CN102533733A

CN102533733A - 棉花pmc单染色体分离及其特异分子标记建立的方法

Info

Publication number: CN102533733A
Application number: CN2012100210443A
Authority: CN
Inventors: 王为; 王坤波; 刘方; 彭仁海; 袁有禄; 黎绍惠; 张香娣; 王春英; 王玉红
Original assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-01-31
Filing date: 2012-01-31
Publication date: 2012-07-04

Abstract

本发明涉及分子标记领域，具体地，涉及棉花PMC单染色体分离及其特异分子标记建立的方法。根据本发明的方法包括取材、鉴定、显微切割目标染色体等步骤，并以分离的单染色体为材料，构建DNA文库、克隆随机测序后，利用标记软件开发分子标记，并将其定位在棉花特定染色体上。本发明的PMC切割方法只要有对应的单体材料即可，目前棉花26条染色体大部分都有；PMC切割更精确，假阳性低，但同时技术难度大，中期细胞少，目标染色体数量少，一个细胞只有一条。

Description

棉花PMC单染色体分离及其特异分子标记建立的方法

技术领域

本发明涉及分子标记领域，具体地，涉及棉花PMC单染色体分离及其特异分子标记建立的方法。

背景技术

棉花分子标记广泛用于遗传多样性、遗传图谱构建、基因定位、比较基因组学、起源进化等研究，同时广泛应用于分子标记辅助选择、品种设计、转基因育种等分子育种中，经过第一代RFLP、第二代SSR、第三代SNP为代表的发展历程，而其中第二代SSR分子标记由于共显性、重复性好、多态性高、操作相对简单等优点被广泛利用。SSR有gSSR(来自基因组序列)和eSSR(来自EST序列)两种。目前棉花遗传图谱(海陆种间)虽然说已经比较饱和(＜2cM)，但实际上远远不能满足实际要求，1cM可能要棉花覆盖基因组400-600Kb，所以有必要不断加密图谱。通过各种基因组文库或EST测序序列开发SSR标记是一个方法，但这只能覆盖整个基因组，无法达到定向、特异开发某条染色体分子标记的目的(例如1号染色体在比较饱和的图谱上也只有66个标记，而比它小的好多染色体上标记多于此，所以有必要对1号染色体进行定向加密)。中国专利申请CN2009100833029公开了一种棉花单染色体的分离方法，然而该方法仅能分离棉花体细胞的单染色体。体细胞和花粉母细胞的切割方法操作方法差异如下，故不能通用。

为此我们以陆地棉1号染色体为例(形态相对较大且含抗病、纤维发育、产量、纤维品质相关基因)通过取材及鉴定、显微切割体系构建、单染色体富集、微克隆及验证、单染色体DNA文库构建及评价、克隆随机测序、1号染色体的genome-SSR标记开发及定位等步骤总结了一种开发棉花单染色体特异分子标记的方法。

发明内容

本申请的发明人为了解决上述问题提出并完成了本发明。

本发明的目的是提供一种分离棉花花粉母细胞单染色体的方法。

本发明的再一目的是提供一种建立棉花单染色体特异分子标记的方法。

根据本发明的分离棉花花粉母细胞单染色体的方法包括以下步骤：

(1)取材、鉴定

A.减数分裂中期染色体膜载片的支架制作与准备

用玻璃刀切割与膜片内框大小相近的玻璃载片，用强力胶将其粘贴在完整的玻璃载片适当位置，再将膜载片反扣在支架上，用透明胶固定两端，紫外线下照射30min备用。用玻璃刀划好半边玻片，带有支架的每个膜片恰好用两块半边盖玻片。根据本发明的具体实施方案，所述膜片的材料为PET膜载片。

B.取材

正常天气在上午10点前和下午5点以后取，按照苞叶的宽度与高度计，一般均在0.5cm到1cm之间的花蕾，花蕾本身≤4mm。根据本发明的具体实施方案，所使用的棉花品种为棉花单染色体材料，取样材料可以来源于室外花盆(安阳)、温室(安阳)及海南大田，例如，根据本发明的具体实施方案，收集了足够量的陆地棉单体1号中期花蕾。

