CN110229890A - 红细胞microRNA在耐缺氧能力或高原病诊断中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种红细胞microRNA或检测红细胞microRNA的产品在耐缺氧能力或高原病诊断中的应用,所述的microRNA选自miR‑144‑5p、miR‑30b‑5p、miR‑423‑5p、miR‑16‑2‑3p、miR‑3200‑5p、miR‑4732‑5p、miR‑200c‑3p、miR‑125a‑5p、miR‑195‑5p或miR‑141‑3p中的一种或几种。
Description
技术领域
本发明涉及医疗诊断领域,具体涉及一种检测红细胞microRNA的产品,及红细胞microRNA或检测红细胞microRNA的产品在检测生命体耐缺氧能力或制备诊断高原病的产品中的应用。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,他们在动植物中参与转录后基因表达调控。到目前为止,在动植物以及病毒中已经发现有28645个miRNA分子,大多数miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇的形式存在于基因组中。
目前,文献Influence of A High-Altitude Hypoxic Environment on HumanPlasma miRNA(Sci.Rep.5,15156.doi:10.1038/srep15156)、文献Elevation ofCirculating miR-210-3p in High-Altitude Hypoxic Environment(Front.Physiol.7,84.doi:10.3389/fphys.2016.00084)和文献A Signature of Circulating microRNAsPredicts the Susceptibility of Acute Mountain Sickness(Front.Physiol.8,55.doi:10.3389/fphys.2017.00055)均有报道高海拔低氧环境下,人体循环血液中miRNA的水平情况。
文献Genetic Evidence for High-Altitude Adaptation in Tibet(Science.329,72-75.doi:10.1126/science.1189406)统计表明在高海拔低氧环境下,汉族移民者的红细胞数量显著上升,并且文献The Genomic Analysis of ErythrocytemiRNA Expression in Sickle Cell Disease(Plos One.3,e2360.doi:10.1371/journal.pone.0002360)、文献Differential Profiling of Human Red Blood CellsDuring Storage for 52Selected miRNAs(Transfusion.50,1581-1588.doi:10.1111/j.1537-2995.2010.02585.x)和文献Novel Approach to Fecal Occult Blood Testingby Assay of Erythrocytes-Specific microRNA Markers(Dig.Dis.Sci.62,1985-1994.doi:10.1007/s10620-017-4627-6)更是公开了在成熟的红细胞中miRNA含量丰富。然而,在高海拔低氧环境下,红细胞内的miRNA的水平仍然不清楚。
高海拔低氧环境对人红细胞的生理指标具有显著影响。文献Hemoglobin Levelsin Qinghai-Tibet:Different Effects of Gender for Tibetans vs.Han(J.Appl.Physiol.98,598-604.doi:10.1152/japplphysiol.01034.2002)、文献Hematological Parameters in High Altitude Residents Living at 4,355,4,660,and5,500Meters Above Sea Level(High.Alt.Med.Biol.1,97-104.doi:10.1089/15270290050074233)和文献Genetic Evidence for High-Altitude Adaptation inTibet(Science.329,72-75.doi:10.1126/science.1189406)报道,与当地的藏族人、低海拔地区人相比,十年前移民到西藏的汉族人红细胞(Red Blood Cell,RBC)、血红蛋白(Hemoglobin,HGB)和红细胞压积(Hematocrit,HCT)的水平显著升高。虽然,RBC、HGB和HCT水平的合理上升是机体应对低氧环境的有益调节,但是过分升高会增加血液黏度、加重组织细胞缺氧,并且导致高原病。因此,对于红细胞的调节机制还需要进一步的详细查明,已报道,miRNA是调控红细胞生成的关键因子。文献Infected Erythrocyte-derivedExtracellular Vesicles Alter Vascular Function Via Regulatory Ago2-miRNAComplexes in Malaria(Nat.Commun.7:12727.doi:10.1038/ncomms12727)、文献RedBlood Cells Release Microparticles Containing Human Argonaute 2and miRNAs toTarget Genes of Plasmodium Falciparum(Emerg.Microbes.Infect.6,e75.doi:10.1038/emi.2017.63)和文献Cell-cell Communication Between Malaria-infectedRed Blood Cells Via Exosome-like Vesicles(Cell.153,1120-1133.doi:10.1016/j.cell.2013.04.029)证实了红细胞之间通过携带miRNA的胞外囊泡进行信息交流。
