ES2226112T3 - Procedimiento para hibridacion substractiva y analisis diferencial. - Google Patents
Procedimiento para hibridacion substractiva y analisis diferencial.Info
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Abstract
SE EXPONEN PROCEDIMIENTOS PERFECCIONADOS PARA OBTENER POLINUCLEOTIDOS QUE COMPRENDEN SECUENCIAS QUE DIFIEREN ENTRE DOS POBLACIONES DE DNA O DNAC. ENTRE LOS PERFECCIONAMIENTOS SE INCLUYEN LA DISMINUCION DEL NUMERO DE CICLOS DE AMPLIFICACION, EL USO DE UNA ETAPA DE DIGESTION DE LA NUCLEASA ANTES DE LA AMPLIFICACION, UN NUEVO ADAPTADOR DE OLIGONUCLEOTIDOS PARA LA PRACTICA DEL PROCEDIMIENTO PERFECCIONADO, Y NUEVOS PROCEDIMIENTOS PARA AMPLIFICACION SELECTIVA DE LOS FRAGMENTOS UNICOS DESEADOS Y DEGRADACION SELECTIVA DE FRAGMENTOS QUE CONTENGAN SECUENCIAS COMUNES A AMBAS POBLACIONES. LOS FRAGMENTOS DE UNA POBLACION DE MUESTRA SE AMPLIFICAN UTILIZANDOSE UN INICIADOR QUE DOTA A LOS PRODUCTOS DE AMPLIFICACION DE RESISTENCIA A LA DEGRADACION DE LA NUCLEASA. OTROS FRAGMENTOS DE UNA POBLACION DE CONTROL SE AMPLIFICAN, USANDOSE UN INICIADOR QUE SE DIRIGE A LOS PRODUCTOS DE AMPLIFICACION PARA DEGRADACION PREFERENTE. CON EL FIN DE ENRIQUECER LOS FRAGMENTOS PROPIOS DE LA POBLACION DE MUESTRA, SE UTILIZAN CICLOS MULTIPLES DE HIBRIDIZACION, TRATAMIENTO CON NUCLEASA Y AMPLIFICACION. ESTOS FRAGMENTOS UNICOS PODRIAN REPRESENTAR SECUENCIAS NUEVAS O AMPLIFICADAS DE LA MISMA POBLACION, SECUENCIAS QUE SE ENCUENTRAN DISPUESTAS DE MANERA DIFERENTE EN LA MISMA POBLACION, COMPARADAS CON LA POBLACION DE CONTROL, Y SECUENCIAS QUE SE EXPRESAN DE MANERA DIFERENCIAL EN UNA POBLACION DE ADNC. UNA VARIACION DE LA TECNICA PERMITE IGUALMENTE EL AISLAMIENTO DE FRAGMENTOS QUE REPRESENTAN SUPRESIONES EN LA POBLACION DE MUESTRA.
Description
Procedimiento para hibridación substractiva y
análisis diferencial.
El invento se encuentra situado en el campo del
análisis genético. El invento se refiere a métodos para el
aislamiento de polinucleótidos, que comprenden secuencias de ácidos
nucleicos que se expresan diferencialmente, están presentes
diferencialmente, o se disponen diferencialmente en dos o más
diferentes células, poblaciones de células o tipos de células,
utilizando técnicas de hibridación substractiva y amplificación
selectiva.
La capacidad para detectar diferencias entre dos
poblaciones de secuencias de ácidos nucleicos, es importante para
caracterizar la base molecular de diversos estados patológicos, por
ejemplo neoplasias, enfermedades infecciosas y degenerativas,
infecciones víricas y predisposición hereditaria a enfermedades. De
un modo creciente, la técnica de hibridación substractiva está
siendo usada para identificar polinucleótidos que comprenden
secuencias que están presentes en una primera población de
secuencias de ácidos nucleicos, pero están ausentes, presentes en
una concentración diferente, o dispuestas de una manera diferente en
una segunda población.
Sargent y Dawid, Science 222:
135-139 (1983) usaron una hibridación substractiva
para aislar ADNc's (ácidos desoxirribonucleicos complementarios)
que representan moléculas de ARNm`s (ácidos ribonucleicos
mensajeros) expresadas preferentemente en el estadio de gástrula del
desarrollo del embrión de una rana. El ADNc de gástrula era
hibridado para formar un ARN a partir de huevos no fertilizados y
el ADNc que no se hibridaba era clonado. Estas secuencias clonadas
representaban unos ARNm's que eran expresados diferencialmente en
la gástrula de una rana. Similarmente, Hedrick y colaboradores,
Nature (Londres) 308: 149-153 (1984) clonaron
una molécula de un receptor de células T hibridando un ADNc
procedente de células T específicas para ciertos antígenos con un
ARN procedente de células B, y recogiendo el ADNc no hibridado. A
pesar de estos éxitos tempranos, prontamente resultó evidente que
este método está limitado en la práctica a la detección de ARNm's
expresados diferencialmente, que representan un 0,01% o más de la
población total de ARNm. Además, en los casos en los que es
práctico el método, la selección del ADNc expresado
diferencialmente (como un material de una sola hebra =
monocatenario) se consigue mediante una cromatografía con
hidroxiapatito, que es complicada y da como resultado pérdidas de
un material valioso. Finalmente, esta técnica no proporciona ningún
método para detectar diferencias en la organización de un genoma,
tales como una supresión (= deleción), y una amplificación, o un
reajuste (= redisposicion) de genes.
