WO2024039065A1 - 치주염 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 치주염 진단용 키트 - Google Patents

치주염 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 치주염 진단용 키트 Download PDF

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WO2024039065A1
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present
diagnosing
protein
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박혜련
김윤학
이한송
주지영
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부산대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention identifies a resistin ligand in myeloid dendritic cells (mDC) by confirming the inflammatory signaling mechanism that is increased compared to normal tissue in single cell transcriptome (single cell RNA sequencing) data of the blood of periodontitis patients.
  • mDC myeloid dendritic cells
  • This relates to a biomarker composition for diagnosing periodontitis, which confirms that it is exported and received by CAP1 and TLR4 receptors by immune cells in the blood, and a kit for diagnosing periodontitis using the same.
  • Periodontitis is a chronic inflammatory disease of periodontal tissue caused by the interaction between the host's oral dysbiosis and immune response. If not controlled, it can cause tooth loss along with alveolar bone loss.
  • Periodontitis is the 11th most common disease worldwide, and its prevalence increases with age. Periodontitis is known to be closely related to systemic health, and it interacts with and shares common risk factors with various non-communicable diseases (NCDs) such as cardiovascular disease, diabetes, autoimmune diseases, etc.
  • NCDs non-communicable diseases
  • the progression of periodontitis can eventually cause tooth loss, which can lead to not only functional problems related to pronunciation and chewing, but also aesthetic problems that can reduce an individual's quality of life.
  • the present invention was created to solve the above problems, and the purpose of the present invention is to provide objective indicators for the diagnosis of periodontitis by comparing single cell transcriptome data from the blood of periodontitis patients and identifying differentially expressed inflammatory signaling mechanisms. will be.
  • the purpose of the present invention is to present standards and grounds for establishing a treatment plan appropriate for the characteristics of periodontitis progression by objectively quantifying factors related to the pathogenesis of periodontitis.
  • the purpose of the present invention is to construct a diagnostic composition that measures the level of resistine protein distributed in a biological sample such as blood and use it as a kit to diagnose periodontitis.
  • biomarker composition for diagnosing periodontitis according to the present invention
  • It is characterized by comprising an antibody that specifically binds to a resistin protein, a nucleotide sequence encoding the resistin protein, a sequence complementary to the nucleotide sequence, or a fragment of the nucleotide sequence.
  • mDC myeloid dendritic cells
  • the receptors of the immune cells are,
  • CAP1 Adrenylyl Cyclase-Associated Protein 1
  • TLR4 Toll-like receptor 4
  • It is characterized by comprising an antibody that specifically binds to a resistin protein, a nucleotide sequence encoding the resistin protein, a sequence complementary to the nucleotide sequence, or a fragment of the nucleotide sequence.
  • the periodontitis diagnostic kit is,
  • a microarray selected from the group consisting of a microarray, aptamer chip kit, ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) kit, blotting kit, immunoprecipitation kit, immunofluorescence kit, protein needle kit, or a combination thereof. It is characterized by
  • the periodontitis diagnostic kit is,
  • It is characterized by being selected from the group consisting of sequencing, PCR techniques, or a combination thereof.
  • the information provision method for diagnosing periodontitis according to the present invention is,
  • the measured expression level increases compared to the expression level of the normal control group, it is characterized as periodontitis.
  • the present invention can provide an objective index for the diagnosis of periodontitis by comparing single cell transcriptome data of the blood of periodontitis patients and identifying differentially expressed inflammatory signaling mechanisms.
  • the present invention can provide criteria and evidence for establishing a treatment plan suitable for the characteristics of periodontitis progression by objectively quantifying the factors related to the pathogenesis of periodontitis.
  • the present invention can be used as a kit to diagnose periodontitis by constructing a diagnostic composition that measures the level of resistine protein distributed in a biological sample such as blood.
  • Figure 1 is a schematic diagram showing intercellular interactions of the resistin pathway in a healthy state according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a schematic diagram showing intercellular interactions of the resistin pathway in periodontitis according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a schematic diagram showing intercellular interactions of the resistin pathway after periodontitis treatment according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 shows the relative contribution of the ligand-receptor (LR) pair included in the resistine pathway according to health status according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5 shows the RETN expression ratio by state of a single cell (monocyte) according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6 shows the ratio of monocytes expressing RETN (RETN+) by state according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7 shows the RETN expression ratio by state of mDC according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 8 shows the ratio of mDC expressing RETN (RETN+) by state according to an embodiment of the present invention.
  • the present invention provides a biomarker for diagnosing periodontitis, including metabolites that show relative expression differences in the blood, gingival crevicular fluid, or saliva of periodontal disease patients compared to the body fluids of normal people (control group).
  • control group refers to a group for determining whether the experimental results were obtained properly.
  • control group refers to an individual not suffering from periodontal disease.
  • gingiodontitis used in the present invention, also known as gum disease, refers to a chronic inflammatory disease that is initiated by dysbiosis of plaque bacteria and damages periodontal tissue.
  • stage I, II, III, IV The severity of the disease (stage I, II, III, IV) and progress speed (grade A, B, C).
  • diagnosis means confirming the presence or characteristics of a pathological condition.
  • diagnosis is to determine whether periodontitis has occurred, the extent of disease progression, or whether there is a risk group due to it.
  • the present invention is a biomarker composition for diagnosing periodontitis, including an antibody that specifically binds to a resistin protein, a nucleotide sequence encoding the resistin protein, a sequence complementary to the nucleotide sequence, or a fragment of the nucleotide sequence.
  • the resistin protein is a ligand for myeloid dendritic cells (mDC) and binds to receptors on immune cells.
  • the receptor of the immune cell includes a CAP1 (Adenylyl Cyclase-Associated Protein 1) structure or a TLR4 (Toll-like receptor 4) structure.
  • CAP1 Addenylyl Cyclase-Associated Protein 1
  • TLR4 Toll-like receptor 4
  • the periodontitis refers to symptoms and signs such as gingival bleeding, gingival retraction, periodontal pocket, alveolar bone destruction, or alveolar bone loss. It may be expressed as, but is not limited to this.
  • the alveolar bone loss is a type of periodontal disease that occurs when the balance between bone formation and bone resorption in the alveolar bone is broken, bone resorption exceeds bone formation, and bone mass decreases below the limit, and alveolar bone resorption occurs. It may appear.
  • the present invention provides a diagnostic kit containing the biomarker composition for diagnosing periodontitis.
  • the biomarker composition for diagnosing periodontitis is as described previously.
  • the diagnostic kit is a microarray, aptamer chip kit, ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) kit, blotting kit, immunoprecipitation kit, immunofluorescence test kit, protein chip kit, or these. It may be selected from the group consisting of a combination of, but is not limited thereto.
  • the diagnostic kit may be selected from the group consisting of sequencing, PCR, or a combination thereof, but is not limited thereto.
  • the diagnostic kit includes a molecule that specifically binds to a metabolite, and is particularly preferred for diagnosing periodontal disease.
  • the specifically binding molecule may be an antibody, substrate, ligand protein, peptide, nucleic acid, chemical substance, polymer, or cofactor, and specifically, a monoclonal that recognizes each marker.
  • the diagnostic kit preferably uses blood, gingival crevicular fluid, or saliva as a specimen.
  • the kit for diagnosing periodontitis is characterized by comprising an antibody that specifically binds to a resistin protein, a nucleotide sequence encoding the resistin protein, a sequence complementary to the nucleotide sequence, or a fragment composition of the nucleotide.
  • the information provision method for diagnosing periodontitis includes an antibody that specifically binds to the resistin protein distributed in blood, gingival crevicular fluid, or saliva in a biological sample, a nucleotide sequence encoding the resistin protein, and the nucleotide sequence. measuring a sequence complementary to or a fragment of the nucleotide; And comparing the measured expression level with the expression level of a normal control group.
  • the measured expression level increases compared to the expression level of the normal control group, it is characterized as periodontitis.
  • PBMCs Peripheral blood samples were collected in plastic blood collection tubes containing EDTA. PBMCs were isolated using SepMate (Stemcell Technologies Inc.) within 30 min of collection. After carefully mixing the medium and sample, the tube was centrifuged at 1200 xg for 10 minutes. The top layer was poured into a new tube and washed twice with PBS containing 2% FBS. The tube was centrifuged at 300 xg for 8 minutes at room temperature. Collected PBMCs were frozen and stored at -80°C until use.
