WO2023017905A1 - 알츠하이머성 치매 조기 진단용 신규 마이크로 rna 바이오마커 - Google Patents

알츠하이머성 치매 조기 진단용 신규 마이크로 rna 바이오마커 Download PDF

Info

Publication number
WO2023017905A1
WO2023017905A1 PCT/KR2021/014874 KR2021014874W WO2023017905A1 WO 2023017905 A1 WO2023017905 A1 WO 2023017905A1 KR 2021014874 W KR2021014874 W KR 2021014874W WO 2023017905 A1 WO2023017905 A1 WO 2023017905A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
alzheimer
early diagnosis
mirna
kit
dementia
Prior art date
Application number
PCT/KR2021/014874
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김명옥
Original Assignee
주식회사 알츠코리아
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 알츠코리아 filed Critical 주식회사 알츠코리아
Publication of WO2023017905A1 publication Critical patent/WO2023017905A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a novel microRNA biomarker for early diagnosis of Alzheimer's disease.
  • Alzheimer's disease In the diagnosis of Alzheimer's disease, it is very important to take an accurate medical history through the report of the guardian who knows the patient best. The doctor checks whether there is a change in cognitive function, including memory, compared to the previous one, when and how it appeared, and biochemical tests such as physical examination, neurological examination, mental status examination, daily living function level examination, blood examination, etc.
  • biochemical tests such as physical examination, neurological examination, mental status examination, daily living function level examination, blood examination, etc.
  • there are still various limitations in diagnosing Alzheimer's disease making early diagnosis difficult. Mainly, Alzheimer's disease is diagnosed through neuropsychological tests and imaging diagnosis based on the cognitive impairment and amyloid hypothesis, and recently, efforts to develop indicators for diagnosing Alzheimer's dementia from blood, a non-invasive sample, have been actively pursued. It is being done.
  • miRNA is a single-chain small RNA with a sequence of about 20 bases that binds to the 3'-UTR (3'-untranslated regions) of a specific target mRNA and regulates protein through inhibition of mRNA translation. It is a short sequence of RNA. About 1,000 human miRNAs have been identified so far, but most of them have not been identified.
  • Dementia analysis using blood mainly relies on proteins, but has the disadvantage of severe variation among patients compared to structural stability and inability to fully reflect the pathology of Alzheimer's dementia in blood. You need a target.
  • abnormal protein aggregation is not caused by genetic factors alone, but by various environmental stimuli. It is important to find
  • miRNA when used as a diagnostic indicator, it is a single-stranded RNA of 21 to 25 nucleotides present in all biological fluids including blood, urine, and saliva, which inhibits mRNA translation and directly controls gene expression. In addition, it is resistant to degradation by RNase and stably exists in the blood. Defects in metabolism or function of miRNA are closely related to the onset of dementia, and it is known to have high specificity and sensitivity depending on the disease, so it can be used as the most optimal diagnostic index. there is.
  • Korean Patent No. 1992539 discloses a composition and method for diagnosing a cognitive disorder based on miRNA as technologies related to the diagnosis of cognitive disorders
  • Korean Patent No. 1718940 discloses epigenetics for Alzheimer's dementia or mild cognitive impairment.
  • a composition for early diagnosis has been disclosed
  • the microRNA biomarker for early diagnosis of Alzheimer's dementia derived using the blood of patients with mild cognitive impairment (MCI) of the present invention has not yet been disclosed.
  • the present invention was derived from the above needs, and the present invention provides a microRNA biomarker for early diagnosis of Alzheimer's dementia, and the novel miRNA of SEQ ID NO: 1 according to the present invention is mild cognitive impairment for early diagnosis of Alzheimer's dementia.
  • the present invention was completed by confirming that it is expressed in the plasma of a patient group and can reduce the expression of an Alzheimer's dementia-related protein.
  • the present invention provides a biomarker composition for early diagnosis of Alzheimer's disease, comprising novel microRNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • the present invention provides a biomarker composition for early diagnosis of Alzheimer's disease, comprising an agent capable of detecting microRNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • the present invention is a kit for early diagnosis of Alzheimer's dementia comprising, as an active ingredient, a biomarker composition for early diagnosis of Alzheimer's disease containing an agent capable of measuring the expression level of a novel microRNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient provides
  • the present invention comprises the steps of (1) collecting blood from an individual;
  • the present invention relates to a microRNA biomarker for early diagnosis of Alzheimer's disease, wherein the novel miRNA of SEQ ID NO: 1 according to the present invention is expressed in the plasma of a patient group with mild cognitive impairment and has the effect of reducing the expression of proteins related to Alzheimer's disease will be. Therefore, the present invention has an effect of enabling early diagnosis before the symptoms of Alzheimer's dementia appear by using novel miRNAs present in relatively less invasive plasma as a diagnostic index.
  • Figure 1 shows the RNA composition of each patient sample, showing the proportion of RNA types classified in reads.
  • Figure 2 shows the stem loop structure and sequence information of the novel miRNA identified in the present invention.
  • Figure 3 shows the mimic miRNA and miRNA inhibitor synthetic sequences for confirming the novel miRNA function of the present invention.
  • Figure 4 is a Western blot result confirming changes in the expression levels of the novel miRNA target gene proteins SYNJ1, SNAP91 and HOOK3 of the present invention.
  • *, **, *** indicate that there is a statistically significant difference in the expression level of the target gene between the control group that was not treated with anything and the group treated with the mimic miRNA or miRNA inhibitor of the present invention, * indicates p ⁇ 0.05, and ** is p ⁇ 0.01, *** is p ⁇ 0.001.
  • Figure 5 is the result of confirming the change in the expression level of the novel miRNA target gene proteins SYNJ1, SNAP91 and HOOK3 of the present invention by immunocytochemistry.
  • the present invention relates to a biomarker composition for early diagnosis of Alzheimer's disease, comprising novel microRNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • microRNA refers to 21 to 23 non-coding RNAs that regulate gene expression after transcription by promoting degradation of target RNA or inhibiting their translation.
  • miRNAs represented by specific nucleotide sequences, but also precursors (pre-miRNA, pri-miRNA) of the miRNAs, miRNAs with biological functions equivalent to these, for example, homologues (i.e., homologs or orthologs), variants such as polymorphisms, and derivatives.
  • the novel microRNA is preferably derived from human plasma, but is not limited thereto.
  • the novel microRNA is characterized by reducing the expression level of synnaptojanin 1 (SYNJ1), synaptosome associated protein 91 (SNAP91), or hook microtubule tethering protein 3 (HOOK3) genes.
  • 'Diagnosis' of the present invention is to determine the susceptibility of an object, that is, a test subject, to a specific disease or disorder, to determine whether an object currently has a specific disease or disorder, to a specific disease or disorder
  • Concepts include determining the prognosis of an affected subject or therametrics (eg, monitoring the condition of a subject to provide information about treatment efficacy).
  • the present invention relates to a biomarker composition for early diagnosis of Alzheimer's disease, comprising an agent capable of detecting microRNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • the agent may be an antisense oligonucleotide, primer or probe complementary to the microRNA, but is not limited thereto.
  • Mild cognitive impairment refers to an intermediate stage between cognitive decline and dementia caused by normal aging. In other words, it refers to a state in which cognitive ability is lowered compared to those of the same age group, and it is different from dementia that daily life is possible. This mild cognitive impairment is an intermediate stage between normal and dementia, and is known as a high-risk group for dementia. Therefore, in the present invention, the 'patient group with mild cognitive impairment' was selected as an experimental group for early diagnosis of Alzheimer's dementia.
  • the present invention relates to a kit for early diagnosis of Alzheimer's dementia comprising, as an active ingredient, a biomarker composition for early diagnosis of Alzheimer's disease containing an agent capable of detecting novel microRNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • the kit is preferably for RT-PCR, real-time PCR, isothermal PCR, Northern blotting, RNA protection assay or microarray chip, but is not limited thereto.
  • the kit of the present invention may additionally include a nucleic acid capable of specifically binding to the microRNA of SEQ ID NO: 1, which means that the nucleic acid includes both RNA, DNA, or RNA/DNA (chimera), and the DNA includes cDNA. , genomic DNA, and synthetic DNA may all be included.
  • the RNA may include all of total RNA, mRNA, rRNA, miRNA, siRNA, snoRNA, snRNA, non-coding RNA, and synthetic RNA.
