CN103571959A - 用于检测基因位点突变的引物、探针、试剂盒及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测基因位点突变的引物、探针、试剂盒及使用方法。所述引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述探针序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，所述试剂盒包括有上述引物和探针、实时荧光定量PCR Mix试剂、去离子水、分隔并集中包装这些试剂的瓶或管以及包装盒。本发明可快速对JAK2基因V617F位点突变进行检测，检测灵敏度高，出现假阳性或假阴性的概率小，检测步骤简单，耗时短，可在第一时间得到临床所需资料。

Description

用于检测基因位点突变的引物、探针、试剂盒及使用方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及基因突变检测引物、探针和试剂盒，尤其涉及一种用于检测JAK2基因V617F位点突变的引物、探针和试剂盒及其使用方法。
背景技术
JAK2基因属于JAK基因家族，编码一种JAK酪氨酸蛋白激酶，一部分生长因子和大部分细胞因子能通过JAK激活信号转导因子和转录激活因子（STAT），从而影响基因的转录调节。JAK-STAT信号转导途径参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。JAK2可以介导多种细胞因子和生长因子的信号转导，包括红细胞生成素（EPO）、白细胞介素（IL-3）、生长因子（GH）、血小板生成素（TPO）、粒巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和粒细胞集落刺激因子（G-CSF），从而调节细胞生长、增殖和分化。JAK2基因特定位点的突变将破坏正常LAK2蛋白酪氨酸激酶活性的自我抑制作用，导致造血细胞的异常增生。
骨髓增殖性肿瘤（MPN）是某一系或多系分化相对成熟的骨髓细胞不断地克隆性增殖所致的一组肿瘤性疾病的统称，该疾病包括真性红细胞增多症（PV）、原发性血小板增多症（ET）、原发性骨髓纤维化（PMF）、慢性骨髓细胞性白血病（CML）。研究表明，骨髓增殖性肿瘤（MPN）常伴有JAK2-V617F突变，该突变是JAK2基因的第1849位突变，导致第617位的缬氨酸（V）变为苯丙氨酸（F），该突变发生在65～97%的真性红细胞增多症（PV）、23～57%的原发性血小板增多症（ET）及35～57%的原发性骨髓纤维化（PMF）患者中。世界卫生组织已将JAK2-V617F突变作为MPN的诊断标准之一。因此，检测JAK2-V617F突变对患者的诊断、治疗具有重要的意义。
目前，国内针对JAK2-V617F突变的检测有常规DNA测序法和普通定性PCR法。常规DNA测序法是从全血粒细胞中抽提DNA，经PCR扩增后直接测序，然而，因为该突变是获得性的，且仅限于髓系，所以该检测方法的敏感性只有20～30%，检测灵敏度低，且试验程序繁琐、耗时长、成本高；普通定性PCR法是通过设计特殊引物，同时扩增内参和突变片段，然后通过普通电泳跑胶来观察检测结果，该方法的敏感性为20～30%，检测灵敏度低，检测结果需要通过看电泳图，主观性强，容易出现假阳性或假阴性。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种用于检测JAK2基因V617F位点突变的引物、探针，本发明还公开了包括有该引物的试剂盒及其使用方法。
本申请的发明人根据JAK2的基因编码序列，设计特异性的引物和探针，其中，探针为TaqMan MGB探针，MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团，本身不产生荧光，大大降低了本底信号的强度，同时探针上还连有MGB(Minor Groove Binder)修饰基团，使更短的探针能获得和普通探针同样的Tm值，使探针设计的成功率大为提高，对于富含A/T的模板可以区分得更理想。本发明可以快速检测JAK2-V617F突变，检测灵敏度高，检测程序简单，可更高效地筛查出JAK2-V617F突变的患者。
根据本发明的实施例，提供了一种用于检测JAK2基因V617F位点突变的引物和探针，所述引物序列如下：
SEQ ID NO:15’-TTTCCTTAGTCTTTCTTTGAAGCAGC-3’
SEQ ID NO:25’-AAGGCATTAGAAAGCCTGTGTAGTT-3’
所述探针序列如下，其中，FAM和HEX为荧光报告基团，NFQ为非荧光淬灭基团：
SEQ ID NO:35’--FAM-CCACAGACACATAC-MGB-NFQ-3’
SEQ ID NO:45’-HEX-CTCCACAGAAACATAC-MGB-NFQ-3’。
根据本发明的实施例，还提供了一种用于检测JAK2基因V617F位点突变的试剂盒，其主要包括：1）序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物，序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的探针；2）实时荧光定量PCR Mix试剂，该Mix试剂为本领域常规的在实时荧光定量PCR中使用的Mix试剂，优选的，该Mix试剂为宝生物公司的Premix ex taq(Probe qPCR)；去离子水；3）分隔并集中包装这些试剂的瓶或管以及包装盒。
优选的，所述引物的浓度为5μmol/L，所述探针的浓度为10μmol/L。
本发明的引物和试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
（1）使用常规方法提取待测样品的基因组DNA；其中，待测样品为待测样品为EDTA或枸橼酸钠抗凝的外周血或骨髓。
（2）以步骤（1）提取的DNA为模板，进行实时荧光定量PCR；
（3）分析得到的检测试验数据和扩增曲线图，若只有SEQ ID NO:4探针有明显S型扩增曲线出现，则有JAK2基因V617纯合突变；若两个探针均有明显S型扩增曲线出现，则有JAK2基因和V617杂合突变（阳性对照）；若只有SEQ ID NO:3探针有明显S型扩增曲线出现，则无JAK2基因V617突变（阴性对照）；若两个探针均无扩增曲线，说明实验失败，DNA提取失败。
通过以上技术方案，本发明的有益效果如下：
（1）可快速对JAK2基因V617F位点突变进行检测，检测灵敏度高，出现假阳性或假阴性的概率小，检测步骤简单，耗时短，可在第一时间得到临床所需资料。
（2）可以通过试验数据判断该突变是纯合子还是杂合子，检测结果更加精确，具有广阔的临床应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步描述，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例
用于检测JAK2基因V617F位点突变的试剂盒及其使用
1.该用于检测JAK2基因V617F位点突变的试剂盒中装有：
⑴引物和探针
所述引物序列如下：
SEQ ID NO:15’-TTTCCTTAGTCTTTCTTTGAAGCAGC-3’
SEQ ID NO:25’-AAGGCATTAGAAAGCCTGTGTAGTT-3’
所述探针序列如下，其中，FAM和HEX为荧光报告基团，NFQ为非荧光淬灭基团：
SEQ ID NO:35’--FAM-CCACAGACACATAC-MGB-NFQ-3’
SEQ ID NO:45’-HEX-CTCCACAGAAACATAC-MGB-NFQ-3’
所述引物的浓度为5μmol/L，所述探针的浓度为10μmol/L。
⑵实时荧光定量PCR Mix试剂，该Mix试剂为为宝生物公司的Premix extaq(Probe qPCR)；
⑶去离子水；
⑷分隔并集中包装这些试剂的瓶或管以及包装盒。
2.试剂盒的使用方法如下：
⑴采集患者的组织样品，提取待测样品的基因组DNA，建议使用本领域常规的试剂盒柱提法，按照试剂盒的说明书进行提取，最后收集到50μlDNA溶液，浓度为50ng/μl，直接进行检测或保存于-20℃。
⑵进行实时荧光定量PCR扩增，扩增体系如下表：
组分 体积（total25μl）
DNA模板 1.0μl
上游引物 0.9μl
下游引物 0.9μl
探针（SEQ ID NO:3） 0.5μl
探针（SEQ ID NO:4） 0.5μl
PCR Mix试剂 12.5μl
去离子水 8.7μl
使用含有FAM及HEX两种探针荧光通道的实时荧光定量PCR仪器。
反应程序为：
95℃，300s，进行1个循环；
95℃，15s→60℃，50s；进行45个循环。
(3)分析得到的检测试验数据和扩增曲线图，若只有SEQ ID NO:4探针有明显S型扩增曲线出现，则有JAK2基因V617纯合突变；若两个探针均有明显S型扩增曲线出现，则有JAK2基因和V617杂合突变（阳性对照）；若只有SEQ ID NO:3探针有明显S型扩增曲线出现，则无JAK2基因V617突变（阴性对照）；若两个探针均无扩增曲线，说明实验失败，DNA提取失败。
本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
Figure IDA0000407522960000011