本发明人通过创造性劳动,惊奇的发现,红细胞内的miRNA对高海拔低氧环境下产生的缺氧症状起到十分显著的作用。
发明内容
本发明提供了一种检测红细胞microRNA的产品,所述的microRNA选自miR-144-5p、miR-30b-5p、miR-423-5p、miR-16-2-3p、miR-3200-5p、miR-4732-5p、miR-200c-3p、miR-125a-5p、miR-195-5p或miR-141-3p中的一种或几种。
优选的,所述的microRNA为miR-144-5p和/或miR-30b-5p。
本发明所述的检测红细胞microRNA的产品为检测microRNA的存在或水平的产品。
本发明所述的产品选自探针组、引物组、试剂盒或基因芯片。优选的,所述的基因芯片包括检测红细胞microRNA的探针组和/或引物组。进一步优选的,所述的试剂盒包括检测红细胞microRNA的探针组和/或引物组和/或基因芯片。
本发明所述的引物组中,各引物通过本领域常规的方法涉及并合成,例如,使用Primer5.0软件设计引物。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的引物组包括引物如下(1)-(10)中的一种或几种:(1)miR-144-5p的引物;(2)miR-30b-5p的引物;(3)miR-423-5p的引物;(4)miR-16-2-3p的引物;(5)miR-3200-5p的引物;(6)miR-4732-5p的引物;(7)miR-200c-3p的引物;(8)miR-125a-5p的引物;(9)miR-195-5p的引物;(10)miR-141-3p的引物。
本发明所述的试剂盒包括引物组;优选的,所述的试剂盒还包括杂交液和/或缓冲液和/或洗涤液。进一步优选的,所述试剂盒还包括富集缓冲液、杂交缓冲液、结合缓冲液、漂洗液、NaOH溶液、Tris-HCl缓冲液、PCR反应液和/或TE缓冲液。
本发明所述的miR-144-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示:
GGATATCATCATATACTGTAAG(SEQ ID NO:1)
本发明所述的miR-30b-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示:
TGTAAACATCCTACACTCAGCT(SEQ ID NO:2)
本发明所述的miR-423-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示:
TGAGGGGCAGAGAGCGAGACT(SEQ ID NO:3)
本发明所述的miR-16-2-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示:
ACCAATATTACTGTGCTGCT(SEQ ID NO:4)
本发明所述的miR-3200-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示:
AATCTGAGAAGGCGCACAAGGT(SEQ ID NO:5)
本发明所述的miR-4732-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示:
TGTAGAGCAGGGAGCAGGAAGCT(SEQ ID NO:6)
本发明所述的miR-200c-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示:
TAATACTGCCGGGTAATGATGGA(SEQ ID NO:7)
本发明所述的miR-125a-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示:
TCCCTGAGACCCTTTAACCTGT(SEQ ID NO:8)
本发明所述的miR-195-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示:
TAGCAGCACATAAATATTGGC(SEQ ID NO:9)
本发明所述的miR-141-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示:
TAACACTGTCTGGTAAAGATG(SEQ ID NO:10)
本发明还提供了红细胞microRNA在检测生命体耐缺氧能力中的应用,其中,所述的microRNA选自miR-144-5p、miR-30b-5p、miR-423-5p、miR-16-2-3p、miR-3200-5p、miR-4732-5p、miR-200c-3p、miR-125a-5p、miR-195-5p或miR-141-3p中的一种或几种。
优选的,所述的microRNA为miR-144-5p和/或miR-30b-5p。
优选的,所述的产品为检测microRNA的存在或水平的产品。
本发明还提供了红细胞microRNA在制备检测生命体耐缺氧能力的产品中的应用,其中,所述的microRNA选自miR-144-5p、miR-30b-5p、miR-423-5p、miR-16-2-3p、miR-3200-5p、miR-4732-5p、miR-200c-3p、miR-125a-5p、miR-195-5p或miR-141-3p中的一种或几种。