Se han desarrollado ciertas adaptaciones de la
técnica de hibridación substractiva, que permiten la identificación
y el aislamiento de polinucleótidos que representan diferencias de
secuencias entre diferentes genomas. Lamar y Palmer, Cell
37: 171-177 (1984) usaron un enfoque de
clonación selectiva para aislar secuencias específicas para un
cromosoma Y en un ratón. Se realizaron hibridaciones usando un ADN
masculino digerido con enzimas de restricción como rastreador
(trazador), y un ADN femenino tratado por ultrasonidos (= sonicado)
como conductor. De los dúplex obtenidos después de una asociación,
solamente los que tienen ambas hebras derivadas de un ADN masculino
contienen secuencias singulares (únicas) para el cromosoma Y, y
poseen en cada extremo un sitio de reconocimiento por enzimas de
restricción. Dichos dúplex eran clonados de una manera preferente
dentro de un vector que contenía extremos generados con enzimas de
restricción compatibles.
Kunkel y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 82: 4778-4782 (1985), y Nussbaum y
colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:
6521-6525 (1987) describieron el aislamiento de
fragmentos que contenían secuencias suprimidas a partir de un
cromosoma X humano por hibridación de un ADN digerido con enzimas
de restricción a partir de células que eran polisómicas para el
cromosoma X con un exceso de ADN cortado procedente de células que
albergaban una o más supresiones (= deleciones) del cromosoma X,
usando unas condiciones en las que se había aumentado la velocidad
de reasociación. Una clonación selectiva, que usaba un vector con
extremos generados por enzimas de restricción compatibles, se usó
para el aislamiento de secuencias que estaban ausentes en las
supresiones del cromosoma X.
Strauss y Ausubel, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 87: 1889-1893 (1990) describieron
una técnica para aislar un polinucleótido que comprendía un ADN que
está ausente en un mutante por supresión de una levadura. En este
método, se deja que un ADN de tipo salvaje, desnaturalizado, se
asocie con un ADN marcado con biotina, procedente del mutante por
supresión, y se retiran de la solución unos dúplex que contienen
biotina (los cuales contienen secuencias comunes para el mutante y
para el tipo salvaje) por fijación a unos glóbulos revestidos con
avidina. El proceso se repite durante varios ciclos, con adición de
un ADN de tipo salvaje biotinilado, recientemente obtenido, al ADN
mutante que permanece sin fijar al final de cada ciclo. Finalmente,
un material de una sola hebra (monocatenario) es amplificado por
una reacción en cadena de la polimerasa, para generar una sonda
enriquecida en cuanto a secuencias que faltan en el mutante por
supresión. Desde luego, este método se puede usar solamente para
aislar una región genómica que es definida por un mutante de
supresión, y no se ha ensayado su aplicabilidad a genomas que son
más complicados que el de una levadura. Un proceso similar, que usa
una separación basada en biotina para el aislamiento de ADNc's
expresados diferencialmente, fue descrito por Lebeau y
colaboradores, Nucleic Acids Research 19: 4778
(1991).
(1991).
Wieland y colaboradores, Proc. Natl. Acad Sci.
USA 87: 2720-2724 (1990) describieron un
método para aislar polinucleótidos que comprendían secuencias
presentes en una población de ADN's "probadores" que están
ausentes en una población de "conductores". En este método, el
ADN probador es marcado con biotina, y luego es sometido a varias
rondas de hibridación con un exceso de un ADN conductor. Después de
cada ronda, un ADN de una única hebra se recoge mediante una
cromatografía con hidroxiapatito. Después de la ronda final, la
pequeña cantidad de ADN biotinilado no hibridado (que es único
(singular) para la población de probadores) se purifica mediante
una cromatografía de afinidad con avidina, se amplifica por una
reacción en cadena de la polimerasa y se clona para generar una
sonda para secuencias únicas (singulares) para la población de
probadores.
Recientemente, se ha desarrollado una técnica
conocida como análisis de diferencias entre representaciones (RDA,
de Representational Difference Analysis) que permite el aislamiento
de fragmentos de ADN's que están presentes en una población de
secuencias de ADN's pero ausentes en otra población de secuencias
de ADN's. Lisitsyn y colaboradores, Science 259:
946-951 (1993); Lisitsyn y colaboradores, Meth.
Enzymology 254: 291-304 (1995); patente
de los EE.UU. 5.436.142; patente de los EE.UU. 5.501.964; Lisitsyn y
colaboradores, Nature Genetics 6:
57-63 (1994). