CN112980963A - 一种检测个体肤质基因的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种检测个体肤质基因的试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测个体肤质基因的试剂盒及其使用方法。发明采用多重PCR扩增和电泳方法分析和鉴定4个基因的等位基因多态性(SNP)：MMP1、MMP3、MMP9和AQP3,包括如下步骤：a)采集受测者口腔内脱落细胞保存于采集卡或者对血液样本进行DNA核酸提取；b)取受测者唾液采集卡样本或提取的DNA样本加入到反应体系中，进行PCR扩增；c)运行扩增程序；d)对扩增产物进行电泳分析，并根据峰型图进行判读。本发明可同步对受测者相关多个基因的SNP进行检测，实现检测的简易性、高效性和特异性。通过该分析为受测者的肤质类型提供参考。

Description

一种检测个体肤质基因的试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体是涉及一种检测个体肤质基因的试剂盒及其使用方法。
背景技术
随着社会的发展，人们开始越来越关注皮肤的质量，使自己看起来更年轻更有活力。最近的研究表明，高达60％的个体间肤质的差异可以归因于遗传因素，而剩下的40％是由于非遗传因素，例如光照、气候等。通过基因组学和生物信息学方面的研究表明某些单核苷酸多态性(Single Nucleotide polymorphism，SNP)与个体肤质存在的联系。SNP指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，包括碱基转换、颠换、缺失和插入。人类基因组80％以上基因多态性都是单核苷酸多态性。与个体肤质的基因SNP位点发生突变可使对应的蛋白活性发生变化，从而影响个体肤质。因此，通过对个体肤质的SNP位点进行检测，可以更加客观地了解自身肤质，以便更科学、更有针对性地选择美容产品。
皮肤由表皮、真皮、皮下组织三层构成，表皮处于皮肤的最外层，覆盖全身表面。表皮由复层扁平上皮构成，由浅入深依次为角质层，透明层、颗粒层和生发层。角质层由多层角化上皮细胞构成，无生命，不透水，具有防止组织液外流，抗磨擦和防感染等功能。在角质层中角蛋白的含氮物质具有与水结合的能力，称之为水合作用。水合作用不仅可以使皮肤保持柔软湿润，还能促进皮肤对化妆品的吸收。AQP3基因编码一种水通道蛋白，主要在皮肤中表达来调控皮肤的水合作用。其功能缺陷可导致皮肤干燥、弹性下降和屏障作用减弱等皮肤损伤。真皮由致密结缔组织构成，由浅入深依次为乳头层和网状层。其中网状层与皮下组织相连，其内有丰富的胶原纤维，弹力纤维和网状纤维。它们互相交织成网，使皮肤具有较大弹性和韧性。MMP基因编码基质金属蛋白酶，是负责皮肤细胞外基质中的大型分子，能在Ca2+、Zn2+等金属离子的辅助下降解皮肤内的皮肤细胞外基质，使皮肤老化，丧失弹性。基质金属蛋白酶是一个大家族，目前已分离鉴别出26个成员，编号分别为MMP1～26。在皮肤老化过程中，基质金属蛋白酶家族中的MMP1、MMP3和MMP9的含量增加，从而加速皮肤细胞外基质的降解，导致皮肤出现皱缩细纹等衰老症状。
目前市场上，SNP分型检测技术主要有三种：测序法、荧光定量PCR法、基因芯片法。
荧光定量PCR
荧光定量PCR采用荧光淬灭及双末端标记技术，针对SNP位点设计特异性的探针，具有灵敏度高、准确性高和特异性高等优势。但荧光定量PCR通量低，若要同时检测多个个SNP位点，需要分管检测，操作复杂，样品用量大，难以适应临床需求。此外，荧光定量PCR难以设置内参质控，无法避免假阳性和假阴性。
基因芯片技术：
基因芯片是通过微加工技术，将数以万计的特定序列的DNA片段(基因探针)，有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。其优点是通量高、操作简便；缺点是检测成本昂贵、重复性差、灵敏度较低。芯片的种类较多，难以制定一个统一的质量控制标准也限制了基因芯片技术的普及。
测序法：
Sanger测序法是SNP分型金标准，不仅能检测已知SNP，也能发现未知SNP。但Sanger测序法操作复杂，成本较高。当测序位点较多时需要逐个位点测序，耗时长，累计价格相对昂贵。二代测序技术实现了边合成边测序，具有高通量、高效率的优势。然而二代测序平台价格昂贵、普及度低，作为SNP检测技术在临床上的应用还不够成熟。
