CN101760538A - 植物染色体显微切割、微克隆技术 - Google Patents
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Abstract
染色体微切割、微分离与微克隆(chromosome micro-dissection and micro-cloning)技术是由Scalenghe等(1981)创立的一项分子细胞遗传学新技术。该技术首先对果蝇染色体进行了切割，成功获得了80个克隆，随后用于鼠和人类(Rohme等，1984)。随着PCR技术的发展，切割和微克隆技术得到了较大发展(Ludecke等，1989)。自Sandery等(1991)利用染色体微切割和微克隆技术获得了黑麦DNA克隆以来，该技术在植物遗传与进化研究上得到了较为广泛应用。
Description
技术领域
植物染色体显微切割、微克隆技术属于生物工程领域。
背景技术
植物染色体显微切割技术主要采用微细玻璃针或激光，在倒置显微镜下对目标染色体(区段)进行切割或者灼烧使之与其它染色体分离；将分离得到的染色体(片段)经体外扩增从而构建染色体或染色体区段特异性的DNA文库，主要包括酶切直接克隆法和以PCR技术为介导的微克隆技术。
发明内容
染色体显微切割、微克隆技术主要包括染色体标本的制备、染色体的识别和微切割、PCR扩增、DNA克隆及鉴定等步骤。
染色体标本制备
染色体标本制备和染色体显微切割是一项高度精细的技术，因而对染色体标本制作的要求相当高。染色体标本制备根据所采用的切割方法不同而有所不同。染色体标本的制作一般与常规方法相同，首先要挑选带有目标染色体的适宜的材料，一般有根尖和花粉母细胞两种类型。目前，宋文芹等(1996)选用蚕豆根尖、胡赞民等(1998)对玉米、王槐等(1998)对大麦、邓可京等(1999)对水稻的根尖细胞染色体进行了相应的切割；Vega等(1994)对小麦减数分裂细胞中的单价体、Houben等(1996)对黑麦B染色体进行了切割。但无论什么材料，采用什么方法，都要求染色体尽量散开，显带后带纹清晰，易于识别；在制片过程中减少酸碱处理的时间，以防DNA受损。采用染色体显维切割仪进行激光切割时必须采用合适方法将目标染色体转移到膜上。
目标染色体的识别
染色体标本制好之后，必须采用合适方法对目标染色体进行识别，常常可以采用分带、核型分析、原位杂交等方法。如Vega等(1994)成功切割了小麦单体附加系中减数分裂中呈单价体状态的染色体。Houben等(1996)微切割了黑麦染色体组中的B染色体。田靫等(1997)在C-分带识别普通小麦钢82～122(Triticum aestivum 2n＝42)1D染色体长臂的基础上，通过微细玻璃针分离1D染色体。
目标染色体(片断)显微切割和分离
植物染色体的显微切割主要有两种方法：玻璃针切割法和激光灼烧法。
玻璃针切割法是在倒置显微镜下进行的，倒置显微镜上装有显微操纵装置，其末端装有直径不超过0.5μm的玻璃纤维，用来对染色体直接进行切割，切下的目标染色体或染色体片段用微细玻璃针在45％的醋酸中收集到油室内，进行蛋白酶消化等处理，随后将所获得的DNA用于PCR扩增和克隆。该方法是植物染色体显微切割的主要方法之一，已在多种植物染色体切割上得到应用。该技术能对目的染色体直接切割、分离，具有费用低的优点；但该技术操作困难，不易掌握，在一定程度上限制了其应用。
激光灼烧法也叫激光切割法，就是指借助于激光对目标染色体进行灼烧达到显微切割、分离的目的。先将染色体标本做在贴有特殊薄膜的培养皿或者载玻片上，切割时将标本放置在倒置显微镜下，找好分裂相，用足以穿透薄膜的较大功率激光切出一个以目标染色体为中心的八角形膜，然后用较小功率的激光照射八角形膜内其它不需要的染色体，使其蒸发，只保留所需要的染色体或染色体片段，回收八角形膜，放入0.5ml离心管内，进行PCR扩增和微克隆的操作。这是比较原始的方法，现在本实验室可以借助于SLμ
(Molecularmachine industry，MMI)切割系统借助于系统软件直接对目标染色体进行可视化切割，然后运用带有黏性的Eppendorf管的管盖对目标染色体回收，进而进行下游工作。较玻璃针法，该方法对设备条件要求相对较高，费用较高；但是该法操作简单，容易掌握，操作也更准确，因而受到许多研究者的青睐。
微克隆库的建立
分离到的染色体必须经过体外扩增，才能进行下一步的的研究工作。显微切割染色体微克隆文库的建立主要包括酶切直接克隆和以PCR为介导克隆技术两种。
微克隆的筛选和鉴定
所建立的DNA文库的特异性一般采用Southern杂交、原位杂交和特定片段的PCR扩增进行鉴定。
具体实施方式
染色体标本制备
染色体标本制备和染色体显微切割是一项高度精细的技术，因而对染色体标本制作的要求相当高。染色体标本制备根据所采用的切割方法不同而有所不同。染色体标本的制作一般与常规方法相同，首先要挑选带有目标染色体的适宜的材料，一般有根尖和花粉母细胞两种类型。但无论什么材料，采用什么方法，都要求染色体尽量散开，显带后带纹清晰，易于识别；在制片过程中减少酸碱处理的时间，以防DNA受损。采用染色体显维切割仪进行激光切割时必须采用合适方法将目标染色体转移到膜上。