  • the kit of the present invention may include, in addition to the nucleic acid, a known nucleic acid or a nucleic acid that can be discovered in the future that enables early diagnosis of Alzheimer's disease, and an antibody for measuring a known marker for early diagnosis of Alzheimer's disease. can also be included.
  • the nucleic acids included in the kit may be individually or arbitrarily combined and packaged in different containers.
  • the kit of the present invention may include a fluorescent material for labeling, an enzyme and medium for nucleic acid amplification, instructions for use, and the like.
  • the kit of the present invention is a device for early diagnosis of Alzheimer's disease in which the nucleic acid is bound or attached to, for example, a solid phase.
  • the material of the solid phase include plastic, paper, glass, silicon, and the like, and a material of the solid phase that is preferable from ease of processing may be plastic.
  • the shape of the solid phase is arbitrary, and may be, for example, square, circular, rectangular, or film-like.
  • the kit of the present invention may be included in a device for multiplexed POCT based on high-throughput-screening (HTS) that simultaneously processes a large amount of miRNA samples.
  • the cartridge in the device can be composed of a thermostat, stirrer, disposable tip, sample injection container, etc., and the 'dementia risk index' is automatically derived when human blood is injected into the all-in-one device with a built-in ultra-small whole blood separator, fluorescence detector, and liquid handler.
  • a fully automatic detection system may be included.
  • the present invention comprises the steps of (1) collecting blood from an individual;
  • MCI mild cognitive impairment
  • RNA from the plasma of each of the above-obtained patient and normal groups was extracted using the QIAGEN miRNeasy Serum/Plasma Separation Kit, which can purify miRNA and other small RNAs mainly from small amounts of serum and plasma.
  • RNA-seq library was created on the Illumina Platform using the SMARTer smRNA-Seq Kit, which can produce a high-quality miRNA library even with a small amount of RNA.
  • Samples prepared with the NovaSeq 6000 sequencing platform were sequenced according to the SMARTer smRNA-Seq Kit manual.
  • Contaminated or low-quantity data in plasma was removed in the order of adapter, quality, and length trimming from the raw data obtained by NGS analysis.
  • miRNA Deep2 sequencing was performed with clean data from which unnecessary information was removed through this trimming process.
  • miRNA Deep2 can predict new miRNAs by arranging short-cut miRBase (Pre-miRNA) libraries side by side in mature, star, and loop sequences according to the software's RNAfold algorithm, which can identify new miRNAs from purified raw data.
  • the RNAfold algorithm can be derived by using the most similar thermodynamic model to predict the secondary structure of the RNA sequence with the minimum free energy.
  • the RNA fold generation graphic includes the number of reads for each part of the hairpin, the score for the minimum free energy, the score for the randfold, and the conserved seed sequence score.
  • the miRDeep2 system can detect previously known miRNAs and new miRNAs by mapping using an RNA database.
  • miRNAs target genes
  • SH-SY5Y cells used as a neural function and differentiation model were used, and a miRNA mimic showing the overexpression effect of the selected new miRNA, a miRNA inhibitor suppressing the expression of the new miRNA, and a negative control miRNA were transfected into SH-SY5Y After injection, the protein expression of the target gene was confirmed by Western blot.
  • Example 1 Sample acquisition and total RNA extraction
  • RNA in plasma collected from patients and normal groups was extracted using the QIAGEN miRNeasy Serum/Plasma Kit, which can purify miRNA and other small RNAs from small amounts of serum and plasma. Subsequently, it was confirmed that a sufficient amount of RNA was secured for NGS analysis by quantifying RNA using a Bioanalyzer RNA Small RNA chip to determine whether a sufficient amount of RNA was secured for library production for NGS.
  • RNA-seq Library for sequencing on the Illumina Platform for NGS
  • the SMARTer smRNA-Seq Kit which can produce a high-quality miRNA library even with a small amount of RNA
  • Libraries for total RNA sequencing of patients and normal groups obtained from plasma were prepared, and raw data were derived by sequencing using the prepared libraries and the NovaSeq 6000 sequencing platform.
  • the raw data obtained from NGS analysis was trimmed in the order of Adapter, Quality, and Length to remove contaminated or small amounts of data.
  • Total Read Count which is the raw data obtained by sequencing, and tablets obtained from a group of 10 patients.
  • the resulting values are shown in Table 1, and miRNA Deep2* sequencing was performed using the primary processed data from which unnecessary information was removed through the trimming selection process.
  • miRNA Deep2* predicts new miRNAs by arranging short-cut miRBase (Pre-miRNA) libraries side by side in mature, star, and loop sequences according to the RNAfold algorithm of the software that can identify newly known miRNAs from the primary processed data.
  • the RNAfold algorithm was derived by predicting the secondary structure with the minimum free energy of the RNA sequence using the most similar thermodynamic model.
  • the RNA fold generation graphic contains the number of reads for each part of the hairpin, the score for the minimum free energy, the score for the randfold, and the conserved seed sequence score.
  • the miRDeep2* system detected previously known miRNAs and new miRNAs by mapping using an RNA database.
  • the reads finally processed for the 10 samples were classified into piRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, known miRNA and novel miRNA through miRBase v22.1 and non-coding RNA database (RNAcentral release 14.0) (Fig. 1) .
  • Genome mapping was processed by Bowtie and STAR using RSEM. Bowtie was then used for miRDeep2 analysis using the genome sequence. Known/novel miRNAs predicted by miRDeep2 and other small RNAs matching RNAcentral were aligned using Bowtie (target small RNA, ⁇ 50nt) and Bowtie2 (target smRNA, ⁇ 50nt).
  • RNA-Seq by Expectation-Maximization a tool to quantify RNA-Seq transcripts
  • RNAfold function predicted the minimum free energy secondary structure of an RNA sequence using a nearest-neighbor thermodynamic model.
  • graphics generated by RNAfold include real in silico-folded hairpins, read counts for each part of the hairpin, the minimum free energy score, and the randfold score, as well as the score of the conserved seed sequence.
  • miRDeep2* derived summary results of novel miRNAs through scores ranging from -10 to 10. Among them, miRNAs with a miRDeep2* score of 1 or more, an RNA fold of "yes", and a mature read number of 10 or more were selected. The stem loop structure and sequence information of the selected novel miRNAs are shown in FIG. 2 .
  • miRDB software was used to screen the target gene by score based on the miRNA sequence 5'-CAACAGAGCAAGACUCUGUC-3' (SEQ ID NO: 1). Among the target genes with high gene scores, three genes related to Alzheimer's disease were selected.
  • SH-SY5Y cells used as a model for neural function and differentiation were used, mimic miRNAs showing the overexpression effect of selected new miRNAs, inhibitor miRNAs suppressing the expression of new miRNAs, and negative control miRNAs were transfected into SH-SY5Y cells. , The protein expression of the target gene was confirmed by Western blot.
  • the mimic miRNA is a miRNA that can actually function like a novel miRNA in vivo, and is produced as a double bond (miRNA mimic-1: 5'-CAACAGAGCAAGACUCUGUC-3' (1-AS) (SEQ ID NO: 1), 5'-GACAGAGUCUUGCUCUGUUG- 3'(1-AA) (SEQ ID NO: 2)), the inhibitor miRNA is a complementary sequence of the derived miRNA, and is a miRNA that can inhibit the miRNA produced with a single bond (SEQ ID NO: 2).
  • the negative control miRNA is a miRNA composed of miRNAs that do not regulate genes, and serves as a criterion for verification.
  • the produced mimic miRNA and inhibitor miRNA are shown in Figure 3.
  • the target prediction based on the sequence 5'-CAACAGAGCAAGACUCUGUC-3' (SEQ ID NO: 1) of the new miRNA was used to select genes by score using miRDB software. screened. After setting the cut-off value of the gene score of the miRNA to 80, SYNJ1 (synnaptojanin 1), SNAP91 (synaptosome associated protein 91) and HOOK3 (hook microtubule tethering protein 3) were selected as miRNA target genes related to nerve and synaptic function Three species were selected.
  • SYNJ1 plays an important role in synaptic vesicle recycling.
  • SNAP91 is involved in synaptic vesicle transport and movement and plays an important role in synaptic transmission.
  • HOOK3 is a cytoplasmic linker protein involved in endosome transport and is mainly expressed in neurons. It was confirmed that the novel miRNA is related to synaptic proteins in the nervous system.
  • Human neuroblastoma SH-SY5Y was transfected with 100 nM of each miRNA for 24 hours, mimic miRNA for overexpression of new miRNA and inhibitor miRNA for suppression of function, and proteins were isolated and the expression level was confirmed by Western blotting.
  • Overexpression of the new miRNA increased the number of miRNAs that bind to 3', and it was confirmed that the expression of SYNJ1, SNAP91, and HOOK3, which are candidate target gene proteins, was significantly reduced.
  • By removing miRNAs that bind to 3' with inhibitor miRNA It was confirmed that the expression of candidate target gene proteins SYNJ1, SNAP91 and HOOK3 increased (FIG. 4).