由于以上技术均具有明显局限性，很难应用于检测个体肤质的多重基因检测。目前，国内尚无有关以多重PCR和CE分离技术为基础的检测个体肤质基因方案的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测个体肤质基因的试剂盒和使用方法，该试剂盒能对受测者的相关基因进行检测，并给出分析。
具体地，本发明公开了一种检测个体肤质基因的试剂盒和使用方法，包括如下步骤：
a)采集受测者口腔内脱落细胞保存于采集卡或者对血液样本进行DNA核酸提取；
b)取受测者唾液采集卡样本或提取的DNA样本加入到反应体系中，进行PCR扩增；
c)运行扩增程序；
d)对扩增产物进行电泳分析，并根据峰型图进行判读；
本试剂盒包含以下几个组分：Primer Mix、PCR反应液和DNA/RNA-free水。
其中的PrimerMix中，包含扩增4个基因SNP多态位点的引物组及3个人类基因组DNA内参和反应内参pcDNA的引物组，详见表1。
本试剂盒可对受测样本进行同步多重PCR扩增，通过SNP引物的设计，可以精确测出被检测基因MMP1、MMP3、MMP9和AQP3的基因型：杂合子或纯合子；pcDNA用以检测反应体系，监控反应体系是否有效，扩增是否正常；3个人体基因组DNA内参用以检测人体样本，保证人体样本有效。
其中PCR反应液包含以下组分：2×PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、氯化钾、氯化镁等。
本试剂盒的PCR扩增反应条件见表2。
表2本发明的PCR扩增反应程序
Figure BDA0002317250990000041
Figure BDA0002317250990000051
本试剂盒的扩增产物通过电泳对扩增产物进行分析；优选的电泳为毛细管电泳。
根据检测峰图，可获得每个SNP位点的基因型，结合各个基因对应的表现型(表3)，可分析出受测者皮肤的弹性程度和失水能力。
表3本发明检测位点对应的皮肤参考信息
Figure BDA0002317250990000052
附图说明
图1为本试剂盒阴性对照DNA/RNA-free水扩增图谱。只出现pcDNA特征峰。
图2为受测者1口腔脱落细胞样本扩增图谱。MMP1基因型为ZZ、MMP3为ZZ、MMP9为TC、AQP3为AG，出现pcDNA峰及人基因组DNA(huDNA)内参-1、人基因组DNA(huDNA)内参-5、人基因组DNA(huDNA)内-7特征峰。
图3为受测者2口腔脱落细胞样本扩增图谱。MMP1基因型为GG、MMP3为TT、MMP9为CC、AQP3为AG，出现pcDNA峰及人基因组DNA(huDNA)内参-1、人基因组DNA(huDNA)内参-5、人基因组DNA(huDNA)内-7特征峰。
图4为受测者2血液提取DNA样本扩增图谱，结果同图3。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明所述的内容后，该领域的技术人员对本发明做出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的保护范围。
检测个体肤质基因的检测试剂盒，包括盒体和盒体内存放的试剂，包括如下步骤：
a)采集受测者口腔内脱落细胞保存于采集卡或者对血液样本进行DNA核酸提取；
b)取受测者唾液采集卡样本或提取的DNA样本加入到反应体系中，进行PCR扩增；
c)运行扩增程序；
d)对扩增产物进行电泳分析，并根据峰型图进行判读；
本试剂盒包含以下几个组分：包含引物组在内的Primer Mix、PCR反应液和DNA/RNA-free水。
其中的PCR反应体系Primer Mix中，包含扩增4个SNP多态位点、3个人类基因组内参和pcDNA反应内参的引物组，详见表1。
其中PCR反应液包含以下组分：2×PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、氯化钾、氯化镁等。
在实施案例中，所述的样本为DNA/RNA-free水、受测者1口腔内壁脱落细胞采集卡、受测者2口腔内壁脱落细胞采集卡、受测者2血液DNA提取样本。
在实施案例中，所述电泳是通过毛细管电泳对扩增产物进行电泳，并结合分析软件给出扩增图谱并给出分析，判断受测者的肤质。
实施例1
