WO2022220411A1 - 치주질환 진단용 바이오마커 조성물, 치주질환 치료 효용성 평가용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단키트 - Google Patents

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WO2022220411A1
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periodontal disease
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박혜련
김혜정
우복희
김윤학
주지영
이한송
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부산대학교 산학협력단
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    • G01N2800/18—Dental and oral disorders

Definitions

  • the present invention relates to a biomarker for evaluating the treatment efficacy of periodontal disease and a diagnostic kit using the same, and more particularly, to a biomarker for evaluating the treatment efficacy of periodontal disease that can determine the course of periodontal disease and treatment effect using objective indicators and diagnosis using the same It's about the kit.
  • Periodontal disease a representative chronic inflammatory disease, is known to be related to systemic diseases.
  • Low-grade systemic inflammatory signals from chronic periodontitis are suspected to be transmitted to tissues and organs, and these interactions are a major mechanism linking disease.
  • the major cause linking chronic periodontitis and systemic disease has not been identified.
  • periodontal disease relies on the patient's subjective symptoms, radiographic imaging, and then measuring the depth of the periodontal pocket and the degree of retraction of the gums using a periodontal probe to determine the progress of periodontitis or to analyze the degree of bacterial infection.
  • periodontal health after diagnosis and treatment of existing periodontal disease is mainly performed using a periodontal probe, so it is somewhat invasive and partially reflects the operator's subjectivity.
  • the present invention has been devised to solve the above problems, and an object of the present invention is to present an objective index for periodontal disease diagnosis and evaluation and prognosis determination by evaluating based on the expression of the etiological factors of periodontal disease.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for evaluating the efficacy of periodontal disease comprising a diagnostic composition for measuring the level of a protein encoded by a gene.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for evaluating the efficacy of periodontal disease comprising a diagnostic composition for measuring the mRNA level of a gene.
  • the biomarker composition for diagnosing periodontal disease comprises IFITM1 ( Interferon Induced Transmembrane Protein 1 ), CRIP1 ( Cysteine Rich Protein 1 ), MIF ( Macrophage Migration Inhibitory Factor ) and It is characterized in that it consists of a diagnostic composition for measuring the level of the protein encoded by the RPS17 ( Ribosomal Protein S17 ) gene to diagnose periodontal disease.
  • IFITM1 Interferon Induced Transmembrane Protein 1
  • CRIP1 Cysteine Rich Protein 1
  • MIF Macrophage Migration Inhibitory Factor
  • the biomarker composition for evaluating the therapeutic efficacy of periodontal disease is distributed in blood, gingival sulcus fluid or saliva in a biological sample, IFITM1 ( Interferon Induced Transmembrane Protein 1 ), CRIP1 ( Cysteine Rich Protein 1 ), MIF ( Macrophage Migration Inhibitory ) Factor ) and RPS17 ( Ribosomal Protein S17 ) It is characterized in that it is composed of a diagnostic composition for measuring the protein level encoded by the gene to evaluate the effectiveness of periodontal disease.
  • the present invention is a kit for diagnosing periodontitis using a biomarker composition for diagnosing periodontal disease.
  • the present invention is a kit for evaluating the therapeutic efficacy of periodontal disease using a biomarker composition for evaluating the therapeutic efficacy of periodontal disease.
  • the periodontitis diagnostic kit and periodontal disease therapeutic efficacy evaluation kit include a microarray, an aptamer chip kit, an ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) kit, a blotting kit, an immunoprecipitation kit, an immunofluorescence test kit, and a protein. It is characterized in that it is selected from the group consisting of acupuncture kits or combinations thereof.
  • the present invention can present an objective index for periodontal disease diagnosis and evaluation and prognosis determination by evaluating based on the expression of the etiological factors of periodontal disease.
  • the present invention can provide a biomarker centered on a periodontal disease pathogenesis factor that can objectively determine the improvement of periodontal health after periodontal disease treatment.
  • the present invention can present criteria and rationale for establishing a treatment plan suitable for the characteristics of an individual's periodontitis progression.
  • kits for evaluating the efficacy of periodontal disease comprising a diagnostic composition for measuring the level of a protein encoded by a gene.
  • kits for evaluating the efficacy of periodontal disease comprising a diagnostic composition for measuring the mRNA level of a gene.
  • FIG. 1 is a schematic view sequentially showing the steps of extracting a biomarker for periodontal disease diagnosis and a biomarker for periodontal disease treatment efficacy evaluation according to the present invention, 4 peripheral blood mononuclear cell (PBMC) samples collected from 4 healthy donors and 4 periodontal Four pairs of peripheral blood mononuclear cell samples taken before and after treatment of the diseased patient are included in the present invention.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cell
  • RNA-sequencing scRNA-seq
  • This graph is log 10 transformed to show the number of cells in each sample. Blue indicates healthy donors, orange indicates patients before treatment, and yellow indicates patients after treatment.
  • 3 is a view showing the classification of 13 major cell types important for the immune response observed in the biomarker extraction process, and is a UMAP plot in which 111,213 PBMCs observed in 12 samples are color-coded for each major cell lineage.
  • 5 is a bar graph showing the proportion of major cell types for each participant observed during the biomarker extraction process.
  • 6 is a box plot of the percentage of CD8+ T cells per sample condition.
  • Figure 7 is a UMAP plot of B cell subset 4 types, in non-switched MB, switched memory B cells (switched MB), inactive B cells (exhausted B cells) and plasmablasts. It is a graph showing by classifying the expressed genes.
  • FIG. 9 is a dot plot showing the differential expression levels of genes in non-switched MB and switched memory B cells (switched MB) among 4 types of B cells. Genes are normal and treated. It is similar in the post-treatment condition but reversed in the pre-treatment condition. The color of each dot indicates the high and low expression level of the gene, and the dot size indicates the proportion of cells expressing the gene in a particular cell type.
  • CD8+ T cells are divided into central memory T cells (TCM), effector memory T cells (TEM) and terminal effector T cells (TTE).
  • TCM central memory T cells
  • TEM effector memory T cells
  • TTE terminal effector T cells
  • FIG. 13 is a dot plot showing the differential expression levels of genes in TCM and TTE among CD8+ T cell types.
  • the genes are similar in normal and post-treatment conditions, but reversed in pre-treatment conditions.
  • the color of each dot indicates the high and low expression level of the gene, and the dot size indicates the proportion of cells expressing the gene in a particular cell type.
  • CD4+ T cells are classified into T-helper 1 (Th1), T-helper 17 (Th17), follicular helper T (Tfh) and regulatory T (Treg). . It is necessary to control extracellular pathogens such as parasites.
  • 16 is a Violin plot of representative marker genes for each CD4+ T cell type.
  • 17 is a dot plot showing the differential expression levels of genes of each sub-cell type in CD4+ T cells, where the genes are similar in normal and post-treatment conditions, but reversed in pre-treatment conditions.
  • the color of each dot indicates the high and low expression level of the gene, and the dot size indicates the proportion of cells expressing the gene in a particular cell type.
  • 19 is a UMAP plot of three types of monocytes, classified as classical monocytes, non-classical monocytes and intermediate monocytes.
  • 21 is a dot plot showing the differential expression levels of genes of each sub-cell type in monocytes, in which genes are similar in normal and post-treatment conditions, but reversed in pre-treatment conditions.
  • the color of each dot indicates the high and low expression level of the gene, and the dot size indicates the proportion of cells expressing the gene in a particular cell type.
  • GO 22 is a gene ontology (GO) terminology for a subtype of monocyte cell.
  • each dot is a dot plot showing the differential expression levels of genes of each sub-cell type in 13 major cells important for the immune response, where the genes are similar in normal and post-treatment conditions, but reversed in pre-treatment conditions.
  • the color of each dot indicates the high and low expression level of the gene, and the dot size indicates the proportion of cells expressing the gene in a particular cell type.
  • naive B is a gene ontology (GO) term for naive B, naive CD4+, naive CD8+, gdT, MAIT, NK and mDC cells.
  • GO gene ontology
  • the present invention provides a biomarker composition for diagnosing periodontal disease comprising a metabolite and a diagnostic kit using the same.
  • Periodontal disease is a prevalent chronic inflammatory disease that affects a wide population. For decades, many researchers have proposed a bidirectional relationship between oral health and systemic disease. However, how oral diseases increase susceptibility and affect the body has not yet been precisely established.
  • single-cell RNA sequencing was performed using peripheral blood mononuclear cells and molecular differences between periodontal disease patients and healthy donors were compared before and after treatment. Depending on the expression level of certain genes and the cell type they belong to, the inflammatory response was altered.
  • genes that are common to various cell types and recovered to a similar level of healthy donors through therapeutic intervention were extracted.
  • the association of systemic diseases can be confirmed by confirming the change in immune cell gene expression in periodontal disease, a chronic oral inflammatory disease, at the single cell level.
  • it can be used as a therapeutic target to reduce disease by breaking this association.
  • the present invention provides a biomarker for diagnosing periodontal disease including a metabolite that shows a relative difference in expression in blood, sulcus fluid, or saliva of a patient with periodontal disease compared to the body fluid of a normal person (control).
  • control group refers to a group for determining whether the experimental results are properly derived.
  • control group refers to an individual not suffering from periodontal disease.
  • gingivitis refers to a disease in which bacteria infect the gap between the gingiva (gum) and the teeth and damage the periodontal ligament and adjacent tissues, the severity of the disease It is divided into gingivitis and periodontitis. In the onset of the periodontal disease, inflammation progresses and more tissues are damaged, forming a periodontal pocket, and the more severe periodontitis, the deeper the periodontal pocket. is known to cause bone loss.
  • diagnosis means identifying the presence or characteristics of a pathological condition.
  • diagnosis is to determine whether periodontal disease has occurred, the degree of disease progression, or whether the group is at risk.
  • the present invention measures the protein levels encoded by IFITM1 ( Interferon Induced Transmembrane Protein 1 ), CRIP1 ( Cysteine Rich Protein 1 ), MIF ( Macrophage Migration Inhibitory Factor ) and RPS17 ( Ribosomal Protein S17 ) genes distributed in biological samples such as blood. It is a biomarker composition for evaluating the efficacy of periodontal disease treatment to evaluate the efficacy of periodontal disease by composing the composition for diagnosis.
