KR101884989B1 - 조절 miRNA ID의 검출방법 및 이를 이용한 유방암 바이오 마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 마이크로 RNA(miRNA)를 추출하여 서열화된 miRNA의 발현수준별 miRNA 데이터로부터 얻어진 결과물을 통하여 조절 miRNA ID를 검출하는 방법 및 이를 유방암 바이오 마커에 적용하는 관한 것이다.
더욱 상세하게는 발현수준별 miRNA 데이터를 표적예측 데이터베이스 및 RNA 레퍼런스 데이터베이스와 동시에 비교하여 조절 miRNA ID를 검출하여, 종양유전자 및 종양억제유전자를 파악하는 것을 특징으로 하는 유방암 바이오 마커에 관한 것이다.

Description

조절 miRNA ID의 검출방법 및 이를 이용한 유방암 바이오 마커 {Detecting method for controlling miRNA ID and its application of biomarker for breast cancer}

본 발명은 마이크로 RNA(miRNA)를 추출하여 서열화된 miRNA의 발현수준별 miRNA 데이터로부터 얻어진 결과물을 통하여 유방암 바이오 마커에 적용하는 관한 것으로, 더욱 상세하게는 발현수준별 miRNA 데이터를 표적예측 데이터베이스 및 RNA 레퍼런스 데이터베이스와 동시에 비교하여 공통된 결과물을 얻어서, 상기 공통된 결과물로부터 조절 miRNA ID를 검출하여, 이를 유방암 바이오 마커에 적용하는 것이다.

나아가 본 발명은 조절 miRNA ID를 검출하여, 이를 치료제에 적용하는 것이다. 또한 본 발명은 조절 miRNA ID를 검출하여, 검출된 결과를 기초로 판독 가능한 프로그램으로 기록되는 기록매체에 적용할 수 있다.

다수의 질환 상태는 유전적 DNA 카피수의 변화 또는 특정 유전자의 전사 수준의 변화를 통한 다양한 유전자의 발현 수준상의 차이를 특징으로 한다. 예를 들면, 유전물질의 득실이 악성 형질전환과 진행에 있어서 중요한 역할을 한다. 이들 유전물질 중에서 가장 중요한 역할을 하는 것으로는 miRNA가 알려져 있다.

miRNA는 1993년 미국 하버드대 앰브로스(V.Ambros) 교수팀에 의해 처음으로 밝혀졌다. 예쁜 꼬마선충(Caenorhabditis elegans)의 발생시기를 조절하는 유전자를 찾던 중에 lin-4라고 명명된 짧은 RNA 단편이 LIN-14 단백질의 합성에 영향을 준다는 것을 발견하였으나, 이후 같은 종에서 조절인자로서 역할을 하는 let-7이라고 명명된 RNA 단편이 추가로 발견되면서 miRNA의 존재와 기능에 대한 관심이 증가하게 되었다. 또한 miRNA는 21개에서 25개의 뉴클레오티드(nucelotide)로 이루어진 작은 단일가닥염기(single-strand nucleotide)로서, 진핵생물에서 다양한 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 선충(C. elegance)에서 발현되는 miRNA가 1993년 앰브로스 그룹에 의해서 발견된 후, 현재까지 700종 이상이 인간세포에 존재하고 있음이 밝혀졌다.

miRNA의 생합성은 크게 두 가지 효소의 절단에 의해서 진행된다. 먼저, miRNA를 포함하고 있는 유전자가 RNA 중합효소 II 또는 III(RNA polymerase II/III)에 의해서 전사되어 다양한 크기의 miRNA 전사체(transcript)가 합성이 된다. 이러한 과정으로 합성된 primary miRNA(pri-miRNA)는 5‘말단에 cap (7-methylguanylate cap)과 3'말단에 poly[A] tail을 가지고 있다. Pri-miRNA는 핵 내에 존재하는 Drosha라는 RNA 절단효소와 DGCR8(DiGeorge critical region 8)으로 구성된 microprocessor complex에 의해서 70여 개의 nucleotide 길이로 된 전구체 miRNA(pre-miRNA)로 가공된다. Pre-miRNA는 exportin5와 Ran-GTP를 통해서 세포질로 나온 후, 두 번째 절단효소인 Dicer와 TRBP(transactivating response RNA binding protein)에 의해서 20-25개의 nucleotide로 구성된 성숙한 이중가닥의 miRNA로 가공된다.

