BRPI1006640B1

BRPI1006640B1 - método para identificar um melanoma em uma amostra de tecido

Info

Publication number: BRPI1006640B1
Application number: BRPI1006640-3A
Authority: BR
Inventors: Dmitri Talantov; John F. Palma; Tim Jatkoe; Tatiana Vener; Yixin Wang; Haiying Wang
Original assignee: Veridex, Llc
Priority date: 2009-07-08
Filing date: 2010-07-08
Publication date: 2020-12-29
Also published as: DK2272989T3; CA2709106C; KR20110004800A; IL206810A0; US20110009288A1; BRPI1006640B8; EP2272989B1; EP2272989A1; CN101948915A; CN101948915B; JP2011015679A; BRPI1006640A2; IL206810A; MX2010007514A; CA2709106A1; ES2617090T3

Abstract

MÉTODOS E REAGENTES PARA A DETECÇÃO PRECOCE DE MELANOMA. A presente invenção refere-se a um teste para identificar um melanócito maligno nos estágios iniciais em tecidos de biópsia que consiste em determinar se a expressão diferencial de um gene específico indicativo de melanoma excede um valor de corte.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se ao melanoma cutâneomaligno é um sério problema de saúde com expectativa de pelo menos 62.000 novos casos de melanoma invasivo diagnosticados em pessoas em 2008 nos Estados Unidos, dentre os quais 8.200 morrerão desta doença. A incidência de melanoma continua a aumentar mais rapidamente que a incidência de qualquer outra malignidade. Adicionalmente, ele é um dos cânceres mais comuns em adultos jovens e, desta forma, é o segundo tipo de câncer em termos média de anos de perda de vida.

[0002] Certas proteínas mostraram-se associadas ao melanoma eàs suas metástases. Estas proteínas ou suas atividades têm sido usadas em imunoistoquímica para identificar metástases e incluem L1CAM (Thies et al. (2002); Fogel et al. (2003)); e S-100 (Diego et al. (2003)). Microarranjos de alta densidade foram aplicados para monitorar simultaneamente a expressão de milhares de genes em amostras biológicas. Os estudos resultaram na identificação de genes diferencialmente expressos em lesões benignas e malignas, assim como genes que poderiam ter um valor prognóstico. Luo et al. (2001); e Wang et al. (2004). O perfil de expressão gênica de melanoma maligno foi realizado com um microarranjo contendo sondas que monitoram a expressão de 8.150 transcritos de mRNA. Bittner et al. (2000). Estes pesquisadores identificaram vários genes que poderiam estar associados ao comportamento agressivo do tumor. Em um trabalho recente, a comparação entre os perfis de expressão gênica do melanoma e a linhagem de células de melanócito normais levou à identificação de genes diferencialmente expressos e de vias moduladas no melanoma. Takeuchi et al. (2004). Adicionalmente, o fator de diferenciação depróstata GDF15, a molécula de adesão L1CAM, e proteína tipo quinesina 5, osteopontina, catepsina B, caderina 3, e presenilina 2 foram identificados como marcadores promissores para a detecção de melanoma. (Talantov et al. (2005); Wang et al. (2007)).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0003] A presente invenção apresenta um método de identificaçãode um melanoma que consiste em: obter uma amostra de tecido; testar e medir os níveis de expressão nas amostras de genes que codificam mRNA correspondente a SILV (me20m) (SEQ. ID NO: 1-3), e tirosinase (TYR) (SEQ. ID NO: 4). A TYR foi usada com um controle de normalização que confirma a presença de melanócitos na amostra testada. A invenção fornece, adicionalmente, um método para identificar um melanoma que consiste em obter uma amostra de tecido; e testar e medir os níveis de expressão nas amostras de genes que codificam mRNA que corresponde a um ou a ambos dentre GDF15 e L1CAM, e são reconhecidos pelos conjuntos de iniciador/sonda SEQ. ID NOs.: 5 a 7 e 8 a 10, respectivamente, onde a expressão gênica acima de um valor de corte predeterminado é indicativo da presença de um melanoma.

[0004] A invenção fornece, também, um método para distinguir ummelanócito maligno de um melanócito benigno que consiste em obter uma amostra de tecido; e testar e medir os níveis de expressão nas amostras de genes que codificam SILV, onde níveis de expressão gênica acima de um valor de corte predeterminado são indicativos da presença de um melanoma na amostra.

[0005] A invenção fornece, também, um método para distinguir ummelanócito maligno de um melanócito benigno que consiste em obter uma amostra de tecido; e testar e medir os níveis de expressão na amostra para genes que codificam umouambosdentre GDF15 eL1CAM e sãoreconhecidos pelos conjuntos de iniciador/sonda SEQ IDNO.: 5 a 7 e 8 a 10. Níveis de expressão gênica acima de um valor decorte predeterminado são indicativos da presença de um melanoma naamostra

[0006] A invenção fornece, adicionalmente, um método paradeterminar o protocolo de tratamento do paciente que consiste emobter uma amostra de tecido do paciente; e testar e medir os níveis deexpressão na amostra de genes que codificam SILV, onde níveis deexpressão gênica acima de um valor de corte predeterminado sãoindicativos da presença de um melanoma na amostra.

[0007] A invenção fornece, adicionalmente, um método paradeterminar o protocolo de tratamento do paciente que consiste emobter uma amostra de tecido do paciente; e testar e medir os níveis deexpressão na amostra de genes que codificam um ou ambos dentreGDF15 e L1CAM reconhecidos pelos conjuntos de iniciador/sondaSEQ. ID NOS.: 5 a 7 e 8 a 10, onde níveis de expressão gênica acimade um valor de corte predeterminado são indicativos da presença de um melanoma na amostra.

[0008] O marcador final é SILV e é aqui definido como o gene quecodifica qualquer variante, alelo etc. O SILV é também descrito comoPROTEÍNA DE MELANÓCITO 17; PMEL17; PROTEÍNA PREMELANOSSOMAL; PMEL; GP100; ME20; SI; SIL; D12S53E erepresentado pelo número de acesso NM_006928.3. A invençãofornece, adicionalmente, um kit para realizar um teste para determinar a presença de melanoma em uma amostra de célula que compreende:amplificação de ácido nucleico e reagentes de detecção.

[0009] A invenção fornece, adicionalmente, conjuntos deiniciadores/ sondas para a amplificação e detecção de produtos dePCR obtidos nos métodos da invenção. Estes conjuntos incluem osseguintes: SEQ. ID NO: 1, SILV, iniciador de sentido direto, AGCTTATCATGCCTG GTCAA SEQ. ID NO: 2, SILV, iniciador de sentido reverso, GGGTACGGAGAAGTCT TGCT SEQ. ID NO: 3, SILV, sonda, FAM- AGGTTCCGCTATCGTGGGCAT-BHQ1 SEQ. ID NO: 4, ABI AoD*, Hs00165976_m1 SEQ. ID NO: 5, GDF15, iniciador de sentido direto, CGCCAGAAGTGCG GCT SEQ. ID NO: 6, GDF15, iniciador de sentido reverso, CGGCCCGAGAGATA CGC SEQ. ID NO: 7, GDF15, sonda MGB, FAM-ATCCGGCGGCCAC SEQ. ID NO: 8, L1CAM, iniciador de sentido direto, ACTATGGCCTTGTCTG GGATCTC SEQ. ID NO: 9, L1CAM, iniciador de sentido reverso, AGATATGGAACCTGA AGTTGCACTG SEQ. ID NO: 10, L1CAM, sonda MGB, FAM-CACCATCTCAGCCACAGC

[00010] A invenção fornece, adicionalmente, amplicons obtidos pelos métodos de PCR utilizados nos métodos da invenção. Estes amplicons incluem os seguintes: SEQ. ID NO: 11, amplicon de PCR de GDF15:CGCCAGAAGTGCGGCT GGGATCCGGCGGCCACCTGCACCTGCGTATCTCTCGGGCCG SEQ. ID NO: 12, amplicon de PCR de L1CAM:ACTATGGCCTTGTCTGGGA TCTCAGATTTTGGCAACATCTCAGCCACAGCGGGTGAAAACTACA GTGTCGTCTCCTGGGTCCCCAAGGA SEQ. ID NO: 13, amplicon de PCR de SILV:AGCTTATCATGCCTGGTCA AGAAGCAGGCCTTGGGCAGGTTCCGCTGATCGTGGGCATCTTGC TGGTGTTGATGGCTGTGGTCCTTGCATTATGAAGCAAGACTTCTC CGTACCCCTCTGATATATAGGCGCAGACT SEQ. ID NO: 14, amplicon de PCR de TYR:TCTGCTGGTATTTTTCTGTAA AGACCATTTGCAAAATTGTAACCTAATACAAAGTGTAGCCTTCTTC CAA

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00011] A figura 1 é um gráfico de desempenho de SILV, GDF15 e L1CAM mostrando a distinção entre lesões de pele benignas e malignas.

