JP2011015679A - 黒色腫の早期検出のための方法及び試薬 - Google Patents

Abstract

【課題】黒色腫の同定方法を提供する。
【解決手段】黒色腫を示す特定の遺伝子の発現差異がカットオフ値を越えるか否かを測定することによる、生検組織中の早期悪性メラニン細胞を同定するためのアッセイを提供する。
【選択図】図１

Description

皮膚悪性黒色腫は重大な医療問題であり、米国で２００８年に、人々の間で少なくとも６２，０００の新たな浸潤性黒色腫症例が診断されると予想され、そのうち８，２００人がこの疾病で死亡すると思われる。黒色腫の発生率は、任意の他の悪性腫瘍の発生率と比較してより急速に上昇し続けている。また、黒色腫は、若い成人に最もよく見られる癌の１つであり、それ故、生命を失う平均年齢の観点から２番目の癌タイプである。

黒色腫及びその転移には所定のタンパク質が関係していることが示されている。これらのタンパク質又はそれらの活性は、転移を同定する免疫組織化学的検査に使用されており、Ｌ１ＣＡＭを含む（Ｔｈｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）、Ｆｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００３））、及びＳ−１００（Ｄｉｅｇｏ ｅｔ ａｌ．（２００３））。生物学的サンプル中の数千の遺伝子の発現を同時に監視するために、高密度マイクロアレイが適用されている。研究により、良性病変及び悪性病変で異なる発現を示した遺伝子、並びに予測値であり得る遺伝子を同定するに至った。Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）、及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）。悪性黒色腫の遺伝子発現プロファイリングは、８，１５０のｍＲＮＡ転写物の発現を監視するプローブを含むマイクロアレイにより行われた。Ｂｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）。これらの研究者は、攻撃的な腫瘍挙動に関連し得る数個の遺伝子を同定した。最近の業績では、黒色腫と正常なメラニン細胞の細胞ラインとの遺伝子発現プロファイルの比較により、黒色腫で異なる発現を示した遺伝子、及び調節された経路を同定するに至った。Ｔａｋｅｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）。加えて、前立腺分化因子ＧＤＦ１５、接着分子Ｌ１ＣＡＭ、及びキネシン様５、オステオポンチン、カテプシンＢ、カドヘリン３及びプレセニリン２を、黒色腫検出の有望なマーカーとして同定した（Ｔａｌａｎｔｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００５）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７））。

本発明は、組織サンプルを獲得し、ＳＩＬＶ（ｍｅ２０ｍ）（ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：１〜３）、及びチロシナーゼ（tyorsinase）（ＴＹＲ）（ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：４）に対応するｍＲＮＡをコードする遺伝子のサンプル中の発現レベルをアッセイ及び測定することによる、黒色腫の同定方法を提供する。試験したサンプル中のメラニン細胞の存在を確認する正規化（mormalization）対照として、ＴＹＲが使用された。本発明は更に、組織サンプルを獲得し、それぞれプライマー／プローブのセットＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：５〜７及び８〜１０により認識される、ＧＤＦ１５又はＬ１ＣＡＭの一方又は両方に対応するｍＲＮＡをコードする遺伝子のサンプル中の発現レベルをアッセイ及び測定し、所定のカットオフを越える遺伝子発現は、黒色腫の存在を示す、ことによる黒色腫の同定方法を提供する。

本発明はまた、組織サンプルを獲得し、ＳＩＬＶをコードする遺伝子のサンプル中の発現レベルをアッセイ及び測定し、所定のカットオフを越える遺伝子発現レベルは、サンプル中の黒色腫の存在を示す、ことによる悪性メラニン細胞を良性メラニン細胞から区別する方法を提供する。

本発明はまた、組織サンプルを獲得し、プライマー／プローブセットＳＥＱ／ＩＤ ＮＯ．：５〜７及び８〜１０により認識される、ＧＤＦ１５及びＬ１ＣＡＭの一方（ｏｅｎ）又は両方をコードする遺伝子のサンプル中の発現レベルをアッセイ及び測定することによる、悪性メラニン細胞を良性メラニン細胞から区別する方法を提供する。所定のカットオフを越える遺伝子発現レベルは、サンプル中の黒色腫の存在を示す。

本発明は更に、患者から組織サンプルを獲得し、ＳＩＬＶをコードする遺伝子のサンプル中の発現レベルをアッセイ及び測定し、所定のカットオフレベルを越える遺伝子発現レベルは、サンプル中の黒色腫の存在を示す、ことによる、患者処置プロトコールを決定する方法を提供する。

本発明は更に、患者から組織サンプルを獲得し、プライマー／プローブセットＳＥＱ．ＩＤ ＮＯＳ．：５〜７及び８〜１０により認識されるＧＤＦ１５及びＬ１ＣＡＭの一方又は両方をコードする遺伝子のサンプル中の発現レベルをアッセイ及び測定し、所定のカットオフレベルを越える遺伝子発現レベルは、サンプル中の黒色腫の存在を示す、ことによる、患者処置プロトコールを決定する方法を提供する。

最終的なマーカーはＳＩＬＶであり、本明細書において、任意の変異体、対立遺伝子等をコードする遺伝子として定義される。ＳＩＬＶは、ＭＥＬＡＮＯＣＹＴＥ ＰＲＯＴＥＩＮ １７、ＰＭＥＬ１７、ＰＲＥＭＥＬＡＮＯＳＯＭＡＬ ＰＲＯＴＥＩＮ、ＰＭＥＬ、ＧＰ１００、ＭＥ２０、ＳＩ、ＳＩＬ、Ｄ１２Ｓ５３Ｅとしても記載され、受入番号ＮＭ＿００６９２８．３で表される。本発明は更に、核酸増幅及び検出試薬を含む、細胞サンプル中の黒色腫の存在を測定するアッセイを行うためのキットを提供する。

