CN105154444A

CN105154444A - 一种有效提高建库效率的非对称高通量测序接头及其应用

Info

Publication number: CN105154444A
Application number: CN201510666660.8A
Authority: CN
Inventors: 沈双烨; 戴琳超; 陆祖宏
Original assignee: NANJING PERCARE BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: NANJING PERCARE BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2015-10-15
Filing date: 2015-10-15
Publication date: 2015-12-16

Abstract

本发明涉及高通量测序领域，提供了一种用于SOLiD测序系统文库构建的非对称高通量测序接头，并确定一种适用于SOLiD测序系统的使用非对称高通量测序接头的文库构建方法。所述非对称高通量测序接头，是分别选取SOLiD测序系统固有的P1和P2接头序列中的一条DNA单链，对其进行改造并退火形成的非对称高通量测序接头。改造后接头的非对称区域含有文库扩增引物的结合位点。本发明的非对称高通量测序接头应用在SOLiD测序系统文库构建中，能够避免传统文库构建中同一测序片段两端连上同一接头的现象，可有效提高建库效率。

Description

一种有效提高建库效率的非对称高通量测序接头及其应用

技术领域

本发明涉及高通量测序领域，更具体地说，涉及一种应用于SOLiD测序系统的，可有效提高建库效率的非对称高通量测序接头及其应用。

背景技术

高通量测序技术已广泛应用于生物学研究的各大领域，很多生物学问题借助高通量测序技术予以解决。SOLiD测序系统可以对由任何方法制成的测序文库进行测序，其最大的特点是使用了双碱基编码技术，该技术具有误差校正功能，因为它是通过两个碱基来对应一个荧光信号而不是传统的一个碱基对应一个荧光信号，这样每一个位点都会被检测两次，因此错误率明显降低。利用常规方法构建测序文库之后，在微反应器中加入测序模板、反应元件、微珠和引物，进行油包水PCR。这一步可以形成数目庞大的独立反应空间以进行扩增。理想状态下，每个反应空间只含一个DNA模板和一个P1磁珠，由水相中的P2引物和磁珠表面的P1引物所介导进行PCR反应，这个DNA模板的拷贝数量呈指数级增加。SOLID测序系统最大的优点就是每张玻片能容纳更高密度的微珠，在同一系统中实现更高的通量。

二代测序系统中，只有SOLiD测序系统以四色荧光标记寡核苷酸进行连续连接合成为基础，使得该方法在系统准确性和下游数据分析上表现出明显的优越性：独特的内置错误检查能力能把测量错误和真正的基因多态性区别开来。SOLiD测序系统适用于基因组测序的同时在转录组测序有很大的优势，例如，釆用SOLiD测序系统对构建的RNA文库进行测序可以快速获得大量数据，即使RNA表达水平很低系统也能够无偏向性地分析样品中存在的已知和未知的RNA而定量测定的RNA差异表达模式，因而可以检测到低丰度的RNA。因此，测序系统在对miRNA和mRNA进行大规模识别及其表达分析方面非常有优势。

在进行高通量测序之前，最重要的步骤莫过于进行测序文库的构建。例如，在SOLiD测序系统DNA测序文库构建中，首先要把基因组DNA随机打断，获得大量的DNA片段，其次选取其中一定范围大小的DNA片段进行末端修复，然后在片段两端连上P1和P2平端接头并进行缺口平移，最后进行扩增反应得到所需要的DNA测序文库。但是，在其文库构建的过程中，往往会出现同一测序片段只有一端连上P1或者P2接头中，而且由于接头连接时具有随意性，还会出现在同一测序片段两端连上同一接头的现象。这样减少接头利用率，降低扩增效率，不利于确定测序文库片段大小，同时提高了分离目的文库片段的难度。

针对SOLiD测序系统，为了解决以上在文库构建中出现的同一测序片段只有一端连上P1或者P2接头和同一测序片段两端连上同一接头的现象，需要设计一种适用于此系统的新的接头，以及采用新接头的一种文库构建新方法。这种新的接头可以提高接头的连接效率和减少错误接头连接的情形，并且接头连接之后目的DNA文库片段易于分离，最终提高测序文库构建的成功率。

发明内容

发明目的：

为了解决上述问题，本发明提供了一种有效提高建库效率的非对称高通量测序接头及其应用，以解决在文库构建的过程中目的DNA片段两端连上同一接头的问题。

技术方案：

本发明提供的一种有效提高建库效率的非对称高通量测序接头，由两条DNA寡核苷酸单链组成。

所述的一种有效提高建库效率的非对称高通量测序接头，其接头是：由两条DNA寡核苷酸单链经过退火得到的接头。其接头序列是：

P1-A：5’CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3’

PY-2：3’GACGGGGCCCAAGGAGTAAGACCGTCAGCCACT(PO₄)5’；

所述的非对称高通量测序接头的结构见附图1。

所述的非对称高通量测序接头中P1-A序列与P1接头的其中一条序列一致，其P1接头为SOLiD测序系统中构建DNA文库所用接头；

所述的P1接头，其序列是由两条DNA寡核苷酸单链经过退火得到的；其的接头序列是：

P1-A:5’CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3’

P1-B:3’TTGGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA5’。

所述的非对称高通量测序接头的PY-2DNA单链中下划线标记部分序列(3’-5’方向)与P2接头中的P2-B单链中下划线标记部分序列(3’-5’方向)一致，横线后面的序列为与P1-A单链对应的互补序列，其P2接头为SOLiD测序系统中构建DNA文库所用接头；

所述的P2接头，其序列是由两条DNA单链经过退火得到的P2接头；其接头序列是：

P2-B：5’AGAGAATGAGGAACCCGGGGCAGTT3’

P2-A：3’TCTCTTACTCCTTGGGCCCCGTC5’。

前述提供的一种有效提高建库效率的非对称高通量测序接头，其为双链DNA接头。

前述提供的一种有效提高建库效率的非对称高通量测序接头，其所述的非对称的设计是为了在测序文库构建的过程中避免目的DNA片段两端连上同一接头的现象。

前述提供的一种有效提高建库效率的非对称高通量测序接头，其所述的接头没有完全互补的一端含有扩增引物的结合位点，可直接用于结合扩增引物，进行扩增反应。

前述提供的一种有效提高建库效率的非对称高通量测序接头，其P1-A3’端为突出末端T(胸腺嘧啶)，其突出末端与DNA片段粘性末端A(腺苷酸)互补配对。

前述提供的一种有效提高建库效率的非对称高通量测序接头，其PY-25’端用磷酸基团修饰，目的是为了在后续的接头连接步骤中更好的与DNA片段相连接。

前述提供的一种有效提高建库效率的非对称高通量测序接头，是将P1-A和PY-2两条DNA寡核苷酸单链溶于无酶水，分别取P1-A单链(100μM)和PY-2单链(100μM)40μl于200μl薄壁PCR管中，加入10μl的10×PCRBuffer和10μl无酶水，经过下列程序退火：95℃，5min；72℃，5min；60℃，5min；50℃，3min；40℃，3min；30℃，3min；20℃，3min；10℃，3min；4℃保存，即得到终浓度为40μM的有效提高建库效率的非对称高通量测序接头溶液。