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 알츠하이머성 치매 조기 진단용 마이크로 RNA 바이오마커에 관한 것으로, 본 발명에 따른 서열번호 1의 신규 miRNA가 경도인지장애 환자군의 혈장에서 발현되며, 경도인지장애 관련 단백질의 발현을 감소시키는 효과가 있는 것이다. 따라서, 본 발명은 상대적으로 침습성이 낮은 혈장에 존재하는 신규 miRNA를 진단지표로 활용함으로써, 알츠하이머 치매의 증상이 나타나기 전 조기 진단이 가능한 효과가 있다.

Description

알츠하이머성 치매 조기 진단용 신규 마이크로 RNA 바이오마커
본 발명은 알츠하이머성 치매 조기 진단용 신규 마이크로 RNA 바이오마커에 관한 것이다.
알츠하이머병의 진단은 환자에 대해 가장 잘 알고 있는 보호자의 보고를 통한 정확한 병력 청취가 매우 중요하다. 의사는 이전에 비해 기억력을 포함한 인지 기능의 변화가 있는지, 있다면 언제부터 어떠한 양상으로 나타났는지 확인하고, 신체검사와 신경학적 검사, 정신상태 검사, 일상생활 기능수준 검사, 혈액 검사 등의 생화학적 검사, 뇌영상학 검사, 신경심리 검사 등을 통해 진단하고 있지만, 아직까지는 알츠하이머병을 진단하는데는 여러가지 한계점이 존재하여, 조기진단이 어려운 상황이다. 주로, 인지기능의 손상과 아밀로이드 가설을 기반으로 신경심리검사 및 영상진단을 통해 알츠하이머성 치매를 진단하고 있고, 최근들어 비침습적 시료인 혈액으로부터 알츠하이머성 치매를 진단하는 지표를 개발하려는 노력이 활발하게 이루어지고 있다.
한편, miRNA는 약 20개 정도의 염기서열을 가진 단일 사슬의 작은 RNA로서 특정 타겟이 되는 mRNA의 3'-UTR(3'-untranslated regions)과 결합하여 mRNA의 번역 억제를 통해 단백질을 조절할 수 있는 짧은 서열의 RNA이다. 현재까지 밝혀진 인간에 대한 miRNA는 1000여개 정도가 밝혀졌으나, 대부분 기능이 밝혀지지 않은 상태이다.
혈액을 이용한 치매 분석은 주로 단백질에 의존하고 있으나, 구조적 안정성에 비해 환자별 편차가 심하고, 알츠하이머성 치매 병리를 혈액에 온전히 반영하지 못하는 단점이 있으므로, 특이적 진단 지표를 도출하기 위해서 더 작은 크기의 타겟이 필요하다. 특히 알츠하이머성 치매의 경우, 비정상적 단백질의 응집 등이 유전적인 요인으로만 일어나는 것이 아닌, 다양한 환경적 자극으로 유발되기 때문에, 단백질이라는 결과보다, 단백질의 번역 이전인 유전자 발현 조절 변화 분석으로 근본적인 타겟을 찾는 것이 중요하다.
일례로, miRNA를 진단 지표로 활용할 경우, 혈액, 소변 및 타액을 포함한 모든 생체 유체에 존재하는 21~25 뉴클레오티드의 단일 가닥 RNA로 mRNA의 번역을 억제하여 유전자 발현을 직접 제어하는 역할을 한다. 또한 RNase에 의한 분해에 강해 혈액에서 안정적으로 존재하며, miRNA의 대사 또는 기능의 결함은 치매의 발병과 밀접한 관련이 있고, 질병에 따라 높은 특이성 및 민감도를 가지는 것으로 알려져 가장 최적의 진단지표로 활용할 수 있다.
한편, 인지장애의 진단 관련 기술로는 한국등록특허 제1992539호에 miRNA 기반의 인지장애 질환 진단용 조성물 및 방법이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1718940호에 알츠하이머성 치매 또는 경도인지장애를 위한 후생유전학 조기진단용 조성물이 개시되어 있으나, 아직까지는 본 발명의 경도인지장애(MCI) 환자의 혈액을 이용하여 도출된 알츠하이머성 치매 조기 진단용 마이크로 RNA 바이오마커에 대해서는 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 알츠하이머성 치매 조기 진단용 마이크로 RNA 바이오마커를 제공하고, 본 발명에 따른 서열번호 1의 신규 miRNA는 알츠하이머 치매의 조기진단을 위한 경도인지장애 환자군의 혈장에서 발현되며, 알츠하이머성 치매 관련 단백질의 발현을 감소시킬 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 신규 마이크로 RNA를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머성 치매 조기 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 마이크로 RNA를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머성 치매 조기 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 신규 마이크로 RNA 발현량을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머성 치매 조기 진단용 바이오마커 조성물을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머성 치매 조기 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 개체로부터 혈액을 채취하는 단계;
(2) 상기 단계 (1)의 혈액으로부터 혈장을 분리하는 단계; 및
(3) 상기 단계 (2)에서 분리한 혈장 내 서열번호 1의 miRNA 발현여부를 확인하는 단계;를 포함하는 경도인지장애 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 알츠하이머성 치매 조기 진단용 마이크로 RNA 바이오마커에 관한 것으로, 본 발명에 따른 서열번호 1의 신규 miRNA가 경도인지장애 환자군의 혈장에서 발현되며, 알츠하이머성 치매 관련 단백질의 발현을 감소시키는 효과가 있는 것이다. 따라서, 본 발명은 상대적으로 침습성이 낮은 혈장에 존재하는 신규 miRNA를 진단지표로 활용함으로써, 알츠하이머 치매의 증상이 나타나기 전 조기 진단이 가능한 효과가 있다.
도 1은 각 환자 시료의 RNA 구성을 나타낸 것으로, 리드에서 분류된 RNA 유형의 비율을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 확인한 신규 miRNA의 stem loop 구조 및 서열 정보를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 신규 miRNA 기능을 확인하기 위한 mimic miRNA 및 miRNA 저해자 합성서열을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 신규 miRNA 타겟 유전자 단백질 SYNJ1, SNAP91 및 HOOK3의 발현량 변화를 확인한 웨스턴블랏 결과이다. *, **, ***은 아무것도 처리하지 않은 대조군과 본 발명의 mimic miRNA 또는 miRNA 저해자를 처리한 군에서의 타겟 유전자 발현량이 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것으로, *은 p<0.05이고, **은 p<0.01이며, ***은 p<0.001이다.
