CN107699612A - 一种分子信标检测人类mtrr基因多态性的引物、试剂盒和方法及其应用 - Google Patents

一种分子信标检测人类mtrr基因多态性的引物、试剂盒和方法及其应用 Download PDF

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任绪义
张锋
曹子豪
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

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Abstract

本发明提供了一种采用分子信标探针法检测人类MTRR基因多态性的引物，包含以下核酸序列：扩增rs1801394(c.66A>G)多态性位点的引物对和检测用的探针。本发明还公开了上述引物和探针在检测扩增MTRR基因多态性的试剂盒、方法及其应用。本发明可以快速检测MTRR基因rs1801394(c.66A>G)多态性，结果准确，易于判读。与测序法相比，该方法不需要对PCR产物进行一系列复杂的后续处理，PCR扩增和检测同步进行，整个检测过程无需开盖操作，降低了PCR产物造成污染的风险，大大缩短了检测时间，降低了检测成本。

Description

一种分子信标检测人类MTRR基因多态性的引物、试剂盒和方 法及其应用
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种分子信标检测人类MTRR基因多态性的引物及其应用。
背景技术
叶酸是一种水溶性B族维生素，是合成核酸所必须的元素，是细胞生长和组织修复所必须的物质，更是胚胎发育过程中不可缺少的元素。叶酸代谢途径中的关键基因的突变会降低代谢酶的活性，从而导致叶酸代谢障碍，造成叶酸缺乏。孕妇缺乏叶酸会导致新生儿出生缺陷等严重后果。参与叶酸代谢最重要的两个基因是亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTRR)和甲硫氨酸合成酶还原基因 (MTRR)。
MTRR全称5-methyltetrahydrofolate-homocysteinemethyltransferasereductase (甲硫氨酸合成酶还原酶)，甲硫氨酸是蛋白质合成和一碳代谢的必须氨基酸，它的合成是由甲硫氨酸合酶(MTR编码)催化的，而甲硫氨酸合酶因为辅助因子维生素B12被氧化而最终失活。MTRR编码的甲硫氨酸合成酶还原酶能够通过还原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合酶。
研究发现，如果MTRR基因第66位密码子发生突变，将会导致酶活性发生变化，造成体内叶酸缺乏或同型半胱氨酸水平升高，进而诱发多种疾病，如神经管疾病、心血管疾病等。对MTRR基因进行检测，可以直接发现被检测者叶酸代谢方面的缺陷(即叶酸的利用代谢能力)，从而可以根据风险高低(相关代谢酶的活性程度)建议更准确的叶酸补充剂量。
目前针对多态性位点分析的方法主要有荧光定量PCR(qPCR)、PCR-限制性片段长度多态性(PCR-Restriction Length Polymorphism，PCR-RFLP)、扩增阻滞突变系统-PCR(Amplification refractory mutation system PCR，ARMS-PCR) 等，但是由于这些方法操作步骤多，费时费力，或者需要PCR后处理，易产生污染，因此不适用于人群大规模的快速检测。测序法是核酸测序的金标准，虽然准确，但是操作步骤繁琐且成本较高。本发明，接触非对称PCR、分子信标技术和溶解曲线分析技术，发明了一种快速、准确的基因分型方法和试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种分子信标探针法检测人类MMTRR 基因多态性的引物、试剂盒和方法及其应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种分子信标探针法检测人类MTRR基因多态性的引物，包括如下核酸序列：
(1)扩增MTRR基因rs1801394多态性位点的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：1和SEQ ID NO.：2所示；
(2)用于检测MTRR基因rs1801394多态性位点的探针序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO.：3所示，其中探针的5末端标记FAM，3末端标记DABSYL。
上述引物对和荧光探针对在一次检测中共同使用。
上述分子信标探针法检测人类MTRR基因多态性的引物和探针在检测 MTRR基因多态性中的应用在本发明的保护范围之内。
一种分子信标探针法用于检测人类MTRR基因多态性的试剂盒，该试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针以及2x PCR反应混合液，阳性标准品。
一种分子信标探针法用于检测人类MTRR基因多态性的方法，包括如下步骤：
(1)提取人外周血基因组DNA；
(2)分别以提取的人外周血基因组DNA和阳性标准品为模板、权利要求1 和2中的引物、探针、PCR反应混合液，进行实时荧光定量PCR反应；
(3)根据检测到的荧光信号值对rs1801394位点进行溶解曲线基因型判定，其中荧光通道选择FAM通道，
作为优选，所述步骤(2)中，实时荧光定量PCR反应的扩增体系为：总体积20μL，2xPCR反应混合液10uL，SEQ ID NO.：1 0.02uM，SEQ ID NO.：2， 0.2uM，SEQ ID NO.：3 0.2uM，模板DNA 50ng。
进一步地，所述步骤(2)中，实时荧光定量PCR反应中的扩增程序为：95℃， 2min；95℃，5s，60℃，45s，收集荧光，50个循环；溶解曲线分析程序为：95℃ 1min；45℃2分钟，45-90℃，连续收集荧光。
本发明提供了一种分子信标探针法检测人类MTRR基因多态性的引物和试剂盒，实现了对MTRR基因多态性位点进行快速、简单的检测。本发明检测结果准确，易于判读。与测序法相比，该方法不需要对PCR产物进行一系列复杂的后续处理，PCR扩增和检测同步进行，整个检测过程无需开盖操作，降低了 PCR产物造成污染的风险，大大缩短了检测时间，降低了检测成本。
附图说明
图1为不同基因型对应的检测结果图示。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
步骤1：DNA提取
取200μL外周血，按照全血基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取 (购自杭州新捷生物科技有限公司)，提取DNA用于后续实验或者存放于-20℃。
步骤2：PCR扩增和检测
(1)扩增MTRR基因rs1801394多态性位点的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：1和SEQ ID NO.：2所示；
(2)用于检测MTRR基因rs1801394多态性位点的分子信标序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：3所示，其中探针的5末端标记FAM，3末端标记 DABSYL。
在0.2mL中，配制如下反应体系：总体积20μL，2x PCR反应混合液10uL， SEQ IDNO.：1 0.02uM，SEQ ID NO.：2，0.2uM，SEQ ID NO.：3 0.02uM，模板DNA 50ng。，加水补足至总体积20μL，同时设立阳性标准品和阴性对照。实时荧光定量PCR反应中的扩增程序为：95℃，2min；95℃，5s，60℃，45s，收集荧光，50个循环；溶解曲线分析程序为：95℃1min；45℃2分钟，45-90℃，连续收集荧光。
步骤3：结果分析
反应结束后，应用仪器自带软件进行数据分析。运行溶解曲线基因型分析程序，进行基因型判读。
步骤4：结果统计
10例标本的基因型结果统计如下：
以上所述，是本发明较佳的实施例，并非本发明任何形式上或实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的技术人员，在不脱离本发明的范围前提下，还可以对之做一些修改和改进，这些改进和补充也应该视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 天津迪安执信医学检验所有限公司
<120> 一种分子信标检测人类MTRR基因多态性的引物、试剂盒和方法及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgttacatg ccttgaagtg atga 24
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacggctcta accttatcgg att 23
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccgatgatc gcagaagaaa tatgtgagca agcatcggg 39
<210> 4
<211> 161
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgttacatg ccttgaagtg atgaggaggt ttctgttact atatgctaca cagcagggac 60
aggcaaaggc catcgcagaa gaaatatgtg agcaagctgt ggtacatgga ttttctgcag 120
atcttcactg tattagtgaa tccgataagg ttagagccgt t 161
<210> 5
<211> 161
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgttacatg ccttgaagtg atgaggaggt ttctgttact atatgctaca cagcagggac 60
aggcaaaggc catcgcagaa gaaatgtgtg agcaagctgt ggtacatgga ttttctgcag 120
atcttcactg tattagtgaa tccgataagg ttagagccgt t 161