同时，本发明还提供了一种应用有效提高建库效率的非对称高通量测序接头的建库方法，其采用以下步骤(图20)：

1.对源基因组DNA进行片段化处理，此处的片段化处理方式为超声打断；

2.已片段化的DNA进行2％琼脂糖凝胶电泳，对后续实验所需的DNA片段进行切胶回收。此处所用的切胶回收试剂盒为天根琼脂糖凝胶回收试剂盒；

3.对回收的DNA片段进行末端修复并纯化；

4.对已经末端修复的DNA片段在3’端进行加A处理并纯化；

5.对已经在3’端进行加A(腺苷酸)处理的DNA片段进行接头连接并纯化，所述的接头是本发明中提供的一种有效提高建库效率的非对称高通量测序接头；

6.对已经完成接头连接的DNA片段再一步进行片段选择，此处进行片段选择的方式是E-Gel。(此步可省略)；

7.对选择的片段(或接头连接之后的DNA片段)进行PCR扩增并对PCR产物纯化。扩增及纯化完成之后即为构建的DNA测序文库；

8.对已构建的DNA测序文库进行质控；

在上述步骤中，在文库构建的过程中所用的纯化方式为磁珠纯化。

发明效果：

本发明的实验证明，由于原先SOLiD测序系统所用的P1和P2接头为平端接头，与平端目的DNA片段之间连接效率低下，且存在同一测序片段只有一端连上P1或者P2接头(参见附图8-9)，同一测序片段两端连上同一接头(参见附图10-13)，以及接头自连(参见附图14)的现象，因而会造成连接效率低下和目的DNA文库片段选择的困难。因此，本发明提供了一种有效提高建库效率的非对称高通量测序接头，利用原先接头序列中的两条DNA单链，经过改造并退火形成一个新非对称高通量测序接头，取代原来的两个接头。本发明的实验证明，使用本发明提供的非对称高通量测序接头，只出现了在同一DNA片段的任一端连上非对称高通量测序接头(参见附图16-17)的现象。有效避免在后续文库构建中出现任意两个接头自连，以及目的DNA片段两端连上相同接头的现象，因而降低了分离目的DNA文库片段的难度。利用本发明中的非对称高通量测序接头，最终提高DNA测序文库构建的成功率。

附图说明

图1是本发明中有效提高建库效率的非对称高通量接头的示意图。

图2是本发明实施例中SOLiD测序系统原文库构建方法中E-Gel选择示意图。图中：1，目的DNA片段两端连上两个P1接头和目的DNA片段两端连上正确的P1和P2接头；2，目的DNA片段两端任一端连上一个P1或者P2接头；3，未连上接头目的DNA片段。

图3是本发明实施例中采用应用有效提高建库效率的非对称高通量测序接头的建库方法中的E-Gel选择示意图。图中：4，目的DNA片段两端各连上一个非对称高通量测序接头；5，目的DNA片段两端任一端连上一个非对称高通量测序接头；6，未连上接头的目的DNA片段。

图4是本发明实施例一中Agilent2100HighSensitivityDNALadder的示意图。

图5是本发明实施例一中Agilent2100HighSensitivityDNA检测人舌癌基因组最终文库片段大小的示意图。图中：a为最终文库片段。

图6是本发明实施例一中Agilent2100HighSensitivityDNA检测没有经过E-Gel选择的人舌癌基因组文库片段大小示意图。图中：b为未经E-Gel选择的最终文库片段。

图7本发明实施例二中Agilent2100HighSensitivityDNA检测血液循环核酸文库片段大小示意图。图中：c为未经E-Gel选择的最终文库片段。

图8至图15是SOLiD测序系统原文库构建方法中P1、P2接头与目的DNA片段连接产生的测序文库片段示意图。图中：7，P1接头；8，目的DNA片段；9，P2接头。

图16至图19是本发明中文库构建中使用非对称高通量测序接头与目的DNA片段连接产生的测序文库片段示意图。图中：10，非对称高通量测序接头；11，3’端腺苷酸话的目的DNA片段。

图20是本发明中一种应用有效提高建库效率的非对称高通量测序接头的建库方法的流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，采用SOLiD测序系统的DNA文库构建对本发明进行进一步详细说明。

本发明实施例中样本的来源为人舌癌基因组和人血液中的循环核酸。

一、实施例1：舌癌基因组150bp文库构建

1、基因组DNA片段化(使用CovarisS220超声破碎仪)

(1)取2μg舌癌基因组DNA，根据设置的参数进行超声打断，PeakincidentPower：175、Dutyfactor：10％、CyclesperBurst：200、TreatmentTime(s)：430、Temperature(℃)：7、Waterlevel：12、SampleVolume(μL)：130。

2、2％琼脂糖凝胶电泳(片段选择)

(1)根据DL500分子信标，选择片段大小在140～160bp的片段进行切胶回收。此处所使用的琼脂糖凝胶回收试剂盒为天根琼脂糖凝胶回收试剂盒；

3、DNA片段进行末端修复(此处所用的末端修复试剂盒为EpicentreEnd-it^TMDNAEnd-RepairKit)

(1)取50ng上述大小的片段化DNA进行末端修复：片段化DNA：34μL、10×End-itbuffer：5μL、End-itATP(10mM)：5μL、End-itdNTPs(2.5mM)：5μL、End-itenzymemix：1μL、Nuclease-freeWater：0μL；

(2)室温孵育30min；

(3)将所获得产物进行磁珠纯化，此处所用的磁珠是BeckmanAgencourtAMPureXP核酸纯化磁珠。

4、已末端修复的DNA片段在3’端进行加A处理

(1)对上一步所得的产物(32μL)在3’端进行加A处理：DNA：32μL、NEBBuffer：25μL、dATP(10mM)：1μL、Nuclease-freeWater：9μL、Klenowexo^-：3μL；

(2)37℃孵育30min；

5、接头连接(此处所用接头为本发明所描述非对称高通量测序接头，所用的接头连接试剂盒为NEBQuickLigation^TMKit)