  • RNA transcripts from single cells were uniquely barcoded and reverse transcribed within droplets.
  • cDNA molecules were pooled followed by single ‘A’ base addition and adapter ligation.
  • the product was purified and enriched by PCR to generate the final cDNA library.
  • the library was sequenced using the Illumina HiSeq platform.
  • Single cell gene expression data were processed using 10X Genomics Cell Ranger v3.1.0.
  • FASTQ files were generated using ‘cellranger mkfastq’ and raw FASTQ files were analyzed using ‘cellranger count’.
  • the resulting cell-by-gene count matrix was created and the gene expression level in each cell was quantified and analyzed.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the cell-to-cell interaction of the resistine pathway in periodontitis. Compared to Figure 1, it can be seen that the role of mDC appears in the resistine pathway.
  • Figure 3 is a schematic diagram showing the intercellular interaction of the resistine pathway, confirming that the role of mDC is maintained despite treatment.
  • Figure 4 shows the relative contribution of the ligand-receptor (LR) pair included in the resistine pathway by health status. It was confirmed that the ratio of the LR pair in the RESISTIN pathway was the same in healthy general people, before and after periodontitis treatment.
  • LR ligand-receptor
  • Figure 5 shows the RETN expression ratio by monocyte state.
  • the p values indicating significance are as follows, and significant differences were confirmed for each group (p ⁇ 0.05 (*), p ⁇ 0.01 (**), p ⁇ 0.001 (***), p ⁇ 0.0001).
  • Figure 6 shows the ratio of single cells (monocytes) expressing RETN (RETN+) by state
  • Figure 7 shows the RETN expression rate by state of mDC.
  • the p value indicating significance is as follows, before and after treatment.
  • FIG. 8 shows the proportion of mDC expressing RETN (RETN+) by state, and it can be seen that the proportion of RETN+ mDC cells increases despite periodontitis treatment.
  • the present invention can provide an objective index for the diagnosis of periodontitis by comparing single cell transcriptome data of the blood of periodontitis patients and identifying differentially expressed inflammatory signaling mechanisms.
  • the present invention seeks to present standards and grounds for establishing a treatment plan appropriate for the characteristics of periodontitis progression by objectively quantifying factors related to the pathogenesis of periodontitis.
  • the present invention can be used as a kit to diagnose periodontitis by constructing a diagnostic composition that measures the level of resistine protein distributed in a biological sample such as blood.

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Abstract

본 발명은 치주염 환자 혈액의 단일세포 전사체(single cell RNA sequencing) 데이터에서 정상 조직에 비해 증가되어 있는 염증성 신호전달기전 확인을 통해 골수성 수지상세포(myeloid dendritic cell, mDC)에서 레지스틴(resistin) 리간드를 내보내고, 이를 혈액 내 면역세포들이 CAP1, TLR4 수용체가 받는 것을 확인 한 치주염 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 치주염 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 치주염 진단용 바이오마커 조성물은, 레지스틴(resistin) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 레지스틴 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

치주염 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 치주염 진단용 키트
본 발명은 치주염 환자 혈액의 단일세포 전사체(single cell RNA sequencing) 데이터에서 정상 조직에 비해 증가되어 있는 염증성 신호전달기전 확인을 통해 골수성 수지상세포(myeloid dendritic cell, mDC)에서 레지스틴(resistin) 리간드를 내보내고, 이를 혈액 내 면역세포들이 CAP1, TLR4 수용체가 받는 것을 확인 한 치주염 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 치주염 진단용 키트에 관한 것이다.