目标染色体的识别
染色体标本制好之后，必须采用合适方法对目标染色体进行识别，常常可以采用分带、核型分析、原位杂交等方法。
目标染色体(片断)显微切割和分离
植物染色体的显微切割主要有两种方法：玻璃针切割法和激光灼烧法。
玻璃针切割法是在倒置显微镜下进行的，倒置显微镜上装有显微操纵装置，其末端装有直径不超过0.5μm的玻璃纤维，用来对染色体直接进行切割，切下的目标染色体或染色体片段用微细玻璃针在45％的醋酸中收集到油室内，进行蛋白酶消化等处理，随后将所获得的DNA用于PCR扩增和克隆。该方法是植物染色体显微切割的主要方法之一，已在多种植物染色体切割上得到应用。该技术能对目的染色体直接切割、分离，具有费用低的优点；但该技术操作困难，不易掌握，在一定程度上限制了其应用。
激光灼烧法也叫激光切割法，就是指借助于激光对目标染色体进行灼烧达到显微切割、分离的目的。先将染色体标本做在贴有特殊薄膜的培养皿或者载玻片上，切割时将标本放置在倒置显微镜下，找好分裂相，用足以穿透薄膜的较大功率激光切出一个以目标染色体为中心的八角形膜，然后用较小功率的激光照射八角形膜内其它不需要的染色体，使其蒸发，只保留所需要的染色体或染色体片段，回收八角形膜，放入0.5ml离心管内，进行PCR扩增和微克隆的操作。这是比较原始的方法，现在本实验室可以借助于SL μ
(Molecularmachine industry，MMI)切割系统借助于系统软件直接对目标染色体进行可视化切割，然后运用带有黏性的Eppendorf管的管盖对目标染色体回收，进而进行下游工作。较玻璃针法，该方法对设备条件要求相对较高，费用较高；但是该法操作简单，容易掌握，操作也更准确，因而受到许多研究者的青睐。
微克隆库的建立
分离到的染色体必须经过体外扩增，才能进行下一步的的研究工作。显微切割染色体微克隆文库的建立主要包括酶切直接克隆和以PCR为介导克隆技术两种。
(1)酶切直接克隆法
该法是在PCR技术之前使用的主要方法，其过程为首先将分离出的多个同一目标染色体片段抽提去蛋白质及DNA纯化、酶切，然后加入同一限制性内切酶切割的载体及连接酶，连接后再转化一定的宿主菌，以建立染色体DNA文库。该方法的优点是克隆片段相对较大，不足是技术复杂、操作精细，为满足微克隆对DNA模板量的要求，需要分离100～200条同一染色体片段。Saudery第一次将微切割和微克隆技术应用于植物中，他们用微细玻璃针分离黑麦B染色体，并在油室中消化、连接等微克隆操作，得到一个区别于A组染色体的克隆，插入序列为2kb。
(2)PCR介导的微克隆技术
目标染色体经显微切割、分离得到的染色体数量有限，往往通过PCR扩增以得到更多的产物以用于后续研究。常用的PCR方法主要有以下两种。
连接体-结合体介导的PCR(Linker-adaptor-PCR，LA-PCR)，LA-PCR即将分离的染色体DNA用限制性内切酶进行消化，根据酶切后产生的粘性末端的碱基序列，分别设计一个连接体(linker)和一个结合体(adaptor)，并使linker与adaptor混合后产生与某一内切酶同样的粘性末端。由于粘性末端不受限制，当酶切后的染色体DNA与连接体-结合体混合后，可大大提高连接效率。再用其中的连接体作PCR扩增的引物，由于每个酶切产物都连接一个已知的连接体(引物)，这样就可扩增任一未知DNA片段。在PCR反应前无需分离程序，所构建的染色体区带特异性文库不仅避免了分离等步骤，减少了产生污染的可能，而且由于DNA丢失少而极大提高了文库的完整性。
微克隆的筛选和鉴定
所建立的DNA文库的特异性一般采用Southern杂交、原位杂交和特定片段的PCR扩增进行鉴定。
(1)Southern杂交分析
Southern杂交时可用一定的标记物标记基因组DNA，与建立的染色体DNA文库进行杂交，或标记建立的DNA文库中插入片段，用其作为探针与基因组DNA进行杂交。其目的是初步鉴定该文库中插入片段的来源。但是Southern杂交可能存在假阳性，需要进一步验证。
(2)原位杂交分析
用得到的染色体DNA文库中插入片段作探针进行原位杂交。其目的是检测插入片段是否源自目的染色体；鉴别该染色体特有的克隆；鉴别与其他染色体共有的克隆。所用探针可用放射性同位素和非放射性标记物如地高辛、生物素等进行标记。
(3)PCR扩增方法
PCR扩增时所用DNA模板可以是微分离的染色体DNA，也可以是染色体DNA文库中的插入片段。只要该染色体某一基因DNA两侧序列可知，就可利用PCR鉴别该染色体的特异性。
Claims (1)
1.植物染色体显微切割、微克隆技术主要包括：
染色体标本制备
