肌组织置于1.5 mL离心管中，加入1 mL Trizol充分匀浆，室温静置10min；
向离心管中加入200μL氯仿上下颠倒摇晃混匀，室温静置5 min；在4℃，12000rpm下离心15 min；
取500 μL上清液置于新的1.5mL离心管中，加入500μL异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min；在4℃，12000rpm下离心10min；弃上清，管底可见白色RNA沉淀；
向离心管中加入1 mL预冷的75%乙醇（用DEPC水配制）洗涤管底RNA沉淀；在4℃，7500 rpm下离心5 min；弃上清，小心吸去管底残留的75%乙醇，在超净台中挥发干燥10min；
向离心管中加入20 μL DEPC水，溶解混匀，获得小鼠骨骼肌组织RNA，用QuickDrop检测RNA浓度和纯度。
S22：小鼠骨骼肌组织RNA逆转录合成小鼠骨骼肌组织cDNA
按逆转录试剂盒（翌圣生物，上海）说明书操作进行。
首先去除基因组DNA（gDNA），在无RNA酶的离心管中配制表2所示的反应体系（总体系15 μL）；
上述反应体系的反应条件为：42℃，2 min。
然后配制表3所示的逆转录反应体系（总体系20 μL）；
逆转录反应体系的反应条件为：25℃，5 min；55℃，60 min；85℃，5 min；得到小鼠骨骼肌组织的cDNA。
S23：以小鼠骨骼肌组织cDNA为模板，将小鼠全长RYR1基因分成4段，分别为RYR1-A、RYR1-B、RYR1-C和RYR1-D，经PCR反应分段扩增；
所述RYR1-A、RYR1-B、RYR1-C、RYR1-D的引物序列（含同源臂和酶切位点）见表4。
所述PCR反应体系的组成如表5所示（总体系50 μL）；
所述PCR扩增反应的程序如表6所示。
PCR扩增反应完成后，将反应液于1%琼脂糖凝胶电泳（150 V，15 min）；电泳结束后，通过胶回收分别回收RYR1基因片段（即RYR1-A、RYR1-B、RYR1-C、RYR1-D的胶回收片段）（美基生物，广州）。
S24：通过同源重组的方式，分别将RYR1-A、RYR1-B、RYR1-C、RYR1-D连接到步骤S1中的线性化载体中，构建分别含有RYR1-A、RYR1-B、RYR1-C、RYR1-D的重组表达质粒；
具体的，RYR1基因片段（即RYR1-A、RYR1-B、RYR1-C、RYR1-D的胶回收片段）和线性化载体同源重组的反应体系如表7所示。
将上述RYR1基因片段和线性化载体同源重组的反应体系，分别于50℃反应30min，将反应产物转化入大肠杆菌中进行测序鉴定。
需要说明的是，通过步骤S2，将小鼠的全长RYR1基因（15108 bp）分为4个片段（RYR1-A、RYR1-B、RYR1-C、RYR1-D），其中每两个相邻片段之间包括15-22 bp的重复序列，作为同源重组的同源臂。
将步骤S1中得到的线性化载体分别和RYR1-A、RYR1-B、RYR1-C、RYR1-D连接，分别得到含有RYR1-A基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-B基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-C基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-D基因片段的重组表达质粒；其中：
RYR1-A重组质粒序列如SEQ ID No.11所示；
RYR1-B重组质粒序列如SEQ ID No.12所示；
RYR1-C重组质粒序列如SEQ ID No.13所示；
RYR1-D重组质粒序列如SEQ ID No.14所示；
具体的，步骤S3中，设计引物，通过PCR反应对含有RYR1-A基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-B基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-C基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-D基因片段的重组表达质粒进行扩增，其中PCR扩增体系中的扩增引物序列如表8所示。
通过上述引物，可以分别从含有RYR1-A基因片段的重组表达质粒、RYR1-B基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-C基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-D基因片段的重组表达质粒上将RYR1-A、RYR1-B、RYR1-C、RYR1-D四个基因片段扩增出来。
所述PCR扩增反应体系的组成如表9所示（总体系50 μL）；
所述PCR扩增反应的程序如表10所示。
扩增后，得到用于同源重组的RYR1-A基因片段序列、用于同源重组的RYR1-B基因片段序列、用于同源重组的RYR1-C基因片段序列和用于同源重组的RYR1-D基因片段序列；
用于同源重组的RYR1-A基因片段序列（4176 bp：RYR1-A基因片段序列4158 bp +同源臂和酶切位点18bp）如SEQ ID No.23所示；