[00012] A figura 2 é um gráfico que plota a sensibilidade versus especificidade de SILV, GDF15 e L1CAM na distinção de melanomas inequívocos e nevos benignos.

[00013] A figura 3 é um gráfico de desempenho de SILV que mostra a distinção entre melanoma e nevos atípicos.

[00014] A figura 4 é um gráfico que plota a sensibilidade versus especificidade de SILV na distinção de melanomas inequívocos e nevos benignos.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00015] A presente invenção apresenta métodos para identificar qualitativamente e quantitativamente um melanoma; distinguir um melanócito maligno de um melanócito benigno; diagnosticar lesões melanocíticas com características patológicas incertas; determinar o protocolo de tratamento do paciente com melanoma Os métodos fornecem, adicionalmente, auxílios no prognóstico de pacientes, monitoramento de pacientes e desenvolvimento de fármacos. Os métodos se baseiam ainda em testar e medir os níveis de expressão de SILV (me20m) como um marcador final para testes de biópsia de melanoma onde um determinado nível de expressão gênica, em relação ao controle de normalização de TYR, é indicativo da presença de um melanócito maligno na amostra testada.

[00016] A presente invenção refere-se à utilidade de marcadores identificados de expressão gênica para diagnosticar, com o uso de tecidos incluídos em parafina ("FFPE"), melanoma maligno dentre várias lesões na pele, incluindo lesões com características morfológicas incertas ou lesões melanocíticas primárias suspeitas, chamadas de casos equívocos. Neste cenário é onde ocorrem discrepâncias de opinião entre os dermatopatologistas. Desta forma, a utilidade desta invenção é identificar marcadores de expressão gênica que diferenciam lesões de pele melanocíticas benignas de melanomas primários em testes de expressão gênica baseados em RT-PCR para o diagnóstico de melanoma em lesões suspeitas.

[00017] O RNA total foi isolado de 47 melanomas primários, 48 nevos de pele benignos, e 98 nevos atípicos/suspeitos incluindo 48 nevos atípicos e 50 melanomas (conforme atribuído pelos dermatopatologistas). As amostras de tecido foram analisadas com o uso de RT-PCR. A expressão gênica diferencial de três genes específicos de melanoma, SILV, GDF15, e L1CAM, foi testada por um teste de RT-PCR quantitativo em uma etapa nas amostras de pele de melanoma, nevos benignos e atípicos/suspeitos. Os resultados demonstraram a capacidade de usar SILV como um marcador final para diferenciar amostras de tecido clinicamente relevantes contendo melanócitos benignos ou malignos.

[00018] Microarranjos de cDNA de alta densidade e de oligonucleotídeos permitem o monitoramento simultâneo da expressão de milhares de genes. A tecnologia de microarranjo fornece uma medição quantitativa da abundância de mRNA e tem ganho aceitação como uma ferramenta para a descoberta de marcadores baseados na expressão gênica. No contexto da pesquisa do câncer, a análise de microarranjo identificou genes expressos diferencialmente em lesões benignas e malignas para diferentes tipos de câncer ou lesões que têm significado prognóstico. Luo et al. (2001); Su et al. (2001); Henshall et al. (2003); e Wang et al. (2004). A primeira definição do perfil de expressão gênica de melanoma maligno usou um microarranjo contendo sondas para 8.150 transcritos de mDNA e identificou genes que poderiam estar associados ao comportamento agressivo do tumor. Bittner et al. (2000). Já que as amostras analisadas no seu estudo não incluíram tecidos contendo melanócitos normais ou benignos, genes diferencialmente expressos no melanoma maligno não foram identificados. Ao contrário da pele normal, o conteúdo de melanócito em nevos benignos é próximo daquele no melanoma.

[00019] Em um outro estudo, duas amostras agrupadas derivadas de melanoma ou de tecidos de nevos benignos foram hibridizadas a um arranjo de cDNA e genes preferencialmente expressos em amostras derivadas de melanoma ou de nevos foram encontrados. Seykora et al. (2003). Outros pesquisadores usaram hibridização subtrativa ou análise de bibliotecas SAGE geradas em linhagem celulares de melanoma para monitorar a expressão gênica no melanoma. Hipfel et al. (2000); e Weeraratna (2004). Recentemente, a comparação entre os perfis de expressão gênica de algumas linhagem de células de melanoma e melanócitos levou à identificação de genes diferencialmente expressos e de vias moduladas no melanoma. Hoek et al. (2004). Embora estes estudos forneçam uma base sólida para a genômica do melanoma, não há marcador que possa diferenciar claramente o melanoma do tecido benigno. Vários marcadores atual- mente usados, como a tirosinase, HMB-45, mart-a/Melanina-a e MITF não provaram ter valor prognóstico para a identificação de tumor melanocítico Phsie et al. (2008). Consequentemente, estes marcadores encontraram uso clínico limitado.

[00020] Como descrito na publicação de patente americana n° 20070154889, incorporada aqui na sua totalidade por referência, foi demonstrado que o PCR tem especificidade e sensibilidade suficientes para detectar metástase de melanoma. Na presente invenção, é fornecido um método com desempenho diagnóstico aprimorado para a diferenciação de lesões de melanoma e de não melanoma a partir de biópsias primárias de pele. O teste da invenção é útil para diagnosticar lesões bem definidas ou inequívocas de lesões suspeitas ou equívocas. Desta forma, a presente invenção pode encontrar utilidade particular no teste de amostra de tecido de estágios iniciais. De preferência, uma medição de probalidade distinguirá tecidos que têm melanoma em relação a melanócito benigno ou tecido normal.

[00021] Os métodos da invenção empregam uma técnica rápida para extrair ácido nucleico de amostras de tecido FFPE e um método para amplificar e detectar fragmentos de ácido nucleico indicativos de melanoma em lesões primárias de pele. Os fragmentos de ácido nucleico medem qualitativamente e quantitativamente o mRNA codificado pelo gene marcador. As amostra de tecido incluem lesões na pele derivadas de biópsias de punção, agulha, remoção ou raspagem. Os métodos aqui fornecidos permitem a detecção do melanoma em amostras de biópsias primárias de pele permitindo a um médico determinar se deve implementar imediatamente um protocolo de tratamento adequado para doença em estágio inicial. Nos métodos da invenção, é importante amostrar adequadamente o tecido para conduzir o ensaio. Isto inclui a remoção e o processamento apropriados da amostra de tecido assim como a extração de RNA. Uma vez obtidas, é importante processar as amostras de tecido apropriadamente para que quaisquer células cancerosas presentes sejam detectadas.

[00022] Em um método da invenção, o RNA é isolado de um bloco de amostra de tecido FFPE. Qualquer kit de parafina adequado comercialmente disponível pode ser usado, tal como High Pure RNA Paraffin Kit obtido junto à Roche (n° de catálogo 3270289). De preferência, as amostras de FFPE são cortadas de acordo com o tamanho do tumor incluído, da seguinte forma: < 2 a 5 mm cortado para 9 x 10 μm; > 6 a 8 mm cortado para 6 x 10 μm. Os cortes são desparafinizados de acordo com as instruções do fabricante e o RNA isolado pode ser armazenado em água isenta de RNase a -80°C.

[00023] No caso de medir os níveis de mRNA para determinar a expressão gênica, os testes podem ser realizados por quaisquer meios conhecidos na técnica e incluem métodos como PCR, amplificação do tipo Rolling Circle (RCA), reação em cadeia da ligase (LCR), amplificação por deslocamento de fita (SDA), amplificação baseada na sequência de ácido nucleico (NASBA), e outros. Os diagnósticos moleculares rápidos envolvidos são, com a máxima preferência, os métodos de PCR quantitativos, incluindo QRT-PCR. A detecção pode ser feita por qualquer método conhecido na técnica incluindo microarranjo, chips de genes e fluorescência.

