CN104294370B - 一种用单条染色体构建文库方法 - Google Patents
一种用单条染色体构建文库方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种用单条染色体构建文库方法，本发明采用分轮扩增的办法，消除了PCR随机偏向性问题；内切酶可选余地大，灵活，粘性末端连接效率高；使用人为设计的接头作特异引物，可用较高的退火温度，消除了非特异性扩增问题，采用超声随机打断后，通过加A反映，然后加接头的做法，属于本发明的扩展，与高通量测序技术相结合进行物种的基因组从头测序，将消除基因组测序中多染色体高杂合度不能正确组装和染色间组装错误问题，为基因组测序开辟广阔的前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种用单条染色体构建基因组文库的方法，尤其涉及一种用单条染色体构建文库方法。
背景技术
基因组序列信息是了解物种遗传信息的最基本、最全面、最重要的途径。随着新一代测序技术或称为高通量测序技术的出现，不少物种的全基因组测序已经完成，为这些物种基因资源的开发利用提供了便利，也为其他物种的基因组测序提供了有益的参照。如今，高通量测序技术成本不断下降，越来越多的物种可望用高通量测序技术实现全基因组从头测序。然而，由于目前常用的高通量测序技术的读长短，基因组的正确组装仍是巨大的挑战，尤其是杂合度高的植物只能得到基因组框架图而非精细图。解决基因组测序杂合度问题的最佳途径是单染色体测序。如果能解决单染色体建库的技术问题，那么任何物种的全基因组测序就有了希望。因此，本发明以已经分离出的牡丹第5号染色体为例，探索用单条染色体构建全染色体文库的技术途径，为单染色体测序提供技术准备。
本发明采用内切酶消化后引入接头而后通过基因组无偏PCR扩增的建库方法。首先用识别四个碱基的II型限制性内切酶对单条染色体进行消化，使其成为带有粘性末端的小片段，用连接酶向片段的两端加上预先设计好的接头，然后利用接头做引物进行多轮PCR扩增，实现单染色体片段的倍增，从而达到高通量测序的要求。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的不足，而提供一种用单条染色体构建文库方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种用单条染色体构建文库方法，酶切时采用了来自NEW England Biolabs的Acil限制性内切酶；HinPll限制性内切酶；HpyCH4IV限制性内切酶；Mspl限制性内切酶，浓度均为10unit/μL。这四种酶为同尾酶，即识别序列不同，但是所切出的粘性末端相同。使用同尾酶的好处是可以设计通用的接头和引物，即方便又经济。为了使内切酶消化后的DNA片段适合高通量测序的读长，本发明采用双酶切体系。
在连接实验中，选用了T4DNA连接酶，这种酶在16-20℃的条件下活性较大，连接效率较好。
在PCR过程中，采用了保真性较好KOD-plus，浓度为1unit/μL，这种聚合酶产自Toyobo，其保真性是普通聚合酶的几百倍。
在接头的选择上以广泛使用的Sau3Al接头为基础，进行了适当的改良，使其与粘性末端匹配更好。接头的序列如下：
正向接头5’-GGGTCGAATTCGAGCTCAG-3’
反向接头5’-CGCTGAGCTCGAATTCGACCC-3’
正向接头的相对分子质量5868.8，每OD的质量为27.9微克，长度为19个碱基，每OD的摩尔数为4.7nmol。反向接头的相对分子质量6367.3，OD的质量为28.5微克，长度为21个碱基，每OD的摩尔数为4.7nmol。双链接头的相对分子质量为12236.1，在制作接头时加入等摩尔数的正反向寡核苷酸片段，先在94℃的条件下充分变性，然后再自然降温至室温，降低错配的可能性。
本发明的实验步骤如下。
(1)双内切酶消化
酶切的体系如下：