치주염은 숙주의 구강 미생물 세균 불균형(dysbiosis)과 면역반응의 상호 작용으로 인한 치주 조직의 만성 염증성 질환으로, 조절되지 않으면 치조골 손실과 더불어 치아 손실을 유발할 수 있다. 2016년 글로벌 질병 부담 연구에 따르면, 치주염은 전 세계적으로 11 번째로 가장 흔한 질병으로, 나이가 들수록 치주염 유병률은 점점 증가한다. 치주염은 전신 건강과 밀접한 관련이 있다고 알려져 있으며, 심혈관 질환, 당뇨병, 자가 면역 질환 등과 같은 다양한 비 감염성 질환(NCD)과 상호 작용하며 공통 위험 요소를 공유한다. 치주염의 진행은 결국 치아 상실을 유발하여 발음 및 저작과 관련된 기능적 문제뿐만 아니라 개인의 삶의 질을 저하시킬 수 있는 심미적 문제를 초래할 수 있다.
치주염은 성인의 대다수가 이환되어 있으며 큰 증상 없이 진행되어 치아를 잃을 수 있다. 하지만, 정기 검진과 스케일링으로 꾸준하게 관리하지 않으면 재발이 잦고, 완치가 어려워 새로운 치료법의 개발이 필요하다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하기 위해서 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 치주염 환자 혈액의 단일세포 전사체 데이터를 비교하여 차별적으로 발현되는 염증성 신호전달 기전 확인을 통해 치주염 진단에 대한 객관적 지표 제시하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 치주염 발병 기전 관련 인자를 객관적 수치화함으로써 치주염 진행 특성에 적합한 치료계획 수립 기준 및 근거를 제시하고자 한다.
또한, 본 발명의 목적은 혈액과 같은 생물학적 시료내에 분포한 레지스틴(resistine) 단백질 수준을 측정하는 진단용 조성물 구성하여 치주염을 진단하는 키트로 활용하고자 한다.
발명이 해결하고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
(1) 치주염 진단용 바이오마커 조성물
본 발명에 따른 치주염 진단용 바이오마커 조성물은,
레지스틴(resistin) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 레지스틴 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 레지스틴(resistin) 단백질은,
상기 골수성 수지상세포(myeloid dendritic cell, mDC)의 리간드이며, 면역세포의 수용체에 의해 결합되는 것을 특징으로 한다.
상기 면역세포의 수용체는,
CAP1(Adenylyl Cyclase-Associated Protein 1) 구조를 포함하거나, TLR4(Toll-like receptor 4) 구조를 포함하는 것을 특징으로 한다.
(2) 치주염 진단용 키트
본 발명에 따른 치주염 진단용 키트는,
레지스틴(resistin) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 레지스틴 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 치주염 진단용 키트는,
마이크로어레이, 앱타머 칩 키트, 엘리사(ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 키트, 블랏팅(Blotting) 키트, 면역침전법 키트, 면역형광검사 키트, 단백질 침 키트 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
상기 치주염 진단용 키트는,
시퀀싱, PCR 기법 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
(3) 치주염 진단을 위한 정보제공방법
본 발명에 따른 치주염 진단을 위한 정보제공방법은,
생물학적 시료 내 혈액, 치은열구액 또는 타액에 분포한,
레지스틴(resistin) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 레지스틴 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드의 단편을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 측정된 발현 수준이 정상 대조군의 발현 수준과 비교하여 증가한 경우 치주염으로 판단하는 것을 특징으로 한다.
상기 과제의 해결 수단에 의해, 본 발명은 치주염 환자 혈액의 단일세포 전사체 데이터를 비교하여 차별적으로 발현되는 염증성 신호전달 기전 확인을 통해 치주염 진단에 대한 객관적 지표 제시할 수 있다.
또한, 본 발명은 치주염 발병 기전 관련 인자를 객관적 수치화함으로써 치주염 진행 특성에 적합한 치료계획 수립 기준 및 근거를 제시할 수 있다.
또한, 본 발명은 혈액과 같은 생물학적 시료내에 분포한 레지스틴(resistine) 단백질 수준을 측정하는 진단용 조성물 구성하여 치주염을 진단하는 키트로 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 건강한 상태의 레지스틴(resistine) 경로의 세포간 상호작용을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 치주염 상태에서 레지스틴(resistine) 경로의 세포간 상호작용을 나타내는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 치주염 치료 후, 레지스틴(resistine) 경로의 세포간 상호작용을 나타내는 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 레지스틴(resistine) 경로에 포함된 ligand-receptor(LR) pair의 건강 상태별 상대적 기여도이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 단세포(monocyte)의 상태별 RETN 발현 비율이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 상태별 RETN을 발현(RETN+) 하는단세포(monocyte)의 비율이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 mDC의 상태별 RETN 발현 비율이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따라 상태별 RETN을 발현(RETN+)하는 mDC의 비율이다.