[00024] Uma reação de PCR típica inclui múltiplas etapas de ampli- ficação, ou ciclos, que amplificam seletivamente espécies de ácido nucleico-alvo. Uma reação de PCR típica inclui três etapas: uma etapa de desnaturação na qual um ácido nucleico alvo é desnaturado; uma etapa de anelamento na qual um conjunto de iniciadores de PCR (iniciadores de sentido direto e reverso) anelam a fitas de DNA complementares; e uma etapa de extensão na qual uma DNA polimerase termoestável alonga os iniciadores. Pela repetição múltipla desta etapas, um fragmento de DNA é amplificado para produzir um amplicon, que corresponde à sequência de DNA-alvo. Uma reação de PCR típica inclui 20 ou mais ciclos de desnaturação, anelamento e extensão. Frequentemente, as etapas de anelamento e extensão podem ser realizadas simultaneamente, e neste caso o ciclo contém apenas duas etapas.

[00025] Em uma modalidade da invenção, a reação de amplificação de RT-PCR pode ser conduzida em um tempo tal que a duração de cada uma destas etapas pode situar-se na faixa de segundos, ao invés de minutos. Especificamente, com determinados termocicladores novos que são capazes de gerar uma taxa de aumento de temperatura de pelo menos cerca de 5 °C por segundo, amplificações por RT-PCR em 30 minutos ou menos são usadas. Com mais preferência, as amplificações são conduzidas em menos de 25 minutos. Com isto em mente, os tempos, a seguir, fornecidos para cada etapa do ciclo de PCR, não incluem os tempos de aumento. A etapa de desnaturação pode ser conduzida em tempos de 10 segundos ou menos. De fato, alguns termocicladores tem ajustes para "0 segundos" que pode ser a duração ótima da etapa de desnaturação. Isto é, é suficiente que o termociclador atinja a temperatura de desnaturação. As etapas de anelamento e extensão são, com a máxima preferência, menores que 10 segundos cada, e quando conduzidas na mesma temperatura, a combinação da etapa de anelamento/extensão pode ser menor que 10 segundos. Alguns métodos de detecção homogênea por sonda podem exigir uma etapa separada de extensão para maximizar o rápido desempenho do teste. De modo a minimizar o tempo total de amplificação e a formação de reações colaterais inespecíficas, as temperaturas de anelamento são tipicamente acima de 50°C. Com mais preferência, as temperaturas de anelamento são acima de 55°C.

[00026] Uma reação única combinada para RT-PCR, sem intervenção do pesquisador, é desejável por várias razões: (1) redução do risco de erro do pesquisador; (2) redução do risco de contaminação do alvo ou produto; e (3) aumento da velocidade do teste. A reação pode consistir em uma ou duas polimerases. No caso de duas polimerases, uma destas enzimas é tipicamente uma polimerase de DNA dependente de RNA (transcriptase reversa) e uma é uma polimerase de DNA termoestável. Para maximizar o desempenho do teste, é preferível empregar uma forma de tecnologia de "partida a quente" para ambas estas funções enzimáticas. As patentes U.S. 5.411.876 e 5.985.619 fornecem exemplos de diferentes abordagens de "partida a quente" e estão aqui incorporadas, a título de referência. Os métodos preferenciais incluem o uso de um ou mais métodos de termoativação que sequestram um ou mais dos componentes necessários para a polimerização eficaz do DNA. As patentes U.S. 5.550.044 e 5.413.924 descrevem métodos para preparar reagentes para uso em tais métodos e estão aqui incorporadas a título dereferência. A patente U.S. 6.403.341 descreve uma abordagemsequestrante que envolve a alteração química de um doscomponentes reagentes de PCR e está aqui incorporada, a título de referência. Na modalidade da máxima preferência, ambas asatividades de polimerase dependente de RNA e DNA residem em uma única enzima. Outros componentes que são necessários para amplificação eficaz incluem trifosfatos de nucleosídeo, sais divalentes e componentes tampão. Em alguns casos, estabilizadores de enzima e ácidos nucleicos inespecíficos podem ser benéficos.

[00027] Na RT-PCR preferencial, as quantidades de certas transcriptases reversas e dos componentes de PCR são atípicas de modo a tirar vantagem dos tempos de aumento de temperatura mais rápidos de alguns termocicladores. Especificamente, as concentrações dos iniciadores são muito altas.

[00028] As concentrações típicas de iniciadores gene-específicos para reações com transcriptase reversa são menores que cerca de 20 nM. Para se obter uma reação com transcriptase reversa rápida na ordem de um a dois minutos, a concentração do iniciador da transcriptase reversa é elevada para mais de 20 nM, de preferência pelo menos cerca de 50 nM, e tipicamente cerca de 100 nM. As concentrações dos iniciadores para uma reação de PCR padrão estão na faixa de 100 nM a 300 nM. Concentrações mais elevadas podem ser usadas em uma reação de PCR padrão para compensar as variações de Tm. Entretanto, para os propósitos da presente invenção, as referidas concentrações dos iniciadores são para as circunstâncias nas quais nenhuma compensação de Tm é necessária. Concentrações proporcionalmente maiores de iniciadores podem ser determinadas empiricamente e usadas se compensação da Tm for necessária ou desejada. Para se obter uma reação de PCR rápida, as concentrações dos iniciadores de PCR são tipicamente maiores que 250 nM, de preferência maiores que cerca de 300 nM e tipicamente de cerca de 500 nM.

[00029] Diagnósticos usados comercialmente também empregam, de preferência, um ou mais controles positivos internos que confirmam a operação de uma reação de amplificação particular no caso de um resultado negativo. As potenciais causas de resultados falso-negativos que devem ser controlados em uma RT-PCR incluem: quantidade inadequada de RNA, degradação de RNA, inibição de RT e/ou PCR e erro do pesquisador.

[00030] No caso de medir os níveis de proteína para determinar a expressão gênica, qualquer método conhecido na técnica é adequado contanto que ele resulte em especificidade e sensibilidade adequadas. Por exemplo, os níveis de proteína podem ser medidos pela ligação a um anticorpo ou a um fragmento de anticorpo específico para a proteína e a medição da quantidade de proteína ligada ao anticorpo. Os anticorpos podem ser marcados por reagentes radioativos, fluorescentes ou outros reagentes detectáveis para facilitar a detecção. Os métodos de detecção incluem, porém não se limitam a, Ensaio Imunossorvente Ligado a Enzima (ELISA) e técnicas de immunoblot.

[00031] A invenção fornece especificidade e sensibilidade suficientes para identificar um melanócito maligno em uma amostra de tecido. Os métodos determinam a expressão de um gene marcador particular, o SILV, mediante a medição de mRNA codificado pelo marcador. Os resultados apresentados aqui mostram que o SILV é um marcador importante que demonstra a clara discriminação entre melanoma e casos benignos inequívocos, assim como entre diferentes subgrupos atípicos em amostras de tecido de grupos suspeitos. O marcador SILV é aqui definido como o gene que codifica qualquer variante, alelo etc. incluindo SEQ ID NO: 1 a 3.

[00032] Nos métodos da invenção, a tirosinase é usada como um gene de controle para demonstrar a presença de melanócitos na amostra de tecido e para normalizar o conteúdo melanocítico. A tirosinase é descrita por Mandelcorn-Monson et al. (2003); e na patente U.S. n° 6.153.388 e é representada pelo número de acesso NM_000372. A tirosinase é também identificada como o gene que codifica mRNA reconhecido pelo teste ABI sob demanda (Hs00165976_m1) com o amplicon de PCR SEQ ID NO: 14.

[00033] A especificidade de qualquer diagnóstico molecularbaseado em amplificação se baseia grandemente, mas não exclusivamente, na identidade dos conjuntos de iniciadores. Os conjuntos de iniciadores são pares de iniciadores de oligonucleotídeos no sentido direto e no sentido reverso que anelam a uma sequência de DNA-alvo para permitir a amplificação da sequência alvo produzindo, assim, um amplicon específico para a sequência-alvo. Os iniciadores devem ser capazes de amplificar marcadores dos estados de doença de interesse. No caso de da presente invenção, o marcador é direcionado para melanoma.