在前期对单染色体进行去蛋白处理时加入了蛋白酶K，所以在进行酶切实验之前要在95℃10min的条件下灭活。然后进行酶切，酶切操作的程序为：37℃3小时处理，65℃10min灭活限制性内切酶。
因为在本次发明中，关键的环节就在于接头能否与酶切片段高效连接，只有连接了接头的酶切片段才能在所加引物的引导下得到扩增。II型限制性内切酶对缓冲液的要求比较低，为了保证T4DNA连接酶的活性，选择用T4DNA连接酶的缓冲液作为限制性内切酶切时的缓冲液。
(2)连接
连接体系的如下：
采用的程序16℃恒温连接10小时。
(3)多轮PCR扩增
第一轮
PCR体系为连接产物15μL；KOD-plus高保真酶0.5μL；KOD-plus dNTP 2.5μL；KOD-plus buffer 2.5μL；KOD-plus镁离子2.0μL；引物2.5μL。扩增程序为94℃3min；94℃30s，52℃40s，72℃50s，10个循环；72℃10min，4℃保存。
第二轮
将第一轮PCR产物均分为5管进行第二轮PCR扩增。
PCR体系为第一轮PCR产物5μL；KOD-plus高保真酶0.2μL；KOD-plus dNTP 1μL；KOD-plus buffer 1μL；KOD-plus镁离子0.8μL；引物2μL。运行程序与第一轮扩增相同。
第三轮
将第二轮PCR产物合管，然后均分为10管进行第三轮PCR。
PCR体系为第二轮PCR产物5μL；KOD-plus高保真酶0.2μL；KOD-plus dNTP 1μL；KOD-plus buffer 1μL；KOD-plus镁离子0.8μL；引物2μL。运行程序与第一轮扩增相同。
第四轮
将第三轮的10管PCR产物混合充分，然后将其均分为10管，进行第四轮PCR扩增。
PCR体系为第三轮PCR产物10μL；KOD-plus高保真酶0.4μL；KOD-plus dNTP 2μL；KOD-plus buffer 2μL；KOD-plus镁离子1.6μL；引物4μL。运行程序与第一轮扩增相同。
第五轮
将第四轮的10管PCR产物混合充分，然后将其均分为10管，进行第五轮PCR扩增。
PCR体系为第四轮PCR产物20μL；KOD-plus高保真酶0.8μL；KOD-plus dNTP 4μL；KOD-plus buffer 4μL；KOD-plus镁离子3.2μL；引物2μL；无菌水6μL。运行程序与第一轮扩增相同。
第六轮
将第五轮的10管PCR产物混合充分，然后将其均分为10管，进行第六轮PCR扩增。
与前几轮PCR扩增不同，这轮的PCR只将第五轮的PCR产物混合后再均分为10管，不添加任何试剂，使存在于产物中的酶和引物继续反应，尽可能地消耗残存的引物。运行程序与第一轮扩增相同。
第七轮
将第六轮的PCR扩增产物混合充分，向其中补加同以上比例的酶，引物，缓冲液，镁离子等40μL，然后均分为10管，进行PCR扩增。运行程序与第一轮扩增相同。
以上七轮PCR扩增共进行了总和70个循环的PCR，扩增产物达到高通量测序要求。
这种方法在实验时底物只需一条染色体，不存在杂合度问题。我们采用分轮扩增的办法，消除了PCR随机偏向性问题。内切酶可选余地大，灵活，粘性末端连接效率高。使用人为设计的接头作特异引物，可用较高的退火温度，消除了非特异性扩增问题。采用超声随机打断后，通过加A反映，然后加接头的做法，属于本发明的扩展。
这项技术的发明为微量DNA构建基因组文库提供了参考的途径。本发明与高通量测序技术相结合进行物种的基因组从头测序，将消除基因组测序中多染色体高杂合度不能正确组装和染色间组装错误问题，为基因组测序开辟广阔的前景。
附图说明
图1为牡丹五号单染色体的扩增结果。
图2为酶Acil，Mspl组合的PCR产物；酶Acil，HinPll组合的PCR产物；酶HpyCH4IV，Mspl组合的PCR产物；酶HinPll，Mspl组合的PCR产物的浓度和A260/280的比值。