  • IFITM1 Interferon Induced Transmembrane Protein 1
  • CRIP1 Cysteine Rich Protein 1
  • MIF Macrophage Migration Inhibitory Factor
  • RPS17 Ribosomal Protein S17
  • the present invention relates to the mRNA levels of IFITM1 ( Interferon Induced Transmembrane Protein 1 ), CRIP1 ( Cysteine Rich Protein 1 ), MIF ( Macrophage Migration Inhibitory Factor ) and RPS17 ( Ribosomal Protein S17 ) genes distributed in biological samples such as gingival sulcus fluid. It is a biomarker composition for evaluating the efficacy of periodontal disease treatment by constructing a diagnostic composition for measuring the periodontal disease efficacy.
  • IFITM1 Interferon Induced Transmembrane Protein 1
  • CRIP1 Cysteine Rich Protein 1
  • MIF Macrophage Migration Inhibitory Factor
  • RPS17 Ribosomal Protein S17
  • the periodontal disease is gingivitis, periodontal inflammation, gingival bleeding, gingival retraction, periodontal pocket, alveolarbone destruction or alveolar bone loss ( alveolar bone loss), but is not limited thereto.
  • the alveolar bone loss is a type of periodontal disease that occurs when the balance between bone formation and bone resorption is broken in alveolar bone, so that bone resorption exceeds bone formation and bone mass decreases below the limit.
  • peripheral blood mononuclear cells obtained from periodontitis patients
  • peripheral blood mononuclear cells obtained from periodontitis patients
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • FIG. 1 peripheral blood mononuclear cells from 4 healthy donors were Cells were drawn and 4 pairs of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were collected before and after treatment from 4 patients with periodontal disease.
  • scRNA-seq Droplet-based single-cell RNA sequencing
  • 111,213 cells with an average of 9,268 cells per participant were obtained after filtering low-quality cells and integrating the data.
  • Dimensional reduction was performed with uniform manifold approximation and projection (UMAP) and graph-based clustering that captured 26 cell populations using a gene-specific cell expression matrix.
  • UMAP uniform manifold approximation and projection
  • B MS4A1
  • naive B MS4A1 and TCL1A
  • CD4+ T CD4, and CD3
  • naive CD4+ T SELL, CCR7, CD4, and CD3
  • CD8+ T CD8T, and CD3
  • naive CD8+ T SELL, CCR7, CD8T, and CD3
  • gamma delta T cell gdT(TRGC1, and CD3)
  • MAIT SLC4A10, and CD3
  • NK KLRF1
  • plasmacytoid Dendritic Cell pDC
  • mDC myeloid Dendritic Cell
  • the cell populations of PBMCs were clearly identified, and as shown in Fig. 5, the cell populations of each participant were composed of these clusters.
  • the proportion of each cell in the total PBMC is T cells (60 to 73%), B cells (4 to 15%), NK cells (5 to 23%), monocytes (5 to 24%), and dendritic cells (1 to 2). %), which is composed of PBMCs with a normal distribution regardless of the presence or absence of disease and treatment.
  • most of the samples did not have a significant difference in cell composition between the three groups, but CD8+ T cells showed a slight decrease in the periodontal disease group before treatment (p-value 0.063).
  • DEG Differentially expressed genes
  • non-switched MB cells were isolated into non-switched MB cells, switched memory B cells (switched MB), inactive B cells (exhausted B cells) and plasmablasts.
  • switched memory B cells switched memory B cells
  • inactive B cells exhaustted B cells
  • plasmablasts can be identified using CD38.
  • IGLL5 is homologous to IGLL1 involved in B cell development.
  • the decreased RPS26 in the CD4T subset also showed the greatest decrease in non-switched B cells (non-switched MB).
  • genes including IGLL5, MIF and CRIP1 up-regulated in periodontal disease patients shown in FIG. 10 in terms of biological function, interestingly, they are associated with B cell activation in unconverted MB.
  • SELL hi / CCR7 hi central memoryT (TCM), SELL(CD62L) lo / CCR7 lo effector memory T(TEM) cells and SELL(CD62L) lo / CCR7 lo / IL7R lo terminal effector CD8+ T cells were compared by sorting T(TTE).
  • TCM central memoryT
  • SELL(CD62L) lo / CCR7 lo effector memory T(TEM) cells and SELL(CD62L) lo / CCR7 lo / IL7R lo terminal effector CD8+ T cells were compared by sorting T(TTE).
  • TCM SELL hi / CCR7 hi central memoryT
  • TEM SELL(CD62L) lo / CCR7 lo effector memory
  • SELL(CD62L) lo / CCR7 lo / IL7R lo terminal effector CD8+ T cells were compared by sorting T(TTE).
  • IFITM1 , CRIP1 and MIF up-regulated genes
  • GNLY is the first recognized lymphocyte-derived alarm produced by NK cells and activated cytotoxic T cells. Promotes recruitment of antigen presenting cells and transmits endogenous risk signals in inflammatory diseases. Increases in GNLY expression have been reported in autoimmune diseases and infections, and decreases have occurred in severe immunodeficiency. The decreased expression level of GNLY in periodontitis patients was lowest in TCM compared to other cells.
  • S100B a gene from the S100 protein family, is functionally associated with brain or lung disease. In addition, it has a wide range of intracellular and extracellular functions, including regulation including apoptosis, proliferation and inflammation, but not manifested in CD8+ T cells.
  • the TTE cells of periodontitis patients have enhanced abilities such as chemotaxis, cell migration and cytokine secretion.
  • LPS lipopolysaccharide
  • T-helper 1 Th1
  • Th17 T-helper 17
  • Tfh follicular helper T
  • Treg regulatory T
  • STAT1 and STAT4 are Th1 cells
  • CCR6 is Tfh cells
  • MAF is Th17 cells
  • IL2RA and FOXP3 were used to identify Treg cells.
  • Th1 cells involved in cell-mediated immunity to intracellular bacteria and viruses have five upregulated genes ( CRIP1, IFITM1, CCR10, RPS17 and MIF ) and one downregulated gene ( RPS26 ) in periodontal disease patients before treatment have.
  • CRIP1 and IFITM1 were expressed about 2 times higher than that of the healthy group and the treated group.
  • three genes CCR7, CRIMAP4, CRIP1
  • six genes GZMK, TRGC2, GNLY, AC020916) .1
  • GZMK, TRGC2, and GNLY were highly expressed in healthy individuals, but there was no change before and after treatment in patients with periodontal disease.
  • the transcripts of GZMK, TRGC2, and GNLY were significantly decreased in periodontal disease patients.
  • GZMK is widely known as a cytotoxic gene and is associated with CD8+ T cells and cytotoxic CD4+ T cells.
  • TRGC2 triggers an immune receptor tyrosine-based activation motif (ITAM) and ultimately induces T cell expansion and antigen-binding differentiation into effector cells.
  • ITAM immune receptor tyrosine-based activation motif
  • GNLY is a protein released by killer lymphocytes that are cytotoxic and cause microptosis.
  • Tfh cells which are known to regulate the maturation of B cells
  • 7 upregulated genes IFITM1, CRIP1, RPS17, MIF, GNLY, RCSD1, MT-ND3
  • RPS26 3 downregulated genes in periodontal disease patients before treatment
  • IFITM1 and CRIP1 were increased, and RPS26 was more than doubled.
  • Treg cells which are important for maintaining immune homeostasis and preventing autoimmune diseases, have two highly expressed genes ( CRIP1 and IFITM1 ) in periodontal disease patients prior to treatment and no down-regulated genes. Biological functions are shown in FIG. 18 .
  • monocytes There are three subtypes of monocytes, called classical monocytes, non-classical monocytes and intermediate monocytes, as shown in Figure 19, according to the phenotypic receptors CD14 and CD16 (FCGR3A). As shown in Figure 20, classical monocytes express CD14 ++CD16-, whereas non-classical monocytes and intermediate monocytes express CD14+CD16++ and CD14++ CD16+, respectively.
  • pre-treatment patients had 4 highly expressed genes ( AC007952 , CRIP1 , VNN2 , and CD93 ) and 11 low-expressed genes ( LDLR , GPR183 , PF4 , CD69 , ATF3 ) than other subjects.
  • LDLR low-expressed genes
  • PTX3 HLA-DPB1, HLA-DPA1, IL1B, CTNNB1 and ZFP36 ).
  • VMO1, IGKC, CRIP1, HSPA1B and SCGB3A1 Five genes ( VMO1, IGKC, CRIP1, HSPA1B and SCGB3A1 ) were upregulated in non-classical monocytes from periodontal disease before treatment, and 13 genes ( LGALS2, APOBEC3A, CCL4L2, LYPD2, CDKN1A, NFKBIA, AC020916, DUSP2, HLA-DRB5 ) were upregulated. , CD83, ZFP36, HSPB1 and EPSTI1 ) were downregulated.
  • VMO1 is a gene characteristically expressed in CD16+ monocytes rather than CD16- monocytes. It is observed to be three times higher in patients with periodontitis, but its function is not well known.
  • LDLR is implicated in coordinating cholesterol homeostasis and inflammatory modulators in atherosclerosis or cancer.
  • LGALS2 or galectin 2 is known to regulate monocytes maintaining vascular homeostasis by promoting pro-inflammatory cytokines while attenuating monocyte migration.
  • Related gene ontology terms are shown in FIG. 22 .
  • naive CD4+ T cells harbored five up-regulated genes ( IFITM1 , MIF , CRIP1 , GNLY , and RPS17) and one down-regulated gene ( RPS26 ), whereas naive CD8+ T cells had five genes ( IFITM1, CRIP1, MIF, RPS17 and TLN1) expression was increased and the expression of four genes ( RPS10 , TNFAIP3, CD69 and CCL5 ) was decreased.