优选的,所述的microRNA为miR-144-5p和/或miR-30b-5p。
优选的,所述的产品为检测microRNA的存在或水平的产品。
本发明还提供了一种上述的检测红细胞microRNA的产品在检测生命体耐缺氧能力中的应用,其中,所述的microRNA选自miR-144-5p、miR-30b-5p、miR-423-5p、miR-16-2-3p、miR-3200-5p、miR-4732-5p、miR-200c-3p、miR-125a-5p、miR-195-5p或miR-141-3p中的一种或几种。
优选的,所述的microRNA为miR-144-5p和/或miR-30b-5p。
优选的,所述的产品为检测microRNA的存在或水平的产品。
本发明进一步提供了红细胞microRNA在制备诊断生命体高原病的产品中的应用,其中,所述的microRNA选自miR-144-5p、miR-30b-5p、miR-423-5p、miR-16-2-3p、miR-3200-5p、miR-4732-5p、miR-200c-3p、miR-125a-5p、miR-195-5p或miR-141-3p中的一种或几种。
优选的,所述的microRNA为miR-144-5p和/或miR-30b-5p。
优选的,所述的产品为检测microRNA的存在或水平的产品。
本发明进一步提供了一种上述的检测红细胞microRNA的产品在制备筛选治疗和/或预防高原病药物中的应用,其中,所述的microRNA选自miR-144-5p、miR-30b-5p、miR-423-5p、miR-16-2-3p、miR-3200-5p、miR-4732-5p、miR-200c-3p、miR-125a-5p、miR-195-5p或miR-141-3p中的一种或几种。
优选的,所述的microRNA为miR-144-5p和/或miR-30b-5p。
优选的,所述的产品为检测microRNA的存在或水平的产品。
优选的,所述的高原病选自在高原环境下产生的急性高原病和慢性高原病。进一步优选的,所述的高原环境为海拔2000m以上、2500以上或4500m以上,具有低压、缺氧的条件。
本发明所述的高原病选自高原心脏病、高原抑郁症、高原红细胞增多症、高原血压异常、高原肺水肿、高原脑水肿、高原昏迷、高原肺型和脑型混合症状的疾病或高原心脏病与红细胞增多症混合症状的疾病。优选的,高原血压异常选自高原高血压、高原低血压或低脉压。
本发明所述的应用可以为治疗或诊断目的,或本发明所述的应用为非治疗或诊断目的。
本发明更进一步提供了一种检测红细胞microRNA的存在或水平的方法,所述的microRNA选自miR-144-5p、miR-30b-5p、miR-423-5p、miR-16-2-3p、miR-3200-5p、miR-4732-5p、miR-200c-3p、miR-125a-5p、miR-195-5p或miR-141-3p中的一种或几种。
优选的,所述的microRNA为miR-144-5p和/或miR-30b-5p。
本发明所述的方法包括RNA提取和microRNA的序列分析;优选的,所述的序列分析为测序、比对。进一步优选的,还包括实时定量PCR(Real time quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)扩增步骤用于验证结果。
本发明的另一所述的方法包括采用实时定量PCR扩增的步骤。
本发明术语“受试者”包括哺乳动物,优选为灵长类动物,特别优选为人类。
本发明术语“诊断”是指以查明患者过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症,或者是查明疾病的进展或将来可能的进展,或者是评估患者对治疗的反应。
本发明术语“和/或”包括择一列出的项目以及任何数量的项目组合。
本发明术语“包括”是开放式的描述,含有所描述的指定成分或步骤,以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。
本发明术语“PCR”是指聚合酶链式反应,检测RNA或DNA序列的指数扩增的方法。
本发明术语“实时定量PCR”是指实时定量聚合酶链式反应,基于PCR技术,用于扩增且同时定量RNA或DNA分子。
本发明术语“检测microRNA存在”是指在本领域通常允许的误差范围内检测样品中microRNA的有无。
本发明术语“检测microRNA水平”是指本领域通常允许的误差范围内检测样品中microRNA的含量或浓度。
本发明的术语“microRNA”包括pri-miRNA、pre-miRNA、成熟miRNA及其片段或变体中的一种或几种,例如“miR-144-5p、miR-30b-5p、miR-423-5p、miR-16-2-3p、miR-3200-5p、miR-4732-5p、miR-200c-3p、miR-125a-5p、miR-195-5p或miR-141-3p”包括各自的pri-miRNA、pre-miRNA、成熟miRNA及其片段或变体中的一种或几种。
附图说明
以下,结合附图来详细说明本发明的实施例,其中:
图1:各血液学参数水平的检测结果,其中,图1A-F分别为各组样品RBC、HGB、HCT、MCHC、MCV、MCH的水平。
图2:红细胞miRNA序列分析,其中,图2A为四川组、汉藏组和西藏组之间miRNA表达的交叠的矢量图;图2B为汉藏组和四川组之间红细胞miRNA表达的比较情况;图2C为西藏组和四川组之间红细胞miRNA表达的比较情况;图2D为西藏组和汉藏组之间红细胞miRNA表达的比较情况。
图3:实时定量PCR证实miRNA序列分析结果;miR-144-5p(图3A)和miR-30b-5p(图3B)的Cq值转化为相对浓度。
图4:红细胞miRNA靶向的基因与耐缺氧或高海拔环境的相关性分析;