(1)对上一步所得的产物(18μL)进行接头连接：DNA：18μL、2×QμickLigationBuffer：25μL、非对称高通量测序接头Ymix(40pmol/μL)：2μL、QuickT4DNALigase：5μL；

(2)20℃孵育15min；

6、E-Gel片段选择(此步可省略，此处所用的E-Gel为Invitrogen公司生产)

(1)对上一步所得的产物(20μL)进行E-Gel片段选择；

(2)根据E-Gel的操作说明，按顺序上样，对已经连上两个接头的目的DNA片段进行回收。片段DNA大小及E-Gel图片可参见附图3。

7、对选择的片段(或接头连接之后的DNA片段)进行PCR扩增

(1)对上一步所得的产物(25μL)进行PCR扩增；

(2)扩增体系：未扩增的模板DNA：25μL、NEBNextHigh-Fidelity2XPCRMasterMix：50μL、LibraryAmplificationPrimerP1(25μM)：2μL、LibraryAmplificationPrimerP2(25μM)：2μL、Nuclease-freeWater：21μL；

(3)扩增条件：

4℃保存

8、质控

对已构建的文库进行Agilent2100检测。检测结果参见附图4、5、6；

构建成功的文库经过荧光定量PCR之后，进入SOLID测序系统emPCR程序，完成之后进入测序。

二、实施例2：人血液循环核酸文库构建

1、DNA片段末端修复

(1)取100ng循环核酸进行末端修复(此处所用的末端修复试剂盒为EpicentreEnd-itTMDNAEnd-RepairKit)：片段化DNA：34μL、10×End-itbuffer：5μL、End-itATP(10mM)：5μL、End-itdNTPs(2.5mM)：5μL、End-itenzymemix：1μL、Nuclease-freeWater：0μL；

(2)室温孵育30min；

2.已末端修复的DNA片段在3’端进行加A处理

(2)37℃孵育30min；

3.接头连接(此处所用接头为本发明所描述非对称高通量测序接头，所用的接头连接试剂盒为NEBQuickLigation^TMKit)

(2)20℃孵育15min；

4、E-Gel片段选择(此步可省略，此处所用的E-Gel为Invitrogen公司生产)

(1)对上一步所得的产物(20μL)进行E-Gel片段选择；

(2)根据E-Gel的操作说明，按顺序上样，对已经连上两个接头的目的DNA片段进行回收。

5.对选择的片段(或接头连接之后的DNA片段)进行PCR扩增

(1)对上一步所得的产物(25μL)进行PCR扩增；

(2)扩增体系：未扩增的模板DNA25：μL、NEBNextHigh-Fidelity2XPCRMasterMix：50μL、LibraryAmplificationPrimerP1(25μM)：2μL、LibraryAmplificationPrimerP2(25μM)：2μL、Nuclease-freeWater：21μL；

(3)扩增条件：

4℃保存

6、质控

对已构建的文库进行Agilent2100检测。检测结果参见附图7；

三、SOLiD测序系统原文库构建方法与本专利所描述的文库构建方法的结果比较

两种文库构建方法E-Gel比较结果参见附图2和附图3。图2中条带弥散，不利于目的DNA片段的选择。图3中用肉眼能分清3条带，错误的接头连接现象少，有利于目的DNA片段的选择。

而且，在本发明使用非对称高通量测序接头文库构建中，优选地将E-Gel选择这一步骤省略，其最终的文库扩增不受影响，结果参见附图6。

SOLiD测序系统原文库构建方法在进行E-Gel实验时对目的DNA文库片段的选择时难度大，目的DNA文库片段的选择主要依靠实验员的经验与对时间的把握。优选的本发明的非对称高通量测序接头适用于SOLiD测序系统文库构建，并减小了片段选择的难度。而且，如果在本发明所描述的文库构建方法中优选地将E-Gel这一步骤省略，接头连接之后的样本直接进行PCR扩增，那么其最终的文库片段和经过E-Gel选择的文库片段大小相当，结果参见附图5和6。

SOLiD测序系统原文库构建方法中，接头连接会出现多种情形，具体的连接情形参见附图8-15，正确的接头连接情形参见附图15。本专利中所述的非对称高通量测序接头接头连接情形参见附图16-19，正确的接头连接情形参见附图19。通过SOLiD测序系统原接头与本专利中所述的非对称高通量测序接头比较可知，使用非对称高通量测序接头的错误的接头连接情形要比SOLID测序系统中原文库构建方法中错误接头连接情形少，故使用本发明的非对称高通量测序接头可提高在文库构建中的接头连接效率，进而提高构建测序文库的成功率和质量。