用于同源重组的RYR1-B基因片段序列（3969 bp）如SEQ ID No.24所示；
用于同源重组的RYR1-C基因片段序列（4075 bp）如SEQ ID No.25所示；
用于同源重组的RYR1-D基因片段序列（2978 bp：RYR1-D基因片段 2959 bp +同源臂和酶切位点19 bp）如SEQ ID No.26所示；
具体的，步骤S4中，通过无缝克隆的方式将扩增后得到的用于同源重组的RYR1-A基因片段、用于同源重组的RYR1-B基因片段、用于同源重组的RYR1-C基因片段、用于同源重组的RYR1-D基因片段连接到步骤S1中的线性化载体上，得到同源重组连接产物，对同源重组连接产物进行鉴定，可知所述同源重组连接产物为全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒；其中用于同源重组的RYR1-A基因片段、用于同源重组的RYR1-B基因片段、用于同源重组的RYR1-C基因片段、用于同源重组的RYR1-D基因片段、线性化载体的摩尔比是1:1:1:1；用于构建全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒的反应体系（总体系20 μL）如表11所示。
上述反应体系的反应条件为：50℃，60 min。
将S4中得到的同源重组连接产物进行鉴定，具体操作步骤为：
取5 μL S4中的同源重组连接产物加入100 μL大肠杆菌感受态细胞，冰上静置30min，42℃水浴60 s，冰上静置3 min；
加入900 μL无抗LB培养基，在37℃摇床中180 rpm培养1h，2000 rpm离心2 min；
弃去上层培养基，用剩余200 μL培养基混匀管底细菌沉淀，将菌液滴在含0.1%氨苄霉素的LB平板培养基，涂布均匀；
将平板培养基倒扣在37℃细菌培养箱中过夜培养；
挑选单克隆菌落进行Sanger测序，鉴定序列正确的单克隆菌液加入含0.1%氨苄霉素的LB培养基中，在37℃摇床中摇菌扩增，提取质粒；鉴定可知S4中得到的同源重组连接产物为全长小鼠RYR1基因重组表达质粒。
需要说明的是，RYR1基因突变可导致恶性高热易感性增加，通过在小鼠RYR1基因表达质粒上做点突变引入相应的突变位点，可以检测RYR1基因上某种碱基序列的变化是否具有致病性，以及研究该突变导致恶性高热的发病机制。
在本发明中，通过在全长小鼠RYR1基因重组表达质粒上引入点突变，使7525-7527位碱基由“CGA”突变为“TGC”，导致RYR1基因编码的氨基酸序列发生相应改变（2509位氨基酸由精氨酸突变为半胱氨酸，即RYR1-p.R2509基因突变），这种突变分别对应人类RYR1基因7522-7524位碱基序列和2508位氨基酸序列。通过这一突变，模拟人类恶性高热实验模型，进而探究RYR1基因突变导致恶性高热的发病机制，可以为临床上探索恶性高热疾病的防治和干预靶点提供思路和依据。
本发明中，小鼠RYR1-p.R2509表达质粒构建流程为：
步骤1：将pcDNA3.1-3Myc-His质粒通过HindIII和BamHI酶切质粒反应体系进行双酶切，得到线性化载体；
步骤2：获取小鼠RYR1基因片段RYR1-A、RYR1-B、RYR1-C和RYR1-D，将RYR1-A、RYR1-B、RYR1-C和RYR1-D分别连接到线性化载体中，分别构建含有RYR1-A基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-B基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-C基因片段的重组表达质粒和含有RYR1-D基因片段的重组表达质粒；
步骤3：设计引物在含有RYR1-B基因片段的重组表达质粒上引入点突变，使7525-7527位碱基序列由CGA突变为TGC，其中，突变引物序列如表12所示；
步骤4：采用PCR扩增体系对含有RYR1-A基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-B基因片段（带突变位点）的重组表达质粒、含有RYR1-C基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-D基因片段的重组表达质粒进行扩增，得到PCR产物，采用电泳回收PCR产物，得到扩增后的RYR1基因片段；含有RYR1-B基因片段（带突变位点）的重组表达质粒序列如SEQ ID No.29所示；
步骤5：通过无缝克隆的方式将扩增后的RYR1基因片段连接到线性化载体上，构建得到带有突变位点的RYR1-p.Arg2509Cys质粒，RYR1-p.Arg2509Cys质粒全长包括20599个碱基对，第1-10000位碱基如SEQ ID No.30所示，第10001-20599位碱基如SEQ ID No.31所示；反应体系如表15所示。