本発明は更に、本発明の方法で得られたＰＣＲ産物を増幅及び検出するためのプライマー／プローブセットを提供する。これらのセットは、以下を含む。
ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：１、ＳＩＬＶ、フォワードプライマー、ＡＧＣＴＴＡＴＣＡＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡ
ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：２、ＳＩＬＶ、リバースプライマー、ＧＧＧＴＡＣＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴＴＧＣＴ
ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：３、ＳＩＬＶ、プローブ、ＦＡＭ−ＡＧＧＴＴＣＣＧＣＴＡＴＣＧＴＧＧＧＣＡＴ−ＢＨＱ１
ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：４、ＡＢＩ ＡｏＤ^＊、Ｈｓ００１６５９７６＿ｍ１
ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：５、ＧＤＦ１５、フォワードプライマー、ＣＧＣＣＡＧＡＡＧＴＧＣＧＧＣＴ
ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：６、ＧＤＦ１５、リバースプライマー、ＣＧＧＣＣＣＧＡＧＡＧＡＴＡＣＧＣ
ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：７、ＧＤＦ１５、ＭＧＢ Ｐｏｂｅ、ＦＡＭ−ＡＴＣＣＧＧＣＧＧＣＣＡＣ
ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：８、Ｌ１ＣＡＭ、フォワードプライマー、ＡＣＴＡＴＧＧＣＣＴＴＧＴＣＴＧＧＧＡＴＣＴＣ
ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：９、Ｌ１ＣＡＭ、リバースプライマー、ＡＧＡＴＡＴＧＧＡＡＣＣＴＧＡＡＧＴＴＧＣＡＣＴＧ
ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：１０、Ｌ１ＣＡＭ、ＭＧＢプローブ、ＦＡＭ−ＣＡＣＣＡＴＣＴＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣ

本発明は更に、本発明の方法に使用されるＰＣＲ方法で得られるアンプリコンを提供する。これらのアンプリコンは、以下を含む。
ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：１１、ＧＤＦ１５ ＰＣＲアンプリコン：ＣＧＣＣＡＧＡＡＧＴＧＣＧＧＣＴＧＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＧＴＡＴＣＴＣＴＣＧＧＧＣＣＧ
ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：１２ Ｌ１ＣＡＭ ＰＣＲアンプリコン：ＡＣＴＡＴＧＧＣＣＴＴＧＴＣＴＧＧＧＡＴＣＴＣＡＧＡＴＴＴＴＧＧＣＡＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＧＧＧＴＧＡＡＡＡＣＴＡＣＡＧＴＧＴＣＧＴＣＴＣＣＴＧＧＧＴＣＣＣＣＡＡＧＧＡ
ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：１３ ＳＩＬＶ ＰＣＲアンプリコン：ＡＧＣＴＴＡＴＣＡＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧＧＣＣＴＴＧＧＧＣＡＧＧＴＴＣＣＧＣＴＧＡＴＣＧＴＧＧＧＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧＧＴＧＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＴＧＧＴＣＣＴＴＧＣＡＴＴＡＴＧＡＡＧＣＡＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＧＴＡＣＣＣＣＴＣＴＧＡＴＡＴＡＴＡＧＧＣＧＣＡＧＡＣＴ
ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：１４ ＴＹＲ ＰＣＲアンプリコン：ＴＣＴＧＣＴＧＧＴＡＴＴＴＴＴＣＴＧＴＡＡＡＧＡＣＣＡＴＴＴＧＣＡＡＡＡＴＴＧＴＡＡＣＣＴＡＡＴＡＣＡＡＡＧＴＧＴＡＧＣＣＴＴＣＴＴＣＣＡＡ

良性と悪性の皮膚病変の区別におけるＳＩＬＶ、ＧＤＦ１５及びＬ１ＣＡＭのパフォーマンスを示すグラフ。 明白な（unequivocal）黒色腫と良性母斑の区別におけるＳＩＬＶ、ＧＤＦ１５及びＬ１ＣＡＭの感度対特異性をプロットするグラフ。 黒色腫と非定型母斑の区別におけるＳＩＬＶのパフォーマンスのグラフ。 明白な黒色腫と良性母斑の区別におけるＳＩＬＶの感度対特異性をプロットするグラフ。

本発明は、黒色腫の定性的及び定量的同定、悪性メラニン細胞の良性メラニン細胞からの区別、不確かな病理学的特徴を有するメラニン細胞病変の診断、並びに黒色腫患者処置プロトコールの決定の方法を提供する。本発明は更に、患者予後、患者監視及び薬剤開発における補助を提供する。本方法は、黒色腫生検アッセイに関する最終マーカーとしてのＳＩＬＶ（ｍｅ２０ｍ）の発現レベルのアッセイ及び測定に依存し、ＴＹＲ正規化対照に対する所定のレベルの遺伝子発現が、アッセイしたサンプル中の悪性メラニン細胞の存在を示す。

本発明は、パラフィン包埋（「ＦＦＰＥ」）組織を使用して、不確かな形態学的特徴を有する病変、又は曖昧な（equivocal）症例と称される疑わしい（suspicious）原発性メラニン細胞病変を含む、様々な皮膚病変の中から悪性黒色腫を診断するための、同定された遺伝子発現マーカーの有用性に焦点を当てる。この設定において、皮膚病理専門医の意見の間で相違が生じている。したがって、本発明の有用性は、ＲＴ−ＰＣＲに基づく遺伝子発現アッセイにて良性メラニン細胞皮膚病変を原発性黒色腫から区別する遺伝子発現マーカーを同定して、疑わしい病変にて黒色腫を診断することである。