图5:红细胞miRNA靶向的基因与耐缺氧或高海拔环境的相关性分析;
图6:红细胞miRNA靶向的基因与耐缺氧或高海拔环境的相关性分析;
图7:红细胞miRNA靶向的基因与耐缺氧或高海拔环境的相关性分析。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明的部分实施例,而不是全部。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
一、实验步骤
1、红细胞样本收集
采集42份血液样品,其中,20份血样来自居住在海拔500m的成都(四川)的汉族居民(四川组),10份血样来自从平原移民到海拔3658m的拉萨(西藏)15年的汉族居民(汉藏组),12份为居住在海拔3658m的拉萨的本土西藏居民(西藏组)。所有的受试者均为健康男性,且,四川组中受试者平均年龄为24.3±4.6,汉藏组中受试者平均年龄为40.1±6.8,西藏组中受试者平均年龄为34.5±12.3,并经过书面的知情同意。同时,该研究协议经中国伦理委员会批准。
样品保存:将42份血液样品储存在含有EDTA的采血管中,含量4mL。
样品处理:将每个血液样品在2500rpm下离心5min,去除血浆、白细胞和血小板,获得成熟的红细胞。过滤成熟的红细胞,用PBS进行清洗3次,获得纯化的成熟的红细胞。用血液分析仪(BC2800,迈瑞公司,中国)评估纯化的成熟红细胞中残留的血小板(PLT)和白细胞(WBC)的量均为0/L。通过FACS检测分析纯化红细胞中CD235a(红细胞标志物)、CD45(白细胞标志物)、CD41a(血小板标志物)的阳性率,其比值分别为98.1%、0.35%、0.1%。
2、RNA提取和microRNA序列分析
采用试剂盒(英杰公司,CA,美国),按照标准步骤,从每个血液样品(100μL纯化的成熟的红细胞)中提取总RNA。用RNA 6000Nano Lab的芯片和生物分析仪2100(安捷伦科技公司,CA,美国)测定总RNA的含量和纯度。每个样本取1μg总RNA建立RNA库(TruSeq SmallRNA Sample Prep Kit protocol(Illumina,CA,美国))和执行单端测序(Illumina HiSeq2500)。
二、检测参数
采用BC-2800分析仪(迈瑞公司,中国)检测的参数包括:红细胞(RBC)计数、血红蛋白浓度(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)。
三、数据分析
所有的数据分析均使用GraphPad Prism(版本5.0)。组间各变量的差异采用单向方差分析和T检验,其中p<0.05被认为具有统计学意义。
四、结果
1、血液学参数检测结果
图1为各血液学参数水平的检测结果,其中,图1A-F分别为各组样品RBC、HGB、HCT、MCHC、MCV、MCH的水平。如图1A-D所示,RBC、HGB、HCT、MCHC的水平中,汉藏族的水平是明显高于四川组,且差异具有显著性。然而,与汉藏族相比,西藏组的RBC、HGB、HCT的值是较低的。如图1E-F所示,四川组和汉藏组的MCV、MCH的水平没有显著差异。
2、红细胞miRNA序列分析
在汉藏组和四川组之间,miRNA的表达是不同的。在不同表达水平中,表达最高的前十位分别为miR-144-5p、miR-30b-5p、miR-423-5p、miR-16-2-3p、miR-3200-5p、miR-4732-5p、miR-200c-3p、miR-125a-5p、miR-195-5p和miR-141-3p(见表1),其中汉藏组和四川组之间的p值小于0.05。
表1表达最高的前十种miRNA的表达量
采用miRNA序列分析表明,如图2所示,与四川组相比,汉藏组和西藏组除红细胞miRNA的交叠显著不同之外,其表达量也不同。图2B显示,汉藏组与四川组相比,49个红细胞miRNA表达不同,其中17个为上调,32个为下调。图2C显示,西藏组与四川组相比,33个红细胞miRNA表达不同,其中12个为上调,21个为下调。图2D显示,西藏组与汉藏组相比,40个红细胞miRNA表达不同,其中15个为上调,25个为下调。
实施例2实时定量PCR验证实验
1、实验步骤
将提取的总RNA(1μg)进行反转录,制备cDNA(采用Synthesis Kit(天根,中国));用实时定量PCR扩增miRNA中水平最高的miR-144-5p和miR-30b-5p进行验证(试剂:SYBRGreen reagent(天根,中国)),U6被用来作为参照物miRNA。
2、用实时定量PCR证实miRNA序列分析结果
选择miR-144-5p和miR-30b-5p,对每组组随机选择的5个红细胞样本进行实时定量PCR检测,结果见图3所示,其与测序结果一致。
实施例3受高海拔低氧环境影响的红细胞miRNA的功能预测分析
通过生物信息学预测miR-144-5p和miR-30b-5p靶向的基因,预测算法选择TargetScan50和miRanda 3.3a。如图4、5所示,基于GO和KEGG途径分析,miR-144-5p的靶向基因与“ATP酶活性”和“钙信号通路”关系密切。如图6、7所示,miR-30b-5p靶向的基因功能分析显示,大部分基因涉及“蛋白质结合”和“肌动蛋白骨架调节”。表2显示了miR-144-5p和miR-30b-5p靶向的基因中与缺氧相关的、与红细胞相关的或一氧化氮相关的基因列表。图4-7和表2均印证了miR-144-5p和miR-30b-5p可以检测生命体的耐缺氧能力,参与适应高海拔低氧环境。经验证,本发明所述的其他标志物miR-423-5p、miR-16-2-3p、miR-3200-5p、miR-4732-5p、miR-200c-3p、miR-125a-5p、miR-195-5p或miR-141-3p也可作为检测生命体耐缺氧能力的标志物,并参与适应高海拔低氧环境。
