CN114075601B - 一种融合基因原位检测方法、试剂盒及其应用 - Google Patents

一种融合基因原位检测方法、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种融合基因原位检测方法及其试剂盒，所述方法包括：通透细胞；基因组DNA的平末端处理，暴露平末端；暴露融合基因DNA；探针锁定；信号放大；信号检测。本发明还提供了所述融合基因原位检测方法及其试剂盒在癌细胞重排融合基因检测中的应用。本发明的有益的技术效果在于所提供的方法无需核酸提取，细胞用量少；特异性的探针放大目标信号，灵敏度高；对细胞核进行原位检测，鉴定基因位置变化从而确定是否发生基因融合。本发明提供的方法可以用于所有实体肿瘤中人ETV6‑NTRK3融合基因的检测，具有广泛适用性的优点。

Description

一种融合基因原位检测方法、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学和肿瘤学技术领域，具体涉及一种检测人ETV6-NTRK3融合基因的探针、试剂盒、检测方法及应用。
背景技术
近年来，随着分子病理诊断的快速发展。恶性肿瘤的诊断和治疗都有了很明显的进步。恶性肿瘤的发生发展往往是由于抑癌基因的失活和原癌基因的激活共同导致的。ETV6(全名:ETS variant transcription factor 6)基因编码ETS家族转录因子，位于12号染色体，该基因常参与引起血癌和先天性显微肉瘤的染色体重排。NTRK3(全名：neurotrophic receptor tyrosine kinase 3)基因编码NTRK家族成员之一的蛋白，位于15号染色体，该基因的变异与髓母细胞瘤、分泌性乳腺癌和其他一些癌症相关。研究发现，ETV6-NRTK3融合基因表达的产物(部分ETV6基因和NTRK3激酶结构域的基因)是多种癌症发生的原因。根据COSMIC的数据库，进行过融合基因表达测试的乳头状甲状腺癌患者样本中，有约5.1％呈ETV6 Exon4-NTRK3 Exon14融合阳性。进行过融合基因表达测试的肾癌、唾液腺癌、乳腺癌、皮肤癌患者样本中，有约47.14％、66.67％、10.34％、22.95％呈ETV6 Exon5-NTRK3 Exon15融合阳性。
传统的检测方法需要从肿瘤组织提取RNA，进行逆转录，再进行PCR产物测序或者二代高通量测序，以此确定ETV6-NTRK3融合基因表达产物的存在，该检测方法步骤繁琐，耗时较长，且无法在细胞核内对目标基因进行定位。而采用原位检测(原位检测是指保持DNA在细胞核内天然的状态进行检测)，如采用细胞核内定位的方法则更加简单方便和易于观察。
发明内容
本发明提供了一种融合基因原位检测方法，所述融合基因至少包括第一基因和第二基因，所述方法包括：
步骤一：通透细胞；
步骤二：基因组DNA的平末端处理，暴露平末端；
步骤三：暴露融合基因DNA；
步骤四：探针锁定；
步骤五：信号放大；
步骤六：信号检测。
本发明所述的融合基因是指两段及以上基因拼接在一条DNA上，包括两段及以上基因序列的直接连接或间接连接。所述融合基因可以为野生型的融合基因，即在正常的生物体内原本就拼接在一条DNA上的两段及以上基因；也可以是原本不在一起或者原本位于不同染色体上的基因在生物体内自发重排而拼接在一条DNA上的融合基因；也可以是人工拼接在一条DNA上的两段及以上基因。
优选的是，步骤二通过spacer guide RNA和Cas蛋白识别第一基因和/或第二基因位点，将第一或第二基因位点处的基因组DNA平末端化，暴露平末端。spacer guide RNA包括目的核酸的识别序列和Cas蛋白的识别序列，其中目的核酸的识别序列识别第一基因或第二基因，使spacer guide RNA结合于基因组DNA，Cas蛋白的识别序列与Cas蛋白结合，从而使Cas蛋白对spacer guide RNA与目的核酸的结合位点进行酶切，获得平末端。
上述任一项优选的是，步骤三通过核酸外切酶从平末端开始降解双链DNA 5`-3`方向的单链DNA，保留另一条基因组单链DNA。
上述任一项优选的是，步骤四中，基因检测探针与融合基因结合，包括第一基因检测探针和/或第二基因检测探针，所述第一基因检测探针与第一基因单链基因组DNA结合，所述第二基因检测探针与第二基因单链基因组DNA结合，同时在连接酶的作用下，基因检测探针发生环化，形成环化探针。
上述任一项优选的是，步骤五中，所述环化探针以单链基因组DNA结合位置为起点，在聚合酶的作用下进行自我复制，产生大量的含重复序列的单链DNA。
上述任一项优选的是，步骤六中，荧光探针结合在含重复序列的单链DNA上。
上述任一项优选的是，所述第一基因为ETV6，所述第二基因为NTRK3，所述spacerguide RNA序列包含ETV6基因的识别序列或NTRK3基因的识别序列。
上述任一项优选的是，spacer guide RNA序列的ETV6基因的识别序列位于ETV6基因组DNA的内含子或外显子上；进一步优选的位于ETV6基因外显子1-8任一外显子序列上；进一步的，优选位于ETV6基因外显子4或5上；进一步ETV6外显子4spacer guide RNA的靶DNA区域的位于Seq ID NO:11所示核苷酸序列的1-40，20-60，40-80，60-100，80-120，100-135bp的区域；进一步的ETV6外显子5spacer guide RNA的靶DNA区域的位于Seq ID NO:12所示核苷酸序列的1-100，50-150，100-200，150-250，200-300，250-350，300-400，350-450，400-500，450-546bp的区域。
上述任一项优选的是，spacer guide RNA序列的NTRK3基因的识别序列位于NTRK3基因组DNA的内含子或外显子上；进一步优选的位于NTRK3基因外显子1-19任一外显子序列上；进一步的，优选位于NTRK3基因外显子14或15上；进一步NTRK3外显子14spacer guideRNA的靶DNA区域的位于Seq ID NO:13所示核苷酸序列的1-60，30-90，60-120，90-150，120-189bp的区域；进一步NTRK3外显子15spacer guide RNA的靶DNA区域的位于Seq ID NO:14所示核苷酸序列的1-40，20-60，40-80，60-100，80-120，100-131bp的区域。
上述任一项优选的是，spacer guide RNA序列的基因识别序列的长度为20nt。
上述任一项优选的是，所述spacer guide RNA序列包含Seq ID NO:1、2、3、4任一项所示的核苷酸序列。
上述任一项优选的是，所述基因检测探针的核苷酸序列包括基因组DNA结合序列，所述基因组DNA结合序列分布于基因检测探针的3’和5’端；所述基因检测探针的核苷酸序列还包括荧光探针序列。
上述任一项优选的是，所述基因检测探针的基因组DNA结合序列为10-20nt。
上述任一项优选的是，所述基因检测探针包括ETV6检测探针和/或NTRK3基因检测探针。
上述任一项优选的是，所述ETV6检测探针为Seq ID NO:5或Seq ID NO:6所示的核苷酸序列；所述NTRK3基因检测探针为Seq ID NO:7或Seq ID NO:8所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种融合基因原位检测试剂盒，所述融合基因至少包括第一基因和第二基因，利用上述任一项所述的方法对第一基因和第二基因进行检测，包括通透处理体系、平末端处理体系、目的核酸暴露处理体系、探针锁定处理体系、信号放大处理体系、信号检测处理体系和洗液处理体系。
优选的是，所述通透处理体系具体包括：Tris-HCl、CaCl2和蛋白酶K。
上述任一项优选的是，所述平末端处理体系具体包括：spacer guide RNA、Cas蛋白、Hepes buffer、KCl、MgCl2和无核酸酶超纯水。
上述任一项优选的是，所述目的核酸暴露处理体系具体包括：Exonucleasebuffer、Lambda核酸外切酶和无核酸酶超纯水。
上述任一项优选的是，所述探针锁定处理体系具体包括：DNA Ligase buffer、ATP、50％PEG4000、ETV6 Exon4探针、NTRK3 Exon14探针、DNA连接酶和无核酸酶超纯水；或DNA Ligase buffer、ATP、50％PEG4000、ETV6 Exon5探针、NTRK3 Exon15探针、DNA连接酶和无核酸酶超纯水。
上述任一项优选的是，所述信号放大处理体系具体包括：DNA polymerasebuffer、DTT、dNTPs、DNA聚合酶和无核酸酶超纯水。
上述任一项优选的是，所述信号检测处理体系具体包括：甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、鲑鱼精子DNA、荧光探针和无核酸酶超纯水。
上述任一项优选的是，荧光探针序列是如Seq ID NO:9或Seq ID NO:10所示的核苷酸序列。
上述任一项优选的是，所述荧光探针标记的荧光为Alex488或Cy3。
上述任一项优选的是，所述清洗处理体系具体包括：Tris-HCl、NaCl、Tween20和无核酸酶超纯水。
本发明提供了上述任一项融合基因原位检测方法及其试剂盒，在癌症基因融合表达检测中的应用。进一步的，用于对癌症融合基因进行原位检测。
在本发明具体的实施方式中提供了一种人ETV6-NTRK3融合基因的检测方法。本方法具有需求样本量少，无需提取RNA，成本低，灵敏度高，特异性好，操作简单便捷的特点。
本发明提供的一种人ETV6-NTRK3融合基因的检测试剂盒，由上述任一项所述的通透处理体系、平末端处理体系、目的核酸暴露处理体系、探针锁定处理体系、信号放大处理体系、信号检测处理体系和洗液处理体系组成。
进一步的，本发明所提供的一种人ETV6-NTRK3融合基因的检测方法，其步骤如下：
(1)待检测样本固定好后，使用通透处理体系通透细胞，清洗。
(2)使用平末端处理体系细胞基因组DNA，暴露平末端，清洗。
(3)使用目的核酸暴露处理体系，从平末端开始降解双链DNA 5’-3’方向的单链DNA，保留另一条基因组单链DNA，清洗。
(4)使用探针锁定处理体系，在探针结合目的核酸同时连接酶将其环化，清洗，并用70％，85％，100％的乙醇-水溶液梯度脱水晾干。
(5)使用信号放大处理体系，环化探针以单链基因组DNA结合位置为起点，在聚合酶的作用下进行自我复制，产生大量的含重复序列的单链DNA，清洗。
(6)使用信号检测处理体系，荧光探针结合在含重复序列的单链DNA上，清洗，并用70％，85％，100％的乙醇-水溶液梯度脱水晾干。
(7)使用封片剂。
(8)最终在荧光显微镜下观察记录结果。