[00034] A reação deve ainda conter algum meio de detecção de um sinal específico. Isto é realizado, de preferência, através do uso de um reagente que detecta uma região da sequência de DNA derivada de polimerização da sequência alvo de interesse. Reagentespreferenciais para detecção dão um sinal mensurável diferencialquando ligados a uma sequência de ácido nucleico específica deinteresse. Frequentemente, estes métodos envolvem sondas de ácido nucleico que geram aumento de fluorescência quando ligadas àsequência de interesse. Tipicamente, o progresso das reações dos métodos da invenção é monitorado pela análise das taxas relativas de produção de amplicon para cada conjunto de iniciadores de PCR.

[00035] A invenção inclui, ainda, conjuntos de iniciadores/sondas e seus usos nos métodos reivindicados. As identidades de sequência são: SEQ. ID Nos.: 1 a 10. O monitoramento da produção de amplicon pode ser obtido por inúmeros reagentes e métodos de detecção, incluindo sem limitação, iniciadores fluorescentes, e sondas fluorogênicas e corantes fluorescentes que se ligam ao DNA dupla-fita. Sondas do tipo molecular beacons, Scorpions, e outros esquemas de detecção podem também ser usados. Um método comum para monitoramento de uma reação de PCR emprega um ensaio de sonda de hidrólise fluorescente. Este método explora a atividade 5’ nuclease de determinadas DNA polimerases termoestáveis (como Taq ou Tfl DNA polimerases) para clivar uma sonda oligomérica durante o processo de PCR.

[00036] A invenção fornece, adicionalmente, amplicons obtidos pelos métodos de PCR utilizados nos métodos da invenção. Estes amplicons incluem as sequências: SEQ. ID Nos: 11 a 14.

[00037] O oligômero é selecionado para anelar à sequência amplificada alvo sob condições de extensão. A sonda tem, tipicamente um repórter fluorescente na sua extremidade 5’ e um supressor fluorescente do repórter na extremidade 3’. Contanto que o oligômero esteja intacto, o sinal fluorescente do repórter está suprimido. Entretanto, quando o oligômero é digerido durante o processo de extensão, o repórter fluorescente não está mais próximo ao supressor. O acúmulo relativo do repórter fluorescente livre para um dado amplicon pode ser comparado ao acúmulo dos mesmos amplicons para uma amostra de controle e/ou daquele de um gene de controle, como, sem limitação, β-Actina ou PBGD para determinar a abundância relativa de um dado produto de cDNA de um dado RNA em uma população de RNA. Os produtos e reagentes para o teste com sonda de hidrólise fluorescente são prontamente disponíveis comercialmente, por exemplo, junto à Applied Biosystems.

[00038] Os reagentes de detecção da máxima preferência são as sondas TaqMan® (Roche Diagnostics, Branchburg, NJ) e eles são descritos nas patentes U.S. 5.210.015, 5.487.972 e 5.804.375incorporadas aqui por referência. Essencialmente, estas sondas envolvem a detecção de ácido nucleico por meio da separação de uma combinação flúor-supressor em uma sonda através da atividade 5’-3’ exonuclease da polimerase usada na reação de PCR. Qualquer fluoróforo adequado pode ser usado para qualquer um dos marcadores ou controles. Tais fluoróforos incluem, porém não se limitam a, Texas Red, Cal Red, Fam, Cy3 e Cy5. Em uma modalidade, os seguintes fluoróforos correspondem aos marcadores citados: PLAB: Fam; L1CAM: Texas Red ou Cal Red, tirosinase: C1; PBGD: Cy5. O equipamento e o programa também são prontamente disponíveis para controlar e monitorar o acúmulo do amplicon na reação de PCR e QRT-PCR incluindo o termociclador Smart Cycler disponível comercialmente junto à Cepheid de Sunnyvale, Califórnia, e o ABI Prism 7900 Sequence Detection System, disponível comercialmente junto à Applied Biosystems.

[00039] Na comercialização dos métodos descritos para QRT-PCR certos kits para detecção de ácidos nucleicos específicos são particularmente úteis. Em uma modalidade, o kit inclui reagentes para amplificar e detectar os marcadores. Opcionalmente, o kit inclui reagentes de preparação da amostra e/ou artigos (por exemplo, tubos) para extrair os ácidos nucleicos do tecido do linfonodo. Os kits podem também incluir artigos para minimizar o risco de contaminação da amostra (por exemplo, bisturi descartável e superfície para dissecção e preparação de linfonodo).

[00040] Em um kit preferencial, os reagentes necessários para o processo de QRT-PCR em um tubo descritos acima estão incluídos, como transcriptase reversa, um iniciador de transcriptase reversa, um conjunto de iniciadores de PCR correspondente (de preferência para os marcadores e controles), uma DNA polimerase termoestável, como Taq polimerase, e reagente(s) de detecção adequado(s), como, sem limitação, uma sonda scorpion, uma sonda para um teste de sonda de hidrólise fluorescente, uma sonda do tipo molecular beacon, um iniciador de corante único ou um corante fluorescente específico para DNA dupla-fita, como brometo de etídio. Os iniciadores estão, de preferência, em quantidades que geram as altas concentrações descritas acima. DNA polimerases termoestáveis são comumente e comercialmente disponíveis junto à uma variedade de fabricantes. Materiais adicionais no kit podem incluir: tubos ou frascos de reação adequados, uma composição de barreira, tipicamente uma microesfera de cera, opcionalmente incluindo magnésio; misturas de reação (tipicamente 10X) para a transcriptase reversa e para os estágios da reação de PCR, incluindo os tampões e reagentes necessários como dNTPs; água isenta de nucleases ou de RNases; inibidor de RNase; ácido nucleico(s) de controle e/ou quaisquer tampões adicionais, compostos, cofatores, constituintes iônicos, proteínas e enzimas, polímeros, e similares que podem ser usados em transcriptase reversa e/ou estágios de PCR de QRT-PCR. Opcionalmente, os kits incluem reagentes e materiais de extração de ácido nucleico. Instruções são, de preferência, também incluídas nos kits.

[00041] Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar, porém não limitam a invenção reivindicada.

Exemplo 1 Características clínicas e patológicas dos pacientes

[00042] 204 amostras de tecido de biópsia de pele FFPE foramselecionadas de pacientes com lesões primárias de pele melanocíticas diagnosticadas no Georgetown University Hospital. A série de pacientes incluiu amostras com 102 características inequívocas de melanoma invasivo ou nevos benignos e 102 amostras com graus variados de atipia celular. Estas amostras atípicas foram inicialmente classificadas como suspeitas/atípicas e subsequentemente separadas por dermatopatologistas especialistas como nevos atípicos ou melanoma maligno. Duas amostras de pacientes foram excluídas devido ao insuficiente rendimento de RNA (menor que 350 ng) após a etapa de preparação da amostra. Mais nove amostras de RNA foram excluídas devido à falha do controle da reação de PCR. O conjunto final das amostras qualificado para análise consistiu em 193 tecidos de biópsia (95% do conjunto de amostras original) representando 47 melanomas, 48 nevos benignos e 98 atípicas/suspeitas, incluindo 48 nevos atípicos e 50 melanomas conforme atribuído pelos dermatopatologistas. Um resumo das características clínicas e patológicas das amostras de melanoma é mostrada na tabela 1. Tabela 1.

[00043] As amostras foram ordenadas dos casos mais benignos para os mais malignos, com base nos dados clínicos fornecidos pela patologia. Com o uso de um diagnóstico histológico, cinco grandes categorias foram criadas: melanoma avançado, melanoma, atipia grave, atipia moderada e nevos benignos, com cada uma das 193 amostras encaixando-se em um destes grupos. O melanoma de lentigem maligno, melanoma in situ, e melanomas invasivos superficiais foram combinados em uma única categoria de melanoma. Dois grupos de melanomas com características avançadas (espalhamento superficial com T2 e mais e nodular ou metastático) foram adicionados no grupo de melanoma avançado. Uma classificação binária foi baseada na divisão dos melanomas avançados e melanomas em malignos, e as classes restantes como benignos. Esta estratificação continha 97 casos malignos com 47 lesões inequívocas e 50 gravemente atípicas classificadas como melanomas, e 96 casos benignos representando 48 nevos benigos e 48 atípicos. Todas as análises de dados adicionais descritas é apresentada para os casos inequívocos classificados em um dos 3 grupos: melanoma avançado, melanoma e benigno e para os casos equívocos classificados em um dos 4 grupos: melanoma avançado, melanoma, atipia grave e moderada.