SEQUENCELISTING

<110>南京普东兴生物科技有限公司

<120>一种有效提高建库效率的非对称高通量测序接头及其应用

<130>20151008

<160>5

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列PY-2

<220>

<223>在第1位碱基进行磷酸化修饰

<400>1

tcaccgactgccagaatgaggaacccggggcag33

<210>2

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列P1-A

<400>2

ccactacgcctccgctttcctctctatgggcagtcggtgat41

<210>3

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列P1-B

<400>3

atcaccgactgcccatagagaggaaagcggaggcgtagtggtt43

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列P2-B

<400>4

agagaatgaggaacccggggcagtt25

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列P2-A

<400>5

ctgccccgggttcctcattctct23

Claims

1.一种有效提高建库效率的非对称高通量测序接头，其特征在于：所述的接头由两条DNA寡核苷酸单链组成；

所述的接头序列为：

P1-A：5’CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3’

PY-2：3’GACGGGGCCCAAGGAGTAAGACCGTCAGCCACT(PO₄)5’。

2.根据权利要求1所述的有效提高建库效率的非对称高通量测序接头，其特征在于：所述的有效提高建库效率的非对称高通量测序接头的P1-ADNA单链3’端为突出末端T，其中T为胸腺嘧啶。

3.根据权利要求1所述的有效提高建库效率的非对称高通量测序接头，其特征在于：所述的接头的PY-2单链5’端用磷酸基团修饰。

4.根据权利要求1所述的有效提高建库效率的非对称高通量测序接头，其特征在于：所述的接头的制备方法如下：

将所述的P1-A和PY-2两条DNA寡核苷酸单链溶于无酶水，分别取P1-A单链(100μM)和PY-2单链(100μM)40μl于200μl薄壁PCR管中，加入10μl的10×PCRBuffer和10μl无酶水，经过下列程序退火：95℃，5min；72℃，5min；60℃，5min；50℃，3min；40℃，3min；30℃，3min；20℃，3min；10℃，3min；4℃保存，即得到终浓度为40μM的有效提高建库效率的非对称高通量测序接头溶液。

5.根据权利要求1所述的有效提高建库效率的非对称高通量测序接头，其特征在于：所述的接头中单链P1-A的序列与P1接头的其中一条单链的序列一致，其中P1接头为SOLiD测序系统中构建DNA文库所用接头；

上述的P1接头序列为：

P1-A:5’CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3’

P1-B:3’TTGGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA5’。

6.根据权利要求1所述的有效提高建库效率的非对称高通量测序接头，其特征在于：所述的接头的PY-2单链中下划线标记部分序列(3’-5’方向)与P2接头中的P2-B单链中下划线标记部分序列(3’-5’方向)一致，横线后面的序列为与P1-A单链对应的互补序列，其中P2接头为SOLiD测序系统中构建DNA文库所用接头；

上述的P2接头序列为：

P2-B：5’AGAGAATGAGGAACCCGGGGCAGTT3’

P2-A：3’TCTCTTACTCCTTGGGCCCCGTC5’。

7.一种应用权利要求1所述的有效提高建库效率的非对称高通量测序接头的建库方法，其特征在于：所述的建库方法采用以下步骤：

a)对源基因组DNA进行片段化处理；

b)回收实验所需的DNA片段；

c)对回收的DNA片段进行末端修复并纯化；

d)对已经末端修复的DNA片段在3’端进行加A处理并纯化，其中A为腺苷酸；

e)对已经在3’端进行加A处理的DNA片段进行接头连接并纯化；

f)对已经完成接头连接的DNA片段再一步进行片段选择(此步可省略)；

g)对选择的片段(或接头连接之后的DNA片段)进行PCR扩增并对PCR产物纯化，对已构建的DNA测序文库进行质控；

h)质控过后的文库进行emPCR(EmulsionPCR),完成之后在SOLiD测序系统上进行测序。

8.根据权利要求7所述的一种应用有效提高建库效率的非对称高通量测序接头的建库方法，其特征在于：其所述的基因组DNA来源于植物、动物或微生物。

9.根据权利要求7所述的一种应用有效提高建库效率的非对称高通量测序接头的建库方法，其特征在于：测序平台为SOLiD高通量测序仪。