本发明提供的融合基因原位检测方法及其试剂盒还可以应用于人工合成融合基因的检测及鉴定，例如，人工构建的重组融合蛋白基因的检测和鉴定。
本发明的优点和积极效果是：
1.本发明提供的方法无需核酸提取。因此，可以用少量的细胞或者临床组织样本进行检测。
2.本发明提供的方法通过特异性的探针放大目标信号。因此，可以观察细胞或者临床组织样本中是否存在ETV6-NTRK3融合基因。
3.本发明提供的方法可以用于所有实体肿瘤中人ETV6-NTRK3融合基因的检测。因此，具有广泛适用性的优点。
附图说明
图1为本发明一种融合基因原位检测方法的工作示意图；
图2为本发明优选实施例一种人ETV6-NTRK3融合基因的检测方法在体外细胞系中的应用；
具体实施方式
下面结合实例，对本发明进行进一步说明，下述实例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
实施例1
实施例1所述的一种检测人ETV6-NTRK3融合基因的方法的工作原理如图1所示，ETV6是定位于人12号染色体p13.2的编码基因，NTRK3是定位于人15号染色体q25.3的编码基因。多种癌症患者的组织样本中检测到了ETV6-NTRK3基因的重排后融合基因的表达，其mRNA上检测出ETV6基因的4号和5号外显子，NTRK3基因的14号和15号外显子。本发明方法首先利用蛋白酶K将细胞核膜打孔，然后通过spacer guide RNA和Cas9切割其目标双链DNA，暴露出平末端。紧接着在核酸外切酶的作用下，从平末端开始降解双链DNA中的5’-3’端的一条链。至此，探针结合的靶基因组单链DNA被暴露出来。最后，探针在连接酶的作用下在结合位点环化形成闭合环状单链DNA，这个DNA在聚合酶的作用下，线性自我复制，其产生的序列中有大量人类基因上没有的DNA重复序列，特异性荧光探针通过跟这些重复序列结合来显示探针在细胞核内的定位。从而检测出ETV6基因4号外显子、5号外显子和NTRK3基因14号外显子、15号外显子在细胞核内的定位，进而通过不同外显子之间的相互定位判断是否存在ETV6-NTRK3融合基因。
实施例1提供的一种人ETV6-NTRK3融合基因的方法，由通透处理体系、平末端处理体系、目的核酸暴露处理体系、探针锁定处理体系、信号放大处理体系、信号检测处理体系组成。
实施例1所述通透处理体系具体包括：Tris-HCl、CaCl2和蛋白酶K，其中蛋白酶浓度为5ug/mL～100ug/mL。所述试剂均为本领域常用生化试剂，均为商业化产品。
实施例1所述平末端处理体系具体包括：1×Cas buffer、Cas9酶、spacer guideRNA和无核酸酶超纯水，其中1×Cas buffer的配方为20mM/L Hepes、100mM/L KCl、5mM/LMgCl2、1mM DTT、0.1mg/mL BSA，5％甘油。Cas9酶以及spacer guide RNA为自制，其余试剂均为本领域常用生化试剂，均为商业化产品。
实施例1中Cas9酶的制备步骤包括：构建表达Cas9酶的工程菌，诱导表达Cas9蛋白，经过亲和层析纯化后获得Cas9酶。其中，Cas9蛋白编码序列为如Seq ID NO:15所示的核苷酸序列，Cas9蛋白C端融合表达了His标签。上述编码基因被克隆进了pET21b(+)载体，转入ER2566菌株中，利用IPTG进行了诱导表达，表达的蛋白通过镍柱与His标签的相互作用被纯化出来，进行后续的实验。具体的实验步骤记载与pET21b(+)载体、分子克隆等现有文献及工具书中，在此不进行赘述。
实施例1中Spacer guide RNA的自制过程：构建表达spacer guide RNA的质粒，利用RNA聚合酶进行体外转录，之后纯化获得RNA。具体的，首先构建了T7 sgRNA表达载体，该载体以从Addgene上获得的px330为骨架改造。主要功能序列为Seq ID NO:16所示的核苷酸序列。体外转录体系由质粒、T7 RNA聚合酶(NEB)、T7 RNA聚合酶buffer(NEB)、NTPs和无核酸酶超纯水组成。RNA纯化采用通用的Trizol提取RNA的方法进行。具体操作均为本领域常规技术，参照各商业化产品的说明书及分子克隆等工具书，在此不进行赘述。
实施例1所述目的核酸暴露处理体系具体包括：1×Exonuclease buffer、核酸外切酶和无核酸酶超纯水，其中1×Exonuclease buffer的配方为50mM/L乙酸钾、20mM/LTri-acetate、10mM/L乙酸镁、0.1mg/mL BSA，核酸外切酶0.4U/μL。这些试剂均为本领域常用生化试剂。
实施例1所述探针锁定处理体系具体包括：1x DNA Ligase buffer、500nM/L ATP、DNA连接酶、探针和无核酸酶超纯水，其中1x DNA Ligase buffer配方为40mM/L Tris-HCl、10mM/L氯化镁、10mM/L DTT、0.5mM/L ATP，DNA 0.05Weiss U/μL，ETV6 Exon4探针和NTRK3Exon14探针组合，或ETV6 Exon5探针和NTRK3 Exon15组合，终浓度为100μM/L。这些试剂均为本领域常用生化试剂。
实施例1所述信号放大处理体系具体包括：1x DNA polymerase buffer、1mM/LDTT、2.5mM/L dNTPs、DNA聚合酶和无核酸酶超纯水，其中1x DNA polymerase buffer的配方为33mM/L Tris-乙酸、10mM/L乙酸镁、66mM/L乙酸钾、0.1％(v/v)Tween20，DNA聚合1U/L。这些试剂均为本领域常用生化试剂。