  • gdT was associated with 8 elevated genes ( IFITM1 , CRIP1 , ALOX5AP , MT2A , TLN1 , FGFBP2 , GIMAP4 and CD247 ) and 7 decreased genes (TNFAIP3, AC020916.1, HLA-DRA, FOS, HOPX , NFKBIA and CD69 ).
  • Three genes (CCL3L1, CRIP1 , IFITM1 ) were highly expressed in NK cells of periodontal disease patients before treatment, and two genes (KLRC2, NUSAP1) were expressed low.
  • MAIT cells have four up-regulated genes ( IFITM1 , CRIP1 , RPS17 and MIF ) and one down-regulated gene ( HOPX ), whereas mDCs have eight genes high ( CRIP1 , S100A12 , CD14 , VACN , MIF , TNFRSF1B). , RPS17 and FTL ) and the lower five genes ( CCL5 , PMAIP1 , IL18 , RPS10 and HLA-DRB5 ).
  • the biological function associated with each cell is illustrated in FIG. 24 .
  • periodontal disease has been reported to affect the occurrence and progression of various diseases through a systemic inflammatory response.
  • specific factors linking these interrelationships are not yet known and need to be studied.
  • the immune factors change characteristics and related biological functions of periodontal disease at the cellular level are described by comparing the healthy state after periodontal disease treatment.
  • the present invention not only revealed molecular heterogeneity and characteristic changes, but also clearly revealed that genes with large changes play an important role in the inflammatory response corresponding to the relevant cell types.
  • functions related to other diseases have been demonstrated as previously described.
  • CRIP1 is a substance composed of LIM-family domains and directly affects gene regulation, cell fate determination, and tumorigenesis through protein-protein interactions. In addition, changes have been observed in various cancer types such as colorectal cancer, breast cancer, osteosarcoma, and gastric cancer. In the case of thyroid carcinoma, CRIP1 was overexpressed, and silencing of CRIP1 inhibited cell proliferation, migration and invasion. Studies on CRIP1 originally focused on the intestine, but the same was observed in PBMCs. In particular, CRIP1 mRNA levels were increased after LPS stimulation in murine peritoneal macrophages, PBMCs, spleen and intestines.
  • CRIP1 overexpressing transgenic mice produced high concentrations of IL-6 and IL-10 after LPS treatment, but low concentrations of TNF- and IFN-, suggesting that CRIP1 affects the imbalance of cytokine production. have. CRIP1 overexpressing transgenic mice had severe weight loss and diarrhea.
  • MIF was elevated in Th1, Tfh, TCM, TTE, unconverted MB, switched MB, naive CD4+ T, naive CD8+ T, naive B, MAIT cells and mDC.
  • MIF is a fundamental component of the host inflammatory response as a factor regulating innate and adaptive immunity. MIF is induced by toxin-containing bacteria such as LPS carrying P. gingivalis in the case of periodontitis. After being released into the tissue or systemic circulation, it activates macrophages and T cells to enable the host to respond immediately and defend quickly with cytokines that cause inflammation.
  • IFITM1 was observed in Th1, Tfh, Treg, TCM, TTE, naive CD4+ T, naive CD8+ T, gdT, NK and MAIT cells.
  • IFITM1 is an interferon-stimulating gene and is described to be directly involved in adaptive immunity and to play a role in apoptosis and cell cycle control.
  • an increase in IFITM1 is reported to be associated with tumor progression and invasiveness with worsening overall prognosis in colorectal cancer, head and neck, gastrointestinal tract, inflammatory breast cancer, ulcerative colitis, and Crohn's disease. Although it is highly associated with the induction of inflammation and systemic disease, there is no known study of IFITM1 in the periodontal inflammatory response.
  • RPS17 was highly expressed in Th1, Tfh, unconverted MB, converted MB, intermediate monocytes, naive CD4+ T, naive CD8+ T, naive B, MAIT cells and mDC.
  • a ribosomal protein its mutation is well known as a biomarker of diamond-black plate anemia, but little information about its function is available. Ribosomal proteins are finely tuned in tumorigenesis, development, and immune signaling. For example, some ribosomal proteins, such as RPS3, selectively regulate the transcriptional expression of target genes.
  • ribosomal proteins play a variety of roles in the host immune response to enhance immune signaling, many studies have demonstrated that they have independent oncogenic potential by being upregulated at the mRNA or protein level in human tumors. Because of this ambivalence, it is essential to investigate ribosomal proteins.
  • the present invention elucidates the characteristic changes in gene expression observed in periodontal disease at the cellular level and provides evidence that periodontitis affects systemic disease progression.
  • periodontal changes affect PBMCs and altered PBMC circulation affects the whole body and may contribute to systemic disease progression.
  • sample preparation and scRNA-seq [subject collection, ethical statement, clinical information, PBMC (Peripehral blood mononuclear cell) collection, single cell suspension preparation] using 10X genome.
  • FASTQ files are converted to cell-specific barcode matrices using Cell Ranger (v3.1.0) which performs sorting, filtering, barcode counting and UMI counting.
  • Cell Ranger v3.1.0
  • the pipeline runs with default arguments (10X Genomics).
  • Cells with less than 500 UMIs or more than 20,000 UMIs and 20% or more mitochondrial genes are filtered to remove low-quality cells. Also remove cells with fewer than 250 genes or more than 5,000 genes and less complex cells with less than 80% complexity.
  • genes expressed in more than 0.1% of cells are left behind. Nevertheless, since some samples had large numbers of cells (up to 12,177 cells), Scrublet is used to estimate possible doublets and remove 3.5% of cells (up to 11,852 cells).
  • the remaining count data are normalized using SCTransform based on normalized negative binomial regression on cellular total read counts.
  • After normalization for each sample use the FindIntegrationAnchors and IntegrateData functions to integrate with the reference data, the largest of the 12 samples.
  • SingleR v3.12
  • R package to annotate each cluster with immune cell types.
  • SingleR assigns and annotates single cells to highly matching cell types and joins clusters to the most likely cell types. Most cells in the same cluster were generally suggested with more than 70% coherent cell types, and clusters with low coherence were annotated using multiple genes representing cell-specific signatures.
  • MS4A1, CD19, CD22, TCL1A, CD83 (naive B); CD3E, CD3D, CD3G, CCR7, GZMA (naive T); MS4A1, CD27, FCER2 (B); IL7R, TNFRSF4 (CD4T); CD8A, CD8B, GZMA (CD8T); TRGC2, TRGC1 (gdT); KLRB1, SLC4A10, TRAV1-2 (MAIT); KLRF1 (NK); IL3RA, CLEC4C (pDC); CD1C, CD14, FCGR3A (mDC); LYZ, CD68 (monocyte), ITGA2B (progenitor) .
  • the present invention provides a kit for diagnosing periodontal disease comprising the biomarker for diagnosing periodontal disease.
  • the biomarker for diagnosing periodontal disease is the same as described above.
  • the diagnostic kit is a microarray, an aptamer chip kit, an ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) kit, a blotting kit, an immunoprecipitation kit, an immunofluorescence test kit, a protein chip kit, or these It may be selected from the group consisting of a combination of, but is not limited thereto.
  • the diagnostic kit includes a molecule that specifically binds to a metabolite, and is particularly preferred for diagnosing periodontal disease.
  • the specifically binding molecule may be an antibody, a substrate, a ligand protein, a peptide, a nucleic acid, a chemical, a polymer, or a cofactor, and specifically, a monoclonal recognizing each marker. or polyclonal antibodies, specific proteins, peptides, nucleic acids, polymers or chemicals that interact with each marker, or chemicals or compounds capable of being converted into specific chemicals by chemical reaction with each marker, and additionally antibodies, proteins, It may include a measurement reagent such as nanoparticles, fluorescent dyes, etc. capable of modifying peptides, nucleic acids, polymers, or chemicals.
  • the diagnostic kit uses blood, gingival sulcus fluid, or saliva as a sample.
  • the present invention relates to IFITM1 ( Interferon Induced Transmembrane Protein 1 ), CRIP1 ( Cysteine Rich Protein 1), MIF (Macrophage Migration Inhibitory Factor ) and RPS17 ( Ribosomal Protein S17 ) genes distributed in biological samples such as blood, sulcus fluid or saliva. It is a biomarker composition for evaluating the efficacy of periodontal disease treatment, which consists of a diagnostic composition for measuring the coding protein level and evaluates the efficacy of periodontal disease.
  • the present invention provides IFITM1 ( Interferon Induced Transmembrane Protein 1 ), CRIP1 ( Cysteine Rich Protein 1 ), MIF ( Macrophage Migration Inhibitory Factor ) and RPS17 ( Ribosomal Protein S17 ) distributed in biological samples such as blood, gingival sulcus fluid or saliva. It is a biomarker composition for periodontal disease diagnosis by constructing a diagnostic composition for measuring the mRNA level of a gene.
  • the present invention can present an objective index for periodontal disease diagnosis and evaluation and prognosis determination by evaluating based on the expression of the etiological factors of periodontal disease.
  • the present invention can provide a biomarker centered on a periodontal disease pathogenesis factor that can objectively determine the improvement of periodontal health after periodontal disease treatment.
  • the present invention can present criteria and rationale for establishing a treatment plan suitable for the characteristics of an individual's periodontitis progression.
  • kits for evaluating the efficacy of periodontal disease comprising a diagnostic composition for measuring the level of a protein encoded by a gene.
  • kits for evaluating the efficacy of periodontal disease comprising a diagnostic composition for measuring the mRNA level of a gene.

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Abstract

본 발명은 치주질환 치료 효용성 평가용 바이오마커 및 이를 이용한 진단키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 객관적 지표를 활용하여 치주질환 경과 및 치료효과 판정이 가능한 치주질환 치료 효용성 평가용 바이오마커 및 이를 이용한 진단키트에 관한 것이다. 본 발명은 생물학적 시료 내 혈액, 치은열구액 또는 타액에 분포한 IFITM1(Interferon Induced Transmembrane Protein 1), CRIP1(Cysteine Rich Protein 1), MIF(Macrophage Migration Inhibitory Factor) 및 RPS17(Ribosomal Protein S17) 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 진단용 조성물로 구성하여 치주질환 진단용 바이오마커 조성물이다. 또한, 본 발명은 생물학적 시료 내 혈액, 치은열구액 또는 타액에 분포한 IFITM1(Interferon Induced Transmembrane Protein 1), CRIP1(Cysteine Rich Protein 1), MIF(Macrophage Migration Inhibitory Factor) 및 RPS17(Ribosomal Protein S17) 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 진단용 조성물 구성하여 치주질환 효용성 평가하는 치주질환 치료 효용성 평가용 바이오마커 조성물이다.