上述RYR1-p.Arg2509Cys质粒构建过程和全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒的构建过程相似，不同之处在于构建了含有RYR1-B基因片段（带突变位点）的重组表达质粒，因而步骤4中，在对含有RYR1-B基因片段（带突变位点）的重组表达质粒进行扩增时，PCR扩增反应体系略有不同，其余则和长小鼠RYR1基因外源性表达质粒的构建过程相同。
对含有RYR1-B基因片段（带突变位点）的重组表达质粒进行扩增时，PCR扩增反应体系组成如表13所示。
所述PCR扩增反应的程序如表14所示。
反应结束后，将反应液于1%琼脂糖凝胶电泳（150 V，15 min）；电泳结束后回收目的DNA片段（DNA回收试剂盒，美基生物公司，广州）。检测DNA浓度和纯度。
上述反应体系的反应条件为：50℃，60 min。
反应结束之后，将反应产物加入大肠杆菌感受态细胞，进行转化。具体操作步骤为：
取10μL 反应产物加入100 μL大肠杆菌感受态细胞，冰上静置30 min，42℃水浴60s，冰上静置3min；
加入900 μL无抗LB培养基，在37℃摇床中180 rpm培养1 h，将菌液放入离心机2000 rpm离心2 min；
弃去上层培养基，用剩余200 μL培养基混匀管底细菌沉淀，将菌液滴在含0.1%氨苄霉素的LB平板培养基，涂布均匀；
将平板培养基倒扣在37℃细菌培养箱中过夜培养；
挑选单克隆菌落进行Sanger测序，鉴定序列正确的单克隆菌液加入含0.1%氨苄霉素的LB培养基中，在37℃摇床中260rpm摇菌4h扩增进行测序鉴定，选取测试结果正确的单克隆菌落进口扩增，提取质粒，得到带有突变位点的RYR1- p.Arg2509Cys质粒。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将pcDNA3.1-3Myc-His质粒通过HindIII和BamHI酶切质粒反应体系进行双酶切，得到线性化载体；
S2：获取小鼠RYR1基因片段RYR1-A、RYR1-B、RYR1-C和RYR1-D，将RYR1-A、RYR1-B、RYR1-C和RYR1-D分别连接到线性化载体中，分别构建含有RYR1-A基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-B基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-C基因片段的重组表达质粒和含有RYR1-D基因片段的重组表达质粒；
S3：采用PCR扩增体系对含有RYR1-A基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-B基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-C基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-D基因片段的重组表达质粒进行扩增，得到PCR产物，采用电泳回收PCR产物，得到扩增后的RYR1基因片段；
S4：通过无缝克隆的方式将扩增后的RYR1基因片段连接到线性化载体上，构建得到全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒。
2.根据权利要求1所述的全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒的构建方法，其特征在于，步骤S2包括以下步骤：
S21：获取小鼠骨骼肌组织RNA；
S22：小鼠骨骼肌组织RNA逆转录合成小鼠骨骼肌组织cDNA；
S23：以小鼠骨骼肌组织cDNA为模板，将小鼠全长RYR1基因分成4段，分别为RYR1-A、RYR1-B、RYR1-C和RYR1-D，经PCR反应分段扩增；
S24：通过同源重组的方式，分别将扩增后的RYR1-A、RYR1-B、RYR1-C、RYR1-D基因片段，连接到步骤S1中得到的线性化载体中，构建分别含有RYR1-A、RYR1-B、RYR1-C、RYR1-D的重组表达质粒。
3.根据权利要求2所述的全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒的构建方法，其特征在于，步骤S23中，
所述RYR1-A基因片段PCR反应的上游引物序列如SEQ ID No.3所示；
所述RYR1-A基因片段PCR反应的下游引物序列如SEQ ID No.4所示；
所述RYR1-B基因片段PCR反应的上游引物序列如SEQ ID No.5所示；
所述RYR1-B基因片段PCR反应的下游引物序列如SEQ ID No.6所示；
所述RYR1-C基因片段PCR反应的上游引物序列如SEQ ID No.7所示；
所述RYR1-C基因片段PCR反应的下游引物序列如SEQ ID No.8所示；
所述RYR1-D基因片段PCR反应的上游引物序列如SEQ ID No.9所示；
所述RYR1-D基因片段PCR反应的下游引物序列如SEQ ID No.10所示。
4.根据权利要求3所述的全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒的构建方法，其特征在于，步骤S24中，
所述含有RYR1-A基因片段的重组表达质粒序列如SEQ ID No.11所示；