이중가닥 중에서 한 가닥은 분해되고, 다른 한 가닥만이 Ago(Argonaute)와 함께 결합하여 RISC(RNA-induced silencing complex)를 구성한다. TRBP는 Ago와 miRNA의 결합을 유도하여 miRNA가 표적유전자의 발현을 조절할 수 있도록 한다. 일반적으로 miRNA는 단백질로 번역되지 않는 3' 말단(3' untranslated region, 3'UTR)에 결합하여 mRNA의 안정성(stability)을 낮추거나 번역율(translation efficiency)을 낮추어 표적유전자의 발현을 억제한다.

최근에는 생물학적으로 miRNA가 유전자의 발현을 조절하는 중요한 조절인자임이 밝혀지고, 또한 지금까지 동식물을 포함한 32가지의 종에서 15,172개의 miRNA가 발견됨에 따라 대량의 데이터를 처리하고 분석하기 위하여 생물정보학적 연구방법이 도입되었다. 또한 암억제 유전자로 알려진 BRCA1 유전자는 17번 염색체에 존재하는 암억제 유전자로 유전성 유방암의 발병과 연관이 있다고 알려져 있다.

유전성 유방암은 부모의 생식세포 돌연변이가 그 자손에게 유전되어 발생하므로 유전자상에 존재하는 돌연변이는 부계와 모계 양쪽으로부터 자손에 유전될 수 있다. 최근에는 코돈 패턴 마이닝법을 통하여 유전성 유방암을 유발하는 원인 유전자의 일정한 패턴들을 발견함으로써 암 발생 여부를 사전에 예측할 수 있다. 특히, 세균에서 사람에 이르기까지 연구된 모든 형태의 생물에서 같은 코돈이 같은 아미노산을 지정한다는 특성을 고려하여 유전자 패턴 중에서도 코돈 패턴에 초점을 맞추었다. 하나의 코돈 패턴은 하나의 아미노산을 지정하게 되는데, 여러 아미노산은 단백질의 구성요소가 되며, 만약 코돈의 패턴변이가 일어나게 되면 단백질이 원래의 기능을 상실하게 되어 예상치 못한 신체 이상이 생기되므로 DNA 서열을 일련의 유전자 마이닝 기법을 응용하여 일정한 코돈들의 패턴을 추출하여 변이된 코돈 패턴을 발견함으로서 유방암의 조기진단에 이용될 수 있다.

miRNA들의 서열 및 정보, 특징들을 저장, 관리하는 데이터베이스들이 구축되었는데, miRBase, ASRP, miRNA Map 등이 널리 이용되는 대표적인 데이터베이스들이다. 또한, miRNA 유전자 후보나 miRNA의 표적 유전자를 예측하는 다양한 알고리즘과 이를 적용할 수 있는 애플리케이션 개발도 활발히 진행되고 있다

miRNA 유전자의 후보를 예측하는 방법에는 일반적으로 RNA 구조(RNA conformation) 기반 검색, 유사한 서열을 가진 miRNA에 대한 호몰로지(homology) 검색, miRNA 특성 값을 적용한 기계학습(machine-learning) 방법에 의한 접근 등이 사용된다. RNA 구조에 기반한 검색은 pre-miRNA가 가지는 머리핀(hairpin) 구조의 물리화학적 특징을 이용하는 방법으로서, 특정 염기서열이 열역학적으로 안정한 머리핀 구조를 가질 수 있는 지를 계산하여 miRNA의 후보인지를 예측하는 과정이다.

호몰로지 검색에 의한 예측은 염기서열의 유사 정도를 확률적으로 계산하여 후보를 예측하는 방법으로서, 진화적으로 보존되어 있는 miRNA의 서열 예측에 매우 유용하게 적용된다. 기계학습 방법을 통한 예측은 생물정보학 연구에서 널리 사용하는 방법으로 이미 알려진 miRNA에 대한 염기서열이나 분포, 구조적 특이성, 진화보존성과 같은 특징들을 이용하여 반복적으로 학습(training)시킨 후, 새로운 염기서열 정보가 입력되었을 때 학습된 사항에 따라 결과를 예측해 주는 방법이다.

이와 관련한 종래기술로서, 하기 특허 문헌 001은 모세관 전기영동 시스템을 이용하여 다중 miRNA를 검출하는 것을 기술하고 있으나, 이와 같은 방법으로는 정확한 miRNA의 특성을 파악할 수 없다. 또 하기 특허문헌 002은 miRNA의 정량분석하는 방법에 관한 것이나, 이는 미지의 miRNA를 파악할 수 있는 정확성이 떨어지는 실정이다. 또한 하기 특허문헌 003은 miRNA의 탐색자동화시스템에 관한 것이나, 단순한 레퍼런스 miRNA 데이터베이스(D/B)의 맵핑 툴을 이용하는 것으로 단순하게 동정하는 방법에 대해 개시되어 있을 뿐이다. 하기 특허문헌 004는 ncRNA 서열의 컴퓨터 동정방법만이 개시되어 있다.