Exemplo 2 Preparação de tecidos

[00044] Duzentas e quatro amostras de tecido foram coletadas de indivíduos diagnosticados com lesões primárias de pele melanocíticas. Todas as amostras foram coletadas usando biópsia de remoção, punção, ou raspagem dependendo do tamanho e profundidade da lesão, e do julgamento do médico e incluídas em blocos de FFPE.

[00045] O RNA total foi isolado a partir dos blocos de FFPE com o uso de um kit para parafina padrão, High Pure RNA paraffin Kit, obtido junto à Roche (n° de Catálogo 3270289) com as seguintes modificações. As amostras de tecido incluídas em parafina foram cortadas de acordo com o tamanho do tumor incluído (2 a 5 mm ou menor = 9 x 10 μm, 6 a 8 mm ou maior = 6 x 10 μm). Os cortes foram desparafinizados de acordo com as instruções do fabricante. O RNA isolado foi armazenado em água isenta de RNase a -80°C até o uso.

[00046] As distribuições por tipo de biópsia e por rendimento de RNA extraído são apresentadas nas tabelas 2a e 2b, respectivamente. Os rendimentos de RNA medianos, que correspondem a uma média total de 10,5; 4,5 e 6 lâminas foram equivalentes entre todos os três tipos de biópsias. Nenhuma inclinação no desempenho do teste foi observada com base nas diferenças nas técnicas de biópsia. Tabela 2a

Tabela 2b

Exemplo 3 Testes únicos de qRTPCR em uma etapa com o uso de iniciadores específicos para RNA e estabelecimento de valor de corte

[00047] A avaliação da expressão de genes selecionados foi executada com RT-PCR em uma etapa com RNA de tecido de FFPE melanoma, nevos benignos, e atípicos/suspeitos. As amostras incluíram duas séries de amostras: 1) casos de melanoma e nevos benignos inequívocos ou bem definidos e 2) amostras com graus variados de atipia. A tirosinase ("TYR") foi usada como um gene demanutenção para controlar a quantidade adicionada e a qualidade doRNA nas reações. Tratamento com DNase não foi usado. Ao invésdisso, os iniciadores ou sondas foram desenhados para abranger umíntron para que eles não fornecessem informações sobre o DNAgenômico. Todos os conjuntos de iniciadores/sondas foram pré-triadosem um conjunto de 20 amostras de RNA total isoladas a partir de 10tecidos FFPE de melanomas e 10 de nevos benignos junto a umfornecedor comercial (Oncomatrix). O conjunto de iniciador-sonda commelhor desempenho foi selecionado para cada um dos quatromarcadores. As sequências são listadas na tabela 3 abaixo.

[00048] Os marcadores de expressão gênica GDF-15, SILV, eL1CAM junto com a tirosinase ("TYR") de controle de normalizaçãoforam testados em um teste de biópsia de melanoma com o uso de umformato de reação de RT-PCR único na plataforma ABI7900. Os testesde qRT-PCR único em uma etapa foram executados de acordo com oseguinte protocolo. 50 ng de RNA total foi usado para a reação deqRT-PCR. O RNA total foi transcrito de forma reversa com o uso dosreagentes Multiscribe 40X e mistura de inibidor de RNase presentesno kit TAQMAN® One Step PCR Master Mix Reagents Kit (AppliedBiosystems, Foster City, CA, EUA). O cDNA foi então submetido aoreagente 2x Master Mix com o uso de UNG e a amplificação por PCRfoi executada no sistema ABI 7900 HT Sequence Detection System(Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) no formato de 384 poçoscom o uso de um tamanho de reação de 10 L. Cada reação foicomposta de 5,0 L de 2X One Step RT-PCR Master Mix, 0,5 L demistura de iniciador/sonda, 0,25 L de enzima 40X Multiscribe, emistura de inibidor de RNase, 0,25 L de dNTP e 4 L de 12,5 ng/Lde RNA total. A mistura final de iniciador/sonda foi composta de umaconcentração final de 900 nM de iniciadores de sentido direto ereverso, listados na tabela 3, e 250 nM de sonda fluorescente. A mistura de dNTP continha uma concentração final de 20 mM de cada um dentre dATP, dGTP, dCTP, e dTTP. A mistura de reação foi incubada a 48°C durante 30 minutos para a transcrição reversa, seguida de uma etapa de ativação da Amplitaq de 95°C durante 10 minutos, e finalmente 40 ciclos de desnaturação a 95°C durante 15 segundos e anelamento e extensão a 60°C durante 1 minuto. As sequências usadas nas reações foram como descrito a seguir, cada uma delas escrita na direção 5'-para-3'. Tabela 3

[00049] Para cada amostra ΔCt=Ct (gene-alvo) - Ct TYR foicalculado. O ΔCt tem sido amplamente usado em testes clínicos de RT-PCR e foi escolhido como um método objetivo. Cronin et al. (2004).

[00050] Os valores de Ct obtidos a partir dos arquivos de saída do ABI7900 foram usados para a análise dos dados. Na configuração de teste de reação única, apenas amostras que geram Ct de TYR < 30 foram analisadas Os valores de Ct para cada um dos marcadores são apresentados como Cts brutos normalizados contra o marcador específico de melanócito, TYR, com o uso da seguinte equação: Ct(normalizado) = Ct(marcador) - CT(TYR)

[00051] O diagnóstico gerado pelo teste foi comparado com o exame dermatopatológico. Para estimar o desempenho do teste, os valores de AUC foram calculados com base na análise da curva de ROC com o uso do pacote de programas R versão 2.5.0. (equipe RDC www.r-project.org).

[00052] Para os casos bem definidos (inequívocos), expressão aumentada foi demonstrada no melanoma em comparação às lesões benignas para os três marcadores específicos de melanoma (tabela 4, figura 1a). Expressão diferencial significativa foi observada para SILV e GDF15 entre os nevos benignos e as amostras de melanoma nos casos bem definidos (inequívocos) (2,8- e 1,2-vezes com valores de p <0,001 e 0,003, respectivamente). Entretanto, L1CAM demonstrou muito menos diferenciação com uma mudança de 0,2 vezes e nenhuma importância estatística para a diferença (p=0,47) entre os casos benignos e malignos bem definidos (figura 1). Desta forma, este marcador foi excluído da análise posterior. O SILV demonstrou o melhor desempenho com uma resposta linear entre os três grupos de pacientes (melanoma avançado, melanoma, e casos benignos), representando graus continuamente alterados de estado de doença como definido pela patologia. Tabela 4

[00053] O desempenho de S LV e GD F15 foi testado para a diferen-ciação entre melanomas inequívocos e nevos benignos com o uso de uma análise de curva de ROC univariada. Conforme mostrado na figura 2, os valores de AUC foram 0,94 e 0,67, respectivamente. Com base na análise multivariada com um modelo de regressão linear, a combinação de SILV e GDF15 não otimizou o desempenho do teste além de AUV de 0,94 nos casos inequívocos. Portanto, GDF15 não foi levado adiante para a análise de casos suspeitos (casos equívocos). Finalmente, a normalização para TYR melhorou o desempenho de SILV para 0,94 comparado a 0,78 quando são usados valores de Ct brutos.

[00054] O desempenho de SILV foi testado adicionalmente através da comparação entre os casos suspeitos e os casos benignos inequívocos. O ΔCt médio de SILV nas amostras equívocas em cada por histologia, excluindo melanoma avançado já que n=2, foi comparado ao ΔCt médio do grupo benigno inequívoco. Os valores de ΔCt médios e os valores de p para comparações de teste t com as amostras benignas inequívocas são listados na tabela 5 abaixo. O SILV foi significativamente diferente entre melanoma suspeito e cada grupo atípico suspeito: melanoma versus atipia grave com um valor de p =0,0077 e melanoma vs. atipia moderada com um valor de p = 0,0009.

[00055] As figuras 1 a 4 confirmam que o SILV é o principal marcador e demonstram clara discriminação entre casos de melanoma e benignos equívocos assim como entre diferentes subgrupos de atipia no grupo suspeito de amostras de tecido. Tabela 5

[00056] Da perspectiva de um dermatopatologista, não há um critério único para determinar se uma lesão pigmentada é um nevo gravemente atípico ou se atingiu o limite para melanoma. Os dermatopatologistas enfrentam pelo menos 10 características histológicas separadas. Nenhum marcador imunohistoquímico é capaz de distinguir entre proliferações melanocíticas benignas e malignas.