C.预检

取少许幼小花药于载片，滴加卡宝品红染色，镊子平头捣碎，镊除余渣，加盖片。压片时在火上略加烘烤，进行分色(促使染色体着色更深，细胞质褪色)。压片完成后，镜检。在显微镜下直接观察，能识别出有单个细胞(非四分体)且整体呈红色，外周有半透明状边圈的花蕾选用。以1号染色体为目标，且定向加密该条染色体遗传图谱，所以要对该染色体进行富集，而在切割时首先需要准确识别1号染色体，主要有形态识别和Marker标记识别等，本研究利用陆地棉1号染色体单体材料在减数分裂时有一条染色体不能联会配对而形成落后(孤单)染色体这一特性进行准确识别。

D.预处理

采用改良卡诺II(乙醇∶冰乙酸∶氯仿＝5∶3∶2)作为固定剂，室温下处理4h左右。其中固定液为样品的5倍以上，固定后用70％乙醇4℃保存。

(2)显微切割体系构建

针对棉花PMC(花粉母细胞Pollen Mother Cell)及染色体特点，总结出棉花PMC显微切割体系，主要步骤如下：

1、用ddH₂O水洗预处理后的花蕾2-3次，室温浸泡10分钟。

2、然后分别用KCL水溶液(0.075mol/L)和ddH₂O分别低渗10-20分钟。

3、37℃酶解(含4％的纤维素酶和2％的果胶酶)45分钟左右。

4、酶解好的材料用ddH₂O浸泡10分钟。

5、将花药点在半片盖玻片上，加少许卡宝溶液并用镊子夹碎染色3-5分钟。

6、将半片盖玻片反扣在垫有支架的膜载片上，轻轻按压。滤纸垫压。

7、-20度存放2小时。

8、取出30s左右上有凝结水时快速揭片，去掉支架。

9、水浴锅80℃干燥2分钟，在60℃烘箱30分钟。

10、-20度封严存放(可短期存放，用前烘干)。

11、“三明治”结构进行显微切割(具体切割流程如下)，3个切割参数协调最佳(Speed为10％左右，Focus为5％-8％，Power为90％左右)。

12、切割染色体后(每管的收集时间控制在2h之内)，立即加入20-50μl蛋白酶K，倒置5分钟。

13、离心2分钟(2000转左右)以收集染色体，-20度保存(可长期存放)。

14、蛋白酶K 37℃酶解4小时。

15、70℃灭活20分钟。

其中，棉花单染色体的具体切割流程如下：

1、“三明治”结构制作，烘干的膜制片和正常干净的载破片中间是待切割的组织。

2、选择切割目标，先默认切割仪各种调节，通过鼠标沿需要切割的样本周长进行勾画，点击cut键切割选定的样本。一般在10×或20×物镜下，选取目标细胞区域。根据本发明的具体实施方案，所用的切割仪为德国产MMI Cell Cut切割仪。

3、放置收集管盖，将对应的Eppendorf管放到切割仪载物台上方悬着的升降装置上。

4、全自动激光显微切割，40×或60×下自动切割及拍照，可以进行多个目标连续或分组切割，3个切割参数协调最佳(Speed为10％左右，Focus为5％-8％，Power为90％左右)。

5、按Cut键进行切割。

6、收集切割样品，提起收集管，收集显微切割获得的样本，调节微调观察是否有切割后留下的“洞”。放下Eppendorf管调节微调检查管盖上面是否有切割染色体。

(3)单染色体富集

由于1个花粉母细胞减数分裂中期时只有1条落后染色单体，所以需要多次收集目标染色体到一个收集管中，用于扩增一般需要30-50条。产物可以用于微克隆及后续研究。

在通过本发明的方法富集单染色体后，进一步经过“微克隆及验证”、“构建DNA文库”、“克隆随机测序”等步骤后，利用标记软件开发SSR标记，并将其定位在棉花特定染色体上。

具体地，根据本发明的具体实施方案，“微克隆及验证”包括以下步骤：

A、LA-PCR及DOP-PCR扩增

采用LA-PCR(linker adapter polymerase chain reaction)方法扩增微分离得到的材料染色体，包括接头的制备、染色体片段的蛋白酶K消化、接头连接及两轮PCR扩增反应过程。利用DOP-PCR(degenerate oligonucleotide primed polymerase chainreaction)的扩增分微分离得到的材料染色体，包括染色体片段的蛋白酶K消化及两轮PCR扩增反应过程。