Description

치주질환 진단용 바이오마커 조성물, 치주질환 치료 효용성 평가용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단키트
본 발명은 치주질환 치료 효용성 평가용 바이오마커 및 이를 이용한 진단키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 객관적 지표를 활용하여 치주질환 경과 및 치료효과 판정이 가능한 치주질환 치료 효용성 평가용 바이오마커 및 이를 이용한 진단키트에 관한 것이다.
치은(잇몸)과 치아 사이에는 V자 모양의 틈이 있는데 이 홈(sulcus)의 잇몸 선 아래 부분을 박테리아가 공격하여 치주인대와 인접조직을 손상시키는 것이 치주질환이다. 염증이 진행되어 더 많은 조직이 손상되면서 홈이 치주낭(periodontal pocket)으로 발전하게 되며 치주낭이 깊어지면서 치주인대에 염증이 생기게 되고 골소실이 일어나게 되는 것이 치주질환이다.
최근 대사 질환, 암 등 다양한 질환의 진행에서 만성 염증의 역할이 강조되고 있다. 대표적인 만성 염증성 질환인 치주질환은 전신 질환과 관련이 있는 것으로 알려져있다. 만성 치주염으로 인한 낮은 등급의 전신 염증 신호가 조직과 기관으로 전달되는 것으로 의심되며, 이러한 상호 작용은 질병을 연결하는 주요 메커니즘이다. 그러나 만성 치주염과 전신 질환을 연결하는 주요 원인은 확인되지 않고 있다.
현재 치주질환의 진단은 환자의 자각증상, 방사선 촬영 후 치주낭 탐침기를 이용하여 치주낭 깊이, 잇몸의 퇴측 정도를 측정하여 치주염 진행 정도를 파악하거나, 세균감염 정도를 분석하는 것에 의존하고 있다.
또한, 기존 치주질환에 대한 진단과 치료 후 치주건강 개선도에 대한 평가는 주로 치주탐침(periodontal probe)을 활용하여 이루어지므로 다소 침습적이며 부분적으로는 술자의 주관이 반영된다. 종래의 경우 병인기전 또는 인자에 기반 한 객관적 평가 기법이 없어 질환 진행 예측이 제대로 되지 않으며, 치료 효용성 또한 정확하게 판정할 수 없는 문제점이 있다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하기 위해서 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 치주질환 병인기전 인자 발현에 기반하여 평가함으로써 치주질환 진단과 평가 및 예후 판정에 대한 객관적 지표를 제시하고자 한다.
또한, 본 발명의 목적은 치주질환 치료 후 치주 건강도 개선에 대한 객관적인 판정이 가능한 치주질환 발병기전 인자 중심의 바이오마커를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명의 목적은 개인의 치주염 진행 특성에 적합한 치료계획 수립 기준 및 근거를 제시할 수 있는 치주질환 발병기전 인자 중심의 바이오마커를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명의 목적은 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 진단용 조성물로 구성된 치주질환 효용성 평가용 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 진단용 조성물로 구성된 치주질환 효용성 평가용 키트를 제공하는 것이다.
발명이 해결하고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 치주질환 진단용 바이오마커 조성물은 생물학적 시료 내 혈액, 치은열구액 또는 타액에 분포한, IFITM1(Interferon Induced Transmembrane Protein 1), CRIP1(Cysteine Rich Protein 1), MIF(Macrophage Migration Inhibitory Factor) 및 RPS17(Ribosomal Protein S17) 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 진단용 조성물로 구성하여 치주질환을 진단하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 치주질환 치료 효용성 평가용 바이오마커 조성물은 생물학적 시료 내 혈액, 치은열구액 또는 타액에 분포한, IFITM1(Interferon Induced Transmembrane Protein 1), CRIP1(Cysteine Rich Protein 1), MIF(Macrophage Migration Inhibitory Factor) 및 RPS17(Ribosomal Protein S17) 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 진단용 조성물로 구성하여 치주질환 효용성을 평가하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 치주질환 진단용 바이오마커 조성물을 이용한 치주염 진단용 키트 이다.
또한, 본 발명은 치주질환 치료 효용성 평가용 바이오마커 조성물을 이용한 치주질환 치료 효용성 평가용 키트 이다.
상기 치주염 진단용 키트 및 치주질환 치료 효용성 평가용 키트는 마이크로어레이, 앱타머 칩 키트, 엘리사(ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 키트, 블랏팅(Blotting) 키트, 면역침전법 키트, 면역형광검사 키트, 단백질 침 키트 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
상기 과제의 해결 수단에 의해, 본 발명은 치주질환 병인기전 인자 발현에 기반하여 평가함으로써 치주질환 진단과 평가 및 예후 판정에 대한 객관적 지표를 제시할 수 있다.
또한, 본 발명은 치주질환 치료 후 치주 건강도 개선에 대한 객관적인 판정이 가능한 치주질환 발병기전 인자 중심의 바이오마커를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 개인의 치주염 진행 특성에 적합한 치료계획 수립 기준 및 근거를 제시할 수 있다.
또한, 본 발명의 목적은 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 진단용 조성물로 구성된 치주질환 효용성 평가용 키트를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 목적은 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 진단용 조성물로 구성된 치주질환 효용성 평가용 키트를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명인 치주질환 진단용 바이오마커 및 치주질환 치료 효용성 평가용 바이오마커를 추출하는 단계를 순서대로 나타낸 개략도로, 4명의 건강한 기증자로부터 채취한 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 표본 4개와 4명의 치주질환자의 치료 전후에 채취한 말초 혈액 단핵 세포 표본 4쌍이 본 발명에 포함되어 있다.
도 2는 단일 세포 RNA-시퀀싱(scRNA-seq)을 수행한 후 저품질 셀을 필터링하고 데이터를 통합하여 획득된 셀 개수를 나타낸 그래프로, 본 그래프는 log10 변환되어 각 샘플의 세포 수를 나타낸다. 파란색은 건강한 기증자, 주황색은 치료 전 환자, 노란색은 치료 후 환자를 나타낸다.
도 3은 바이오마커 추출과정에서 관찰한 면역 반응에 중요한 13가지 주요 세포 유형을 분류하여 나타낸 도면으로, 12개 표본에서 관찰한 111,213 개의 PBMC를 주요 세포 계통별로 색깔로 표시한 UMAP 플롯이다.
도 4는 바이오마커 추출과정에서 관찰한 UMAP 플롯에 투영되는 13 개의 주요 계통에 대한 표준 마커 유전자의 산점도로, 파란색과 회색 스펙트럼은 각 유전자의 발현 수준을 나타낸다.
도 5는 바이오마커 추출과정에서 관찰한 각 참가자에 대한 주요 세포 유형의 비율을 표시하는 막대 그래프이다.
도 6은 샘플 상태 당 CD8+ T 세포 비율의 상자 플롯이다.
도 7은 B세포 하위 집합 4 유형의 UMAP 플롯으로, 비 전환된 MB(non-switched MB), 전환된 메모리 B 세포(switched MB), 비활성 B 세포(exhausted B cells) 및 형질 아세포(plasmablasts)에서 발현된 유전자를 분류하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 각각의 B세포 하위 집합 4 세포 유형에 대한 대표적인 마커 유전자의 바이올린 플롯이다.
도 9는 4 유형의 B세포 중 비 전환된 MB(non-switched MB)와 전환된 메모리 B 세포(switched MB)에서의 유전자 차등 발현 수준을 보여주는 점 플롯(Dot Plot)으로, 유전자는 정상 및 치료 후 조건에서 유사하지만 치료 전 상태에서는 역으로 나타난다. 각 점의 색상은 유전자의 높고 낮은 발현 수준을 나타내며, 점 크기는 특정 세포 유형에서 유전자를 발현하는 세포의 비율을 나타낸다.
도 10은 B 세포의 하위 유형에 대한 유전자 온톨로지 (GO) 용어이다.
도 11는 CD8+ T 세포 하위 유형 3가지에 대한 서브 세트의 UMAP 플롯으로, CD8+ T 세포는 중심 기억 T세포(TCM), 효과 기억 T세포(TEM) 및 말단 효과 T세포(TTE) 나뉜다.
도 12는 각각의 CD8+ T 세포 유형에 대한 대표적인 마커 유전자의 바이올린 플롯이다.
도 13은 CD8+ T 세포 유형 중 TCM과 TTE 에서의 유전자 차등 발현 수준을 보여주는 점 플롯(Dot Plot)으로, 유전자는 정상 및 치료 후 조건에서 유사하지만 치료 전 상태에서는 역으로 나타난다. 각 점의 색상은 유전자의 높고 낮은 발현 수준을 나타내며, 점 크기는 특정 세포 유형에서 유전자를 발현하는 세포의 비율을 나타낸다.
도 14는 CD8+ T 세포의 하위 군에 대한 유전자 온톨로지 (GO) 용어이다.
도 15는 CD4+ T 세포 의 하위 유형 세트의 UMAP 플롯으로, CD4+ T 세포는 T-helper 1 (Th1), T-helper 17(Th17), follicular helper T(Tfh) 및 regulatory T (Treg)로 분류한다. 기생충과 같은 세포 외 병원체를 제어하는데 필요하다.
도 16은 CD4+ T 각 세포 유형에 대한 대표적인 마커 유전자의 바이올린 플롯이다.
도 17은 CD4+ T 세포에서 각 하위 세포 유형의 유전자 차등 발현 수준을 보여주는 점 플롯(Dot Plot)으로, 유전자는 정상 및 치료 후 조건에서 유사하지만 치료 전 상태에서는 역으로 나타난다. 각 점의 색상은 유전자의 높고 낮은 발현 수준을 나타내며, 점 크기는 특정 세포 유형에서 유전자를 발현하는 세포의 비율을 나타낸다.