(1)所选样本：DNA/RNA-free水。
(2)体系配置
根据说明书，将引物Primer Mix、PCR反应液，在冰上按照说明书比例进行反应体系配置，涡旋混匀后，用离心机进行离心，然后用枪头进行混匀和分装。
(3)加入样本
按照说明书，用移液器取对应体积的DNA/RNA-free水，加入到已经分装好的反应体系中。
(4)扩增程序
PCR仪器上的扩增程序为如表2。
(5)扩增产物在3500DX遗传分析仪上检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标(Size-500)组成上样混合物{(1μL Size-500+12μL去离子甲酰胺)×(进样数)}。将9μL上样混合物与1μL扩增产物混合，避免产生气泡，尽快电泳。用ABI 3500遗传分析仪(购自美国ABI公司)检测分析，具体分析参数为进样电压：1.2kv，进样时间：15s，电泳时间1210-1500s。检测结果如图一所示。
(6)分析数据
本次实验中所使用的是DNA/RNA-free水，在电泳图谱中应不存在各基因位点的目标峰，只出现pcDNA基因的特征峰，如下：pcDNA位点所对应的出峰情况为：单峰，图谱中显示pcDNA；
如图一所示，DNA/RNA-free水扩增产物电泳分析图谱只出现反应内参pcDNA峰。
本次实验能够有效地验证反应试剂的扩增有效性，无外界污染源。
实施例2
(1)所选样本：受测者1和受测者2的口腔内壁脱落细胞样本。
(2)样本采集
采集类型：口腔内壁脱落细胞。
采集方法：采用唾液采集棒在口腔内壁上来回擦拭4次，用唾液采集棒的反面继续在口腔内壁上来回擦拭4次，取出唾液采集棒，在唾液样本采集卡上反复按压，将唾液内壁细胞转移到唾液样本采集卡上，并将已经采集好的唾液样本采集卡在无污染区域作晾干处理。
有效样本：唾液样本采集卡的粉色区域变成浅粉色或白色的区域为有效唾液样本区域。
选取样本方法：利用达博塑料打孔器(1.0mm)进行手动打孔取样。
(3)体系配置
根据说明书，将引物Primer Mix、PCR反应液，在冰上按照说明书比例进行反应体系配置，涡旋混匀后，用离心机进行离心，然后用枪头进行混匀和分装。
(4)加入样本：用打孔器取唾液卡中的有效样本1～2个，加入到配置好的反应体系中。
(5)扩增程序
PCR仪器上的扩增程序为如表2。
(6)扩增产物在3500DX遗传分析仪上检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标(Size-500)组成上样混合物{(1μL Size-500+12μL去离子甲酰胺)×(进样数)}。将9μL上样混合物与1μL扩增产物混合，避免产生气泡，尽快电泳。用ABI 3500遗传分析仪(购自美国ABI公司)检测分析，具体分析参数为进样电压：1.2kv，进样时间：15s，电泳时间1210-1500s。检测结果分别为图二和图三。
(7)分析数据
本次实验中所使用的是受测者样本，根据各目的峰在图谱中出现的位置，确定该受测者的基因型，从而指导判断受测者的肤质。
图二为受测者1唾液样本的分析图谱，图三为受测者2唾液样本的分析图谱。
根据图二分析如下：
受测者1扩增产物电泳图谱出现以下特征峰：口腔样本扩增图谱。MMP1基因型为ZZ、MMP3为ZZ、MMP9为TC、AQP3为AG，出现pcDNA峰及人基因组DNA(huDNA)内参-1、人基因组DNA(huDNA)内参-5、人基因组DNA(huDNA)内-7特征峰。
其中MMP1基因SNP位点Z显示为MMP1-Z；MMP3基因SNP位点Z显示为MMP3-Z；MMP9基因SNP位点T显示为MMP9-T，SNP位点C显示为MMP9-C；AQP3基因SNP位点A显示为AQP3-A，SNP位点G显示为AQP3-G；pcDNA位点为单峰；人基因组DNA(huDNA)内参-1为单峰，图谱中显示B-1；人基因组DNA(huDNA)内参-5为单峰，图谱中显示B-5；人基因组DNA(huDNA)内参-7位点为单峰，图谱中显示B-7。
参考表3，1号受测者MMP1和MMP3的基因型显示其皮肤弹性较好，MMP9和AQP3的基因型均为杂合子，影响其皮肤弹性和锁水能力，综合所有靶点结果1号受测者的皮肤弹性较好，但锁水能力一般。
图3为受测者2口腔脱落细胞样本的分析图谱。