B、扩增产物的琼脂糖电泳验证

C、DNA提取、SSR扩增及PAGE电泳检测。

如上所述，中国专利申请CN2009100833029公开了一种棉花单染色体的分离方法，然而该方法仅能分离棉花体细胞的单染色体，其中，SC切割方法推广应用局限性大，需要目标染色体具有明显的特征，如大随体或端体，而PMC切割方法只要有对应的单体材料即可，目前棉花26条染色体大部分都有；PMC切割更精确，假阳性低，但同时技术难度大，中期细胞少，目标染色体数量少，一个细胞只有一条。

附图说明

图1根据本发明的实施例1的膜支架的制作过程，其中a、b、c、d为四个制作步骤。

图2切割染色体后收集情况。

图3陆地棉1号单体染色体的切割。

图4显示一个视野里较多的PMC切割。

图5LA-PCR第二次扩增产物电泳图，1.阴性对照；2，3.单染色体扩增产物；4.阳性对照(TM-1)；M.Marker。

图6DOP-PCR的第二次扩增产物电泳图，1，2.阳性对照；3.阴性对照；4-9.单染色体扩增产物；M.Marker。

图7SSR引物扩增产物的聚丙烯酰胺电泳检测结果，7A：以从一个分裂相中分离的不同单染色体第二次LA-PCR扩增产物做为模板的扩增条带带型；7B以1号单染色体第二次LA-PCR扩增产物做为模板，用A1～A13号染色体特异SSR引物进行扩增的结果。0.为阴性对照(ddH₂O)；A1-13.为同一引物不同单染色体扩增；B1-13.为不同特异SSR引物在1号染色体扩增产物中的扩增；14.为阳性对照(TM-1)；M.Marker.(箭头为特征条带)。

图8部分重组克隆子的T7/SP6通用引物PCR扩增结果。

图9根据本发明的建立染色体特异分子标记的方法的流程图。

图10CICR标记定位结果。

具体实施方式

实施例1基于陆地棉单体1号材料的1号染色体特异分子标记开发

一、分离陆地棉单体1号材料的1号染色体

陆地棉单体1号材料(缺一条1号染色体)，引自美国得克萨斯州农工大学。

(1)陆地棉单体1号取材、鉴定

A.减数分裂中期染色体膜载片的支架制作与准备

用玻璃刀切割与膜片内框大小相近的玻璃载片，用强力胶粘贴在完整的玻璃载片适当位置(图1a，c)，再将膜载片反扣在支架上，用透明胶固定两端(图1d)，紫外线下照射30min备用。用玻璃刀划好半边玻片(图1b)，带有支架的每个膜片恰好用两块半边玻片。

B.取材

正常天气在上午10点前和下午5点以后取，按照苞叶的宽度与高度计，一般均在0.5cm到1cm之间的花蕾，花蕾本身≤4mm。材料来源于室外花盆(安阳)、温室(安阳)及海南大田，以收集足够量的陆地棉单体1号中期花蕾。

C.预检

取少许幼小花药于载片上，滴加卡宝品红染色，镊子平头捣碎，镊除余渣，加盖片。压片时在火上略加烘烤，进行分色(促使染色体着色更深，细胞质褪色)。压片完成后，镜检。在显微镜下直接观察，能识别出有单个细胞(非四分体)且整体呈红色，外周有半透明状边圈的花蕾选用。

D.预处理

(2)显微切割体系构建

使用的切割仪为MMI Cell Cut切割仪。MMI Cell Cut激光显微切割仪、PET膜载片和Eppendorf黏性收集管等购自基因有限公司。

主要步骤如下：

1、用ddH₂O水洗预处理后的花蕾2-3次，室温浸泡10分钟。

2、然后分别用KCL水溶液(0.075mol/L)和ddH₂O分别低渗10-20分钟。

3、37℃酶解(含4％的纤维素酶和2％的果胶酶)45分钟左右。

4、酶解好的材料用ddH₂O浸泡10分钟。

6、将半片盖玻片反扣在垫有支架的膜载片上，轻轻按压，滤纸垫压。

7、-20度存放2小时。

8、取出30s左右上有凝结水时快速揭片，去掉支架。

9、水浴锅80℃干燥2分钟，在60℃烘箱30分钟。

10、-20度封严存放(可短期存放，用前烘干)。

14、蛋白酶K 37℃酶解4小时。

15、70℃灭活20分钟。

其中，棉花单染色体的具体切割流程如下：

1、“三明治”结构制作，烘干的膜制片和正常干净的载破片中间是待切割的组，将膜制片放在Cell Cut Plus激光显微切割仪载物台上，于低倍镜下找到目标染色体，然后换到高倍镜下进行切割。