도 18은 CD4+ T 세포의 하위 그룹에 대한 유전자 온톨로지 (GO) 용어이다.
도 19는 단핵구 하위 3가지 유형의 UMAP 플롯으로, 고전적 단핵구, 비 고전적 단핵구 및 중간 단핵구로 분류된다.
도 20은 단핵구 각 세포 유형에 대한 대표적인 마커 유전자의 바이올린 플롯이다.
도 21은 단핵구에서 각 하위 세포 유형의 유전자 차등 발현 수준을 보여주는 점 플롯(Dot Plot)으로, 유전자는 정상 및 치료 후 조건에서 유사하지만 치료 전 상태에서는 역으로 나타난다. 각 점의 색상은 유전자의 높고 낮은 발현 수준을 나타내며, 점 크기는 특정 세포 유형에서 유전자를 발현하는 세포의 비율을 나타낸다.
도 22는 단핵구 세포의 하위 유형에 대한 유전자 온톨로지 (GO) 용어이다.
도 23은 면역 반응에 중요한 13가지 주요 세포에서 각 하위 세포 유형의 유전자 차등 발현 수준을 보여주는 점 플롯(Dot Plot)으로, 유전자는 정상 및 치료 후 조건에서 유사하지만 치료 전 상태에서는 역으로 나타난다. 각 점의 색상은 유전자의 높고 낮은 발현 수준을 나타내며, 점 크기는 특정 세포 유형에서 유전자를 발현하는 세포의 비율을 나타낸다.
도 24는 naive B, naive CD4+, naive CD8+, gdT, MAIT, NK 및 mDC 세포에 대한 유전자 온톨로지 (GO) 용어이다.
본 명세서에서 사용되는 용어에 대해 간략히 설명하고, 본 발명에 대해 구체적으로 설명하기로 한다.
본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
명세서 전체에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
아래에서는 첨부한 도면을 참고하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시 예에 한정되지 않는다.
본 발명에 대한 해결하고자 하는 과제, 과제의 해결 수단, 발명의 효과를 포함한 구체적인 사항들은 다음에 기재할 실시 예 및 도면들에 포함되어 있다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다.
본 발명은 대사물질을 포함하는 치주 질환 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단용 키트를 제공한다.
이하, 본 명세서에 대하여 더욱 상세하게 설명한다.
치주 질환은 광범위한 인구에 영향을 미치는 만연한 만성 염증성 질환이다. 수십 년 동안 많은 연구자들은 구강 건강과 전신 질환 사이의 양방향 관계를 제안했다. 그러나 구강 질환이 어떻게 감수성을 증가시키고 신체에 영향을 미치는지에 관해서는 아직 정확하게 확립되지 않았다. 본 발명에서는 말초 혈액 단핵 세포를 사용하여 단일 세포 RNA 시퀀싱을 수행하고 치료 전과 후의 치주질환 환자 및 건강한 기증자의 분자 차이를 비교하였다. 특정 유전자의 발현 수준과 이들이 속한 세포 유형에 따라 염증 반응이 변경되었다. 또한, 본 발명에서는 치료적 개입을 통해 유사한 수준의 건강한 기증자로 회복되고 다양한 세포 유형에 공통적으로 나타나는 유전자를 추출했다.
본 발명에 따르면, 단일 세포 수준에서 만성 구강염증성 질환인 치주질환에서의 면역세포 유전자 발현변화 확인을 통해 전신 질환의 연관성을 확인할 수 있다. 또한, 이러한 연관성을 끊어 질병을 줄이는 치료 표적으로 활용할 수 있다.
치주 질환 진단용 바이오마커
본 발명은 정상인(대조군)의 체액 대비 치주 질환 환자의 혈액, 치은열구액 또는 타액에서 상대적으로 발현의 차이를 나타내는 대사물질을 포함하는 치주 질환 진단용 바이오마커를 제공한다.
본 발명에 사용된 용어 “정상인(대조군)”이란, 실험 결과가 제대로 도출되었는지 여부를 판단하기 위한 집단을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 “정상인(대조군)”이란 치주 질환을 앓고 있지 않은 개체를 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "치주질환(periodontal disease)" 이란, 풍치라고도 하며, 치은(잇몸)과 치아 사이의 틈에 박테리아가 감염되어 치주인대와 인접조직을 손상시키는 질환을 의미하는데, 병증의 정도에 따라 치은염과 치주염으로 구분된다. 상기 치주질환의 발병시 염증이 진행되어 더 많은 조직이 손상되면서 치주낭(periodontal pocket)이 형성되고, 치주염이 심할수록 치주낭의 깊이가 깊어지게 되는데, 치주낭이 깊어지면서 치주인대에 염증이 생기게 되고 최종적으로는 골소실이 유발된다고 알려져 있다.
본 발명에 사용된 용어 “진단”이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 치주 질환의 발병 여부, 병의 진전 정도 또는 이로 인한 위험군 여부를 확인하는 것이다.
본 발명은 혈액과 같은 생물학적 시료 내에 분포한 IFITM1(Interferon Induced Transmembrane Protein 1), CRIP1(Cysteine Rich Protein 1), MIF(Macrophage Migration Inhibitory Factor) 및 RPS17(Ribosomal Protein S17) 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 진단용 조성물로 구성하여 치주질환 효용성 평가하는 치주질환 치료 효용성 평가용 바이오마커 조성물이다.
또한, 본 발명은 치은열구액과 같은 생물학적 시료 내에 분포한 IFITM1(Interferon Induced Transmembrane Protein 1), CRIP1(Cysteine Rich Protein 1), MIF(Macrophage Migration Inhibitory Factor) 및 RPS17(Ribosomal Protein S17) 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 진단용 조성물 구성하여 치주질환 효용성 평가하는 치주질환 치료 효용성 평가용 바이오마커 조성물이다.
본 발명에 있어서, 상기 치주 질환은 치은염(gingivitis), 치주염(periodontal inflammation), 치은출혈(gingival bleeding), 치은퇴축(gingival retraction), 치주낭(periodontal pocket), 치조골 파괴(alveolarbone destruction) 또는 치조골 소실(alveolar bone loss)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 치조골 소실은 치조골에서 골형성과 골흡수의 균형이 깨어져 골흡수가 골형성을 초과하여 골량이 한계 이하로 감소하면서 나타나는 치주 질환의 일종으로, 치조골 흡수(alveolar bone resorption)가 나타날 수 있다.
실험예
1) 치주염 환자에서 PBMC의 단일 세포 전사
치주염 환자에서 얻은 말초 혈액 단핵세포(PBMC)의 단일 세포 전사 환경 전신에서 치주염의 면역학적 특징과 메커니즘을 프로파일링 하기 위해, 본 발명에서는, 도 1에 나타난 바와 같이, 4명의 건강한 기증자로부터 말초 혈액 단핵세포를 그리고 4명의 치주질환자로부터 4 쌍의 치료 전 후 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 수집하였다.
액적 기반 단일세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)을 수행했다. 도 2에 나타난 바와 같이, 저품질 셀을 필터링하고 데이터를 통합 한 후 참가자 당 평균 9,268 개의 셀이 있는 111,213 개의 셀을 획득하였다. 유전자 별 세포 발현 매트릭스를 사용하여 균일한 다양체 근사 및 투영 (UMAP) 및 26개의 세포 집단을 캡처 한 그래프 기반 클러스터링으로 차원 감소를 수행하였다.
먼저 각 집단에 대한 마커 유전자를 찾은 다음 상기 유전자를 활용하여 참조 전사체 데이터 세트를 활용하여 세포의 기원을 확인하였다. 각 셀의 원점을 추정하여 클러스터 단위에서 확률이 가장 높은 셀 유형에 할당했다. 도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, 면역 반응에 중요한 13가지 주요 세포 유형을 발견하고 알려진 마커를 사용하여 기원을 확인했다 : B(MS4A1), naive B(MS4A1 and TCL1A), CD4+ T(CD4, and CD3), naive CD4+ T(SELL, CCR7, CD4, and CD3), CD8+ T(CD8T, and CD3), naive CD8+ T(SELL, CCR7, CD8T, and CD3), gamma delta T cell, gdT(TRGC1, and CD3), MAIT(SLC4A10, and CD3), NK(KLRF1), plasmacytoid Dendritic Cell, pDC(IL3RA), myeloid Dendritic Cell, mDC(CD1C), monocyte(LYZ,CD4), progenitor(ITGA2B). 따라서 PBMC의 세포 집단은 명확하게 식별되었으며, 도 5에 나타난 바와 같이, 각 참가자의 세포집단은 이러한 클러스터로 구성되었다. PBMC 전체에서 각 세포가 차지하는 비율은 T 세포(60 ~ 73%), B 세포(4 ~ 15%), NK 세포(5 ~ 23%), 단핵구(5 ~ 24%) 및 수지상 세포(1 ~ 2%)로 질병 유무와 치료에 상관없이 정상 분포를 가진 PBMC로 구성된다. 도 6에 나타난 바와 같이, 대부분의 샘플은 세 그룹 사이에 세포 조성의 유의 한 차이가 없었지만 CD8+ T 세포는 치료 전 치주질환자 그룹에서 약간의 감소를 보였다 (p- 값 0.063).
차별적으로 발현 된 유전자(이하, DEG) 분석을 수행하고 건강한 기증자와 치료 전 환자 사이 및 치료 전후 환자 사이에서 공통 유전자를 추출했다.
2) 치주 상태에 따른 B세포의 특성 변화
B 세포를 전환되지 않은 메모리 B세포(non-switched MB), 전환된 메모리 B 세포(switched MB), 비활성 B 세포(exhausted B cells) 및 형질모세포로 분리했다. 도 7 및 도 8에 나타난 바와 같이, 비 전환된 MB(non-switched MB), 전환된 메모리 B 세포(switched MB)는 모두 CD19 및 CD27을 발현하는 것으로, 전환된 메모리 B 세포(switched MB)에서는 낮은 발현을 나타내는 IGHD 및 IGHM을 사용하여 구별할 수 있으며, 형질모세포는 CD38을 사용하여 확인할 수 있다.