본 명세서에서 사용되는 용어에 대해 간략히 설명하고, 본 발명에 대해 구체적으로 설명하기로 한다.
본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
명세서 전체에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
아래에서는 첨부한 도면을 참고하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
본 발명에 대한 해결하고자 하는 과제, 과제의 해결 수단, 발명의 효과를 포함한 구체적인 사항들은 다음에 기재할 실시 예 및 도면들에 포함되어 있다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.
(1) 치주염 진단용 바이오마커 조성물
본 발명은 정상인(대조군)의 체액 대비 치주 질환 환자의 혈액, 치은열구액 또는 타액에서 상대적으로 발현의 차이를 나타내는 대사물질을 포함하는 치주염 진단용 바이오마커를 제공한다.
본 발명에 사용된 용어 “정상인(대조군)”이란, 실험 결과가 제대로 도출되었는지 여부를 판단하기 위한 집단을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 “정상인(대조군)”이란 치주 질환을 앓고 있지 않은 개체를 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "치주염(periodontitis)" 이란, 풍치라고도 하며, 치태세균의 불균형 (dysbiosis)에 의해 개시되어 치주조직을 손상시키는 만성염증성질환을 의미하는데, 병증의 심도 (stage Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ )와 진행속도 (grade A,B,C)에 따라 세분화된다. 치주염의 발병시 염증 및 면역반응이 진행되는데 이 과정에서 치주낭(periodontal pocket)이 형성된다. 치주염이 심할수록 치주낭의 깊이가 깊어지게 되는데, 치주낭이 깊어지면서 하부의 결합조직 파괴를 초래하게 되어 최종적으로는 골소실이 유발된다고 알려져 있다.
본 발명에 사용된 용어 “진단”이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 치주염의 발병 여부, 병의 진전 정도 또는 이로 인한 위험군 여부를 확인하는 것이다.
본 발명은 레지스틴(resistin) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 레지스틴 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드의 단편을 포함하는 치주염 진단용 바이오마커 조성물이다.
상기 레지스틴(resistin) 단백질은 상기 골수성 수지상세포(myeloid dendritic cell, mDC)의 리간드이며, 면역세포의 수용체에 의해 결합된다.
상기 면역세포의 수용체는 CAP1(Adenylyl Cyclase-Associated Protein 1) 구조를 포함하거나, TLR4(Toll-like receptor 4) 구조를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 치주염(periodontitis)은 치은출혈(gingival bleeding), 치은퇴축(gingival retraction), 치주낭(periodontal pocket), 치조골 파괴(alveolarbone destruction) 또는 치조골 소실(alveolar bone loss)과 같은 증상과 징후로 표현될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 치조골 소실은 치조골에서 골형성과 골흡수의 균형이 깨어져 골흡수가 골형성을 초과하여 골량이 한계 이하로 감소하면서 나타나는 치주 질환의 일종으로, 치조골 흡수(alveolar bone resorption)가 나타날 수 있다.
(2) 치주염 진단용 키트
본 발명은 상기 치주염 진단용 바이오마커 조성물을 포함하는 진단용 키트를 제공한다.
상기 치주염 진단용 바이오마커 조성물은 앞서 기재한 바와 같다.