[00057] A presente invenção apresenta um teste de biópsias de melanoma com desempenho diagnóstico aprimorado na diferenciação de lesões de melanoma das melanocíticas através de identificação e validação de uma assinatura genética específica de melanoma. Os resultados do teste demonstram um aumento progressivo em pelo menos dois genes que são diferencialmente expressos no melanoma: SILV e GDF15. Entretanto, com base na análise multivariada com um modelo de regressão linear, a adição de GDF15 não melhorou o desempenho de SILV além da AUC de 0,94 nos casos bem definidos. Portanto, o SILV é classificado como o marcador final para o teste de biópsia de melanoma. Uma diferença significativa foi também observada entre nevos gravemente atípicos e melanoma para SILV com um valor de p de 0,0077 tornando este marcador aplicável para o diagnóstico dos casos bem definidos (inequívocos) e suspeitos (equívocos), o último sendo o desafio mais difícil para os patologistas especialistas. Tabela 6 Descrições de sequência, Nomes e SEQ ID NOs

[00058] Sequências com com’primento completo de 4 marcadores, conforme fornecido na base de dados do NCBI.>gi|113722118|ref|NM_000372.4| Tirosinase de Homo sapiens (albinismo oculocutâneo IA) (TYR), mRNA ATCACTGTAGTAGTAGCTGGAAAGAGAAATCTGTGACTCCAATTAG CCAGTTCCTGCAGACCTTGTGAGGACTAGAGGAAGAATGCTCCTG GCTGTTTTGTACTGCCTGCTGTGGAGTTTCCAGACCTCCGCTGGC CATTTCCCTAGAGCCTGTGTCTCCTCTAAGAACCTGATGGAGAAG GAATGCTGTCCACCGTGGAGCGGGGACAGGAGTCCCTGTGGCCA GCTTTCAGGCAGAGGTTCCTGTCAGAATATCCTTCTGTCCAATGC ACCACTTGGGCCTCAATTTCCCTTCACAGGGGTGGATGACCGGGA GTCGTGGCCTTCCGTCTTTTATAATAGGACCTGCCAGTGCTCTGG CAACTTCATGGGATTCAACTGTGGAAACTGCAAGTTTGGCTTTTGG GGACCAAACTGCACAGAGAGACGACTCTTGGTGAGAAGAAACATC TTCGATTTGAGTGCCCCAGAGAAGGACAAATTTTTTGCCTACCTCA CTTTAGCAAAGCATACCATCAGCTCAGACTATGTCATCCCCATAGG GACCTATGGCCAAATGAAAAATGGATCAACACCCATGTTTAACGA CATCAATATTTATGACCTCTTTGTCTGGATGCATTATTATGTGTCAA TGGATGCACTGCTTGGGGGATCTGAAATCTGGAGAGACATTGATT TTGCCCATGAAGCACCAGCTTTTCTGCCTTGGCATAGACTCTTCTT GTTGCGGTGGGAACAAGAAATCCAGAAGCTGACAGGAGATGAAA ACTTCACTATTCCATATTGGGACTGGCGGGATGCAGAAAAGTGTG ACATTTGCACAGATGAGTACATGGGAGGTCAGCACCCCACAAATC CTAACTTACTCAGCCCAGCATCATTCTTCTCCTCTTGGCAGATTGT CTGTAGCCGATTGGAGGAGTACAACAGCCATCAGTCTTTATGCAA TGGAACGCCCGAGGGACCTTTACGGCGTAATCCTGGAAACCATG ACAAATCCAGAACCCCAAGGCTCCCCTCTTCAGCTGATGTAGAAT TTTGCCTGAGTTTGACCCAATATGAATCTGGTTCCATGGATAAAGC TGCCAATTTCAGCTTTAGAAATACACTGGAAGGATTTGCTAGTCCA CTTACTGGGATAGCGGATGCCTCTCAAAGCAGCATGCACAATGCC TTGCACATCTATATGAATGGAACAATGTCCCAGGTACAGGGATCT GCCAACGATCCTATCTTCCTTCTTCACCATGCATTTGTTGACAGTA TTTTTGAGCAGTGGCTCCGAAGGCACCGTCCTCTTCAAGAAGTTT ATCCAGAAGCCAATGCACCCATTGGACATAACCGGGAATCCTACA TGGTTCCTTTTATACCACTGTACAGAAATGGTGATTTCTTTATTTCA TCCAAAGATCTGGGCTATGACTATAGCTATCTACAAGATTCAGACC CAGACTCTTTTCAAGACTACATTAAGTCCTATTTGGAACAAGCGAG TCGGATCTGGTCATGGCTCCTTGGGGCGGCGATGGTAGGGGCCG TCCTCACTGCCCTGCTGGCAGGGCTTGTGAGCTTGCTGTGTCGTC ACAAGAGAAAGCAGCTTCCTGAAGAAAAGCAGCCACTCCTCATGG AGAAAGAGGATTACCACAGCTTGTATCAGAGCCATTTATAAAAGG CTTAGGCAATAGAGTAGGGCCAAAAAGCCTGACCTCACTCTAACT CAAAGTAATGTCCAGGTTCCCAGAGAATATCTGCTGGTATTTTTCT GTAAAGACCATTTGCAAAATTGTAACCTAATACAAAGTGTAGCCTT CTTCCAACTCAGGTAGAACACACCTGTCTTTGTCTTGCTGTTTTCA CTCAGCCCTTTTAACATTTTCCCCTAAGCCCATATGTCTAAGGAAA GGATGCTATTTGGTAATGAGGAACTGTTATTTGTATGTGAATTAAA GTGCTCTTATTTTAAAAAATTGAAATAATTTTGATTTTTGCCTTCTG ATTATTTAAAGATCTATATATGTTTTATTGGCCCCTTCTTTATTTTAA TAAAACAGTGAGAAATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAA >gi|153792494|ref|NM_004864.2| Fator de diferenciação de crescimento 15 de Homo sapiens (GDF15), mRNA AGTCCCAGCTCAGAGCCGCAACCTGCACAGCCATGCCCGGGCAA GAACTCAGGACGGTGAATGGCTCTCAGATGCTCCTGGTGTTGCTG GTGCTCTCGTGGCTGCCGCATGGGGGCGCCCTGTCTCTGGCCGA GGCGAGCCGCGCAAGTTTCCCGGGACCCTCAGAGTTGCACTCCG AAGACTCCAGATTCCGAGAGTTGCGGAAACGCTACGAGGACCTG CTAACCAGGCTGCGGGCCAACCAGAGCTGGGAAGATTCGAACAC CGACCTCGTCCCGGCCCCTGCAGTCCGGATACTCACGCCAGAAG TGCGGCTGGGATCCGGCGGCCACCTGCACCTGCGTATCTCTCGG GCCGCCCTTCCCGAGGGGCTCCCCGAGGCCTCCCGCCTTCACCG GGCTCTGTTCCGGCTGTCCCCGACGGCGTCAAGGTCGTGGGACG TGACACGACCGCTGCGGCGTCAGCTCAGCCTTGCAAGACCCCAG GCGCCCGCGCTGCACCTGCGACTGTCGCCGCCGCCGTCGCAGT CGGACCAACTGCTGGCAGAATCTTCGTCCGCACGGCCCCAGCTG GAGTTGCACTTGCGGCCGCAAGCCGCCAGGGGGCGCCGCAGAG CGCGTGCGCGCAACGGGGACCACTGTCCGCTCGGGCCCGGGCG TTGCTGCCGTCTGCACACGGTCCGCGCGTCGCTGGAAGACCTGG GCTGGGCCGATTGGGTGCTGTCGCCACGGGAGGTGCAAGTGACC