도 9에 나타난 바와 같이, DEG 분석에서는 치료 전 치주질환자의 전환되지 않은 메모리 B세포와 전환된 메모리 B 세포에서 뚜렷하게 상향 및 하향 조절되는 유전자가 있다. 6개의 유전자(IGLL5, CRIP1, RPS17, MIF, RCSD1 및 GABARAPL2)가 증가했고, 2개의 유전자(DUSP2, RPS26)가 치료 전 환자의 비 전환 B 세포(non-switched MB)에서 감소했다. 또한 전환 된 B 세포(switched MB)에서 3 개의 유전자(CRIP1, MIF 및 RPS17)가 상향 조절되었고 RPS10은 하향 조절되었다. CD4+T 세포에서도 IGLL5와 RPS26은 치료 전 환자에서 각각 매우 높고 낮은 발현을 나타냈다. 또한 치은 조직에서 IGLL5의 발현 수준이 높은 것으로 보고 되었다. 그 기능은 거의 알려지지 않았지만 IGLL5는 B 세포 개발에 관여하는 IGLL1과 상동하다. CD4T 하위 집합에서 감소 된 RPS26은 전환되지 않은 B 세포(non-switched MB)에서도 가장 큰 감소를 나타냈다. 도 10에 나타난 치료 전 치주질환자에서 상향 조절된 IGLL5, MIF 및 CRIP1을 포함한 유전자의 경우, 생물학적 기능에 관해서는 흥미롭게도 전환되지 않은 MB에서 B 세포 활성화와 관련이 있다.
3) 치주 상태에 따른 CD8+ T 세포의 특성 변화
도 11 및 도 12에 나타난 바와 같이, SELLhi / CCR7hi central memoryT (TCM), SELL(CD62L)lo / CCR7lo effector memory T(TEM) cells and SELL(CD62L)lo / CCR7lo / IL7Rlo terminal effector T(TTE)를 분류하여 CD8+ T 세포를 비교했다. 도 13에 나타난 바와 같이, 치료 전 치주질환자의 TCM 세포에는 3 개의 상향 조절 된 유전자(IFITM1, CRIP1 및 MIF)와 3 개의 하향 조절 된 유전자(GNLY, FOS 및 RPS10)가 있다. 또한 TTE 세포의 4 개 유전자(CCL3, CRIP1, IFITM1 및 MIF)와 2 개 유전자(S100B, ZNF683)는 치료 전 군에서만 각각 높고 낮은 발현을 보였다. 특히 GNLY와 S100B는 다른 그룹에 비해 치료 전 그룹에서 가장 큰 차이를 보였다. GNLY는 NK 세포와 활성화 된 세포 독성 T 세포에 의해 생성되는 최초의 인정 된 림프구 유래 알람이다. 항원 제시 세포의 모집을 촉진하고 염증성 질환에서 내인성 위험 신호를 전달한다. GNLY 발현의 증가는 자가 면역 질환 및 감염에서 보고되었으며, 감소는 심각한 면역 결핍에서 발생했다. 치주염 환자에서 GNLY의 감소 된 발현 수준은 다른 세포에 비해 TCM에서 가장 낮았다.
S100 단백질 군의 유전자 인 S100B는 기능적으로 뇌 또는 폐 질환과 관련이 있다. 또한, 세포아포프토시스, 증식 및 염증을 포함하는 조절을 포함하는 광범위한 세포 내 및 세포 외 기능을 가지고 있지만 CD8+ T 세포에는 명시되어 있지 않다. 생물학적 기능을 조사했을 때, 치주염 환자의 TTE 세포는 화학 주성, 세포 이동 및 사이토카인 분비와 같은 능력이 향상되어 있다. 특히, 도 14에 나타난 바와 같이, 본 발명에서는 LPS가 표적 세포의 수용체에 결합함으로써 개시되는 분자 신호 인 LPS(lipopolysaccharide) 매개 신호 전달 경로를 발견했다. 치주 질환의 주요 병원체 인 Porphyromonas gingivalis(P. gingivalis)는 LPS를 보유한 그람 음성균으로 전신 염증과 질병을 유발하는 LPS에 대한 많은 연구가 진행되고 있다.
4) 치주 상태에 따른 CD4+ T 세포의 특성 변화
도 15에 나타난 바와 같이, 우리는 CD4+ T 세포를 하위 유형인, T-helper 1 (Th1), T-helper 17(Th17), follicular helper T(Tfh) and regulatory T (Treg) 로 나누었다. 도 16에 나타난 바와 같이, STAT1 및 STAT4는 Th1 세포를 CCR6는 Tfh 세포를 MAF는 Th17 세포를, IL2RA 및 FOXP3는 Treg 세포를 식별하는 데 사용되었다. 세포 내 박테리아 및 바이러스에 대한 세포 매개 면역에 관여하는 Th1 세포는 치료 전 치주질환자에서 5 개의 상향 조절 된 유전자 (CRIP1, IFITM1, CCR10, RPS17 및 MIF)와 1 개의 하향 조절 된 유전자 (RPS26)를 가지고 있다. 도 17에 나타난 바와 같이, CRIP1 및 IFITM1은 건강한 그룹과 치료 후 그룹보다 약 2 배 높게 발현되었다. 특정 진균 및 세포 외 세균에 대한 세포 매개 염증 과정이 요구되는 Th17 세포의 경우, 3 개의 유전자(CCR7, CRIMAP4, CRIP1)가 치료 전 치주질환자에서 높게 관찰되었으며 6 개의 유전자(GZMK, TRGC2, GNLY, AC020916.1)는 건강한 사람에서 높게 발현되었으나 치주질환자의 경우 치료 전후 변화는 없었다. 이들 유전자 중 특히 GZMK, TRGC2, GNLY의 전사체는 치주질환자에서 크게 감소하였다. GZMK는 세포 독성 유전자로 널리 알려져 있으며 CD8+ T 세포 및 세포 독성 CD4+ T 세포와 관련이 있다. TRGC2는 면역 수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)를 유발하고 궁극적으로 T 세포 확장 및 항원에 결합하여 효과기 세포로의 분화를 유발한다. 병원균 제거 및 조직 복구를 유도하는 것으로 보고되었지만 CD4+ T 세포에 대해서는 정보가 부족하다. GNLY는 세포 독성이 있는 살해 림프구에 의해 방출되는 단백질로 미세 안검하수증을 유발한다. B 세포의 성숙을 조절하는 것으로 알려진 Tfh 세포의 경우 치료 전 치주질환자에서 7 개의 상향 조절 된 유전자(IFITM1, CRIP1, RPS17, MIF, GNLY, RCSD1, MT-ND3)와 3 개의 하향 조절 된 유전자 (RPS26, RPS10, RPL36A)가 있다. IFITM1과 CRIP1은 증가했고 RPS26은 두 배 이상 감소했다. 면역 항상성 유지 및 자가 면역 질환 예방에 중요한 Treg 세포는 치료전 치주질환자에서 2 개의 고도로 발현 된 유전자 (CRIP1 및 IFITM1)를 가지고 있으며 하향 조절 된 유전자는 없다. 생물학적 기능은 도 18에 나타나 있다.
5) 치주 상태에 따른 단핵구의 특성 변화
단핵구에는 표현형 수용체 CD14 및 CD16 (FCGR3A)에 따라, 도 19에 나타난 바와 같이, 고전적 단핵구, 비 고전적 단핵구 및 중간 단핵구라고하는 세 가지 하위 유형이 있다. 도 20에 나타난 바와 같이, 고전적 단핵구는 CD14++ CD16-을 발현하지만, 비 고전적 단핵구 및 중간 단핵구는 CD14+ CD16++ 및 CD14++ CD16+를 각각 발현한다.
도 21에 나타난 바와 같이, 고전적인 단핵구에서 치료 전 환자는 다른 피험자보다 4 개의 고도로 발현 된 유전자(AC007952, CRIP1, VNN2 및 CD93)와 11 개의 낮은 발현 된 유전자(LDLR, GPR183, PF4, CD69, ATF3, PTX3, HLA-DPB1, HLA-DPA1, IL1B, CTNNB1 및 ZFP36)가 있다. 치료 전 치주질환자의 비 고전적 단핵구에서 5 개의 유전자(VMO1, IGKC, CRIP1, HSPA1B 및 SCGB3A1)가 상향 조절되었고 13 개의 유전자(LGALS2, APOBEC3A, CCL4L2, LYPD2, CDKN1A, NFKBIA, AC020916, DUSP2, HLA-DRB5, CD83, ZFP36, HSPB1 및 EPSTI1)은 하향 조절되었다. 중간 단핵구는 13 개 유전자(AC007952, ATP2B1-AS1, CRIP1, NUP214, RBMS1, RPS17, TALDO1, CAST, LYZ, RPL17, CCNI, NCL 및 CSDE1)의 치료 전 치주질환자에서 상향 조절만 있었으며 발현 감소 유전자는 없었다. 이 중 AC007952, VMO1, IGKC가 가장 많이 증가한 반면 LDLR과 LGALS2가 가장 많이 감소했다.
lncRNA 인 AC007952는 고전적 단핵구와 중간 단핵구 모두에서 발견되었지만 염증 관련 연구는 없었다. VMO1은 CD16- 단핵구보다 CD16+ 단핵구에서 특징적으로 발현되는 유전자이다. 치주염 환자에서 3 배 더 높은 것으로 관찰되지만 그 기능은 잘 알려져 있지 않다. IGKC의 단핵구 관련 기능은 확인되지 않았지만 종양 진단 및 화학 요법에서 강력하고 유명한 마커이다. LDLR은 죽상 동맥 경화증 또는 암에서 콜레스테롤 항상성과 염증 조절제를 조율하는 것과 관련이 있다. LGALS2 또는 갈렉틴 2는 단핵구 이동을 약화시키면서 전 염증성 사이토카인을 촉진하여 혈관 항상성을 유지하는 단핵구를 조절하는 것으로 알려져 있다. 관련 유전자 온톨로지 용어는 도 22에 나타나 있다.