而且，所述信号检测处理体系具体包括：20％(v/v)甲酰胺、0.3M/L NaCl、0.03M/L柠檬酸钠、0.5ug/uL鲑鱼精子DNA、100μM/L Alex488荧光探针、100μM/L Cy3荧光探针和无核酸酶超纯水。这些试剂均为本领域常用生化试剂。
实施例1所述清洗处理体系具体包括：Tris-HCl、NaCl和Tween20和无核酸酶超纯水，其中Tris-HCl的浓度为0.1M/L，NaCl的浓度为0.15M/L，Tween20浓度为0.05％(v/v)。这些试剂均为本领域常用生化试剂。
实施例1提供的一种人ETV6-NTRK3融合基因原位检测方法，其具体步骤如下：
(1)待检测样本固定好后，使用通透处理体系通透细胞。体外细胞固定好后在37℃环境下处理3～4分钟；临床组织样本在37℃环境下处理15至20分钟。完成后弃掉液体，放入超纯水中，最后70％、85％、100％乙醇水溶液脱水晾干。
(2)使用平末端处理体系，暴露基因组DNA平末端。配制反应体系，将10×Casbuffer用无核酸酶超纯水稀释至1×Cas9酶的终浓度为0.5ug/μL，spacer guide RNA20nM，37℃处理1小时。完成后弃掉液体，用清洗液清洗，再弃掉清洗液。
(3)使用目的核酸暴露处理体系，从平末端开始沿着5’-3’方向降解单链DNA，保留另一条基因组单链DNA。配制核酸外切酶反应体系，将10×Exonuclease buffer用无核酸酶超纯水稀释至1×，核酸外切酶的终浓度为0.2U/μL，37℃处理0.5小时。完成后弃掉液体，用清洗液清洗，再弃掉清洗液。
(4)使用探针锁定处理体系，将探针形成环状DNA。配制探针锁定处理体系，将10×DNA Ligase buffer用无核酸酶超纯水稀释至1×，10mM/L ATP稀释至0.5mM/L，50％PEG4000稀释至5％，100nM ETV6 Exon4探针和NTRK3 Exon14探针组合，或ETV6 Exon5探针和NTRK3 Exon15，DNA连接酶的终浓度为0.05Weiss U/μL，37℃处理1小时。完成后弃掉液体，用清洗液清洗，再弃掉清洗液，最后70％、85％、100％乙醇水溶液脱水晾干。
(5)使用信号放大处理体系，环状探针DNA以单链基因组DNA结合位置为起点，在聚合酶的作用下进行自我复制，产生含大量重复序列的单链DNA。配制信号放大处理体系，将10×DNA polymerase buffer用无核酸酶超纯水稀释至1×，100mM/L DTT稀释至1mM/L，10mM/L dNTPs稀释至0.25mM/L，DNA聚合酶的终浓度为1U/μL，44℃处理1小时。完成后弃掉液体，用清洗液清洗，再弃掉清洗液。
(6)使用信号检测处理体系，荧光探针结合在含重复序列的单链DNA上。配制探针结合处理体系，甲酰胺终浓度20％(v/v)，NaCl终浓度为0.3M/L、柠檬酸钠终浓度为0.03M/L、10ug/uL鲑鱼精子DNA稀释至0.5μg/μL，荧光探针的终浓度为100μM/L，37℃处理10分钟。完成后弃掉液体，用清洗液清洗，再弃掉清洗液，最后70％、85％、100％乙醇水溶液脱水晾干。
(7)加入含DAPI的封片剂，封片。
(8)最终在荧光显微镜下观察记录结果。
实施例2
实施例2是将实施例1提供的ETV6-NTRK3融合基因的原位检测方法应用于重排的融合基因检测应用的实验例。选用的是HMy2.CIR体外细胞系。
从中国科学院细胞库获得细胞系HMy2.CIR。离心收集细胞后，用4％PFA固定10分钟，接着在超纯水中处理3分钟，将样本拿出晾干后，滴加通透处理反应液20μL，湿盒中37℃处理3分钟，放入洗液缸中清洗一次；加入平末端处理反应液15μL，湿盒中37℃处理1小时，放入洗液缸中清洗一次；加入目的核酸暴露处理反应液15μL，湿盒中37℃处理0.5小时，放入洗液缸中清洗一次；加入探针锁定处理反应液15μL，湿盒中37℃处理0.5小时，放入洗液缸中清洗一次，乙醇梯度处理脱水；晾干后，加入信号放大处理反应液15μL，湿盒中44℃处理1小时，放入洗液缸中清洗一次；加入信号检测处理反应液15μL，湿盒中37℃避光处理15分钟，放入洗液缸中清洗一次，乙醇梯度处理脱水；晾干后，加入适量封片剂，封片；荧光显微镜下观察结果。以显微镜下蓝色的细胞核为定位，荧光斑点为阳性结果，红色荧光指示NTRK基因在细胞核中的位置，绿色荧光指示ETV6基因在细胞核中的位置，从而指示基因的融合，结果如图2所示。
实施例3
实施例3与实施例1或2相似，不同的是探针的选择，实施例3同时选用3中或4中基因检测探针。
如：同时加入Seq ID NO:4、Seq ID NO:5、Seq ID NO:7、Seq ID NO:8所示的基因检测探针；或同时加入Seq ID NO:4、Seq ID NO:7、Seq ID NO:8所示的基因检测探针；或同时加入Seq ID NO:5、Seq ID NO:7、Seq ID NO:8所示的基因检测探针；或同时加入Seq IDNO:4、Seq ID NO:5、Seq ID NO:8所示的基因检测探针；或同时加入Seq ID NO:4、Seq IDNO:5、Seq ID NO:7所示的基因检测探针。
序列表
<110> 派德洛格（天津）生物科技有限公司