ATGTGCATCGGCGCGTGCCCGAGCCAGTTCCGGGCGGCAAACAT GCACGCGCAGATCAAGACGAGCCTGCACCGCCTGAAGCCCGACA CGGTGCCAGCGCCCTGCTGCGTGCCCGCCAGCTACAATCCCATG GTGCTCATTCAAAAGACCGACACCGGGGTGTCGCTCCAGACCTAT GATGACTTGTTAGCCAAAGACTGCCACTGCATATGAGCAGTCCTG GTCCTTCCACTGTGCACCTGCGCGGAGGACGCGACCTCAGTTGT CCTGCCCTGTGGAATGGGCTCAAGGTTCCTGAGACACCCGATTCC TGCCCAAACAGCTGTATTTATATAAGTCTGTTATTTATTATTAATTT ATTGGGGTGACCTTCTTGGGGACTCGGGGGCTGGTCTGATGGAA CTGTGTATTTATTTAAAACTCTGGTGATAAAAATAAAGCTGTCTGAA CTGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA >gi|42542384|ref|NM_006928.3| Homo sapiens silver homolog (camundongo) (SILV), mRNA AGTGCCTTTGGTTGCTGGAGGGAAGAACACAATGGATCTGGTGCT AAAAAGATGCCTTCTTCATTTGGCTGTGATAGGTGCTTTGCTGGCT GTGGGGGCTACAAAAGTACCCAGAAACCAGGACTGGCTTGGTGT CTCAAGGCAACTCAGAACCAAAGCCTGGAACAGGCAGCTGTATCC AGAGTGGACAGAAGCCCAGAGACTTGACTGCTGGAGAGGTGGTC AAGTGTCCCTCAAGGTCAGTAATGATGGGCCTACACTGATTGGTG CAAATGCCTCCTTCTCTATTGCCTTGAACTTCCCTGGAAGCCAAAA GGTATTGCCAGATGGGCAGGTTATCTGGGTCAACAATACCATCAT CAATGGGAGCCAGGTGTGGGGAGGACAGCCAGTGTATCCCCAGG AAACTGACGATGCCTGCATCTTCCCTGATGGTGGACCTTGCCCAT CTGGCTCTTGGTCTCAGAAGAGAAGCTTTGTTTATGTCTGGAAGA CCTGGGGCCAATACTGGCAAGTTCTAGGGGGCCCAGTGTCTGGG CTGAGCATTGGGACAGGCAGGGCAATGCTGGGCACACACACCAT GGAAGTGACTGTCTACCATCGCCGGGGATCCCGGAGCTATGTGC CTCTTGCTCATTCCAGCTCAGCCTTCACCATTACTGACCAGGTGC CTTTCTCCGTGAGCGTGTCCCAGTTGCGGGCCTTGGATGGAGGG AACAAGCACTTCCTGAGAAATCAGCCTCTGACCTTTGCCCTCCAG CTCCATGACCCCAGTGGCTATCTGGCTGAAGCTGACCTCTCCTAC ACCTGGGACTTTGGAGACAGTAGTGGAACCCTGATCTCTCGGGCA CTTGTGGTCACTCATACTTACCTGGAGCCTGGCCCAGTCACTGCC CAGGTGGTCCTGCAGGCTGCCATTCCTCTCACCTCCTGTGGCTCC TCCCCAGTTCCAGGCACCACAGATGGGCACAGGCCAACTGCAGA GGCCCCTAACACCACAGCTGGCCAAGTGCCTACTACAGAAGTTGT GGGTACTACACCTGGTCAGGCGCCAACTGCAGAGCCCTCTGGAA CCACATCTGTGCAGGTGCCAACCACTGAAGTCATAAGCACTGCAC CTGTGCAGATGCCAACTGCAGAGAGCACAGGTATGACACCTGAG AAGGTGCCAGTTTCAGAGGTCATGGGTACCACACTGGCAGAGAT GTCAACTCCAGAGGCTACAGGTATGACACCTGCAGAGGTATCAAT TGTGGTGCTTTCTGGAACCACAGCTGCACAGGTAACAACTACAGA GTGGGTGGAGACCACAGCTAGAGAGCTACCTATCCCTGAGCCTG AAGGTCCAGATGCCAGCTCAATCATGTCTACGGAAAGTATTACAG GTTCCCTGGGCCCCCTGCTGGATGGTACAGCCACCTTAAGGCTG GTGAAGAGACAAGTCCCCCTGGATTGTGTTCTGTATCGATATGGT TCCTTTTCCGTCACCCTGGACATTGTCCAGGGTATTGAAAGTGCC GAGATCCTGCAGGCTGTGCCGTCCGGTGAGGGGGATGCATTTGA GCTGACTGTGTCCTGCCAAGGCGGGCTGCCCAAGGAAGCCTGCA TGGAGATCTCATCGCCAGGGTGCCAGCCCCCTGCCCAGCGGCTG TGCCAGCCTGTGCTACCCAGCCCAGCCTGCCAGCTGGTTCTGCA CCAGATACTGAAGGGTGGCTCGGGGACATACTGCCTCAATGTGTC TCTGGCTGATACCAACAGCCTGGCAGTGGTCAGCACCCAGCTTAT CATGCCTGGTCAAGAAGCAGGCCTTGGGCAGGTTCCGCTGATCG TGGGCATCTTGCTGGTGTTGATGGCTGTGGTCCTTGCATCTCTGA TATATAGGCGCAGACTTATGAAGCAAGACTTCTCCGTACCCCAGT TGCCACATAGCAGCAGTCACTGGCTGCGTCTACCCCGCATCTTCT GCTCTTGTCCCATTGGTGAGAATAGCCCCCTCCTCAGTGGGCAGC AGGTCTGAGTACTCTCATATGATGCTGTGATTTTCCTGGAGTTGAC AGAAACACCTATATTTCCCCCAGTCTTCCCTGGGAGACTACTATTA ACTGAAATAAATACTCAGAGCCTGAAAAAAAAAAAAAAAAAA >gi|13435354|ref|NM_000425.2| Molécula de adesão de célula L1 de Homo sapiens (L1CAM), transcrito variante 1, mRNA GCGCGGTGCCGCCGGGAAAGATGGTCGTGGCGCTGCGGTACGT GTGGCCTCTCCTCCTCTGCAGCCCCTGCCTGCTTATCCAGATCCC CGAGGAATATGAAGGACACCATGTGATGGAGCCACCTGTCATCAC GGAACAGTCTCCACGGCGCCTGGTTGTCTTCCCCACAGATGACAT CAGCCTCAAGTGTGAGGCCAGTGGCAAGCCCGAAGTGCAGTTCC GCTGGACGAGGGATGGTGTCCACTTCAAACCCAAGGAAGAGCTG GGTGTGACCGTGTACCAGTCGCCCCACTCTGGCTCCTTCACCATC ACGGGCAACAACAGCAACTTTGCTCAGAGGTTCCAGGGCATCTAC CGCTGCTTTGCCAGCAATAAGCTGGGCACCGCCATGTCCCATGA GATCCGGCTCATGGCCGAGGGTGCCCCCAAGTGGCCAAAGGAGA CAGTGAAGCCCGTGGAGGTGGAGGAAGGGGAGTCAGTGGTTCTG CCTTGCAACCCTCCCCCAAGTGCAGAGCCTCTCCGGATCTACTGG ATGAACAGCAAGATCTTGCACATCAAGCAGGACGAGCGGGTGAC GATGGGCCAGAACGGCAACCTCTACTTTGCCAATGTGCTCACCTC CGACAACCACTCAGACTACATCTGCCACGCCCACTTCCCAGGCAC CAGGACCATCATTCAGAAGGAACCCATTGACCTCCGGGTCAAGGC CACCAACAGCATGATTGACAGGAAGCCGCGCCTGCTCTTCCCCAC CAACTCCAGCAGCCACCTGGTGGCCTTGCAGGGGCAGCCATTGG TCCTGGAGTGCATCGCCGAGGGCTTTCCCACGCCCACCATCAAAT GGCTGCGCCCCAGTGGCCCCATGCCAGCCGACCGTGTCACCTAC CAGAACCACAACAAGACCCTGCAGCTGCTGAAAGTGGGCGAGGA GGATGATGGCGAGTACCGCTGCCTGGCCGAGAACTCACTGGGCA GTGCCCGGCATGCGTACTATGTCACCGTGGAGGCTGCCCCGTAC TGGCTGCACAAGCCCCAGAGCCATCTATATGGGCCAGGAGAGAC TGCCCGCCTGGACTGCCAAGTCCAGGGCAGGCCCCAACCAGAGG TCACCTGGAGAATCAACGGGATCCCTGTGGAGGAGCTGGCCAAA GACCAGAAGTACCGGATTCAGCGTGGCGCCCTGATCCTGAGCAA CGTGCAGCCCAGTGACACAATGGTGACCCAATGTGAGGCCCGCA ACCGGCACGGGCTCTTGCTGGCCAATGCCTACATCTACGTTGTCC AGCTGCCAGCCAAGATCCTGACTGCGGACAATCAGACGTACATG