6) 치주 상태에 따른 Naive CD4 + T, Naive CD8 + T, Naive B, gdT, NK, MAIT, mDC의 특성 변화
도 23에 나타난 바와 같이, 면역 반응에 중요한 13가지 주요 세포 중 pDC와 전구 세포를 제외한 거의 모든 세포에서 치료 전 치주질환자에서 유전자가 뚜렷하게 증가 또는 감소하는 것을 발견했다. naive B 세포는 치주질환자에서 5 개 유전자(GNLY, CRIP1, IGLL4, MIF 및 RPS17)의 발현이 증가하였으며 2 개 유전자(RPS26 및 HLA-DRB5)는 감소했다. naive B 세포에서 증가 된 유전자 중, 특히 GNLY와 CRIP1이 훨씬 더 높은 발현 수준을 나타냈다. 치료 전 치주질환자에서 naive CD4+ T 세포는 5 개의 상향 조절 된 유전자(IFITM1, MIF, CRIP1, GNLY 및 RPS17)과 1 개의 하향 조절 된 유전자(RPS26)를 보유한 반면, naive CD8+ T 세포는 5 개의 유전자(IFITM1, CRIP1, MIF, RPS17 및 TLN1) 발현이 증가되었고 4 개의 유전자(RPS10, TNFAIP3, CD69 및 CCL5) 발현이 감소하였다. 치료 전 치주질환자에서 gdT는 8 개의 상승 된 유전자(IFITM1, CRIP1, ALOX5AP, MT2A, TLN1, FGFBP2, GIMAP4 및 CD247)와 7 개의 감소 된 유전자(TNFAIP3, AC020916.1, HLA-DRA, FOS, HOPX, NFKBIA 및 CD69)를 보였다. 치료 전 치주질환자의 NK 세포에서는 3 개의 유전자(CCL3L1, CRIP1, IFITM1)가 높게 발현되었고 2 개의 유전자(KLRC2, NUSAP1)가 낮은 발현을 보였다. MAIT 세포에는 4 개의 상향 조절 된 유전자(IFITM1, CRIP1, RPS17 및 MIF)와 1 개의 하향 조절 된 유전자(HOPX)가있는 반면, mDC에는 높은 8 개의 유전자(CRIP1, S100A12, CD14, VACN, MIF, TNFRSF1B, RPS17 및 FTL) 및 낮은 5 개 유전자(CCL5, PMAIP1, IL18, RPS10 및 HLA-DRB5)를 포함한다. 각 세포와 연계된 생물학적 기능은 도 24에 설명되어 있다.
여러 가지 연구에서 치주질환은 전신염증 반응을 통해 다양한 질환의 발생과 진행에 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다. 그러나 이와 같은 상호관계를 연결짓는 구체적인 인자는 아직 밝혀지지 않았으며 연구할 필요가 있다. 본 발명에서 PBMC에 scRNA-seq를 적용하여 치주질환 치료 후 및 건강한 상태를 비교하여 세포 수준에서 치주질환의 면역인자 변화 특징 및 관련 생물학적 기능을 설명한다. 본 발명은 분자 이질성과 특징적인 변화를 밝혀냈을 뿐만 아니라 큰 변화를 보이는 유전자가 관련 세포 유형에 해당하는 염증 반응에 중요한 역할을 하는 것을 명확히 밝혀냈다. 또한, 앞서 기재한 바와 같이 다른 질병과 관련된 기능을 입증하였다.
한편, 본 발명에서는 다양한 세포 유형에 걸쳐 중첩되게 관찰되는 4개의 유전자에 집중했다. 해당 유전자가 세포 유형에 관계없이 동일한 양상을 보인다는 것이 흥미롭다. 각 세포 유형에는 고유의 세포가 아닌 것을 구분하기 위한 고유한 특성과 기계적 시스템이 있다. 그럼에도 불구하고 치주염 환자에서의 세포 유형 비특이적 변화는 치주염이 수많은 세포에 대한 면역 반응을 일으키는 동시에 상당한 영향을 미칠 것을 암시한다. CRIP1, IFITM1, MIF 및 RPS17이 여러 세포 유형에 걸쳐 증가했음을 고려할 때, 해당 유전자는 전신 염증의 효과적인 표적으로 잠재적 후보로서의 가치가 있다.
CRIP1의 상승은 DEG가 존재하는 모든 세포 유형에서 관찰되었다. CRIP1은 LIM 계열 도메인으로 구성된 물질로 단백질-단백질 상호 작용을 통해 유전자 조절, 세포 운명 결정 및 종양 형성에 직접적으로 영향을 미친다. 또한 결장 직장암, 유방암, 골육종, 위암 등 다양한 암 유형에서 변화가 관찰되고 있다. 갑상선 암종의 경우 CRIP1이 과발현되었고, CRIP1을 침묵 시키면 세포의 증식, 이동 및 침입이 억제되었다. CRIP1에 대한 연구는 원래 장(intestine)에 초점을 맞추었지만 PBMC에서도 동일하게 관찰되었다. 특히, 쥐의 복막 대식세포, PBMC, 비장 및 장에서 LPS 자극 후 CRIP1 mRNA 수준이 증가 하였다. CRIP1 과발현 된 트랜스 제닉 마우스는 LPS 처리 후 높은 농도의 IL-6 및 IL-10을 생성했지만, 낮은 농도의 TNF- 및 IFN-을 생성하여 CRIP1이 사이토카인 생산의 불균형에 영향을 미친다는 것을 알 수 있다. CRIP1 과발현 트랜스 제닉 마우스는 체중 감소와 설사가 심했다.
MIF는 Th1, Tfh, TCM, TTE, 전환되지 않은 MB, 전환 된 MB, naive CD4 + T, naive CD8+ T, naive B, MAIT 세포 및 mDC에서 상승했다. MIF는 선천 면역과 적응 면역을 조절하는 인자로서 숙주 염증 반응의 기본 구성 요소이다. MIF는 치주염의 경우 P. gingivalis를 보유한 LPS와 같은 독소 함유 박테리아에 의해 유도된다. 조직이나 전신 순환으로 방출 된 후 대식세포와 T세포를 활성화시켜 염증을 일으키는 사이토카인으로 숙주가 즉시 반응하여 빠르게 방어 할 수 있도록 한다. 천식, 관절염, 염증성 장 질환, 아토피 성 피부염 및 죽상 경화증을 포함한 여러 급성 및 만성 염증성 질환 상태에서 LPS가 있을 경우 고용량의 순환 MIF 는 내독소 혈증을 치명적인 수준으로 악화시키는 데 기여하는 것으로 보고되었다.
반면, IFITM1은 Th1, Tfh, Treg, TCM, TTE, naive CD4+ T, naive CD8+ T, gdT, NK 및 MAIT 세포에서 관찰되었다. IFITM1은 인터페론 자극 유전자이며 적응 면역에 직접 관여하고 세포 사멸 및 세포주기 제어에 역할을 하는 것으로 설명된다. 특히, IFITM1의 증가는 대장 암, 두경부, 위장관, 염증성 유방암, 궤양성 대장염 및 크론 병에서 전반적인 예후가 악화되는 종양 진행 및 침습성과 관련이 있는 것으로보고된다. 염증 및 전신 질환의 유도와 관련이 높지만 치주 염증 반응에서 IFITM1에 대한 연구에 대해서는 알려진 바가 없다.
RPS17의 경우 Th1, Tfh, 전환되지 않은 MB, 전환 된 MB, 중간 단핵구, naive CD4+ T, naive CD8+ T, naive B, MAIT 세포 및 mDC에서 높게 발현되었다. 리보솜 단백질로서 그 돌연변이는 다이아몬드-블랙판 빈혈의 바이오 마커로 잘 알려져 있지만, 기능에 대한 정보는 매우 적다. 리보솜 단백질은 종양 형성, 발달 및 면역 신호 전달에서 미세하게 조정된다. 예를 들어, RPS3와 같은 일부 리보솜 단백질은 표적 유전자의 전사 발현을 선택적으로 조절한다. 리보솜 단백질은 면역 신호를 강화하는 숙주 면역 반응에서 다양한 역할을 하지만 인간 종양에서 mRNA 또는 단백질 수준에서 상향 조절되어 독립적인 발암 능력을 가지고 있음이 많은 연구에서 입증되었다. 이러한 양면성 때문에 리보솜 단백질을 조사하는 것이 필수적이다.
결론적으로, 본 발명은 치주질환에서 관찰되는 유전자 발현의 특징적인 변화를 세포 수준에서 설명하고 치주염이 전신 질환 진행에 영향을 미친다는 증거를 제시한다. 최근까지 많은 질병과의 인과 관계가 반복적으로 언급 되었지만 이 관계에 대한 연구는 없다. 참가자가 다른 질병을 앓지 않았음을 감안할 때 치주 변화는 PBMC에 영향을 미치고 변화된 PBMC 순환은 전신에 영향을 미치며 전신 질환 진행에 기여할 수 있다. 이를 위해 조사가 필요한 4 가지 주요 조절 유전자를 제안한다.
추가 실험방법
1) 방법 세부 사항
10X 게놈을 사용한 샘플 준비 및 scRNA-seq [대상 수집, 윤리 성명서, 임상 정보, PBMC(Peripehral blood mononuclear cell) 수집, 단일 세포 현탁액 준비]를 준비한다.
2) 정량화 및 통계 분석
- scRNA-seq 데이터 전처리 (정렬, 바코드 할당 및 UMI 계수, 품질 관리)
FASTQ 파일은 정렬, 필터링, 바코드 계수 및 UMI 계수를 수행하는 Cell Ranger (v3.1.0)를 사용하여 세포 특성 바코드 매트릭스로 변환한다. 파이프 라인은 기본 인수 (10X Genomics)로 실행한다. 저품질 세포를 제거하기 위해 UMI가 500 개 미만이거나 UMI가 20,000 개 이상이고 미토콘드리아 유전자가 20 % 이상인 세포를 걸러 낸다. 또한 유전자가 250 개 미만이거나 유전자가 5,000 개 이상인 세포와 복잡성이 80 % 미만인 덜 복잡한 세포는 제거한다. 또한 세포의 0.1 % 이상에서 발현되는 유전자는 남긴다. 그럼에도 불구하고 일부 샘플에는 다량의 세포 (최대 12,177 개 세포)가 있었기 때문에 Scrublet을 사용하여 가능한 이중선을 추정하고 3.5 %의 세포 (최대 11,852 개 세포)는 제거한다.