Claims (8)

1.一种引物和探针，其特征在于，所述引物序列如下：
SEQ ID NO:15’-TTTCCTTAGTCTTTCTTTGAAGCAGC-3’
SEQ ID NO:25’-AAGGCATTAGAAAGCCTGTGTAGTT-3’
所述探针序列如下，其中，FAM和HEX为荧光报告基团，NFQ为非荧光淬灭基团：
SEQ ID NO:35’--FAM-CCACAGACACATAC-MGB-NFQ-3’
SEQ ID NO:45’-HEX-CTCCACAGAAACATAC-MGB-NFQ-3’。
2.一种包括有权利要求1所述的引物和探针的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括有权利要求1所述的引物和探针。
3.按照权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：1）序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物，序列如SEQ ID NO:3和SEQID NO:4所示的探针；2）实时荧光定量PCR Mix试剂；去离子水；3）分隔并集中包装这些试剂的瓶或管以及包装盒。
4.按照权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述实时荧光定量PCRMix试剂为宝生物公司的Premix ex taq(Probe qPCR)。
5.按照权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述引物的浓度为5μmol/L，所述探针的浓度为10μmol/L。
6.权利要求1所述的引物和探针的使用方法，包括以下步骤：
（1）使用常规方法提取待测样品的基因组DNA；其中，待测样品为EDTA或枸橼酸钠抗凝的外周血或骨髓；
（2）以步骤（1）提取的DNA为模板，进行实时荧光定量PCR；
（3）分析得到的检测数据和扩增曲线图。
7.按照权利要求1所述的引物和探针在检测JAK2基因V617F位点突变中的应用。
8.按照权利要求2～5中任一所述试剂盒在检测JAK2基因V617F位点突变中的应用。
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