图1中：01为Trans2k plus DNA Marker；02-06依次为引物；酶Acil，Mspl组合的PCR产物酶Acil，HinPll组合的PCR产物；酶HpyCH4IV，Mspl组合的PCR产物；酶HinPll，Mspl组合的PCR产物。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一种用单条染色体构建文库方法，酶切时采用了来自NEW England Biolabs的Acil限制性内切酶；HinPll限制性内切酶；HpyCH4IV限制性内切酶；Mspl限制性内切酶，浓度均为10unit/μL。这四种酶为同尾酶，即识别序列不同，但是所切出的粘性末端相同。使用同尾酶的好处是可以设计通用的接头和引物，即方便又经济。为了使内切酶消化后的DNA片段适合高通量测序的读长，本发明采用双酶切体系。
在连接实验中，选用了T4DNA连接酶，这种酶在16-20℃的条件下活性较大，连接效率较好。
在PCR过程中，采用了保真性较好KOD-plus，浓度为1unit/μL，这种聚合酶产自Toyobo，其保真性是普通聚合酶的几百倍。
在接头的选择上以广泛使用的Sau3Al接头为基础，进行了适当的改良，使其与粘性末端匹配更好。接头的序列如下：
正向接头5’-GGGTCGAATTCGAGCTCAG-3’
反向接头5’-CGCTGAGCTCGAATTCGACCC-3’
正向接头的相对分子质量5868.8，每OD的质量为27.9微克，长度为19个碱基，每OD的摩尔数为4.7nmol。反向接头的相对分子质量6367.3，OD的质量为28.5微克，长度为21个碱基，每OD的摩尔数为4.7nmol。双链接头的相对分子质量为12236.1，在制作接头时加入等摩尔数的正反向寡核苷酸片段，先在94℃的条件下充分变性，然后再自然降温至室温，降低错配的可能性。
本发明的实验步骤如下。
(1)双内切酶消化
酶切的体系如下：
在前期对单染色体进行去蛋白处理时加入了蛋白酶K，所以在进行酶切实验之前要在95℃10min的条件下灭活。然后进行酶切，酶切操作的程序为：37℃3小时处理，65℃10min灭活限制性内切酶。
因为在本次发明中，关键的环节就在于接头能否与酶切片段高效连接，只有连接了接头的酶切片段才能在所加引物的引导下得到扩增。II型限制性内切酶对缓冲液的要求比较低，为了保证T4DNA连接酶的活性，选择用T4DNA连接酶的缓冲液作为限制性内切酶切时的缓冲液。
(2)连接
连接体系的如下：
采用的程序16℃恒温连接10小时。
(3)多轮PCR扩增
第一轮
PCR体系为连接产物15μL；KOD-plus高保真酶0.5μL；KOD-plus dNTP 2.5μL；KOD-plus buffer 2.5μL；KOD-plus镁离子2.0μL；引物2.5μL。扩增程序为94℃3min；94℃30s，52℃40s，72℃50s，10个循环；72℃10min，4℃保存。
第二轮
将第一轮PCR产物均分为5管进行第二轮PCR扩增。
PCR体系为第一轮PCR产物5μL；KOD-plus高保真酶0.2μL；KOD-plus dNTP 1μL；KOD-plus buffer 1μL；KOD-plus镁离子0.8μL；引物2μL。运行程序与第一轮扩增相同。
第三轮
将第二轮PCR产物合管，然后均分为10管进行第三轮PCR。
PCR体系为第二轮PCR产物5μL；KOD-plus高保真酶0.2μL；KOD-plus dNTP 1μL；KOD-plus buffer 1μL；KOD-plus镁离子0.8μL；引物2μL。运行程序与第一轮扩增相同。
第四轮
将第三轮的10管PCR产物混合充分，然后将其均分为10管，进行第四轮PCR扩增。
PCR体系为第三轮PCR产物10μL；KOD-plus高保真酶0.4μL；KOD-plus dNTP 2μL；KOD-plus buffer 2μL；KOD-plus镁离子1.6μL；引物4μL。运行程序与第一轮扩增相同。
第五轮
将第四轮的10管PCR产物混合充分，然后将其均分为10管，进行第五轮PCR扩增。