이에 본 발명자들은 이러한 종래 기술상의 문제점을 해결하고자 연구를 거듭한 결과, miRNA를 추출하여 서열화된 miRNA의 발현수준별 miRNA 데이터로부터 얻어진 결과물을 통하여 유방암 바이오 마커에 적용하는 방법을 연구하여 본 발명을 완성하였다.

한국공개특허공보 제10-2013-0122541호(2013. 11. 07) 한국공개특허공보 제10-2014-0108913호(2014. 9. 15) 한국공개특허공보 제10-2014-0114684호(2014. 9. 29) 한국등록특허 제0504039(2005. 7. 19)

본 발명은 미지의 바이오 시료로부터 miRNA를 추출하여 서열화된 miRNA의 발현수준별 miRNA 데이터를 얻고, 상기 얻어진 발현수준별 miRNA 데이터를 표적예측 데이터베이스 및 RNA 레퍼런스 데이터베이스와 동시에 비교하여 공통된 결과물을 얻은 후에, 상기 공통된 결과물로부터 조절 miRNA ID를 검출하는 것으로 특징으로 하는 종양억제유전자 및 종양유전자를 제어하기 위한 조절 miRNA ID 검출방법 및 이를 유방암 바이오 마커에 적용하는 것이다.

나아가 본 발명은 조절 miRNA ID를 검출하여, 검출된 결과를 기초로 판독 가능한 프로그램으로 기록되는 기록매체 및 치료제에 적용할 수 있다.

본 발명은 1) 미지의 바이오 시료로부터 miRNA를 추출하는 제1단계; 2) 상기 제1단계에서 추출된 miRNA로부터 서열화된 miRNA의 발현수준별 miRNA 데이터를 얻는 제2단계; 3) 상기 제2단계에서 얻어진 발현수준별 miRNA 데이터로부터 miRNA의 발현수준이 5폴드 이상, 5폴드 미만부터 2.5폴드 이상, 2.5폴드 미만으로 서열화시키는 제3단계; 4) 상기 제3단계의 서열화된 miRNA 데이터에서 발현수준이 2.5폴드 미만이 제거된 값만으로 재정렬된 miRNA 데이터를 얻는 제4단계; 5) 상기 제4단계에서 얻어진 재정렬된 miRNA 데이터를 표적예측 데이터베이스 및 RNA 레퍼런스 데이터베이스와 동시에 비교하여 공통된 결과물을 얻는 제5단계; 6) 상기 제5단계에서 얻어진 공통된 결과물로부터 종양억제유전자 및 종양유전자를 제어하기 위한 조절 miRNA ID를 검출하는 제6단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양억제유전자 및 종양유전자를 제어하기 위한 조절 miRNA ID 검출방법을 제공한다.

한편, 본 발명에 의한 그 밖의 구체적인 과제의 해결수단은 발명의 상세한 설명에 기재되어 있다.

본 발명은 발현수준별 miRNA 데이터를 표적예측 데이터베이스 및 RNA 레퍼런스 데이터베이스와 동시에 비교하여 공통된 결과물을 얻은 후에, 상기 공통된 결과물로부터 조절 miRNA ID를 검출하는 것으로 이를 통해 암세포의 발현을 정확하게 예측할 수 있으며, 나아가 유방암 발현 miRNA 분석의 효율을 높일 수 있는 효과를 가진다.

또한 본 발명에 따른 조절 miRNA ID를 검출결과를 기초로 하여, 판독 가능한 프로그램으로 기록되는 기록매체 및 치료제를 제공할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 본 발명에 따른 조절 miRNA ID 결과를 얻는 흐름도이다.
도 2는 TCGA에 의해 다운로드된 유방암에 대한 로우 데이터이다.
도 3은 BRCA 1 및 BRCA 2에 관련된 miRNA 결과이다.
도 4는 Cyclin D1에 관련된 miRNA 결과이다.
도 5는 N-RAS에 관련된 miRAN 결과이다.
도 6은 FGF3, FGF4, HER2, c-Myc에 관련된 miRNA 결과이다.
도 7은 miRNA 클러스터링과 관련된 종양유전자이다.
도 8은 유방암의 종양유전자와 관련된 공통 miRNA의 클러스터링 결과이다.

이하, 본 발명의 조절 miRNA ID를 검출을 통하여, 얻어지는 유방암 바이오 마커에 대하여 바람직한 실시형태를 들어 자세하게 설명한다.

본 발명에 의한 조절 miRNA ID 검출방법은 1) 미지의 바이오 시료로부터 miRNA를 추출하는 제1단계; 2) 상기 제1단계에서 추출된 miRNA로부터 서열화된 miRNA의 발현수준별 miRNA 데이터를 얻는 제2단계; 3) 상기 제2단계에서 얻어진 발현수준별 miRNA 데이터로부터 miRNA의 발현수준이 5폴드 이상, 5폴드 미만부터 2.5폴드 이상, 2.5폴드 미만으로 서열화시키는 제3단계; 4) 상기 제3단계의 서열화된 miRNA 데이터에서 발현수준이 2.5폴드 미만이 제거된 값만으로 재정렬된 miRNA 데이터를 얻는 제4단계; 5) 상기 제4단계에서 얻어진 재정렬된 miRNA 데이터를 표적예측 데이터베이스 및 RNA 레퍼런스 데이터베이스와 동시에 비교하여 공통된 결과물을 얻는 제5단계; 6) 상기 제5단계에서 얻어진 공통된 결과물로부터 종양억제유전자 및 종양유전자를 제어하기 위한 조절 miRNA ID를 검출하는 제6단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양억제유전자 및 종양유전자를 제어하기 위한 것이다.

먼저, 상기 제1단계에 있어서, 미지의 바이오 시료는 신선한 또는 냉동된 암조직, 세포, 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 수득된 것일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 신선한 또는 냉동된 암조직의 암은 유방암, 대장암, 위암, 전립선암, 신장암, 간암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 이에 제한된 것은 아니나, 특히 유방암에 효과적이다.

또한 상기 바이오 시료로부터 미지의 miRNA를 포함하는 전체 RNA를 추출하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 트리졸 또는 트리톤 X-100을 이용하여 추출할 수 있다.

그리고 제5단계의 표적예측 데이터베이스는 당업계에서 다양하게 공개된 miRWalk, MicroT4, miRanda, miRBridge, miRDB, miRMap, miRNAMap, PICTAR2, PITA, RNA22, RNAhybrid, Targetscan 중에서 1종 이상을 선택하여 이용할 수 있으며, 이에 제한 된 것은 아니다.

또한 제5단계의 RNA 레퍼런스 데이터베이스는 당업계에서 다양하게 공개된 miRBase, ASRP, micro RNAMAP, miRGen, CoGemiR 중에서 1종 이상을 선택하여 이용할 수 있으며, 이에 제한된 것은 아니다.

나아가 본 발명으로 얻어진 조절 miRNA ID를 검출을 통하여 종양유전자 및 종양억제유전자를 파악할 수 있으며, 종양억제유전자는 BRCA1, BRCA2 등이 있고, 종양유전자는 HER2, CyclinD1, N-RAS, FGF3, FGF4, C-Myc등이 있다. 이들 중 1종 이상의 조합을 통하여 비교 분석할 수 있다. BRCA 유전자에는 BRCA1과 BRCA2가 있다. BRCA1 유전자는 17번 염색체에 있으며 BRCA2는 13번 염색체에 위치한다. BRCA 유전자는 DNA가 손상될 경우 다른 단백질과 반응해 이를 수리하는 역할을 한다. 따라서 BRCA 유전자가 정상 기능을 하지 못하면 DNA 수리에 문제가 발생해 암 발생 위험이 증가한다. 특히, 문제가 되는 것은 유전자 돌연변이(Gene Mutation)다. BRCA 유전자 돌연변이가 나타나면 유방암이나 난소암 발생위험이 급격히 커진다. 유전자 돌연변이란 DNA 염기 서열 변화로 인해 부모에게 없던 형질이 자손에게 나타나는 것이다.

유방암과 난소암의 발생 위험 정도는 BRCA 유전자 돌연변이에 따라 달라진다. BRCA1과 BRCA2 유전자 돌연변이를 모두 가진 여성의 유방암 발생 위험은 60~85% 정도다. 둘 중에서 BRCA1 유전자에 이상이 생기면 난소암 발생 위험이 커진다. BRCA2 유전자 변이는 난소암과의 연관성은 상대적으로 적지만, 췌장암이나 위암 등의 발생에 영향을 준다고 알려졌다.

HER2 나 cyclin D1에 관한 유전자연구는 하버드 의대 연구진에 의해서 초기 유방암 발달에 요구되는 두 가지의 유전적 신호를 발견하였다. 이들은 배양한 유방 조직에 HER2 나 cyclin D1 유전자를 도입하였으며 이에 따라 3차원적 모델에서 일어나는 효과를 추적하였다. HER2 나 cyclin D1 모두 유방 세포의 움푹 파인 곳으로의 증식을 촉진하였고, cyclin D 생산 조직은 증식하는 세포가 자가 세포 죽음에 의해 사멸하기 쉽기 때문에 움푹 파인 곳을 유지하였다. 대조적으로, HER2는 생존 신호항 죽음 신호, a survival(or anti-death) signal를 제공하여 세포로 하여금 움푹 파인 곳을 채우도록 하였다. 이렇게 채워진 구조는 초기 유방 종양의 병리 상태와 닮았다. 따라서 이번 연구는 초기 유방암 발달 단계에서 종양 세포가 증식할 뿐만 아니라 정상 세포 죽음도 극복해야 하는 기작으로 선 구조(glandular architecture)를 유지한다는 것을 보여 주었다.

N-RAS 유전자는 설치류 레트로바이러스의 바이러스암유전자(v-ras)로 동정된 유전자 중의 하나로 포유류의 세포유전자로서 c-H-ras1, c-K-ras2, N-ras의 3종류가 패밀리를 형성한다. 사람염색체 상에서는 각각 11p11.5, 12p12.1, 1p13에 존재하며 4개의 코딩엑손으로 구성되며 구아닌뉴클레오티드를 결합하여 세포막 내측에 편재하는 189개의 아미노산을 함유하는 21kDa의 단백질(p21)을 코드한다. K-ras유전자는 2종류의 엑손 4가 있으므로 ras유전자산물로서 K-Ras 4A, K-Ras 4B, H-Ras, N-Ras의 4종류가 존재한다.

FGF3, FGF4 유전자는 섬유 아세포 성장 인자패밀리의 일종으로 분열및 세포 생존 활동 및 배아 발달, 세포 성장을 포함한 생물학적 과정의 다양한 참여형태를 가지며, 조직 복구, 종양 성장 및 침윤이 되며, 유전자는 종양 형질 전환 활성에 의해 확인되었다., FGF4 유전자는 염색체 11 공동 증폭에 밀접하게 있는 인간 종양의 다양한 종류에서 발견되었다.

대부분의 암세포들에게서 c-Myc 암유전자(oncogene)의 과잉 발현이 관찰되며, 이에 따라 세포 주기의 조절이 불가능하게 된다. 정상적인 세포의 경우, c-Myc 유전자는 종양 억제 유전자인 p53 의존성 ARF 단백질에 의해서 주기적인 검사를 받게 된다. 최근 ARF가 c-Myc에 미치는 직접적인 영향이 새롭게 발견되었으며, 이를 통해서 c-Myc의 비정상적인 조절에 의해서 유발되는 암을 치료하기 위한 새로운 치료법 개발이 가능해질 것으로 여겨진다. P53 종양억제인자와의 상호작용과 함께, ARF는 c-Myc와 결합하여, c-Myc의 타깃 유전자 억제 기능이나 세포 자살을 유발하지 않고 c-Myc의 종양 억제 기능을 직접적으로 차단하는 역할이 발견되었다.

또한 본 발명에서 사용된 용어인 ‘발현’은 소정 핵산 또는 miRNA의 측정 가능한 발현 수준을 지칭한다. 핵산의 발현 수준은 당업계에서 잘 알려진 통계학적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 또한 폴드(fold)는 발현 변화값을 의미하며, 이는 당업계에서 잘 알려져 있다.

miRNA를 추출하여 서열화된 miRNA의 발현수준별 miRNA 데이터를 이용하여 조절 miRNA ID를 검출하기 위해서는 하기의 방법을 통해 실시할 수 있다.

(1) miRNA 서열 데이터는 미지의 시료에서 리드 카운트(read count)에 기초하여 컴퓨터화한 miRNA의 정량적인 발현 수준을 포함한다. 둘 이상의 샘플에서의 miRNA 발현 비교를 위해, 각각의 서열 분석 샘플에서의 발현 수준은 샘플에서 총 리드 수에 의해 정규화된다. RPM은 각 샘플에 대해 생산된 정규화 발현 수준의 값이다. 따라서 데이터에서의 miRNAs의 발현 수준을 필요로 하기 때문에 miRNA ID 및 RPM을 사용한다.

(2) 플랫폼은 오류를 포함하는 모든 시퀀스를 검출하기 때문에 이러한 일루미나(Illumina)의 게놈 분석기 플랫폼과 같은 단일-분자-기반 플랫폼은 일반적으로 고유의 높은 오류를 표시한다. 높은 오류율이 낮은 리드 카운트를 야기한다. miRNAs 발현 수준의 차이에 따라, 5 폴드 이상(RPM>5), 5폴드 미만에서 2.5 폴드 이상(5>RPM≥2.5), 2.5 폴드 미만(RPM<2.5)에서 miRNA IDs는 3 군으로 분류(sorting)하였다. 수집된 대량의 데이터에서 저 수준 발현(<2.5) 및/또는 변경 없는 miRNA IDs는 오류를 방지하기 위해 제거하였다.

(3) miRNA IDs 및 분자 표적의 상호작용을 조사하기 위해, miRNA-표적 예측 데이터베이스인 mirWalk, DIANA-microT, miranda, miRBridge, miRDB, miRmap, miRNA Map, PITA, RNA22 및 Targetscan에서 가능한 miRNA IDs는 다섯 개의 신뢰할 수 있는 D/B(miRWalk, miranda, miRDB, RNA22 및 TargetScan)를 통해 재확인되었다. 다섯 D/Bs에서 3 이상, SUM 값을 기준으로 한 조절 miRNA IDs를 선별 한다. 다섯 D/Bs를 비교하여 두 번 확인함으로써, 우리는 세 가지 사실을 얻을 수 있다. 우선 표적 유전자와 조절 miRNA IDs 사이의 상관관계였다. 두 번째 것은 특정 유전자에 속하는 예측된 miRNAs 신뢰성이었다. 마지막 것은 의미가 없는 조절 miRNA IDs의 완전한 제거를 통해 추출된 조절 miRNA IDs의 정확도를 높였다.

(4) 각 표적 유전자는 5 폴드 이상(RPM>5), 5폴드 미만에서 2.5폴드 이상(5 >RPM≥2.5) 및 2.5 폴드 미만으로 표시된 복수의 조절 miRNA IDs를 갖는다. 추출된 miRNAs는 타겟 유전자를 통해 유방암 발생을 촉진할 수 있는 종양 miRNAs가 있는 것으로 추측되었다. 각 조절 miRNA ID 데이터는 유방암 예방에 효과적이고 새로운 타겟이 될 수 있는 공통적인 것을 선별하기 위하여 클러스터링 한다.

나아가 본 발명은 조절 miRNA ID를 검출하여, 검출된 결과를 기초로 판독 가능한 프로그램으로 기록되는 기록매체를 제조할 수 있고, 치료제 또는 바이오 마커에 이용될 수 있다.

아래의 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 아래의 실시예에 한정된 것은 아니다.

<실험예 1> 냉동된 유방암조직의 RNA 추출방법

냉동된 유방암조직의 바이오 시료를 준비하고, 준비된 바이오 시료로부터 트리아졸을 이용하여 RNA를 추출한다. 추출방법은 바이오시료 50~100mg을 잘게 부수고 나서, 트리아졸 1ml에 넣은 후, 클로로포름 0.2ml를 첨가하여 실온에서 3분간 방치하고, 12000rpm에서 15분 동안 원심분리한다. 상층액을 새 튜브에 옮긴 후에 이소프로필알콜 0.5ml를 가하여 10분간 방치한다. 다시 12000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 버리고, RNA 펠렛을 DEPC 처리한 75% 에탄올 1ml를 가하고 테이핑한 후 12000rpm에서 5분간 원심분리하여 다시 상등액을 버리고, 나머지 RNA 펠렛을 10분간 실온 건조한다.

<실험예 2> 체세포의 RNA 추출방법

체세포 바이오 시료를 준비하고, 준비된 바이오 시료로부터 트리아졸을 이용하여 RNA를 추출한다. 추출방법은 실험예 1과 같다.

<실험예 3> 생체세포의 RNA 추출방법

생체세포 시료를 준비하고, 준비된 생체세포 시료로부터 트리아졸을 이용하여 RNA를 추출한다. 추출방법은 생체세포시료 50~100mg을 잘게 부수는 점만 다를 뿐이고, 나머지 공정은 실험예 1과 같다.

실험예 1에서 제조된 RNA 펠렛을 이용하고, 공지의 전기영동시스템을 통하여 RNA의 염기서열을 파악한다. 도 1에서 나타낸 바와 같이, 조절 miRNA ID 결과를 얻는 흐름도에 따라서 실시하였다. 파악된 염기서열을 통해 발현 수준의 차이에 따라 5폴드 이상, 5폴드 미만부터 2.5폴드 이상, 2.5폴드 미만의 3개 그룹으로 나누고, 이들 중 발현수준이 2.5폴드 미만인 그룹을 제거하였다. 그리고 나머지 그룹인 서열화된 miRNA의 발현수준이 5폴드 이상, 5폴드 미만부터 2.5폴드 이상으로 된 그룹을 표적예측 데이터베이스인 mirWalK, DIANA-microT, miranda, miRBridge, MiRDB, Mirmap, miRNA Map, PITA, RNA22, Targetscan; 및 레퍼런스 데이터 베이스인 miRBase, ASRP, micro RNAMAP, miRGen, CoGemiR와 동시에 비교하여 공통된 결과를 얻는다. 얻어진 결과로부터 miRNA ID를 얻는다.

실험예 2로부터 제조된 RNA 펠렛을 이용하고, 공지의 전기영동시스템을 통하여 RNA의 염기서열을 파악한다.

도 1에서 나타낸 바와 같이, 조절 miRNA ID 결과를 얻는 흐름도에 따라서 실시하였고, miRNA ID를 얻는 방법은 실시예 1과 같다.

실험예 3으로부터 제조된 RNA펠렛을 이용하여 공지의 전기영동시스템을 통하여 RNA의 염기서열을 파악한다. 도 1에서 나타낸 바와 같이, 조절 mRNA ID 결과를 얻는 흐름도에 따라서 실시하였고, miRNA ID를 얻는 방법은 실시예 1과 같다.

별첨 도 2는 TCGA에 의해 다운로드된 유방암에 대한 로우 데이터로서, 종양 유전자와 관련하여 예측된 miRNA 목록은 발현수준(도 3 내지 6)에 따라 분류된다.

도 3은 BRCA 1/2를 조절할 수 있는 추정 miRNA 목록에 관한 것이며, BRCA1은 5폴드 이상(≥5)의 miRNA는 전체의 11%를 점유하고[52 miRNAs], 다음에 2.5폴드 이상(> 2.5)이 1.5%[7 miRNAs]를 가진다.

도 4는 miRNAs을 조절하는 Cyclin D1는 5폴드 이상(≥5)의 miRNAs는 전체의 18%를 점유하고[83 miRNAs], 다음에 2.5 폴드 이상(> 2.5)이 2%를 점유하였다[9 miRNAs]고 있다.

도 5는 miRNAs를 조절하는 종양 유전자 N-RAS와 관련한 것으로 5폴드 이상(≥5)의 miRNAs는 전체의 23%[102 miRNAs]을 점유하였고, 2.5폴드 이상(> 2.5)이 2.9%[13 miRNAs]을 점유하였다.

도 6은 miRNA를 조절하는 종양유전자로 FGF3, FGF4, HER2, c-Myc에 관한 인데, FGF3는 5폴드 이상(≥5)의 miRNA는 전체의 0.4%를 점유하고[2 miRNAs], 다음에 2.5폴드 이상(> 2.5)이 0.2%를 점유하였다[1 miRNA]. FGF4의 경우, 5폴드 이상(≥5)의 miRNAs는 0.4%[2 miRNAs]을 점유하였고, 다음 2.5폴드 이상(> 2.5)이 0.2%[1 miRNA]을 점유하였다. HER2의 경우, 5폴드 이상(≥5)의 miRNAs는 2.9%[13 miRNAs]를 점유하고, 다음 2.5폴드 이상(> 2.5)이 0.4%[2 miRNA]를 점유했다. C-Myc의 경우, 0.2% miRNAs는 5폴드 이상(≥5)이었다.

도 7은 miRNA 클러스터링된 결과에 관한 것으로, 8개의 종양유전자를 모두 타겟팅하는 보편적인 miRNA는 없었다. 도 8은 유방암의 종양유전자와 관련된 공통 miRNA의 클러스터링 결과이다. 그러나 도 7 및 도 8에 따르면, 8개의 종양유전자 중에서 중복된 공통 miRNAs의 결과인 28 miRNAs 중 23miRNAs는 3개, 4miRNAs는 4개, 1miRNAs는 5개의 종양유전자 타겟을 각각 조절한 것으로 나타났다.

let-7C는 5폴드 이상이 점유하였던 miRNA 중에서 5개의 종양유전자(BRCA1, BRCA2, HER2, N-RAS 및 Cyclin D1)를 제어한다. 5폴드 이상(≥5)에서 로 데이터 4 miRNAs인 let-7g, miR-186, miR-589 및 miR-224는 4개의 종양 유전자 타겟 중에서 공통적으로 조절하였다. 21 miRNAs(let-7B, let-7E, let-7i, miR-30D, miR-93, miR-205, miR-106b, miR-146b, miR-424, miR-17, miR-20a, miR-146a, miR-20b, miR-769, miR-26a-1, miR-106a, miR-625, miR-98, miR-19a, miR-3613 및 miR-361)는 3개의 종양 유전자 타겟 중에서 공통적으로 조절하였다. 도 7에서 나타낸 바와 같이, 2.5폴드 이상(> 2.5) 로 데이터 miR-651은 3개의 종양유전자(BRCA1, BRCA2 및 Cyclin D1)를 타겟팅하여 반복되었다. miR-1468은 또한 3개의 종양유전자(BRCA1, N-RAS 및 C-Myc)를 반복했다.