GCTGTCCAGGGCAGCACTGCCTACCTTCTGTGCAAGGCCTTCGG AGCGCCTGTGCCCAGTGTTCAGTGGCTGGACGAGGATGGGACAA CAGTGCTTCAGGACGAACGCTTCTTCCCCTATGCCAATGGGACCC TGGGCATTCGAGACCTCCAGGCCAATGACACCGGACGCTACTTCT GCCTGGCTGCCAATGACCAAAACAATGTTACCATCATGGCTAACC TGAAGGTTAAAGATGCAACTCAGATCACTCAGGGGCCCCGCAGCA CAATCGAGAAGAAAGGTTCCAGGGTGACCTTCACGTGCCAGGCC TCCTTTGACCCCTCCTTGCAGCCCAGCATCACCTGGCGTGGGGA CGGTCGAGACCTCCAGGAGCTTGGGGACAGTGACAAGTACTTCA TAGAGGATGGGCGCCTGGTCATCCACAGCCTGGACTACAGCGAC CAGGGCAACTACAGCTGCGTGGCCAGTACCGAACTGGATGTGGT GGAGAGTAGGGCACAGCTCTTGGTGGTGGGGAGCCCTGGGCCG GTGCCACGGCTGGTGCTGTCCGACCTGCACCTGCTGACGCAGAG CCAGGTGCGCGTGTCCTGGAGTCCTGCAGAAGACCACAATGCCC CCATTGAGAAATATGACATTGAATTTGAGGACAAGGAAATGGCGC CTGAAAAATGGTACAGTCTGGGCAAGGTTCCAGGGAACCAGACCT CTACCACCCTCAAGCTGTCGCCCTATGTCCACTACACCTTTAGGG TTACTGCCATAAACAAATATGGCCCCGGGGAGCCCAGCCCGGTCT CTGAGACTGTGGTCACACCTGAGGCAGCCCCAGAGAAGAACCCT GTGGATGTGAAGGGGGAAGGAAATGAGACCACCAATATGGTCAT CACGTGGAAGCCGCTCCGGTGGATGGACTGGAACGCCCCCCAG GTTCAGTACCGCGTGCAGTGGCGCCCTCAGGGGACACGAGGGC CCTGGCAGGAGCAGATTGTCAGCGACCCCTTCCTGGTGGTGTCC AACACGTCCACCTTCGTGCCCTATGAGATCAAAGTCCAGGCCGTC AACAGCCAGGGCAAGGGACCAGAGCCCCAGGTCACTATCGGCTA CTCTGGAGAGGACTACCCCCAGGCAATCCCTGAGCTGGAAGGCA TTGAAATCCTCAACTCAAGTGCCGTGCTGGTCAAGTGGCGGCCG GTGGACCTGGCCCAGGTCAAGGGCCACCTCCGCGGATACAATGT GACGTACTGGAGGGAGGGCAGTCAGAGGAAGCACAGCAAGAGAC ATATCCACAAAGACCATGTGGTGGTGCCCGCCAACACCACCAGTG TCATCCTCAGTGGCTTGCGGCCCTATAGCTCCTACCACCTGGAGG TGCAGGCCTTTAACGGGCGAGGATCGGGGCCCGCCAGCGAGTTC ACCTTCAGCACCCCAGAGGGAGTGCCTGGCCACCCCGAGGCGTT GCACCTGGAGTGCCAGTCGAACACCAGCCTGCTGCTGCGCTGGC AGCCCCCACTCAGCCACAACGGCGTGCTCACCGGCTACGTGCTC TCCTACCACCCCCTGGATGAGGGGGGCAAGGGGCAACTGTCCTT CAACCTTCGGGACCCCGAACTTCGGACACACAACCTGACCGATCT CAGCCCCCACCTGCGGTACCGCTTCCAGCTTCAGGCCACCACCA AAGAGGGCCCTGGTGAAGCCATCGTACGGGAAGGAGGCACTATG GCCTTGTCTGGGATCTCAGATTTTGGCAACATCTCAGCCACAGCG GGTGAAAACTACAGTGTCGTCTCCTGGGTCCCCAAGGAGGGCCA GTGCAACTTCAGGTTCCATATCTTGTTCAAAGCCTTGGGAGAAGA GAAGGGTGGGGCTTCCCTTTCGCCACAGTATGTCAGCTACAACCA GAGCTCCTACACGCAGTGGGACCTGCAGCCTGACACTGACTACG AGATCCACTTGTTTAAGGAGAGGATGTTCCGGCACCAAATGGCTG TGAAGACCAATGGCACAGGCCGCGTGAGGCTCCCTCCTGCTGGC TTCGCCACTGAGGGCTGGTTCATCGGCTTTGTGAGTGCCATCATC CTCCTGCTCCTCGTCCTGCTCATCCTCTGCTTCATCAAGCGCAGC AAGGGCGGCAAATACTCAGTGAAGGATAAGGAGGACACCCAGGT GGACTCTGAGGCCCGACCGATGAAAGATGAGACCTTCGGCGAGT ACAGGTCCCTGGAGAGTGACAACGAGGAGAAGGCCTTTGGCAGC AGCCAGCCATCGCTCAACGGGGACATCAAGCCCCTGGGCAGTGA CGACAGCCTGGCCGATTATGGGGGCAGCGTGGATGTTCAGTTCA ACGAGGATGGTTCGTTCATTGGCCAGTACAGTGGCAAGAAGGAG AAGGAGGCGGCAGGGGGCAATGACAGCTCAGGGGCCACTTCCC CCATCAACCCTGCCGTGGCCCTAGAATAGTGGAGTCCAGGACAG GAGATGCTGTGCCCCTGGCCTTGGGATCCAGGCCCCTCCCTCTC CAGCAGGCCCATGGGAGGCTGGAGTTGGGGCAGAGGAGAACTT GCTGCCTCGGATCCCCTTCCTACCACCCGGTCCCCACTTTATTGC CAAAACCCAGCTGCACCCCTTCCTGGGCACACGCTGCTCTGCCC CAGCTTGGGCAGATCTCCCACATGCCAGGGGCCTTTGGGTGCTG TTTTGCCAGCCCATTTGGGCAGAGAGGCTGTGGTTTGGGGGAGA AGAAGTAGGGGTGGCCCGAAAGGGTCTCCGAAATGCTGTCTTTCT TGCTCCCTGACTGGGGGCAGACATGGTGGGGTCTCCTCAGGACC AGGGTTGGCACCTTCCCCCTCCCCCAGCCACTCCCCAGCCAGCC TGGCTGGGACTGGGAACAGAACTCGGTGTCCCCACCATCTGCTG TCTTTTCTTTGCCATCTCTGCTCCAACCGGGATGGGAGCCGGGCA AACTGGCCGCGGGGGCAGGGGAGGCCATCTGGAGAGCCCAGAG TCCCCCCACTCCCAGCATCGCACTCTGGCAGCACCGCCTCTTCCC GCCGCCCAGCCCACCCCATGGCCGGCTTTCAGGAGCTCCATACA CACGCTGCCTTCGGTACCCACCACACAACATCCAAGTGGCCTCCG TCACTACCTGGCTGCGGGGCGGGCACACCTCCTCCCACTGCCCA CTGGCCGGC

Claims

1. Método para identificar um melanoma em uma amostra de tecido, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de a. medir os níveis de expressão na amostra de tecido de genes que codificam mRNA correspondente a SILV tendo SEQ ID NO: 16; b. medir o nível de expressão de um gene que codifica tirosinase (TYR) tendo SEQ ID NO: 4; e c. medir o nível de expressão de SILV em relação a tirosinase; em que os níveis de expressão de SILV em relação a tirosinase são indicativos da presença de um melanoma.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra de tecido é uma amostra de biópsia primária de pele.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, carac- terizado pelo fato de que a expressão gênica é medida em um microarranjo ou genechip.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, carac- terizado pelo fato de que a expressão gênica é determinada por amplificação de ácido nucleico conduzida por reação em cadeia da polimerase (PCR) de RNA extraído da amostra de tecido.