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<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
uuuucaccau ucuuccaccc 20
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggcuuacaug aaccacauca 20
<210> 3
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccacugcacc acaucaacca 20
<210> 4
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agccuuugga aaggucuucc 20
<210> 5
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acagccggag gtcaccctcg catcaatacc gatcatctct tcccctcgca tcaataccga 60
tcatcccctg gaaactctat acacac 86
<210> 6
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctgaagagc acgcccctcg catcaatacc gatcatctct tcccctcgca tcaataccga 60
tcatccatgg tctctgtctc cccg 84
<210> 7
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccctcgtcac tggatctgcg aatagccatc cactccattc ttctgcgaat agccatccac 60
tccatccacg gcatcaccac g 81
<210> 8
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cctcagcccg accctgcgaa tagccatcca ctccattctt ctgcgaatag ccatccactc 60
catcctggcc gagtgctaca a 81
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccctcgcatc aataccgatc atc 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctgcgaatag ccatccactc cat 23
<210> 11
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtgatgtgct ctatgaactc cttcagcata ttctgaagca gaggaaacct cggattcttt 60
tttcaccatt cttccaccct ggaaactcta tacacacaca gccggaggtc atactgcatc 120
agaaccatga agaag 135
<210> 12
<211> 546
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ataactgtgt ccagaggacc cccaggccat ccgtggataa tgtgcaccat aaccctccca 60
ccattgaact gttgcaccgc tccaggtcac ctatcacgac aaatcaccgg ccttctcctg 120
accccgagca gcggcccctc cggtcccccc tggacaacat gatccgccgc ctctccccgg 180
ctgagagagc tcagggaccc aggccgcacc aggagaacaa ccaccaggag tcctaccctc 240
tgtcagtgtc tcccatggag aataatcact gcccagcgtc ctccgagtcc cacccgaagc 300
catccagccc ccggcaggag agcacacgcg tgatccagct gatgcccagc cccatcatgc 360
accctctgat cctgaacccc cggcactccg tggatttcaa acagtccagg ctctccgagg 420
acgggctgca tagggaaggg aagcccatca acctctctca tcgggaagac ctggcttaca 480
tgaaccacat catggtctct gtctccccgc ctgaagagca cgccatgccc attgggagaa 540
tagcag 546
<210> 13
<211> 189
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtcccgtggc tgtcatcagt ggtgaggagg actcagccag cccactgcac cacatcaacc 60
acggcatcac cacgccctcg tcactggatg ccgggcccga cactgtggtc attggcatga 120
ctcgcatccc tgtcattgag aacccccagt acttccgtca gggacacaac tgccacaagc 180