- scRNA-seq 데이터 분석 (클러스터링, DEG, UMAP, 주석)
데이터 통합, 확장, 클러스터링 및 시각화를 위해 Seurat (v3.2.2) R 패키지를 실행한다. 나머지 카운트 데이터는 셀룰러 총 읽기 카운트에 대한 정규화 된 음이항 회귀를 기반으로 SCTransform을 사용하여 정규한다. 각 샘플에 대한 정규화 후 FindIntegrationAnchors 및 IntegrateData 함수를 사용하여 12 개 샘플 중 가장 큰 크기 데이터인 참조 데이터와 통합한다.
그런 다음 ScaleData 및 RunPCA 기능을 통해 스케일링 및 주성분 분석을 수행하고 처음 30 대의 PC를 RunUMAP 및 FindNeighbors 기능을 사용하여 UMAP 차원 축소 및 공유 SNN(가장 가까운 이웃 그래프) 구성에 활용한다. 이후, 0.6의 설정 해상도를 가진 커뮤니티를 탐지하기 위한 Louvain 방법의 그래프 기반 모듈성 최적화 알고리즘을 사용하여 세포 클러스터를 구별하고, 27 개의 클러스터를 구별한다. 모든 마커 찾기 기능을 사용하여 세포 동일성 마커를 조사하고, 로그-폴드 변경 임계 값>0.5 및 거짓 발견율 (FDR)<0.01을 갖는 유전자는 유의한 차별적으로 발현 된 유전자 (DEG)로 간주한다.
각 클러스터에 면역 세포 유형에 주석을 달기 위해 이러한 세포 식별 마커를 SingleR (v3.12) R 패키지에 제공한다. SingleR은 단일 셀을 고도로 일치하는 셀 유형에 할당하고 주석을 달고 가장 가능성이 높은 셀 유형에 클러스터를 결합한다. 동일한 클러스터에 있는 대부분의 세포는 일반적으로 70 % 이상의 일관된 세포 유형으로 제안되었으며, 낮은 일관성을 가진 클러스터는 세포 특이적 시그니처를 나타내는 여러 유전자를 사용하여 주석을 달았다.
아래 유전자를 사용하여 세포 정체성을 특성화한다 : MS4A1, CD19, CD22, TCL1A, CD83 (naive B); CD3E, CD3D, CD3G, CCR7, GZMA (naive T); MS4A1, CD27, FCER2 (B); IL7R, TNFRSF4 (CD4T); CD8A, CD8B, GZMA (CD8T); TRGC2, TRGC1 (gdT); KLRB1, SLC4A10, TRAV1-2 (MAIT); KLRF1 (NK); IL3RA, CLEC4C (pDC); CD1C, CD14, FCGR3A (mDC); LYZ, CD68 (monocyte), ITGA2B (progenitor).
주석을 명확히 한 후 B 세포, CD4T 세포 (helper T cells), CD8T 세포 (cytotoxic T cells) 및 단핵구를 추출하고 정규화, 스케일링, 차원 축소, 클러스터링 및 주석 단계를 반복하여 각 세포를 계층적 클러스터로 하위 클러스터링한다. ‘건강한 공여자 vs 치료 전 환자’ 또는 ‘치료 전 vs 치료 후 환자’ 간의 DEG를 찾은 경우, edgeR 및 유연한 제로 팽창 음이항 기반 원한 변동 추출 (ZINB-WaVE)을 수행하여 제로 인플레이션 및 과대 분산을 설명할 수 있다.
치주 질환 진단용 키트
본 발명은 상기 치주 질환 진단용 바이오마커를 포함하는 치주 질환 진단용 키트를 제공한다.
상기 치주 질환 진단용 바이오마커는 앞서 기재한 바와 같다.
본 발명에 있어서, 상기 진단용 키트는 마이크로어레이, 앱타머 칩 키트, 엘리사(ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 키트, 블랏팅(Blotting) 키트, 면역침전법 키트, 면역형광검사 키트, 단백질 칩 키트 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 진단용 키트는 대사물질과 특이적으로 결합하는 분자를 포함하며, 특히, 치주 질환을 진단하는데 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 특이적으로 결합하는 분자는 항체, 기질, 리간드 단백질, 펩타이드, 핵산, 화학물질, 고분자 또는 보조인자(cofactor) 등 일 수 있으며, 구체적으로는 각 마커를 인식하는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 각 마커에 상호작용하는 특정 단백질, 펩타이드, 핵산, 고분자 또는 화학물질, 또는 각 마커와 화학반응을 일으켜 특정 화학 물질로 변환되도록 가능한 화학물질 또는 화합물, 또한 추가적으로 항체, 단백질, 펩타이드, 핵산, 고분자 또는 화학물질에 수식(modification) 가능한 나노입자, 형광 염료(fluorescent dyes) 등의 측정 시약을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 진단용 키트는 검체로서 혈액, 치은열구액 또는 타액을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 혈액, 치은열구액 또는 타액과 같은 생물학적 시료 내에 분포한 IFITM1(Interferon Induced Transmembrane Protein 1), CRIP1(Cysteine Rich Protein 1), MIF(Macrophage Migration Inhibitory Factor) 및 RPS17(Ribosomal Protein S17) 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 진단용 조성물로 구성하여 치주질환 효용성 평가하는 치주질환 치료 효용성 평가용 바이오마커 조성물이다.
또한, 본 발명은 혈액, 치은열구액 또는 타액과 같은 생물학적 시료 내에 분포한 IFITM1(Interferon Induced Transmembrane Protein 1), CRIP1(Cysteine Rich Protein 1), MIF(Macrophage Migration Inhibitory Factor) 및 RPS17(Ribosomal Protein S17) 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 진단용 조성물 구성하여 치주질환 진단용 바이오마커 조성물이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해 질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 실시 예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려 주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시 예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나 하기의 실시 예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시 예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
상기 과제의 해결 수단에 의해, 본 발명은 치주질환 병인기전 인자 발현에 기반하여 평가함으로써 치주질환 진단과 평가 및 예후 판정에 대한 객관적 지표를 제시할 수 있다.
또한, 본 발명은 치주질환 치료 후 치주 건강도 개선에 대한 객관적인 판정이 가능한 치주질환 발병기전 인자 중심의 바이오마커를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 개인의 치주염 진행 특성에 적합한 치료계획 수립 기준 및 근거를 제시할 수 있다.
또한, 본 발명의 목적은 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 진단용 조성물로 구성된 치주질환 효용성 평가용 키트를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 목적은 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 진단용 조성물로 구성된 치주질환 효용성 평가용 키트를 제공할 수 있다.
이와 같이, 상술한 본 발명의 기술적 구성은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해되어야 하고, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타나며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. 생물학적 시료 내 혈액, 치은열구액 또는 타액에 분포한,
    IFITM1(Interferon Induced Transmembrane Protein 1), CRIP1(Cysteine Rich Protein 1), MIF(Macrophage Migration Inhibitory Factor) 및 RPS17(Ribosomal Protein S17) 유전자 중 선택된 어느 하나 이상의 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 치주질환 진단용 바이오마커 조성물.
  2. 제 1항의 바이오마커 조성물의 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 치주질환 진단용 바이오마커 조성물.
  3. 생물학적 시료 내 혈액, 치은열구액 또는 타액에 분포한,
    IFITM1(Interferon Induced Transmembrane Protein 1), CRIP1(Cysteine Rich Protein 1), MIF(Macrophage Migration Inhibitory Factor) 및 RPS17(Ribosomal Protein S17) 유전자 중 선택된 어느 하나 이상의 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 치주질환 치료 효용성 평가용 바이오마커 조성물.
  4. 제 3항의 바이오마커 조성물의 mRNA 또는 이의 단백 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 치주질환 치료 효용성 평가용 바이오마커 조성물.
  5. 제 1항 내지 제 2항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 치주질환 진단용 키트.
  6. 제 3항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 치주질환 치료 효용성 평가용 키트.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 치주염 진단용 키트는,
    마이크로어레이, 앱타머 칩 키트, 엘리사(ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 키트, 블랏팅(Blotting) 키트, 면역침전법 키트, 면역형광검사 키트, 단백질 침 키트 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 치주질환 진단용 키트.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 치주염 진단용 키트는,
    마이크로어레이, 앱타머 칩 키트, 엘리사(ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 키트, 블랏팅(Blotting) 키트, 면역침전법 키트, 면역형광검사 키트, 단백질 침 키트 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 치주질환 치료 효용성 평가용 키트.
  9. 생물학적 시료 내 혈액, 치은열구액 또는 타액에 분포한,
    IFITM1(Interferon Induced Transmembrane Protein 1), CRIP1(Cysteine Rich Protein 1), MIF(Macrophage Migration Inhibitory Factor) 및 RPS17(Ribosomal Protein S17) 유전자 중 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정 하는 단계; 및
    상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 치주질환 진단을 위한 정보제공방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정 하는 단계에서 생물학적 시료 내 생물학적 시료 내 혈액 또는 치은열구액에 존재하는 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 수집하여 B(MS4A1), naive B(MS4A1, and TCL1A), CD4+ T(CD4, and CD3), naive CD4+ T(SELL, CCR7, CD4, and CD3), CD8+ T(CD8T, and CD3), naive CD8+ T(SELL, CCR7, CD8T, and CD3), gamma delta T cell, gdT(TRGC1, and CD3), MAIT(SLC4A10, and CD3), NK(KLRF1), plasmacytoid Dendritic Cell, pDC(IL3RA), myeloid Dendritic Cell, mDC(CD1C), monocyte(LYZ,CD4), progenitor(ITGA2B) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 더 측정하는, 치주질환 진단을 위한 정보제공방법.
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