総ＲＮＡを４７つの原発性黒色腫、４８つの良性皮膚母斑から単離し、４８つの非定型母斑及び５０つの黒色腫を含む９８つの非定型／疑わしい母斑（皮膚病理学者により指定）組織標本をＲＴ−ＰＣＲを使用して分析した。黒色腫特異的な遺伝子、ＳＩＬＶ、ＧＤＦ１５及びＬ１ＣＡＭの異なる遺伝子発現を、黒色腫、良性母斑及び非定型の／疑わしい皮膚サンプルに関して、一段階定量ＲＴ−ＰＣＲアッセイにより試験した。結果は、最終マーカーとしてのＳＩＬＶの使用の、良性又は悪性メラニン細胞を含む臨床的に関連した組織サンプルを区別する能力を証明した。

高密度ｃＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドマイクロアレイにより、数千の遺伝子の発現の同時監視が可能となる。マイクロアレイ技術は、ｍＲＮＡの存在量を定量的に測定し、遺伝子発現に基づいたマーカー発見のためのツールとして一般に認められている。癌研究の状況では、マイクロアレイ分析は、異なる癌タイプに関して、良性及び悪性病変で異なる発現を示した遺伝子、又は予測有意性を有する遺伝子を同定している。Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）、Ｓｕ ｅｔ ａｌ．（２００１）、Ｈｅｎｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００３）、及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）。最初の悪性黒色腫の遺伝子発現プロファイリングは、８，１５０のｍＤＮＡ転写物（trabscript）用のプローブを含むマイクロアレイを使用し、攻撃的な腫瘍挙動に関連し得る遺伝子を同定した。Ｂｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）。彼らの研究で分析されたサンプルは、正常な又は良性のメラニン細胞を含む組織を有さなかったため、悪性黒色腫で異なる発現を示した遺伝子は同定されなかった。正常な皮膚と対比して、良性母斑中のメラニン細胞の含有量は、黒色腫中のものに近い。

他の研究では、黒色腫又は良性母斑組織のいずれかに由来する２つのプールしたサンプルをｃＤＮＡアレイにハイブリダイズし、黒色腫由来又は母斑由来のサンプル中で優位に発現された遺伝子を見出した。Ｓｅｙｋｏｒａ ｅｔ ａｌ．（２００３）。他の研究者らは、黒色腫細胞ライン上で生成したＳＡＧＥライブラリーの差引きハイブリダイゼーション又は分析を使用して、黒色腫中の遺伝子発現を監視した。Ｈｉｐｆｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０００）、及びＷｅｅｒａｒａｔｎａ（２００４）。最近、少数の黒色腫と正常なメラニン細胞の細胞ラインとの遺伝子発現プロファイルの比較により、黒色腫で異なる発現を示した遺伝子、及び調節された経路を同定するに至った。Ｈｏｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００４）。これらの研究が黒色腫ゲノミクスの確かな基盤を提供する一方、黒色腫を良性組織から明確に区別できるマーカーは全く存在しない。チロシナーゼ、ＨＭＢ−４５、ｍａｒｔ−ａ／Ｍｅｌａｎｉｎ−ａ及びＭＩＴＦ等の、現在使用されている数種のマーカーは、メラニン細胞腫瘍同定に関する予測値を有することが証明されていないＰｈｓｉｅ ｅｔａｌ．（２００８）その結果、これらのマーカーは、限定された臨床用途を有することが見出されている。

その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００７０１５４８８９号に開示されているように、ＰＣＲは黒色腫の転移を検出するのに十分な特異性及び感度を有することが示されている。本発明では、原発性皮膚生検からの、黒色腫の非黒色腫病変からの区別において改善された診断パフォーマンスを有する方法を提供する。本発明のアッセイは、疑わしい又は曖昧な病変から、明確な（clear-cut）又は明白な病変を診断するのに有用である。したがって、本発明は、早期組織サンプルの試験にて特定の有用性を見出すことができる。好ましくは、確率測定は、黒色腫を有する組織を良性メラニン細胞又は正常な組織と区別するであろう。

本発明の方法は、ＦＦＰＥ組織サンプルから核酸を抽出する迅速技術と、原発性皮膚病変内の黒色腫を示す核酸断片を増幅及び検出する方法とを使用する。核酸断片は、マーカー遺伝子によりコードされたｍＲＮＡを、定性的及び定量的に測定する。組織サンプルは、穿孔、針、切除又は薄片生検に由来する皮膚病変を含む。本明細書で提供する方法は、原発性皮膚生検サンプル中の黒色腫検出を可能にし、それにより医師は、早期疾病のための適切な処置プロトコールを直ちに実行するか否かを決定することができる。本発明の方法では、アッセイを行うのに使用する組織を十分にサンプリングすることが重要である。これは、組織サンプルの適切な切除及び処理、並びにＲＮＡの抽出を含む。組織サンプルを得た後、存在する任意の癌性細胞が検出されるよう組織サンプルを適切に処理することが重要である。

本発明の一方法において、ＲＮＡは、ＦＦＰＥ組織サンプルブロックから単離される。例えばＲｏｃｈｅ製のＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｐａｒａｆｆｉｎ Ｋｉｔ（Ｃａｔ．＃３２７０２８９）等、任意の好適な市販のパラフィンキットを使用することができる。好ましくは、ＦＦＰＥサンプルは、包埋された腫瘍の寸法（sixe）に従って、以下のように切片とされる。≦２〜５ｍｍを９×１０μｍの切片とし、≧６〜８ｍｍを６×１０μｍの切片とする。切片を製造業者の指示書に従って脱パラフィン処理し、単離したＲＮＡをリボヌクレアーゼフリーの水中に−８０℃で保管し得る。