도 5는 본 발명의 신규 miRNA 타겟 유전자 단백질 SYNJ1, SNAP91 및 HOOK3의 발현량 변화를 면역세포화학법으로 확인한 결과이다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 신규 마이크로 RNA를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머성 치매 조기 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 마이크로 RNA(miRNA)는 표적 RNA의 분해(degradation)를 촉진시키거나 또는 그들의 번역을 억제시킴으로써 유전자 발현을 전사 후에 조절하는 21~23개의 비코딩 RNA를 말한다. 특정 염기서열로 나타내는 miRNA뿐만 아니라 상기 miRNA의 전구체(pre-miRNA, pri-miRNA), 이들과 생물학적 기능이 동등한 miRNA, 예를 들면 동족체(즉, 호몰로그 또는 오솔로그), 유전자다형 등의 변이체, 및 유도체도 포함한다.
상기 신규 마이크로 RNA는 인간의 혈장 유래인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
상기 신규 마이크로 RNA는 SYNJ1(synnaptojanin 1), SNAP91(synaptosome associated protein 91) 또는 HOOK3(hook microtubule tethering protein 3) 유전자의 발현량을 감소시키는 것이 특징이다.
본 발명의 '진단'은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체 즉 검사 대상자의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함하는 개념이다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 마이크로 RNA를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머성 치매 조기 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.
상기 제제는 상기 마이크로 RNA에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
경도인지장애는 정상적인 노화현상으로 인한 인지능력의 감퇴와 치매의 중간 단계를 의미한다. 즉, 동일한 연령대에 비해 인지 능력이 저하되어 있는 상태를 말하며, 일상생활이 가능한 것이 치매와 다른 점이다. 이러한 경도인지장애는 정상과 치매의 중간단계이며, 치매의 고위험군으로 알려져 있다. 따라서 본 발명에서는 알츠하이머성 치매의 조기 진단을 위한 실험군으로, '경도인지장애가 있는 환자군'을 채택하였다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 신규 마이크로 RNA를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머성 치매 조기 진단용 바이오마커 조성물을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머성 치매 조기 진단용 키트에 관한 것이다.
상기 키트는 RT-PCR, 실시간(real-time) PCR, 등온 PCR, 노던 블랏팅, RNA 보호분석법 또는 마이크로어레이 칩용인 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 키트는 서열번호 1의 마이크로 RNA와 특이적으로 결합 가능한 핵산을 추가적으로 포함할 수 있고, 상기 핵산은 RNA, DNA, 또는 RNA/DNA(키메라) 모두 포함하는 것을 의미하고, 상기 DNA에는 cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 DNA 모두가 포함될 수 있다.
또한, 상기 RNA에는 total RNA, mRNA, rRNA, miRNA, siRNA, snoRNA, snRNA, 비코딩(non-coding)RNA 및 합성 RNA 모두가 포함될 수 있다. 본 발명의 키트는 상기 핵산에 추가하여 알츠하이머성 치매의 조기 진단을 가능하게 하는 기지의 핵산 또는 장래 발견될 수 있는 핵산을 포함할 수 있으며, 공지의 알츠하이머성 치매의 조기 진단용 마커를 측정하기 위한 항체도 포함시킬 수 있다. 상기 키트에 포함되는 상기 핵산은 개별적으로 또는 임의로 조합하여 다른 용기에 포장될 수 있다.
본 발명의 키트에는 표지용 형광물질, 핵산 증폭용 효소 및 배지, 사용 설명서 등을 포함시킬 수 있다. 본 발명의 키트는 상기 핵산이 예를 들면 고상에 결합 또는 부착된 알츠하이머성 치매의 조기 진단를 위한 장치이다. 고상의 재질의 예는 플라스틱, 종이, 유리, 실리콘 등이며, 가공의 용이함으로부터 바람직한 고상의 재질은 플라스틱일 수 있다. 고상의 형상은 임의이며, 예를 들면 사각형, 원형, 직사각형, 필름형 등일 수 있다.
본 발명의 키트는 다량의 miRNA 시료를 동시에 처리하는 HTS(high-throughput-screening)기반 다중 현장진단(multiplexed POCT)용 장치에 포함될 수 있다. 장치 내 카트릿지에는 항온장치, 교반기, 일회용 팁, 검체 주입용기 등으로 구성될 수 있고, 초소형 전혈분리기, 형광검출기, 리퀴드핸들러 내장 올인원 장치로 사람의 혈액을 주입하면 자동으로 '치매 위험 지수'가 도출되는 전자동 검출 시스템이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 개체로부터 혈액을 채취하는 단계;
(2) 상기 단계 (1)의 혈액으로부터 혈장을 분리하는 단계; 및
(3) 상기 단계 (2)에서 분리한 혈장 내 서열번호 1의 miRNA 발현여부를 확인하는 단계;를 포함하는 알츠하이머성 치매의 조기 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
1. 알츠하이머성 치매 환자의 시료 확보
선별검사도구(K-MMSE, SNSB) 점수와 영상진단(PET, fMRI, CT)을 통해 알츠하이머성 치매 중증도에 따라 분류된 환자군 중에서 경도인지장애(MCI)로 분류된 환자 10인의 혈액을 채취하여 혈장을 분리하였다. 분리한 혈장은 사용하기 전까지, -70℃에서 냉동보관하였다. 한편, 대조군으로서, 정상인 10인의 혈액을 채취하여 혈장을 분리하였고, 상기 환자군과 동일하게 사용하기 전까지 -70℃에서 냉동보관하였다.