Claims (6)

1.一种分子信标探针法检测人类MTRR基因多态性的引物，其特征在于，包括如下核酸序列：
(1)扩增MTRR基因rs1801394多态性位点的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：1和SEQ ID NO.：2所示；
(2)用于检测MTRR基因rs1801394多态性位点的探针序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO.：3所示，其中探针的5末端标记FAM，3末端标记DABSYL。
上述引物对和荧光探针对在一次检测中共同使用。
2.一种分子信标探针法检测人类MTRR基因多态性的引物在检测人类MTRR基因多态性中的应用。
3.一种分子信标探针法用于检测人类MTRR基因多态性的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针，以及2x PCR反应混合液，阳性标准品。
4.一种分子信标探针法用于检测人类MTRR基因多态性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取人外周血基因组DNA；
(2)分别以提取的人外周血基因组DNA和阳性标准品为模板、权利要求1和2中的引物、探针、PCR反应混合液，进行实时荧光定量PCR反应；
(3)根据检测到的荧光信号值对rs1801394位点进行溶解曲线基因型判定，其中荧光通道选择FAM通道。
5.根据权利要求4所述的分子信标探针法用于检测人类MTRR基因多态性的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，实时荧光定量PCR反应的扩增体系为：总体积20μL，2x PCR反应混合液10uL，SEQ ID NO.：1 0.02uM，SEQ ID NO.：2 0.2uM，SEQ ID NO.：3 0.2uM，模板DNA50ng。
6.根据权利要求5所述的分子信标探针法用于检测人类MTRR基因多态性的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，实时荧光定量PCR反应中的扩增程序为：95℃，2min；95℃，5s，60℃，45s，收集荧光，50个循环；溶解曲线分析程序为：95℃1min；45℃2分钟，45-90℃，连续收集荧光。
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