본 발명에 있어서, 상기 진단용 키트는 마이크로어레이, 앱타머 칩 키트, 엘리사(ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 키트, 블랏팅(Blotting) 키트, 면역침전법 키트, 면역형광검사 키트, 단백질 칩 키트 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 진단용 키트는 시퀀싱(sequencing), PCR 기법 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 진단용 키트는 대사물질과 특이적으로 결합하는 분자를 포함하며, 특히, 치주 질환을 진단하는데 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 특이적으로 결합하는 분자는 항체, 기질, 리간드 단백질, 펩타이드, 핵산, 화학물질, 고분자 또는 보조인자(cofactor) 등 일 수 있으며, 구체적으로는 각 마커를 인식하는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 각 마커에 상호작용하는 특정 단백질, 펩타이드, 핵산, 고분자 또는 화학물질, 또는 각 마커와 화학반응을 일으켜 특정 화학 물질로 변환되도록 가능한 화학물질 또는 화합물, 또한 추가적으로 항체, 단백질, 펩타이드, 핵산, 고분자 또는 화학물질에 수식(modification) 가능한 나노입자, 형광 염료(fluorescent dyes) 등의 측정 시약을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 진단용 키트는 검체로서 혈액, 치은열구액 또는 타액을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 치주염 진단용 키트는 레지스틴(resistin) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 레지스틴 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드의 단편 조성물을 포함하는 것을 특징으로 한다.
(3) 치주염 진단을 위한 정보제공방법
본 발명에 따른 치주염 진단을 위한 정보제공방법은 생물학적 시료 내 혈액, 치은열구액 또는 타액에 분포한, 레지스틴(resistin) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 레지스틴 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드의 단편을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계;를 포함한다.
상기 측정된 발현 수준이 정상 대조군의 발현 수준과 비교하여 증가한 경우 치주염으로 판단하는 것을 특징으로 한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 본 발명의 목적, 특징, 장점은 이하의 실시예를 통하여 쉽게 이해될 것이다. 본 발명은 여기서 설명하는 실시예에 한정되지 않고, 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 여기서 소개되는 실시예는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 따라서 이하의 실시예에 의해 본 발명이 제한되어서는 안 된다.
실험예 1) 샘플 채취
말초 혈액 샘플은 EDTA가 포함된 플라스틱 혈액 수집 튜브에 수집되었다. PBMC는 수집 30분 이내에 SepMate(Stemcell Technologies Inc.)를 사용하여 분리되었다. 배지와 샘플을 조심스럽게 혼합한 후, 튜브를 1200 xg에서 10분 동안 원심분리했다. 상단 층을 새 튜브에 붓고 2% FBS를 함유하는 PBS로 두 번 세척했다. 튜브를 실온에서 8분 동안 300 xg에서 원심분리했다. 수집된 PBMC를 동결하고 사용할 때까지 -80°C에서 보관하였다.
실험예 2) 분석
라이브러리는 10x chromium Next GEM Single Cell 3' v3.1 프로토콜에 따라 크롬 컨트롤러를 사용하여 준비되었다. 단일 세포의 RNA 전사체는 droplet 내에서 고유하게 바코드화 및 역전사되었다. cDNA 분자를 풀링한 다음 단일 'A' 염기 추가 및 어댑터 결찰을 수행했다. 다음으로, 생성물을 정제하고 PCR로 농축하여 최종 cDNA 라이브러리를 생성했다. 마지막으로 Illumina HiSeq 플랫폼을 사용하여 라이브러리를 시퀀싱했다.
단일 세포 유전자 발현 데이터는 10X Genomics Cell Ranger v3.1.0을 사용하여 처리되었다. 'cellranger mkfastq'를 사용하여 FASTQ 파일을 생성하고 'cellranger count'를 사용하여 raw FASTQ 파일을 분석했다. 결과 cell-by-gene count matrix를 생성하여 세포 별 유전자 발현량을 정량화하여 분석했다.
이 정량화 matrix를 이용해 CellChatDB에서 리간드-수용체 쌍의 발현을 기반으로 세포-세포 통신을 추론하였다. 여기서, R 패키지 'CellChat'의 공식 워크플로를 따랐다. 분비 신호, 세포외 기질-수용체 및 세포-세포 접촉 상호작용으로 구성된 리간드-수용체 상호작용 데이터베이스를 설정했다. 그런 다음 computeCommunProb 및 computeCommunProbPathway 함수를 사용하여 통신 확률을 계산하고 세포 간 통신망을 유추했다. 마지막으로 추정된 신호 경로를 집계하고 그 강도와 세포 구성 요소를 비교했다.