遺伝子発現を測定するためのｍＲＮＡレベルの測定の場合、アッセイは、当技術分野で公知の任意の手段を用いることができ、ＰＣＲ、ローリングサークル型増幅（Rolling Circle Amplification）（ＲＣＡ）、リガーゼ連鎖反応（Ligase Chain Reaction）（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（Strand Displacement Amplification）（ＳＤＡ）、核酸配列ベース増幅（Nucleic Acid Sequence Based Amplification）（ＮＡＳＢＡ）及びその他等の方法を含む。関与する迅速分子診断は、最も好ましくはＱＲＴ−ＰＣＲを含む定量的ＰＣＲ方法である。検出は、マイクロアレイ、遺伝子チップ及び蛍光を含む、当技術分野にて公知の任意の方法を用いることができる。

典型的なＰＣＲは、標的核酸種を選択的に増幅する多重増幅ステップ又はサイクルを含む。典型的なＰＣＲは、３つの工程を含む。標的核酸を変性させる変性工程、ＰＣＲプライマー（フォワード及びバックワードプライマー）のセットが相補的なＤＮＡ鎖にアニールするアニーリング工程、並びに熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがプライマーを伸長する伸長工程。この工程を多数回繰り返すことにより、ＤＮＡ断片が増幅されて、標的ＤＮＡ配列に対応するアンプリコンが生成される。典型的なＰＣＲは、変性、アニーリング及び伸長の２０回以上のサイクルを含む。多くの場合、アニーリング及び伸長の工程は、同時に行われ得、その場合、サイクルは２回の工程のみを含む。

本発明の一実施形態において、ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応は、これらの各工程の長さが、分ではなく秒の範囲内にあり得る時間中、行われ得る。詳細には、１秒当たり少なくとも約５℃の熱勾配速度を生成可能な、ＲＴ−ＰＣＲ増幅が３０分間以下の、所定の新しいサーマルサイクラーが使用され得る。より好ましくは、増幅は２５分間未満で行われる。このことを考慮に入れて、ＰＣＲサイクルの各工程に提供される以下の時間は、勾配時間を含まない。変性工程は、１０秒間以下の時間、行われ得る。事実、いくつかのサーマルサイクラーは、「０秒」の設定を有し、これは変性工程の最適持続時間であり得る。即ち、これはサーマルサイクラーが変性温度に到達するのに十分である。アニーリング及び伸長の工程は、それぞれ１０秒未満が最も好ましく、同一温度で行われる場合、アニーリング／伸長工程の組み合わせは、１０秒未満であり得る。いくつかの均一プローブ検出方法は、急速アッセイパフォーマンスを最大にするために別つの伸長工程を必要とし得る。総増幅時間と非特異的な副反応との両方を最小にするために、アニーリング温度は典型的には５０℃を越える。より好ましくは、アニーリング温度は、５５℃を越える。

いくつかの理由により、実験者の介入が全く存在しないＲＴ−ＰＣＲに関する単一の組み合わせ反応が望ましい。（１）実験者の間違いの危険性を低減する、（２）標的又は産物の汚染の危険性を低減する、及び（３）アッセイ速度を上昇させる。反応は、１種又は２種のいずれかのポリメラーゼからなり得る。２種のポリメラーゼの場合、これらの酵素の一方は、典型的にはＲＮＡ−ベースのＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）であり、もう一方は、熱安定性ＤＮＡ−ベースのＤＮＡポリメラーゼである。アッセイパフォーマンスを最大にするために、これら両方の酵素の機能のために「ホットスタート（hot start）」技術の形態を使用することが好ましい。米国特許第５，４１１，８７６号及び同第５，９８５，６１９号は、異なる「ホットスタート」手法の例を提供し、参照により本明細書に組み込まれる。好ましい方法は、効率的なＤＮＡ重合に必要な１種以上の成分を隔離する、１つ以上の熱活性化（thermoactivation）方法の使用を含む。米国特許第５，５５０，０４４号及び同第５，４１３，９２４号は、そのような方法に使用するための試薬の調製方法を記載し、またこれらは参照により本明細書に組み込まれる。米国特許第６，４０３，３４１号は、ＰＣＲ試薬成分の１つの化学的改変を含む隔離手法を記載し、これらは参照により本明細書に組み込まれる。最も好ましい実施形態では、単一の酵素中にＲＮＡ−及びＤＮＡ−依存性ポリメラーゼ活性の両方が存在する。効率的な増幅に必要な他の成分としては、ヌクレオシド三リン酸、二価塩及び緩衝液成分が挙げられる。ある場合に、非特異的核酸及び酵素安定剤が有益であり得る。

好ましいＲＴ−ＰＣＲにおいて、所定の逆転写酵素及びＰＣＲ成分の量は、いくつかサーマルサイクラーのより速い勾配時間を利用するよう不規則である。詳細には、プライマー濃度は非常に高い。

逆転写酵素反応のための典型的な遺伝子特異的プライマー濃度は、約２０ｎＭ未満である。１〜２分のオーダーの迅速な逆転写酵素反応を達成するために、逆転写酵素プライマー濃度を２０ｎＭ越、好ましくは少なくとも約５０ｎＭ越、典型的には約１００ｎＭに増大させる。標準的なＰＣＲプライマー濃度は、１００ｎＭ〜３００ｎＭの範囲である。標準的なＰＣＲに、より高い濃度を使用して、Ｔｍ変動を補償してもよい。しかしながら、本明細書の目的において、引用したプライマー濃度は、Ｔｍ補償が必要ない環境用である。Ｔｍ補償が必要又は所望される場合、比例して高いプライマー濃度は、経験により決定及び使用することができる。迅速ＰＣＲを達成するために、ＰＣＲプライマー濃度は、一般に２５０ｎＭ越、好ましくは約３００ｎＭ越、典型的には約５００ｎＭである。