2、选择切割目标，先默认切割仪各种调节，通过鼠标沿需要切割的样本周长进行勾画，点击cut键切割选定的样本。一般在10×或20×物镜下，选取目标细胞区域。

3、放置收集管盖，将对应的Eppendorf管放到切割仪载物台上方悬着的升降装置上。按照前面描述的进行陆地棉1号单体材料的细胞和单染色体显微切割，切30-50条用于后续研究。经过不断摸索和改良，这套体系可以将比较多的PMC转移性到一个视野里，提高切割效率和效果，切割染色体后收集情况见图2，陆地棉1号染色体的切割如图3所示，图4则显示了一个视野里较多的PMC切割。

5、按Cut键进行切割。

XY载物台移动方法：

有三种不同的模式可以快速或详细扫描样本，搜寻需要的区域：

右击鼠标打开快捷菜单选择Move。通过鼠标左键拖拽，可以移动载物台。

使用键盘上的箭头键，可以缓慢移动载物台。

使用键盘数字区域的箭头键，可以一步一步大范围地移动样本，并保留图像每次有10％的重叠。这个功能可以用于搜寻样本，而不会错过任何区域。

(3)单染色体富集

由于1个花粉母细胞减数分裂中期时只有1条落后染色单体，所以需要多次收集目标染色体到一个收集管中，用于扩增一般需要30-50条。

(4)微克隆及验证

A.LA-PCR及DOP-PCR扩增

采用LA-PCR(linker adapter polymerase chain reaction)方法扩增微分离得到的30条单体1号材料染色体，包括接头的制备、染色体片段的蛋白酶K消化、接头连接及两轮PCR扩增反应过程，涉及23mer和19mer的两个寡核苷酸片段形成(23mer的寡核苷酸碱基的序列为：5’-GATCCTGAGCTCGAATTCGACCC-3’，19mer的寡核苷酸碱基的序列为：5’-GGGTCGAATTCGA GCTCAG-3’)。利用DOP-PCR(degenerate oligonucleotide primed polymerase chain reaction)的扩增分微分离得到的50条单体1号材料染色体，包括染色体片段的蛋白酶K消化及两轮PCR扩增反应过程(使用的简并引物序列为：5’-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3’)。

B.扩增产物的琼脂糖电泳验证

1.0％的琼脂糖电泳检测长片段扩增产物、LA-PCR和DOP-PCR的两次扩增产物，电压100V，时间30min，EB染色40min，紫外灯下观察、照相(LA-PCR结果如图5所示，DOP-PCR扩增结果如图6所示)。

C.DNA提取、SSR扩增及PAGE电泳检测

采用改良的CTAB法提取各材料基因组DNA。

PCR反应配方：总体积为10μL，10×Reaction buffer(含Mg²⁺)1.0μL，dNTPs(10mmol·L^-1)0.5μL，每对引物的正反向引物(10μmol·L^-1)各1μL，TaqDNA聚合酶(2.5U·μL^-1)0.2μL，模板DNA(50ng·μL^-1)1μL，ddH₂O5.3μL。

PCR反应程序为：95℃预变性2min；94℃变性40s、57℃退火45s、72℃延伸60s，共30个循环；72℃延伸7min；最后温度设定为15℃。

PAGE电泳方法：8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：采用BIO-RAD公司PowerPacHCTM电泳仪，北京六一仪器厂DYCZ-30电泳槽装置。电泳缓冲液为1×TBE，在扩增产物中加入1.5μL溴酚蓝上样缓冲液混均匀，取1.8μL加入点样孔，190V恒压电泳45min。最后银染分析。

以1号染色体上特异SSR引物(BNL3580)为引物(序列为TGATGAGGTGCATTAACTATAACC(正向)，GCCTTCAGTTGCACTAAACA(反向)，以从一个分裂相同一花粉母细胞中分离的不同单染色体(同一花粉母细胞的不同染色体)第二次LA-PCR扩增产物做为模板，扩增条带带型如图7A，可以看出第1号泳道内有特异条带(箭头所示，其中向上箭头为BNL3580的220bp目标条带)。而以1号单染色体第二次LA-PCR扩增产物做为模板，用A₁～A₁₃号染色体特异SSR引物进行扩增，也可以看出A1引物扩增出特异条带，如图7B。