受测者2扩增产物电泳图谱出现以下特征峰：口腔样本扩增图谱。MMP1基因型为GG、MMP3为TT、MMP9为CC、AQP3为AG，出现pcDNA峰及人基因组DNA(huDNA)内参-1、人基因组DNA(huDNA)内参-5、人基因组DNA(huDNA)内-7特征峰。
其中MMP1基因SNP位点G显示为MMP1-G；MMP3基因SNP位点T显示为MMP3-T；MMP9基因SNP位点C显示为MMP9-C；AQP3基因SNP位点A显示为AQP3-A，SNP位点G显示为AQP3-G；pcDNA位点为单峰；人基因组DNA(huDNA)内参-1为单峰，图谱中显示B-1；人基因组DNA(huDNA)内参-5为单峰，图谱中显示B-5；人基因组DNA(huDNA)内参-7位点为单峰，图谱中显示B-7。
参考表3，2号受测者MMP1和MMP3的基因型显示其皮肤弹性较差，而MMP9的基因型显示其皮肤弹性较好。AQP3的基因型为杂合子，说明其皮肤锁水能力一般，综合所有靶点结果2号受测者的皮肤弹性和锁水能力均一般。
实施例3
(1)所选样本：受测者2的血液样本。
(2)样本类型：血液样本。
(3)提取DNA：利用核酸提取仪对血液样本进行DNA提取。
(4)体系配置
根据说明书，将引物Primer Mix、PCR反应液，在冰上按照说明书比例进行反应体系配置，涡旋混匀后，用离心机进行离心，然后用枪头进行混匀和分装。
(5)加入样本：按照说明书，用移液器取一定量的提取DNA样本，加入到反应体系中。
(6)扩增程序
PCR仪器上的扩增程序为如表2。
(7)扩增产物在3500DX遗传分析仪上检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标(Size-500)组成上样混合物{(1μL Size-500+12μL去离子甲酰胺)×(进样数)}。将9μL上样混合物与1μL扩增产物混合，避免产生气泡，尽快电泳。用ABI 3500遗传分析仪(购自美国ABI公司)检测分析，具体分析参数为进样电压：1.2kv，进样时间：15s，电泳时间1210-1500s。检测结果分别图四所示。
(8)分析数据
图4为受测者2血液提取DNA样本扩增图谱，结果同图3一致，说明该检测试剂盒同样适用于血样提取的DNA样本。

Claims (7)

1.一种检测个体肤质基因的试剂盒及其使用方法，包括如下步骤：
a)采集受测者口腔内脱落细胞保存于采集卡或者对血液样本进行DNA核酸提取；
b)取受测者唾液采集卡样本或提取的DNA样本加入到反应体系中，进行PCR扩增；
c)运行扩增程序；
d)对扩增产物进行电泳片段分析，并根据峰型图进行判读。
其中的PCR反应体系中，包含扩增4个基因SNP多态位点、3个人体基因组DNA内参和一个PCR反应内参的引物组，见表1，以下引物序列方向均为5’端至3’端。
表1 本试剂盒SNP检测位点、引物序列及PCR扩增片段长度
Figure FDA0002317250980000011
Figure FDA0002317250980000021
2.如权利要求1所述的一种检测个体肤质基因的试剂盒及其使用方法，其特征在于，所述的口腔脱落细胞，为口腔内壁上脱落细胞，保存于细胞采集卡上，可直接用于PCR扩增。
3.如权利要求1所述的一种检测个体肤质基因的试剂盒及其使用方法，其特征在于，所述血液样本，为受测者血液样本或采集于血液保存卡上的血样样本，经过提取的DNA，可直接用于PCR扩增。
4.如权利要求1所述的一种检测个体肤质基因的试剂盒及其使用方法，其特征在于，所述的反应体系包含引物组在内的Primer Mix、PCR反应液和DNA/RNA-free水。
5.权利要求1所述的一种检测个体肤质基因的试剂盒及其使用方法，其特征在于，反应体系中的PrimerMix包含了检测靶点和内参的所有上下游引物，其中检测靶点包括MMP1、MMP3、MMP9和AQP3的SNP所有基因型，内参包括1个PCR反应内参和3个人体基因组DNA内参。
6.权利要求1所述的一种检测个体肤质基因的试剂盒及其使用方法，其特征在于，反应体系中的PCR反应液包含了2×PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、氯化钾、氯化镁等。
7.权利要求1所述的一种检测个体肤质基因的试剂盒及其使用方法，其特征在于，扩增产物通过电泳对扩增产物进行分析；优选的所述电泳为毛细管电泳。
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