商業的に使用されている診断法は、好ましくは、負の結果の場合に備えて、特定の増幅反応の作用（operation）を確認する内部正対照も使用する。ＲＴ−ＰＣＲにて制御する必要がある誤った負の結果の潜在的な原因には、不十分なＲＮＡ品質、ＲＮＡの分解、ＲＴ及び／又はＰＣＲの阻害、並びに実験者の間違いがある。

遺伝子発現を測定するためにタンパク質レベルを測定する場合、十分な特異性及び感度を生じるのであれば、当技術分野で公知の任意の方法が好適である。例えば、タンパク質レベルは、タンパク質に特異的な抗体又は抗体断片に結合させ、抗体結合タンパク質の量を測定することにより測定することができる。抗体を放射性、蛍光又は他の検出可能な試薬により標識して、検出を容易にすることができる。検出の方法には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び免疫ブロット法があるが、これらに限定されない。

本発明は、組織サンプル中の悪性メラニン細胞を同定するのに十分な特異性及び感度を提供する。本発明は、そのマーカーでコードされたｍＲＮＡを測定することにより、特定のマーカー遺伝子、ＳＩＬＶの発現を測定する。本明細書にて示される結果により、ＳＩＬＶが、黒色腫と良性の明白な症例との明確な区別、及び疑わしい組織グループのサンプル中の異なる異型サブグループの明確な区別を示す優れたマーカーであることが示される。マーカーＳＩＬＶは、本明細書ではＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜３を含む任意の変異体、対立遺伝子等をコードする遺伝子として定義される。

本発明の方法では、チロシナーゼを対照遺伝子として使用して、組織サンプル中のメラニン細胞の存在を示し、またメラニン細胞の含有量に関して正規化する。チロシナーゼは、Ｍａｎｄｅｌｃｏｒｎ−Ｍｏｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）及び米国特許第６，１５３，３８８号により記載され、受入番号ＮＭ＿０００３７２として表される。チロシナーゼは、ＰＣＲアンプリコンＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４を用いたＡＢＩアッセイオンデマンド（Ｈｓ００１６５９７６＿ｍ１）により認識されるｍＲＮＡをコードする遺伝子としても定義される。

所定の増幅ベースの分子診断の特異性はいずれも、プライマーセットの同定に高く依存するが、排他的にではない。プライマーセットは、標的ＤＮＡ配列にアニールして標的配列を増幅させることにより、標的配列特異的なアンプリコンを生成する一対のフォワード及びリバースオリゴヌクレオチドプライマーである。プライマーは、関心対象の疾病状態のマーカーを増幅可能である必要がある。本発明の場合、マーカーは、黒色腫に指向される。

反応は、特定のシグナルを検出するいくつかの手段も含む必要がある。これは、好ましくは、関心対象の標的配列の重合から誘導されたＤＮＡ配列の領域を検出する試薬の使用により達成される。検出用の好ましい試薬は、関心対象の特定の核酸配列に結合した際に、測定可能なシグナル差異を与える。多くの場合、これらの方法は、関心対象の配列に結合した際に、蛍光を増大させる核酸プローブに関係する。典型的には、本発明の方法の反応の進行は、各ＰＣＲプライマーセットのアンプリコン生成の相対的な速度を分析することにより監視される。

本発明は更に、プライマー／プローブのセット、及び特許請求された方法におけるそれらの使用を含む。配列ＩＤは：ＳＥＱ，ＩＤ Ｎｏｓ．：１〜１０である。アンプリコン生成は、二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光プライマー、並びに蛍光プローブ及び蛍光染料を含むが、これらに限定されない多数の検出試薬及び方法により監視することができる。分子指標、スコーピオン（Scorpion）及び他の検出スキームも使用することができる。ＰＣＲの通常の監視方法は、蛍光加水分解プローブ（fluorescent hydrolysis probe）アッセイを使用する。この方法は、所定の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ又はＴｆｌ ＤＮＡポリメラーゼ等）の５’ヌクレアーゼ活性を利用して、ＰＣＲプロセス中にオリゴマープローブを切断する。

本発明は更に、本発明の方法で使用されるＰＣＲ方法により得られるアンプリコンを提供する。これらのアンプリコンは、配列：ＳＥＱ．ＩＤ Ｎｏｓ：１１〜１４を含む。

オリゴマーは、伸長条件下で、増幅された配列にアニールするよう選択される。プローブは、一般にその５’末端に蛍光レポーターを有し、３’末端にレポーターの蛍光クエンチャーを有する。オリゴマーが無傷である限り、レポーターからの蛍光シグナルは消光される。しかしながら、オリゴマーが伸長プロセス中に消化される場合、蛍光レポーターはもはやクエンチャーの近接に存在しない。所定のアンプリコンに関する遊離蛍光レポーターの相対的な蓄積を、対照サンプルに関する同じアンプリコン、及び／又は非限定的にβ−Ａｃｔｉｎ又はＰＢＧＤ等の対照遺伝子に関する同じアンプリコンの蓄積と比較して、ＲＮＡ集団中の所定のＲＮＡの所定のｃＤＮＡ産物の相対的な存在量を決定することができる。蛍光加水分解プローブアッセイ用の製品及び試薬は、商業的に容易に、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手することができる。