2. Total miRNA 추출
소량의 혈청 및 혈장에서 주로 miRNA 및 기타 small RNA를 정제할 수 있는 QIAGEN miRNeasy 혈청/혈장 분리 키트를 사용하여 상기 확보한 환자군 및 정상군의 각 혈장 내 있는 Total RNA를 추출하였다.
이후, Bioanalyzer RNA Small RNA chip을 이용하여 NGS 분석을 위한 라이브러리 제작에 충분한 RNA 양이 확보되었는지를 확인하였다.
3. NGS(Next Generation Sequencing) 분석
소량의 RNA에서도 고품질 miRNA 라이브러리 제작이 가능한 SMARTer smRNA-Seq Kit를 사용하여 Illumina Platform에서 small RNA-seq 라이브러리를 생성하였다. SMARTer smRNA-Seq Kit 매뉴얼에 따라 NovaSeq 6000 시퀀싱 플랫폼으로 준비된 시료를 시퀀싱하였다.
4. 가공하지 않은 데이터 분석을 통한 miRNA 데이터 선별
NGS 분석으로 획득한 가공하지 않은 데이터를 Adapter, Quality 및 Length의 trimming 순으로 혈장 속에 존재하는 오염되거나 양이 적은 데이터를 제거하였다. 이러한 trimming 과정을 거쳐 불필요한 정보가 제거된 clean 데이터로 miRNA Deep2 시퀀싱을 실시하였다.
5. miRNA Deep2 시퀀싱
miRNA Deep2는 정제된 가공하지 않은 데이터에서 신규 miRNA를 식별할 수 있는 소프트웨어의 RNAfold 알고리즘에 따라, mature, star 및 loop 서열에 짧게 잘려진 miRBase(Pre-miRNA) 라이브러리를 나란히 배열하여 신규 miRNA를 예측할 수 있으며, RNAfold 알고리즘은 가장 비슷한 열역학 모델을 이용해 RNA 서열이 최소 자유에너지를 갖는 2차 구조를 예측하는 방식으로 도출할 수 있다.
RNA fold 생성 그래픽에는 Hairpin의 각 부분에 대한 읽기 수, 최소자유에너지에 대한 점수, randfold에 대한 점수 및 conserved seed sequence 점수가 포함되어 있다.
miRDeep2 시스템은 RNA 데이터베이스를 활용한 맵핑으로 기존에 알려진 miRNA를 탐지하고 신규 miRNA을 탐지할 수 있다.
6. 혈액에 반영되는 알츠하이머성 치매 관련 신규 miRNA의 검증
신규 miRNA가 알츠하이머성 치매와 어떤 연관이 있는지 기능 검증을 위해 miRNA의 서열기반으로 타겟 유전자(miRNA)를 스코어링하는 miRDB 소프트웨어를 사용하여 스크리닝하였다. 높은 유전자 스코어를 가진 타겟 유전자 중 알츠하이머성 치매와 관련된 유전자 3종에 대한 발현량 분석을 통해 검증하였다.
신경기능 및 분화 모델로 사용되는 SH-SY5Y 세포를 사용하였으며, 선별된 신규 miRNA의 과발현 효과를 나타내는 miRNA mimic, 신규 miRNA의 발현을 억제하는 miRNA 억제제(inhibitor) 및 음성대조군 miRNA를 SH-SY5Y에 형질주입 후, 타겟 유전자의 단백질 발현을 웨스턴블랏으로 확인하였다.
실시예 1. 시료 확보 및 Total RNA 추출
소량의 혈청 및 혈장에서 miRNA 및 기타 small RNA를 정제할 수 있는 QIAGEN miRNeasy Serum/Plasma Kit를 사용하여, 환자군 및 정상군에서 채취한 각 혈장 내에 있는 Total RNA를 추출하였다. 이후 NGS를 위한 라이브러리 제작에 충분한 RNA 양이 확보되었는지 Bioanalyzer RNA Small RNA chip를 이용하여 RNA를 정량하여 NGS 분석에 충분한 양이 확보되었다는 것을 확인하였다.
실시예 2. Next Generation Sequencing(NGS)
(1) 라이브러리 구축 및 가공하지 않은 데이터 도출
NGS를 위한 Illumina Platform에서 Sequencing을 위한 작은 RNA-seq 라이브러리를 생성하는데 있어, 소량의 RNA에서도 고품질 miRNA 라이브러리 제작이 가능한 SMARTer smRNA-Seq Kit를 사용하였다. 혈장에서 획득한 환자군 및 정상군의 Total RNA 시퀀싱을 위한 라이브러리를 제작하였고, 제작된 라이브러리 및 NovaSeq 6000 sequencing platform을 이용하여 시퀀싱하여 가공하지 않은 데이터를 도출하였다.
(2) 가공하지 않은 데이터(Raw data)로부터 miRNA의 데이터 선별
NGS 분석에서 획득한 가공하지 않은 데이터를 Adapter, Quality, Length 순서로 trimming 하여 오염되거나 적은 양의 데이터를 제거하였다.
시퀀싱하여 획득한 가공하지 않은 데이터인 Total Read Count에서 Adapter 유무(nonAdapter Read Count), 적당한 길이(Short Read Count), 낮은 품질(Low Quality Read Count)의 정도를 확인하였으며, 10명의 환자군에서 획득한 정제된 결과값을 표 1에 개시하였고, 이러한 trimming 선별과정을 통해 불필요한 정보가 제거된 1차 가공 데이터를 이용하여 miRNA Deep2* 시퀀싱을 수행하였다.
trimming 선별과정을 거쳐 불필요한 정보가 제거된, 정확도가 높은 데이터
시료 Total Read Count Reain Read Count Filtered Read Count
1 27,219,398 18,390,807(67.57%) 8,828,591(32.43%)
2 26,218,999 11,956,632(45.6%) 14.262,367(54.4%)
3 26,571,228 16,969,474(63.86%) 9,601,754(36.14%)
4 23,724,381 15,139,175(63.81%) 8,585,206(36.19%)
5 22,907,556 14,289,335(62.38%) 8,618,221(37.62%)
6 16,222,537 6,377,318(39.31%) 9,845,219(60.69%)
7 20,776,579 9,679,288(46.59%) 11,097,291(53.41%)
8 17,732,489 9,912,646(55.9%) 7,819,843(44.1%)
9 7,664,012 3,538,318(46.17%) 4,125,694(53.83%)
10 28,799,084 19,621,616(68.13%) 9,177,468(31.87%)
(3) miRNA Deep2* sequencing
miRNA Deep2*는 상기 1차 가공된 데이터로부터 새롭게 알려진 miRNA를 식별할 수 있는 소프트웨어의 RNAfold 알고리즘에 따라, mature, star, loop 서열에 짧게 잘려진 miRBase(Pre-miRNA) 라이브러리를 나란히 배열하여 신규 miRNA를 예측하였으며, RNAfold 알고리즘은 가장 비슷한 열역학 모델을 이용해 RNA 서열이 최소 자유에너지를 갖는 2차 구조를 예측하는 방식으로 도출하였다.