cggacacgt 189
<210> 14
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atgtgcagca cattaagagg agagacatcg tgctgaagcg agaactgggt gagggagcct 60
ttggaaaggt cttcctggcc gagtgctaca acctcagccc gaccaaggac aagatgcttg 120
tggctgtgaa g 131
<210> 15
<211> 4131
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atggacaaga agtacagcat cggcctggac atcggcacca actctgtggg ctgggccgtg 60
atcaccgacg agtacaaggt gcccagcaag aaattcaagg tgctgggcaa caccgaccgg 120
cacagcatca agaagaacct gatcggagcc ctgctgttcg acagcggcga aacagccgag 180
gccacccggc tgaagagaac cgccagaaga agatacacca gacggaagaa ccggatctgc 240
tatctgcaag agatcttcag caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccacaga 300
ctggaagagt ccttcctggt ggaagaggat aagaagcacg agcggcaccc catcttcggc 360
aacatcgtgg acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca cctgagaaag 420
aaactggtgg acagcaccga caaggccgac ctgcggctga tctatctggc cctggcccac 480
atgatcaagt tccggggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caacagcgac 540
gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggaaaacccc 600
atcaacgcca gcggcgtgga cgccaaggcc atcctgtctg ccagactgag caagagcaga 660
cggctggaaa atctgatcgc ccagctgccc ggcgagaaga agaatggcct gttcggaaac 720
ctgattgccc tgagcctggg cctgaccccc aacttcaaga gcaacttcga cctggccgag 780
gatgccaaac tgcagctgag caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc 840
cagatcggcg accagtacgc cgacctgttt ctggccgcca agaacctgtc cgacgccatc 900
ctgctgagcg acatcctgag agtgaacacc gagatcacca aggcccccct gagcgcctct 960
atgatcaaga gatacgacga gcaccaccag gacctgaccc tgctgaaagc tctcgtgcgg 1020
cagcagctgc ctgagaagta caaagagatt ttcttcgacc agagcaagaa cggctacgcc 1080
ggctacattg acggcggagc cagccaggaa gagttctaca agttcatcaa gcccatcctg 1140
gaaaagatgg acggcaccga ggaactgctc gtgaagctga acagagagga cctgctgcgg 1200
aagcagcgga ccttcgacaa cggcagcatc ccccaccaga tccacctggg agagctgcac 1260
gccattctgc ggcggcagga agatttttac ccattcctga aggacaaccg ggaaaagatc 1320
gagaagatcc tgaccttccg catcccctac tacgtgggcc ctctggccag gggaaacagc 1380
agattcgcct ggatgaccag aaagagcgag gaaaccatca ccccctggaa cttcgaggaa 1440
gtggtggaca agggcgcttc cgcccagagc ttcatcgagc ggatgaccaa cttcgataag 1500
aacctgccca acgagaaggt gctgcccaag cacagcctgc tgtacgagta cttcaccgtg 1560
tataacgagc tgaccaaagt gaaatacgtg accgagggaa tgagaaagcc cgccttcctg 1620
agcggcgagc agaaaaaggc catcgtggac ctgctgttca agaccaaccg gaaagtgacc 1680