最も好ましい検出試薬は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）であり、これらは参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２１０，０１５号、同第５，４８７，９７２号及び同第５，８０４，３７５号に記載されている。本質的に、これらのプローブは、ＰＣＲに使用されるポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によるプローブ上の蛍光−クエンチャー組み合わせの分離に基づく核酸検出に関与する。任意のマーカー又は対照のために、任意の好適なフルオロフォアを使用することができる。そのようなフルオロフォアには、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｃａｌ Ｒｅｄ、Ｆａｍ、Ｃｙ３及びＣｙ５が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、以下のフルオロフォアが、記述したマーカーに対応する。ＰＬＡＢ：Ｆａｍ、Ｌ１ＣＡＭ：Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ又はＣａｌ Ｒｅｄ、チロシナーゼ：Ｃ１、ＰＢＧＤ：Ｃｙ５。ＰＣＲ及びＱＲＴ−ＰＣＲにおけるアンプリコン蓄積を制御及び監視するための装置及びソフトウェアも容易に入手可能であり、それらはＳｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＣｅｐｈｅｉｄから市販されているＳｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒサーモサイクラー、及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されているＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを含む。

ＱＲＴ−ＰＣＲに関して記載した方法の商業化において、特定の核酸を検出する所定のキットが特に有用である。一実施形態において、キットは、マーカーを増幅及び検出するための試薬を備える。場合により、キットは、リンパ節組織から核酸を抽出するためのサンプル調製試薬及び又は物品（例えば、チューブ）を備える。キットは、サンプル汚染の危険性を最小にする物品も備え得る（例えば、リンパ節切開及び調製のための使い捨てメス及び表面）。

好ましいキット内に、逆転写酵素、逆転写酵素プライマー、対応するＰＣＲプライマーセット（好ましくはマーカー及び対照用）、Ｔａｑポリメラーゼ等の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、並びに非限定的にスコーピオンプローブ、蛍光加水分解プローブアッセイ用のプローブ、分子指標プローブ、単一染色プライマー、又は臭化エチジウム等の二本鎖ＤＮＡに特異的な蛍光染料等の好適な検出試薬（１種又は複数種）等の、上述したワンチューブＱＲＴ−ＰＣＲ法（one-tube QRT-PCR process）に必要な試薬が含まれる。プライマーは、上述した高い濃度を与える量が好ましい。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、通常、様々な製造業者から市販されている。キット内の更なる材料は、好適な反応チューブ又はバイアル、典型的にはサックスビーズ（wax bead）、場合によりマグネシウムを含むバリア組成物、必要な緩衝液及びｄＮＴＰ等の試薬を含む、逆転写酵素及びＰＣＲ段階用の反応混合物（典型的には１０Ｘ）、ヌクレアーゼ又はリボヌクレアーゼフリー水、リボヌクレアーゼ阻害剤、逆転写酵素及び／又はＱＲＴ−ＰＣＲのＰＣＲ段階に使用し得る対照核酸（１種又は複数種）並びに／又は任意の更なる緩衝液、化合物、補因子、イオン成分、タンパク質及び酵素、ポリマー類等を含んでもよい。場合により、キットは、核酸抽出試薬及び材料を備える。キット内には指示書も含まれることが好ましい。

以下の実施例は、本発明を説明するためのものであって、特許請求された発明を限定するためのものではない。

（実施例１）
患者の臨床的及び病理学的特徴
２０４つのＦＦＰＥ皮膚生検組織標本を、Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌで診断された原発性メラニン細胞皮膚病変を有する患者から選択した。一連の患者は、侵襲的黒色腫又は良性母斑の明白な特徴を有する１０２つの標本と、様々な程度の細胞異型を有する１０２つの標本とを含んでいた。これらの非定型標本を最初、疑わしい／非定型として分類し、次に熟達した皮膚病理専門医により非定型母斑又は悪性黒色腫として決定された。サンプル調製工程後、２つの患者サンプルを不十分なＲＮＡ収量（３５０ｎｇ未満）のため除外した。更なる９つのＲＮＡサンプルをＰＣＲ制御の失敗により除外した。分析に適格な最終的なサンプルセットは、４７つの黒色腫、４８つの良性母斑、並びに皮膚病理専門医により指定された４８つの非定型母斑及び５０つの黒色腫を含む９８つの非定型／疑わしいものからなる１９３つの生検組織（元のサンプルセットの９５％）からなっていた。黒色腫サンプルの病理学的及び臨床的特徴の概略を、表１に示す。

病態により提供された臨床的データに基づき、サンプルを最も良性から最も悪性の症例へ順序付けた。組織学的診断を使用して、進行黒色腫、黒色腫、重度の異型、中度の異型、及び良性母斑からなる５つの主なカテゴリを形成し、１９３つのサンプルのそれぞれをこれらのグループに当てはめた。悪性黒子型黒色腫、上皮内黒色腫、及び表在性侵襲性（superficial invasive）黒色腫を組み合わせて、単一の黒色腫カテゴリとした。進行性特徴（Ｔ２以上の表在拡大型、及び結節型又は転移性）を有する黒色腫の２セットを進行黒色腫グループに加えた。二元分類は、進行黒色腫及び黒色腫を悪性に、残りのクラスを良性に分割することに基づいていた。この層別化は、黒色腫として分類された４７つの明白な病変及び５０つの重度の非定型病変を有する９７つの悪性症例と、４８つの良性及び４８つの非定型母斑を表す９６つの良性症例とを含んでいた。記載した更なる全データ分析は、進行黒色腫、黒色腫及び良性の３つのグループの１つに分類される明白な症例に関して示され、また進行黒色腫、黒色腫、重度及び中度の異型の４つのグループの１つに分類される曖昧な症例に関して示される。

（実施例２）
組織調製
２０４つの組織サンプルを、原発性メラニン細胞皮膚病変と診断された個人から収集した。全てのサンプルを病変の寸法、深さ及び医師の判断に応じて切除、穿孔、又は薄片生検を使用して収集し、ＦＦＰＥブロック中に包埋した。