(5)单染色体DNA文库构建、评价

将陆地棉1号单体的第2轮LA-PCR扩增产物回收纯化，与载体连接后转化，转化菌铺平板进行培养16h后，均出现密度适中的白斑，计算阳性克隆数，取其平均值，每板约283个克隆。在超净工作台上将白斑菌挑存于含冷的培养基的384孔板内，与-70℃下长期保存。从文库中随机分析120个重组克隆子，以T7/SP6扩增电泳检测，结果表明，文库的插入片段大小分布在450-1600bp，平均800bp左右。进一步分析，可以得出该文库覆盖陆地棉1号单体材料1号染色体的40％，文库克隆子的空载率为1％，滴度为1.3×10⁶pfu/mL，文库中单一和低拷贝达到59％以上。图8为部分重组克隆子的T7/SP6扩增电泳检测结果。

(6)克隆随机测序

将阳性克隆送生物公司测序。

(7)1号染色体的genome-SSR标记开发及定位

利用已有的软件，如软件SSRmine1.0(国家版权局已授权，软件登记号：2011SR015269)及Primer3.0软件开发SSR标记，并将其定位在陆地棉中棉所36和海岛棉海1的BC1群体上(群体大小158，作图软件Joinmap3.0，定位软件Wincatogragher2.5)。

利用这种方法将来自1号染色体开发的4个新标记(命名为CICR，ChinaInstitute of Cotton Research，序列如下所示)定位于1号染色体图谱上，分别位于15.5cM、15.5cM、37.8cM、93.1cM处，从而起到了定向加密特定染色体图谱的目的，为1号染色体基因的定位、图位克隆、测序的组装打下坚实的基础。

4个SSR标记的序列：

CICR105序列为CTCTATGAGCGAGGTCCTG(正向)，CCAAGGACTCAATAACAGG(反向)

CICR179序列为GCAGGTCTCTCGACTCTCAC(正向)，CAAGAACAGGCATTGTTGAG(反向)

CICR258序列为CTTACTTTACCCATTCCCCA(正向)，AGCAGAGATGGTTTGAGAGG(反向)

CICR894序列为GACTCCCACCCTAACAACAG正向)，CTTCTGGTCCTCTTCCTTGA(反向)

Claims

1.棉花花粉母细胞单染色体分离方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)取材、鉴定

A.制作减数分裂中期染色体膜载片，切割与膜片内框大小相近的玻璃载片，将膜载片粘贴在完整的玻璃载片适当位置，再将膜载片反扣在支架上，所述膜片的材料为PET膜载片；

B.取材，所用材料为棉花单体材料，取少许花药于玻璃载片，滴加卡宝品红染色，捣碎，除余渣，加盖片压片，压片完成后，镜检，在显微镜下直接观察，识别出有单个细胞且整体呈红色，外周有半透明状边圈的花蕾选用；

C.预处理

采用改良卡诺II，其配方为：乙醇∶冰乙酸∶氯仿＝5∶3∶2作为固定剂，室温下处理4h，其中固定液为样品的5倍以上，固定后用70％乙醇4℃保存，

(2)显微切割目标染色体

水洗预处理后的花蕾、低渗、酶解，将花药点在半片盖玻片上，加卡宝溶液并用镊子夹碎染色，将半片盖玻片反扣在垫有支架的膜载片上，轻轻按压，-20℃存放，取出有凝结水时快速揭片，去掉支架，干燥，进行显微切割，并收集目标染色体。

2.建立棉花单染色体特异分子标记的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)取材、鉴定

C.预处理

(2)显微切割体系构建

水洗预处理后的花蕾、低渗、酶解，将花药点在半片盖玻片上，加卡宝溶液并用镊子夹碎染色，将半片盖玻片反扣在垫有支架的膜载片上，轻轻按压，-20℃存放，取出有凝结水时快速揭片，去掉支架，干燥，进行显微切割，并收集目标染色体，

(3)以步骤(2)分离的单染色体为材料，构建DNA文库、克隆随机测序后，利用标记软件开发分子标记，并将其定位在棉花特定染色体上。