이상 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세하게 설명하였

다. 상기 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 하는 예시적인 것일 뿐이고, 이에 의해 본 발명의 기술적 사상의 본질이 변하거나 범위가 축소되는 것은 아니다. 상기 실시예에서 제시되지 않은 여러 가지 실시예 및 적용예들이 가능함은 당업자에게 있어 당연할 것이다.

Claims (14)

1) 미지의 바이오 시료인 신선한 또는 냉동된 유방암조직, 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 수득되는 것에서 miRNA를 추출하는 제1단계;
2) 상기 제1단계에서 추출된 miRNA로부터 서열화된 miRNA의 발현수준별 miRNA 데이터를 얻는 제2단계;
3) 상기 제2단계에서 얻어진 발현수준별 miRNA 데이터로부터 miRNA의 발현수준이 5폴드 이상, 5폴드 미만부터 2.5폴드 이상, 2.5폴드 미만으로 서열화시키는 제3단계;
4) 상기 제3단계의 서열화된 miRNA 데이터에서 발현수준이 2.5폴드 미만이 제거된 값만으로 재정렬된 miRNA 데이터를 얻는 제4단계;
5) 상기 제4단계에서 얻어진 재정렬된 miRNA 데이터를 mirWalk, DIANA-microT, miranda, miRBridge, miRDB, miRmap, miRNA Map, PITA, RNA22, Targetscan인 표적예측 데이터베이스 및 miRBase, ASRP, micro RNAMAP, miRGen, CoGemiR인 RNA 레퍼런스 데이터베이스와 동시에 비교하여 공통된 결과물을 얻는 제5단계;
6) 상기 제5단계에서 얻어진 공통된 결과물로부터 BRCA1, BRCA2 중 어느 하나 이상의 종양억제유전자 및 FGF3, FGF4, HER2, c-Myc, Cyclin D1, N-RAS 중 어느 하나 이상의 종양유전자를 제어하기 위한 조절 miRNA ID를 검출하는 제6단계;를 포함하되,
상기 종양억제유전자인 BRCA1, BRCA2, 종양유전자인 HER2, Cyclin D1, N-RAS의 5개 모두를 제어하는 조절 miRNA ID가 let-7c인 것을 특징으로 하는 종양억제유전자 및 종양유전자를 제어하기 위한 조절 miRNA ID 검출방법.

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제1항에 있어서,
상기 제6단계에서 검출되는 miRNA ID는 종양억제유전자 및 종양유전자 중 4개를 제어할 수 있는 것으로, 상기 miRNA ID는 let-7g, miR-224, miR-186 및 miR-589이되,
상기 let-7g 및 miR-224는 BRCA1, BRCA2, Cyclin D1 및 N-RAS를 제어하고,
상기 miR-186은 BRCA1, Cyclin D1, N-RAS 및 c-Myc을 제어하며,
상기 miR-589는 BRCA1, Cyclin D1, N-RAS 및 FGF3를 제어하는 것을 특징으로 하는 종양억제유전자 및 종양유전자를 제어하기 위한 조절 miRNA ID 검출방법.

제1항에 있어서,
상기 제6단계에서 검출되는 miRNA ID는 종양억제유전자 및 종양유전자 중 3개를 제어할 수 있는 것으로, 상기 miRNA ID는 miR-651, miR-1468, miR-30d, miR-93,
miR-205, miR-106b, miR-146b, miR-424, miR-17, miR-20a, miR-146a, miR-20b, miR-769, miR-26a-1, miR-106a, let-7b, let-7e, let-7i, miR-625, miR-98, miR-19a, miR-3613 및 miR-361이되,
상기 miR-651은 BRCA1, BRCA2 및 Cyclin D1을 제어하며,
상기 miR-1468은 BRCA1, N-RAS 및 c-Myc을 제어하고,
상기 miR-30d는 BRCA1, HER2 및 N-RAS을 제어하고,
상기 miR-93, miR-106b, miR-424, miR-17, miR-20a, miR-20b, miR-26a-1, miR-106a는 각각 BRCA1, N-RAS 및 Cyclin D1을 제어하고,
상기 miR-205, miR-146b, miR-146a는 각각 BRCA1, BRCA2 및 N-RAS을 제어하며,
상기 miR-769는 BRCA1, BRCA2 및 Cyclin D1을 제어하고,
상기 let-7b, let-7e, let-7i, miR-625, miR-98, miR-19a는 각각 BRCA2, N-RAS 및 Cyclin D1을 제어하며,
상기 miR-3613은 HER2, N-RAS 및 Cyclin D1을 제어하고,
상기 miR-361은 N-RAS, Cyclin D1 및 FGF4를 제어하는 것을 특징으로 하는 종양억제유전자 및 종양유전자를 제어하기 위한 조절 miRNA ID 검출방법.

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