表2miR-144-5p和miR-30b-5p的靶向基因预测
以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于上述实施方式中的具体细节,在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
序列表
<110> 中国人民解放军总医院
<120> 红细胞microRNA在耐缺氧能力或高原病诊断中的应用
<130> 1
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人(human)
<400> 1
ggatatcatc atatactgta ag 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人(human)
<400> 2
tgtaaacatc ctacactcag ct 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人(human)
<400> 3
tgaggggcag agagcgagac t 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人(human)
<400> 4
accaatatta ctgtgctgct 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人(human)
<400> 5
aatctgagaa ggcgcacaag gt 22
<210> 6
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人(human)
<400> 6
tgtagagcag ggagcaggaa gct 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人(human)
<400> 7
taatactgcc gggtaatgat gga 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人(human)
<400> 8
tccctgagac cctttaacct gt 22
<210> 9
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人(human)
<400> 9
tagcagcaca taaatattgg c 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人(human)
<400> 10
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Claims (10)
1.红细胞microRNA在检测生命体耐缺氧能力中的应用,其中,所述的microRNA选自miR-144-5p、miR-30b-5p、miR-423-5p、miR-16-2-3p、miR-3200-5p、miR-4732-5p、miR-200c-3p、miR-125a-5p、miR-195-5p或miR-141-3p中的一种或几种。
2.一种检测红细胞microRNA的产品在检测生命体耐缺氧能力中的应用,其中,所述的microRNA选自miR-144-5p、miR-30b-5p、miR-423-5p、miR-16-2-3p、miR-3200-5p、miR-4732-5p、miR-200c-3p、miR-125a-5p、miR-195-5p或miR-141-3p中的一种或几种。
3.红细胞microRNA在制备诊断生命体高原病的产品中的应用,其中,所述的microRNA选自miR-144-5p、miR-30b-5p、miR-423-5p、miR-16-2-3p、miR-3200-5p、miR-4732-5p、miR-200c-3p、miR-125a-5p、miR-195-5p或miR-141-3p中的一种或几种。
4.一种检测红细胞microRNA的产品在制备筛选治疗和/或预防高原病药物中的应用,其中,所述的microRNA选自miR-144-5p、miR-30b-5p、miR-423-5p、miR-16-2-3p、miR-3200-5p、miR-4732-5p、miR-200c-3p、miR-125a-5p、miR-195-5p或miR-141-3p中的一种或几种。
5.根据权利要求1-4任一所述的应用,其特征在于,所述的microRNA为miR-144-5p和/或miR-30b-5p。
6.根据权利要求2-4任一所述的应用,其特征在于,所述的产品选自探针组、引物组、试剂盒或基因芯片。
7.根据权利要求2-4任一所述的应用,其特征在于,所述的产品为检测microRNA的存在或水平的产品。
8.根据权利要求3或4所述的应用,其特征在于,所述的高原病选自高原心脏病、高原抑郁症、高原红细胞增多症、高原血压异常、高原肺水肿、高原脑水肿、高原昏迷、高原肺型和脑型混合症状的疾病或高原心脏病与红细胞增多症混合症状的疾病。
9.一种检测红细胞microRNA的存在或水平的方法,其特征在于,所述的microRNA选自miR-144-5p、miR-30b-5p、miR-423-5p、miR-16-2-3p、miR-3200-5p、miR-4732-5p、miR-200c-3p、miR-125a-5p、miR-195-5p或miR-141-3p中的一种或几种。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述的方法包括RNA提取和microRNA的序列分析;和/或所述的方法包括采用实时定量PCR扩增的步骤。
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