gtgaagcagc tgaaagagga ctacttcaag aaaatcgagt gcttcgactc cgtggaaatc 1740
tccggcgtgg aagatcggtt caacgcctcc ctgggcacat accacgatct gctgaaaatt 1800
atcaaggaca aggacttcct ggacaatgag gaaaacgagg acattctgga agatatcgtg 1860
ctgaccctga cactgtttga ggacagagag atgatcgagg aacggctgaa aacctatgcc 1920
cacctgttcg acgacaaagt gatgaagcag ctgaagcggc ggagatacac cggctggggc 1980
aggctgagcc ggaagctgat caacggcatc cgggacaagc agtccggcaa gacaatcctg 2040
gatttcctga agtccgacgg cttcgccaac agaaacttca tgcagctgat ccacgacgac 2100
agcctgacct ttaaagagga catccagaaa gcccaggtgt ccggccaggg cgatagcctg 2160
cacgagcaca ttgccaatct ggccggcagc cccgccatta agaagggcat cctgcagaca 2220
gtgaaggtgg tggacgagct cgtgaaagtg atgggccggc acaagcccga gaacatcgtg 2280
atcgaaatgg ccagagagaa ccagaccacc cagaagggac agaagaacag ccgcgagaga 2340
atgaagcgga tcgaagaggg catcaaagag ctgggcagcc agatcctgaa agaacacccc 2400
gtggaaaaca cccagctgca gaacgagaag ctgtacctgt actacctgca gaatgggcgg 2460
gatatgtacg tggaccagga actggacatc aaccggctgt ccgactacga tgtggaccat 2520
atcgtgcctc agagctttct gaaggacgac tccatcgaca acaaggtgct gaccagaagc 2580
gacaagaacc ggggcaagag cgacaacgtg ccctccgaag aggtcgtgaa gaagatgaag 2640
aactactggc ggcagctgct gaacgccaag ctgattaccc agagaaagtt cgacaatctg 2700
accaaggccg agagaggcgg cctgagcgaa ctggataagg ccggcttcat caagagacag 2760
ctggtggaaa cccggcagat cacaaagcac gtggcacaga tcctggactc ccggatgaac 2820
actaagtacg acgagaatga caagctgatc cgggaagtga aagtgatcac cctgaagtcc 2880
aagctggtgt ccgatttccg gaaggatttc cagttttaca aagtgcgcga gatcaacaac 2940
taccaccacg cccacgacgc ctacctgaac gccgtcgtgg gaaccgccct gatcaaaaag 3000
taccctaagc tggaaagcga gttcgtgtac ggcgactaca aggtgtacga cgtgcggaag 3060
atgatcgcca agagcgagca ggaaatcggc aaggctaccg ccaagtactt cttctacagc 3120
aacatcatga actttttcaa gaccgagatt accctggcca acggcgagat ccggaagcgg 3180
cctctgatcg agacaaacgg cgaaaccggg gagatcgtgt gggataaggg ccgggatttt 3240
gccaccgtgc ggaaagtgct gagcatgccc caagtgaata tcgtgaaaaa gaccgaggtg 3300
cagacaggcg gcttcagcaa agagtctatc ctgcccaaga ggaacagcga taagctgatc 3360
gccagaaaga aggactggga ccctaagaag tacggcggct tcgacagccc caccgtggcc 3420
tattctgtgc tggtggtggc caaagtggaa aagggcaagt ccaagaaact gaagagtgtg 3480
aaagagctac tggggatcac catcatggaa agaagcagct tcgagaagaa tcccatcgac 3540
tttctggaag ccaagggcta caaagaagtg aaaaaggacc tgatcatcaa gctgcctaag 3600