ＦＦＰＥブロックから全ＲＮＡを、Ｒｏｃｈｅ製の標準的なＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＲＮＡパラフィンキット（カタログ＃３２７０２８９）を、以下の変更を伴い使用して単離した。パラフィン包埋組織サンプルを、包埋された腫瘍の寸法に応じて切片とした（２〜５ｍｍ以下＝９×１０μｍ、６〜８ｍｍ以上＝６×１０μｍ）。切片を、製造業者の指示書に従って脱パラフィン処理した。単離したＲＮＡを、使用まで、リボヌクレアーゼフリーの水中にて−８０℃で保管した。

生検タイプによる分布と、抽出されたＲＮＡの収量を、それぞれ表２ａ及び表２ｂに示す。１０．５、４．５及び６つのスライドの総平均に対応する平均ＲＮＡ収量は、３つのタイプの全生検を通じて同等であった。生検技術における差異に基づくアッセイパフォーマンスの偏りは、全く観察されなかた。

（実施例３）
ＲＮＡ特異的なプライマーを用いた単一の一段階ｑＲＴＰＣＲアッセイ及びカットオフ確立
黒色腫、良性母斑、及び非定型／疑わしいＦＦＰＥ組織からのＲＮＡを用いた一段階ＲＴ−ＰＣＲにより、選択された遺伝子の発現の評価を行った。標本（specifmen）は、２連のサンプル：１）明白な又は明確な黒色腫（menaoma）及び良性母斑症例、並びに２．）様々な程度の異型を有するサンプルを含んでいた。チロシナーゼ（「ＴＹＲ」）をハウスキーピング遺伝子として使用して、反応中の投入量及びＲＮＡ品質を制御した。デオキシリボヌクレアーゼ処理は用いなかった。代わりに、プライマー又はプローブを、ゲノムＤＮＡについて報告しないように、イントロンにまたがるよう設計した。全部のプライマー／プローブセットを、商業的なベンダー（Ｏｎｃｏｍａｔｒｉｘ）からの１０つの黒色腫及び１０つの良性母斑ＦＦＰＥ組織から単離した２０つの全ＲＮＡ標本のセット上で予め選別した。最高に機能したプライマー−プローブセットを、４つのマーカーのそれぞれに関して選択した。配列を下記の表３に列挙する。

遺伝子発現マーカーＧＤＦ−１５、ＳＩＬＶ及びＬ１ＣＡＭを正規化対照チロシナーゼ（「ＴＹＲ」）と共に黒色腫生検アッセイにて、単一反応ＲＴ−ＰＣＲフォーマットを用いてＡＢＩ７９００プラットホーム上で試験した。単一の一段階ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを、以下のプロトコールに従って行った。５０ｎｇの総ＲＮＡをｑＲＴ−ＰＣＲに使用した。総ＲＮＡを、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に収容されている４０Ｘ Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ及びリボヌクレアーゼミックスを使用して、逆転写した。次に、ＵＮＧを使用して２ｘ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘにｃＤＮＡを供し、ＡＢＩ ７９００ ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上で、３８４ウェルフォーマットにて１０μＬの反応サイズを用いてＰＣＲ増幅を行った。各反応物は、５．０μＬの２Ｘ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、０．５μＬのプライマー／プローブミックス、０．２５μＬの４０Ｘ Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ酵素、及びリボヌクレアーゼ阻害剤Ｍｉｘ、０．２５μＬのｄＮＴＰ及び４μＬの１２．５ｎｇ／μＬの総ＲＮＡから構成されていた。最終的なプライマー／プローブミックスは、表３に列挙される最終濃度９００ｎＭのフォワード及びリバースプライマーと、２５０ｎＭの蛍光プローブとから構成されていた。ｄＮＴＰミックスは、それぞれ最終濃度２０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰを含んでいた。逆転写のために反応混合物を４８℃で３０分間インキュベートし、次いで９５℃のＡｍｐｌｉｔａｑ活性化工程を１０分間行い、最終的に９５℃で１５秒間の変性、６０℃で１分間のアニール及び伸長を４０サイクル行った。反応に使用した配列は、以下の通りであり、それぞれ５’から３’方向へ記載されている。

各サンプルに関して、ΔＣｔ＝Ｃｔ（標的遺伝子）−Ｃｔ ＴＹＲを計算した。ΔＣｔは、臨床的ＲＴ−ＰＣＲアッセイに広く使用されており、直接的な方法として選択された。Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）。

ＡＢＩ７９００出力ファイルから得たＣｔ値を、データ分析に使用した。単一反応のアッセイ形態において、ＴＹＲ Ｃｔ＜３０を生成するサンプルのみを分析した。各マーカーに関するＣｔ値を生Ｃｔｓとして表し、以下の式を使用して、メラニン細胞特異的なマーカー、ＴＹＲに対して正規化した。
Ｃｔ（正規化）＝Ｃｔ（マーカー）−ＣＴ（ＴＹＲ）

アッセイで提供された診断を、皮膚病理検査と比較した。アッセイパフォーマンスを見積もるために、Ｒソフトウェアパッケージバージョン２．５．０．（チームＲＤＣｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を使用するＲＯＣ曲線解析に基づき、ＡＵＣ値を計算した。