RNA fold 생성 그래픽에는 Hairpin의 각 부분에 대한 읽기 수, 최소 자유 에너지에 대한 점수, randfold에 대한 점수 및 conserved seed sequence 점수가 포함되어 있다. miRDeep2* 시스템은 RNA 데이터베이스를 활용한 맵핑으로 기존 알려진 miRNA 및 신규 miRNA을 탐지하였다.
상기 10종의 시료에 대해 최종 처리된 리드는 miRBase v22.1과 non-coding RNA database(RNAcentral release 14.0)을 통해 piRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, 이미 알려진 miRNA 및 신규 miRNA를 분류하였다(도 1).
Genome 맵핑은 RSEM을 사용하여 Bowtie와 STAR에 의해 처리되었다. Bowtie는 이후 Genome 서열을 사용하여 miRDeep2 분석에 이용하였다. miRDeep2에 의해 예측된 알려진/신규 miRNA 및 RNAcentral과 일치하는 다른 small RNA는 Bowtie(표적 small RNA, <50nt) 및 Bowtie2(표적 smRNA, ≥50nt)를 사용하여 정렬하였다.
- RSEM(RNA-Seq by Expectation-Maximization): RNA-Seq 전사체를 정량화하는 도구
- Bowtie: 서열 정렬 및 서열 분석에 일반적으로 사용되는 소프트웨어
- STAR(Spliced Transcripts Alignment to a Reference): 빠른 RNA-seq read mapper
신규 miRNA를 예측하기 위해 고유 클러스터링된 read는 reference genome 및 전구체 miRNA에 대해 별도로 정렬되었다. miRNA는 miRNA Deep2*를 사용하는 RNAfold 알고리즘에 따라 성숙한 star 및 loop 서열을 예측할 수 있다. RNAfold 함수는 가장 근접한 이웃 열역학 모델을 사용하여 RNA 서열의 최소 자유 에너지 2차 구조를 예측하였다. RNAfold에서 생성된 그래픽에는 실제 in silico-folded 헤어핀이 포함되어 있으며, 헤어핀의 각 부분에 대한 판독 횟수, 최소 자유 에너지 점수, randfold 점수 보존된 seed 서열의 점수도 포함되어 있다.
miRDeep2*는 -10에서 10까지의 점수를 통해 신규 miRNA의 요약 결과를 도출하였다. 그 중 miRDeep2* 점수는 1이상, RNA fold는 "yes"이고, mature read의 수가 10 이상인 miRNA를 선별하였다. 선별된 신규 miRNA의 stem loop 구조 및 서열 정보는 도 2에 개시하였다.
실시예 3. 신규 miRNA의 알츠하이머성 치매 관련 유전자 발현량 조절 확인
신규 miRNA가 알츠하이머성 치매와 어떤 연관이 있는지를 검증하기 위해 miRNA의 서열 5'-CAACAGAGCAAGACUCUGUC-3'(서열번호 1)을 기반으로 타겟이 되는 유전자를 스코어별로 스크리닝하는 miRDB 소프트웨어를 사용하였다. 높은 유전자 스코어를 가진 타겟 유전자 중 알츠하이머성 치매와 관련된 유전자 3종을 선별하였다.
신경 기능 및 분화에 모델로 사용되는 SH-SY5Y 세포를 사용하였으며, 선별된 신규 miRNA의 과발현 효과를 나타내는 mimic miRNA, 신규 miRNA의 발현을 억제하는 inhibitor miRNA, 음성대조군 miRNA를 SH-SY5Y에 형질주입 후, 타겟 유전자의 단백질 발현을 웨스턴블랏으로 확인하였다.
mimic miRNA는 실제로 생체 내에 있는 신규 miRNA처럼 기능할 수 있는 miRNA로 이중결합으로 제작되었고(miRNA mimic-1: 5'-CAACAGAGCAAGACUCUGUC-3'(1-AS)(서열번호 1), 5'-GACAGAGUCUUGCUCUGUUG-3'(1-AA)(서열번호 2)), inhibitor miRNA는 도출된 해당 miRNA의 상보적인 서열로, 단일 결합으로 제작되어(서열번호 2) 해당 miRNA를 억제할 수 있는 miRNA이다. 한편, 음성대조군 miRNA는 유전자를 조절하지 않는 miRNA로 이루어진 miRNA로 검증의 기준이 된다. 제작한 mimic miRNA와 inhibitor miRNA는 도 3에 개시하였다.
[ miRDB 소프트웨어를 이용한 유전자 스크리닝 ]
신규 miRNA가 제어하는 유전자 중, 알츠하이머성 치매와 관련성이 높은 타겟을 선별하기 위해, 신규 miRNA의 서열 5'-CAACAGAGCAAGACUCUGUC-3'(서열번호 1)를 기반으로 타겟 예측 miRDB 소프트웨어를 이용해 유전자를 스코어별로 스크리닝하였다. 해당 miRNA의 유전자 스코어의 컷-오프 값을 80으로 설정한 후, 신경 및 시냅스 기능과 관계되는 miRNA 타겟 유전자로 SYNJ1(synnaptojanin 1), SNAP91(synaptosome associated protein 91) 및 HOOK3(hook microtubule tethering protein 3) 3종을 선별하였다.
후보 타겟 유전자에 대한 기능은 다음과 같다. SYNJ1은 시냅스 소포 재순환에서 중요한 역할을 한다. SNAP91은 시냅스 소포 운송과 움직임에 관여하고 synaptic transmission에서 중요한 역할을 한다. HOOK3는 endosome 수송과 관련된 세포질 링커 단백질로 주로 뉴런에서 발현된다. 신규 miRNA는 신경계의 시냅스 단백질과 관련이 있는 것임을 확인할 수 있었다.
신규 miRNA의 과발현을 위한 mimic miRNA, 기능 억제를 위한 inhibitor miRNA를 사람 신경모세포종 SH-SY5Y에 각각의 miRNA 100nM를 24시간 동안 형질 주입하였고, 단백질을 분리하여 웨스턴 블랏으로 발현정도를 확인하였다. 신규 miRNA의 과발현으로 3'에 결합하는 miRNA가 많아져, 후보 타겟 유전자 단백질인 SYNJ1, SNAP91 및 HOOK3의 발현이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였고, inhibitor miRNA로 3'에 결합하는 miRNA를 제거함으로써, 후보 타겟 유전자 단백질 SYNJ1, SNAP91 및 HOOK3의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 4).
또한, mimic miRNA와 inhibitor miRNA의 타겟 유전자 단백질의 발현을 면역세포화학법으로 비교하였다. 양성대조군으로 SNAP23을 확인하였고, SNAP91과 SYNJ1 모두 웨스턴 블랏의 발현 패턴과 일치하는 것을 확인하였다(도 5).