染色体标本制备和染色体显微切割是一项高度精细的技术，因而对染色体标本制作的要求相当高，染色体标本制备根据所采用的切割方法不同而有所不同，染色体标本的制作一般与常规方法相同，首先要挑选带有目标染色体的适宜的材料，一般有根尖和花粉母细胞两种类型，但无论什么材料，采用什么方法，都要求染色体尽量散开，显带后带纹清晰，易于识别；在制片过程中减少酸碱处理的时间，以防DNA受损，采用染色体显维切割仪进行激光切割时必须采用合适方法将目标染色体转移到膜上；
目标染色体的识别
染色体标本制好之后，必须采用合适方法对目标染色体进行识别，常常可以采用分带、核型分析、原位杂交等方法；
目标染色体(片断)显微切割和分离
植物染色体的显微切割主要有两种方法：玻璃针切割法和激光灼烧法：
玻璃针切割法是在倒置显微镜下进行的，倒置显微镜上装有显微操纵装置，其末端装有直径不超过0.5μm的玻璃纤维，用来对染色体直接进行切割，切下的目标染色体或染色体片段用微细玻璃针在45％的醋酸中收集到油室内，进行蛋白酶消化等处理，随后将所获得的DNA用于PCR扩增和克隆，该方法是植物染色体显微切割的主要方法之一，已在多种植物染色体切割上得到应用，该技术能对目的染色体直接切割、分离，具有费用低的优点；但该技术操作困难，不易掌握，在一定程度上限制了其应用；
激光灼烧法也叫激光切割法，借助于SLμ
(Molecular machine industry，MMI)切割系统借助于系统软件直接对目标染色体进行可视化切割，然后运用带有黏性的Eppendorf管的管盖对目标染色体回收，进而进行下游工作。
微克隆库的建立
分离到的染色体必须经过体外扩增，才能进行下一步的的研究工作，显微切割染色体微克隆文库的建立主要包括酶切直接克隆和以PCR为介导克隆技术两种；
微克隆的筛选和鉴定
所建立的DNA文库的特异性一般采用Southern杂交、原位杂交和特定片段的PCR扩增进行鉴定。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200810238623A CN101760538A (zh) | 2008-12-19 | 2008-12-19 | 植物染色体显微切割、微克隆技术 |
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| CN200810238623A Pending CN101760538A (zh) | 2008-12-19 | 2008-12-19 | 植物染色体显微切割、微克隆技术 |
Country Status (1)
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| CN (1) | CN101760538A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102533733A (zh) * | 2012-01-31 | 2012-07-04 | 中国农业科学院棉花研究所 | 棉花pmc单染色体分离及其特异分子标记建立的方法 |
| CN102604883A (zh) * | 2012-03-09 | 2012-07-25 | 河南科技大学 | 小偃麦异代换系中外源染色体的微分离方法 |
| CN106644636A (zh) * | 2016-12-15 | 2017-05-10 | 贵州师范大学 | 一种烟草染色体显微切割技术 |
| CN106755380A (zh) * | 2016-12-13 | 2017-05-31 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 一种尼罗罗非鱼性染色体dna文库的构建方法 |
-
2008
- 2008-12-19 CN CN200810238623A patent/CN101760538A/zh active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102533733A (zh) * | 2012-01-31 | 2012-07-04 | 中国农业科学院棉花研究所 | 棉花pmc单染色体分离及其特异分子标记建立的方法 |
| CN102604883A (zh) * | 2012-03-09 | 2012-07-25 | 河南科技大学 | 小偃麦异代换系中外源染色体的微分离方法 |
| CN102604883B (zh) * | 2012-03-09 | 2013-09-25 | 河南科技大学 | 小偃麦异代换系中外源染色体的微分离方法 |
| CN106755380A (zh) * | 2016-12-13 | 2017-05-31 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 一种尼罗罗非鱼性染色体dna文库的构建方法 |
| CN106644636A (zh) * | 2016-12-15 | 2017-05-10 | 贵州师范大学 | 一种烟草染色体显微切割技术 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20100630 |