所述含有RYR1-B基因片段的重组表达质粒序列如SEQ ID No.12所示；
所述含有RYR1-C基因片段的重组表达质粒序列如SEQ ID No.13所示；
所述含有RYR1-D基因片段的重组表达质粒序列如SEQ ID No.14所示。
5.根据权利要求4所述的全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒的构建方法，其特征在于，步骤S3中，
所述含有RYR1-A基因片段的重组表达质粒PCR反应的上游引物序列如SEQ ID No.15所示；
所述含有RYR1-A基因片段的重组表达质粒PCR反应的下游引物序列如SEQ ID No.16所示；
所述含有RYR1-B基因片段的重组表达质粒PCR反应的上游引物序列如SEQ ID No.17所示；
所述含有RYR1-B基因片段的重组表达质粒PCR反应的下游引物序列如SEQ ID No.18所示；
所述含有RYR1-C基因片段的重组表达质粒PCR反应的上游引物序列如SEQ ID No.19所示；
所述含有RYR1-C基因片段的重组表达质粒PCR反应的下游引物序列如SEQ ID No.20所示；
所述含有RYR1-D基因片段的重组表达质粒PCR反应的上游引物序列如SEQ ID No.21所示；
所述含有RYR1-D基因片段的重组表达质粒PCR反应的下游引物序列如SEQ ID No.22所示。
6.根据权利要求5所述的全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒的构建方法，其特征在于，步骤S4中，所述扩增后的RYR1基因片段包括用于同源重组的RYR1-A基因片段、用于同源重组的RYR1-B基因片段、用于同源重组的RYR1-C基因片段和用于同源重组的RYR1-D基因片段；
所述用于同源重组的RYR1-A基因片段序列如SEQ ID No.23所示；
所述用于同源重组的RYR1-B基因片段序列如SEQ ID No.24所示；
所述用于同源重组的RYR1-C基因片段序列如SEQ ID No.25所示；
所述用于同源重组的RYR1-D基因片段序列如SEQ ID No.26所示。
7. 一种全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒，根据权利要求1-6任一项所述的全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒的构建方法得到，其特征在于，所述全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒全长包括20599个碱基对，第1-10000位碱基如SEQ ID No.1所示，第10001-20599位碱基如SEQ ID No.2所示。
8.一种全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒的应用，其特征在于，根据权利要求1-6任一项所述的全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒的构建方法得到的全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒在研究恶性高热发病机制上的应用。
9.一种RYR1-p.Arg2509Cys质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将pcDNA3.1-3Myc-His质粒通过HindIII和BamHI酶切质粒反应体系进行双酶切，得到线性化载体；
步骤2：获取小鼠RYR1基因片段RYR1-A、RYR1-B、RYR1-C和RYR1-D，将RYR1-A、RYR1-B、RYR1-C和RYR1-D分别连接到线性化载体中，分别构建含有RYR1-A基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-B基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-C基因片段的重组表达质粒和含有RYR1-D基因片段的重组表达质粒；
步骤3：设计引物在含有RYR1-B基因片段的重组表达质粒上引入点突变，使7525-7527位碱基序列由CGA突变为TGC；
步骤4：采用PCR扩增体系对含有RYR1-A基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-B基因片段（带突变位点）的重组表达质粒、含有RYR1-C基因片段的重组表达质粒、含有RYR1-D基因片段的重组表达质粒进行扩增，得到PCR产物，采用电泳回收PCR产物，得到扩增后的RYR1基因片段；
步骤5：通过无缝克隆的方式将扩增后的RYR1基因片段连接到线性化载体上，构建得到带有突变位点的RYR1-p.Arg2509Cys质粒。
10.一种RYR1-p.Arg2509Cys质粒在模拟人类恶性高热实验模型的应用。
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