Claims (12)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 신규 마이크로 RNA를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머성 치매 조기 진단용 바이오마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 신규 마이크로 RNA는 인간의 혈장 유래인 것을 특징으로 하는 알츠하이머성 치매 조기 진단용 바이오마커 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 신규 마이크로 RNA는 SYNJ1(synnaptojanin 1), SNAP91(synaptosome associated protein 91) 또는 HOOK3(hook microtubule tethering protein 3) 유전자의 발현량을 감소시키는 것을 특징으로 하는 알츠하이머성 치매 조기 진단용 바이오마커 조성물.
  4. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 마이크로 RNA를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머성 치매 조기 진단용 바이오마커 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제제는 상기 마이크로 RNA에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 알츠하이머성 치매 조기 진단용 바이오마커 조성물.
  6. 제4항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머성 치매 조기 진단용 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR, 실시간(real-time) PCR, 등온 PCR, 노던 블랏팅, RNA 보호분석법 또는 마이크로어레이 칩용인 것을 특징으로 하는 알츠하이머성 치매 조기 진단용 키트.
  8. 제6항에 있어서, 상기 키트는 HTS(high-throughput-screening)기반 다중 현장진단(multiplexed POCT) 장치용인 것을 특징으로 하는 알츠하이머성 치매 조기 진단용 키트.
  9. 제8항에 있어서, 상기 다중 현장진단(multiplexed POCT)용 장치는 항온장치, 교반기, 일회용 팁 및 검체 주입 용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머성 치매 조기 진단용 키트.
  10. 제8항에 있어서, 상기 다중 현장진단(multiplexed POCT) 장치는 초소형 전혈분리기, 형광검출기 및 리퀴드 핸들러가 내장된 올인원 장치인 것을 특징으로 하는 알츠하이머성 치매 조기 진단용 키트.
  11. 제10항에 있어서, 상기 초소형 전혈분리기, 형광검출기 및 리퀴드 핸들러가 내장된 올인원 장치는 인간 혈액으로부터 치매 위험지수를 계산하는 검출시스템이 포함된 것을 특징으로 하는 알츠하이머성 치매 조기 진단용 키트.
  12. (1) 개체로부터 혈액을 채취하는 단계;
    (2) 상기 단계 (1)의 혈액으로부터 혈장을 분리하는 단계; 및
    (3) 상기 단계 (2)에서 분리한 혈장 내 서열번호 1의 miRNA 발현 여부를 확인하는 단계;를 포함하는 알츠하이머성 치매의 조기 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
PCT/KR2021/014874 2021-08-13 2021-10-22 알츠하이머성 치매 조기 진단용 신규 마이크로 rna 바이오마커 WO2023017905A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2021-0107017 2021-08-13
KR1020210107017A KR102321753B1 (ko) 2021-08-13 2021-08-13 알츠하이머성 치매 조기 진단용 신규 마이크로 rna 바이오마커