tactccctgt tcgagctgga aaacggccgg aagagaatgc tggcctctgc cggcgaactg 3660
cagaagggaa acgaactggc cctgccctcc aaatatgtga acttcctgta cctggccagc 3720
cactatgaga agctgaaggg ctcccccgag gataatgagc agaaacagct gtttgtggaa 3780
cagcacaagc actacctgga cgagatcatc gagcagatca gcgagttctc caagagagtg 3840
atcctggccg acgctaatct ggacaaagtg ctgtccgcct acaacaagca ccgggataag 3900
cccatcagag agcaggccga gaatatcatc cacctgttta ccctgaccaa tctgggagcc 3960
cctgccgcct tcaagtactt tgacaccacc atcgaccgga agaggtacac cagcaccaaa 4020
gaggtgctgg acgccaccct gatccaccag agcatcaccg gcctgtacga gacacggatc 4080
gacctgtctc agctgggagg cgacagcgct catcaccatc accatcacta a 4131
<210> 16
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
taatacgact cactataggg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag 60
ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgctttttt 119

Claims (2)

1.一种融合基因原位检测试剂盒，所述融合基因为ETV6基因和NTRK3基因，其特征在于，所述试剂盒包括通透处理体系、平末端处理体系、目的核酸暴露处理体系、探针锁定处理体系、信号放大处理体系、信号检测处理体系和洗液处理体系，
所述通透处理体系包括Tris-HCl、CaCl2和蛋白酶K；
所述平末端处理体系包括spacer guide RNA 、Cas蛋白、Hepes buffer、KCl、MgCl2和无核酸酶超纯水；所述spacer guide RNA序列为Seq ID NO:1所示的核苷酸序列和Seq IDNO:3所示的核苷酸序列；
所述目的核酸暴露处理体系包括Exonuclease buffer、Lambda核酸外切酶和无核酸酶超纯水；
所述探针锁定处理体系包括DNA Ligase buffer、ATP、50% PEG4000、ETV6 Exon4探针、NTRK3 Exon14探针、DNA连接酶和无核酸酶超纯水；所述ETV6 Exon4探针为Seq ID NO:5所示的核苷酸序列；所述NTRK3 Exon14探针为Seq ID NO:7所示的核苷酸序列；
所述信号放大处理体系包括DNA polymerase buffer、DTT、dNTPs、DNA聚合酶和无核酸酶超纯水；
所述信号检测处理体系包括甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、鲑鱼精子DNA、荧光探针和无核酸酶超纯水；所述荧光探针序列为Seq ID NO:9所示的核苷酸序列和Seq ID NO:10所示的核苷酸序列；
所述洗液处理体系Tris-HCl、NaCl、Tween20和无核酸酶超纯水。
2.一种融合基因原位检测试剂盒，所述融合基因为ETV6基因和NTRK3基因，其特征在于，所述试剂盒包括通透处理体系、平末端处理体系、目的核酸暴露处理体系、探针锁定处理体系、信号放大处理体系、信号检测处理体系和洗液处理体系，
所述通透处理体系包括Tris-HCl、CaCl2和蛋白酶K；
所述平末端处理体系包括spacer guide RNA 、Cas蛋白、Hepes buffer、KCl、MgCl2和无核酸酶超纯水；所述spacer guide RNA序列为Seq ID NO:2所示的核苷酸序列和 Seq IDNO:4所示的核苷酸序列；
所述目的核酸暴露处理体系包括Exonuclease buffer、Lambda核酸外切酶和无核酸酶超纯水；
所述探针锁定处理体系包括DNA Ligase buffer、ATP、50% PEG4000、ETV6 Exon5探针、NTRK3 Exon15探针、DNA连接酶和无核酸酶超纯水；所述ETV6 Exon5探针为Seq ID NO:6所示的核苷酸序列；所述NTRK3 Exon15探针为Seq ID NO:8所示的核苷酸序列；
所述信号放大处理体系包括DNA polymerase buffer、DTT、dNTPs、DNA聚合酶和无核酸酶超纯水；
所述信号检测处理体系包括甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、鲑鱼精子DNA、荧光探针和无核酸酶超纯水；所述荧光探针序列为Seq ID NO:9所示的核苷酸序列和Seq ID NO:10所示的核苷酸序列；
所述洗液处理体系Tris-HCl、NaCl、Tween20和无核酸酶超纯水。
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