그 결과로, 도 1에 나타난 바와 같이, 단세포(monocyte)가 리간드(ligand)로 작용하며, 화살표가 향하는 세포들은 수용체(receptor)로의 역할을 하는 것을 확인할 수 있다. 도 2는 치주염 상태에서 레지스틴(resistine) 경로의 세포간 상호작용을 나타내는 모식도로, 도 1과 비교하여 mDC의 역할이 레지스틴(resistine) 경로에 나타났음을 알 수 있다. 도 3은 레지스틴(resistine) 경로의 세포간 상호작용을 나타내는 모식도로, 치료가 시행되었음에도 불구하고 mDC의 역할이 유지되고 있음을 확인할 수 있다.
도 4는 레지스틴(resistine) 경로에 포함된 ligand-receptor(LR) pair의 건강 상태 별 상대적 기여도로, 건강한 일반인, 치주 염 치료 전과 후, RESISTIN 경로의 LR pair의 비율은 같음을 확인하였다.
도 5는 단세포(monocyte)의 상태별 RETN 발현 비율로, 유의미성을 나타내는 p값은 다음과 같으며, 그룹 별 유의미한 차이를 확인하였다(p ≤ 0.05 (*), p ≤ 0.01 (**), p ≤ 0.001 (***), p ≤ 0.0001). 도 6은 상태별 RETN을 발현(RETN+) 하는 단세포(monocyte)의 비율을 나타내었고, 도 7은 mDC의 상태별 RETN 발현 비율을 나타낸 것으로, 유의미성을 나타내는 p값은 다음과 같으며, 치료 전과 후, mDC 세포의 RETN 발현율에 차이가 없음을 확인할 수 있다(p ≤ 0.05 (*), p ≤ 0.01 (**), p ≤ 0.001 (***), p ≤ 0.0001, p ≥ 0.05 (ns)). 도 8은 상태별 RETN을 발현(RETN+)하는 mDC의 비율로, 치주염 치료에도 불구하고 RETN+ mDC의 세포 비율이 늘어남을 확인할 수 있다.
상기 과제의 해결 수단에 의해, 본 발명은 치주염 환자 혈액의 단일세포 전사체 데이터를 비교하여 차별적으로 발현되는 염증성 신호전달 기전 확인을 통해 치주염 진단에 대한 객관적 지표 제시할 수 있다.
또한, 본 발명은 치주염 발병 기전 관련 인자를 객관적 수치화함으로써 치주염 진행 특성에 적합한 치료계획 수립 기준 및 근거를 제시하고자 한다.
또한, 본 발명은 혈액과 같은 생물학적 시료내에 분포한 레지스틴(resistine) 단백질 수준을 측정하는 진단용 조성물 구성하여 치주염을 진단하는 키트로 활용할 수 있다.
이와 같이, 상술한 본 발명의 기술적 구성은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해되어야 하고, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타나며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

  1. 레지스틴(resistin) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 레지스틴 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 치주염 진단용 바이오마커 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 레지스틴(resistin) 단백질은
    상기 골수성 수지상세포(myeloid dendritic cell, mDC)의 리간드이며, 면역세포의 수용체에 의해 결합되는 것을 특징으로 하는 치주염 진단용 바이오마커 조성물.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 면역세포의 수용체는
    CAP1(Adenylyl Cyclase-Associated Protein 1) 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 치주염 진단용 바이오마커 조성물.
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 면역세포의 수용체는
    TLR4(Toll-like receptor 4) 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 치주염 진단용 바이오마커 조성물.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 치주염 진단용 키트.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 치주염 진단용 키트는,
    마이크로어레이, 앱타머 칩 키트, 엘리사(ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 키트, 블랏팅(Blotting) 키트, 면역침전법 키트, 면역형광검사 키트, 단백질 침 키트 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 치주염 진단용 키트.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 치주염 진단용 키트는,
    시퀀싱, PCR 기법 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 치주염 진단용 키트.
  8. 생물학적 시료 내 혈액, 치은열구액 또는 타액에 분포한,
    레지스틴(resistin) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 레지스틴 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드의 단편을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 치주염 진단을 위한 정보제공방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 측정된 발현 수준이 정상 대조군의 발현 수준과 비교하여 증가한 경우 치주염으로 판단하는 것을 특징으로 하는 치주염 진단을 위한 정보제공방법.
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