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023017905A1 true WO2023017905A1 (ko) 2023-02-16

Family

ID=78521582

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2021/014874 WO2023017905A1 (ko) 2021-08-13 2021-10-22 알츠하이머성 치매 조기 진단용 신규 마이크로 rna 바이오마커

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR102321753B1 (ko)
WO (1) WO2023017905A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20240352528A1 (en) * 2021-08-13 2024-10-24 Alz-Dementia Korea Co. microRNA BIOMARKER FOR EARLY DIAGNOSIS OF MILD COGNITIVE IMPAIRMENT OR ALZHEIMER TYPE DEMENTIA

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190051510A (ko) * 2017-11-07 2019-05-15 주식회사 바이오오케스트라 miR-485-3p를 이용한 알츠하이머병 진단 방법

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101609599B1 (ko) * 2013-07-26 2016-04-07 경상대학교 산학협력단 항원 검출용 형광 나노입자 및 그를 이용한 알츠하이머 치매의 조기 진단키트
KR20160006432A (ko) * 2014-07-09 2016-01-19 대한민국(관리부서 질병관리본부장) 경도인지장애 진단용 바이오마커
KR102236276B1 (ko) * 2016-09-20 2021-04-05 피씨엘 (주) 반응과 분석을 포함한 단일 진단칩의 고감도 신속진단방법
KR102043103B1 (ko) * 2018-11-26 2019-11-11 바이오뱅크 주식회사 전자동 유전자 검출장치

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190051510A (ko) * 2017-11-07 2019-05-15 주식회사 바이오오케스트라 miR-485-3p를 이용한 알츠하이머병 진단 방법

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAO, J. ET AL.: "MicroRNA-195 rescues ApoE4-induced cognitive deficits and lysosomal defects in Alzheimer's disease pathogenesis", MOLECULAR PSYCHIATRY, vol. 26, 6 July 2020 (2020-07-06), pages 4687 - 4701, XP037616551, DOI: 10.1038/s41380-020-0824-3 *
HERRMANN, L. ET AL.: "Hook proteins: association with Alzheimer pathology and regulatory role of hook3 in amyloid beta generation", PLOS ONE, vol. 10, no. 3, 23 March 2015 (2015-03-23), pages 1 - 23, XP093034354, DOI: 10.1371/journal.pone.0119423 *
HU RUI-TING, YU QIAN, ZHOU SHAO-DAN, YIN YI-XIN, HU RUI-GUANG, LU HAI-PENG, HU BANG-LI: "Co-expression Network Analysis Reveals Novel Genes Underlying Alzheimer’s Disease Pathogenesis", FRONTIERS IN AGING NEUROSCIENCE, vol. 12, XP093034331, DOI: 10.3389/fnagi.2020.605961 *
PARK JUN SUNG, KIM SANG TAE, JO MIN GI, CHOI MYEONG JUN, KIM MYEONG OK: "A novel kit for early diagnosis of Alzheimer’s disease using a fluorescent nanoparticle imaging", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 9, no. 1, XP093035677, DOI: 10.1038/s41598-019-49711-y *

Also Published As

Publication number Publication date
KR102321753B1 (ko) 2021-11-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230313300A1 (en) Biomarkers of traumatic brain injury
EP2733219B1 (en) Diagnostic miRNA markers for Alzheimer
EP2699697B1 (en) METHODS OF USING miRNA FROM BODILY FLUIDS FOR EARLY DETECTION AND MONITORING OF MILD COGNITIVE IMPAIRMENT (MCI)
Ogino et al. Spinal muscular atrophy: molecular genetics and diagnostics
CA2780222C (en) Methods of using small rna from bodily fluids for diagnosis and monitoring of neurodegenerative diseases
WO2023033268A1 (ko) 경도인지장애 또는 알츠하이머성 치매 조기 진단을 위한 신규 마이크로 rna 바이오마커
WO2023080340A1 (ko) 경도인지장애 및 알츠하이머성 치매의 선별 진단을 위한 신규 마이크로 rna 바이오마커
WO2009009457A1 (en) Alzheimer&#39;s disease-specific micro-rna microarray and related methods
WO2020046045A1 (ko) 난소의 ｆｓｈ에 대한 반응성의 진단 또는 예측용 바이오마커 및 이의 용도
US20180251837A1 (en) Use of mirco-rnas circulating in the blood serum or blood plasma for identifying patients requiring a biopsy and as a marker for the differential diagnosis of individual non-ischemic cardiomyopathies or storage diseases
CN112961913B (zh) lncRNA在复发性流产诊治中的应用
WO2023017905A1 (ko) 알츠하이머성 치매 조기 진단용 신규 마이크로 rna 바이오마커
CN106222243B (zh) 一种用于精神分裂症诊断的circRNA标志物、试剂盒及基因芯片
US20110269688A1 (en) Genetic Alterations Associated with Schizophrenia and Methods of Use Thereof for the Diagnosis and Treatment of the Same
CN108841949B (zh) 帕金森病早期检测和诊断试剂盒及装置
WO2021230379A1 (ja) パーキンソン病の検出方法
CN110511996B (zh) 一种与帕金森发生发展相关的生物标志物
WO2023018266A1 (ko) 경도인지장애 또는 알츠하이머성 치매 조기 진단을 위한 신규 마이크로 rna 바이오마커
WO2018062683A1 (ko) 피부 장벽 기능 진단용 바이오마커 조성물
WO2022025387A1 (ko) Microrna조합을 이용한 비알코올 지방간염 진단용 바이오마커
WO2012034189A1 (en) Methods of using mirnas transcribed from the 14q32 region of human chromosome 14 as biomarkers for schizophrenia or symptoms thereof
CN108531569A (zh) 用于强迫症与精神分裂症、抑郁症甄别的基因标志物及其应用
CN108277271A (zh) 一种辅助检测阿兹海默疾病的miRNA
WO2024122881A1 (ko) 알츠하이머성 치매 진단용 조성물 및 키트
van Dongen et al. Discordant monozygotic twin studies of epigenetic mechanisms in mental health

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21953552

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21953552

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1