PCR体系为第四轮PCR产物20μL；KOD-plus高保真酶0.8μL；KOD-plus dNTP 4μL；KOD-plus buffer 4μL；KOD-plus镁离子3.2μL；引物2μL；无菌水6μL。运行程序与第一轮扩增相同。
第六轮
将第五轮的10管PCR产物混合充分，然后将其均分为10管，进行第六轮PCR扩增。
与前几轮PCR扩增不同，这轮的PCR只将第五轮的PCR产物混合后再均分为10管，不添加任何试剂，使存在于产物中的酶和引物继续反应，尽可能地消耗残存的引物。运行程序与第一轮扩增相同。
第七轮
将第六轮的PCR扩增产物混合充分，向其中补加同以上比例的酶，引物，缓冲液，镁离子等40μL，然后均分为10管，进行PCR扩增。运行程序与第一轮扩增相同。
以上七轮PCR扩增共进行了总和70个循环的PCR，扩增产物达到高通量测序要求。
实施例一：下述实施例中对DNA的产率和质量的检测方法如下：
(1)电泳检测
通过1％琼脂糖凝胶电泳检测所得PCR产物的情况和浓度。取1μL PCR扩增产物，加9μL电泳缓冲液，混匀后点入1％琼脂糖凝胶，在150V的电压下电泳15min，紫外凝胶成像仪上观察并拍照。
(2)分光光度计检测
取1μL DNA原液，用美国NanoDrop 2000微量分光光度计测定五种DNA提取方法提取的DNA的OD值及A260/280比值。根据分光光度计测定的DNA的OD值计算DNA的产率。
实施例
结果如下：牡丹五号染色体的扩增
在切割出牡丹五号单染色体的基础上，利用前文的实验步骤进行实验，实验结果如下：
1、胶检结果
图1为单染色体扩增实验的结果，从图中可以看出，PCR扩增产物的大小在100bp-1000bp之间，大部分集中在250bp-100bp之间，这个实验结果和我们预想中的结果符合，这说明实验获得了初步的成功。
2、DNA的质量
现有技术中，一般认为，用紫外分光光度计检测，高纯度DNA的A260/280比值应在1.8～2.0之间。当A260/280小于1.8时，说明DNA样品中存在蛋白质的污染，当A260/280大于2.0时，说明DNA样品中RNA含量较高。如图2为实验产物的检测结果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内。
Claims (2)
1.一种用单条染色体构建文库方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对单染色体中的蛋白酶K灭活，灭活条件为95℃ 10-20min，加入酶切体系，酶切；酶切时限制性内切酶选自 NEW England Biolabs的Acil限制性内切酶；HinpII限制性内切酶；HpyCH4IV限制性内切酶；Msp1限制性内切酶；利用T4DNA连接酶缓冲液替换所述酶切体系中的原限制性内切酶的缓冲液；酶切的体系为
酶切的条件为37℃ 3小时处理，并65℃ 10min灭活所述酶切体系中的限制性内切酶；
(2)加入等量的正反向单链接头，制作通用接头，接头的制作条件为94℃ 5-10min，52℃ 20-30min处理之后在室温下放置2-3h，加入适量的接头到酶切产物中，使接头与酶切片段连接；所述接头的序列为
正向接头5’-GGGTCGAATTCGAGCTCAG-3’
反向接头5’-CGCTGAGCTCGAATTCGACCC-3’；
连接的体系为
连接的条件为16-20℃恒温连接10小时；
(3)向连接产物中加入PCR扩增体系，PCR扩增的方式进行七轮扩增，期间对每轮的产物合管混合后再分管以降低PCR偏好；PCR扩增的程序为94℃ 3min，1cycle；94℃ 30S，52℃40S，72℃ 50S，10cycle；72℃ 10min，4℃+∞，1cycle。
2.根据权利要求1所述的一种用单条染色体构建文库方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述酶切体系中的采用的限制性内切酶为同尾酶，方便接头的设计。
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