明確な（明白な）症例に関して、良性病変と比較して黒色腫において３つの黒色腫特異的なマーカーの発現の増大が示された（表４、図１ａ）。明確な（明白な）症例において、良性母斑と黒色腫サンプルとの間にＳＩＬＶ及びＧＤＦ１５の有意な発現差異が観察された（２．８及び１．２倍、それぞれｐ値＜０．００１及び０．００３）。しかしながら、Ｌ１ＣＡＭは、０．２倍の変化という遙かに低い差異を示し、良性と悪性の明確な症例との間で統計的有意性は存在しなかった（ｐ＝０．４７）（図１）。それ故、このマーカーは、更なる分析から除外された。ＳＩＬＶは最高のパフォーマンスを示し、３つの患者グループ（進行黒色腫、黒色腫及び良性症例）全体で線形応答を有し、病理学で定義されるような疾病状態の連続的な変化の程度を示した。

単変量ＲＯＣ曲線解析を使用して、ＳＩＬＶ及びＧＤＦ１５のパフォーマンスを、明白な黒色腫と良性母斑との間の区別に関して評価した。図２に示すように、ＡＵＣ値は、それぞれ０．９４及び０．６７であった。線形回帰モデルを用いた多変量解析に基づき、ＳＩＬＶとＧＤＦ１５との組み合わせは、明白な症例においてアッセイパフォーマンスをＡＵＶ０．９４を越えて改善しなかった。したがって、ＧＤＦ１５は、疑わしい（曖昧な症例）の分析に関して更に追跡しなかった。最終的に、ＴＹＲへの正規化は、生Ｃｔ値を使用した場合の０．７８と比較して、ＳＩＬＶのパフォーマンスを０．９４に改善した。

ＳＩＬＶのパフォーマンスを、疑わしい症例と明白な良性の症例とを比較（compring）することにより、更に評価した。ｎ＝２のため進行黒色腫を除外して、曖昧なサンプル中のＳＩＬＶの平均ΔＣｔをそれぞれ組織学により、明白な良性グループの平均ΔＣｔと比較した。明白な良性サンプルに対するｔ検定比較に関する平均ΔＣｔ値及びｐ値を、下記の表５に列挙する。ＳＩＬＶは、疑わしい黒色腫と、疑わしい非定型グループのそれぞれとの間で有意に異なっていた。黒色腫対重度の異型、ｐ値＝０．００７７、及び黒色腫対中度の異型、ｐ値＝０．０００９。

図１〜図４は、ＳＩＬＶが優れたマーカーであり、黒色腫と良性な曖昧な症例との間を、また組織サンプルの疑わしいグループにおいて異なる異型サブグループ間を明確に区別することを確認する。

皮膚病理専門医の観点から、色素性病変が重度の非定型母斑であるか、又は黒色腫の閾値に到達しているかを決定する単一の基準は存在しない。皮膚病理専門医は、少なくとも１０つの別個の組織学的特徴と取り込む。免疫組織学化学的マーカーのいずれの１つも、悪性メラニン細胞の増殖から良性のものを区別できない。

本発明は、黒色腫の特定の遺伝子シグネチャーを同定及び確認することにより、黒色腫のメラニン細胞病変からの区別において改善された診断パフォーマンスを有する黒色腫生検アッセイを示す。試験結果は、黒色腫で異なる発現を示した少なくとも２つの遺伝子の進行的な増大を示した：ＳＩＬＶ及びＧＤＦ１５。しかしながら、線形回帰モデルを用いた多変量分析に基づき、ＧＤＦ１５の添加は、明確な症例において、ＳＩＬＶパフォーマンスをＡＵＣ０．９４を越えて向上させなかった。したがって、ＳＩＬＶは、黒色腫生検アッセイの最終的なマーカーとして指定される。有意な差異は、ＳＩＬＶに関して重度の非定型母斑と黒色腫との間にも観察され、ｐ値は０．００７７であり、このマーカーを明確な（明白な）及び疑わしい（曖昧な）症例の両方の診断に適用可能とした。後者は熟達した皮膚病理専門医にとって最も困難な挑戦である。

〔実施の態様〕
（１） 黒色腫の同定方法において、
ａ．組織サンプルを獲得する工程と、
ｂ．ＳＩＬＶ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１〜３及び１３）に対応するｍＲＮＡをコードする遺伝子の前記サンプル中の発現レベルを測定する工程と、を含む、方法。
（２） チロシナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４及び１４）をコードする遺伝子の発現レベルを測定することを更に含む、実施態様１に記載の方法。
（３） ＴＹＲに対するＳＩＬＶの発現レベルを測定する、実施態様１及び３に記載の方法。
（４） 前記サンプルが原発性皮膚生検サンプルである、実施態様１〜３のいずれかに記載の方法。
（５） 遺伝子発現がマイクロアレイ又は遺伝子チップ上で測定される、実施態様１〜３のいずれかに記載の方法。
（６） 遺伝子発現が、前記サンプルから抽出したＲＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行われる核酸増幅によって測定される、実施態様１〜３のいずれかに記載の方法。
（７） 黒色腫の診断に関する確率が、実施態様１〜３のいずれかから決定される方法。

Claims (7)

1. 黒色腫の同定方法において、
   ａ．組織サンプルを獲得する工程と、
   ｂ．ＳＩＬＶ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１〜３及び１３）に対応するｍＲＮＡをコードする遺伝子の前記サンプル中の発現レベルを測定する工程と、を含む、方法。
2. チロシナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４及び１４）をコードする遺伝子の発現レベルを測定することを更に含む、請求項１に記載の方法。
3. ＴＹＲに対するＳＩＬＶの発現レベルを測定する、請求項１及び３に記載の方法。
4. 前記サンプルが原発性皮膚生検サンプルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 遺伝子発現がマイクロアレイ又は遺伝子チップ上で測定される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
6. 遺伝子発現が、前記サンプルから抽出したＲＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行われる核酸増幅によって測定される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
7. 黒色腫の診断に関する確率が、請求項１〜３のいずれか一項から決定される方法。

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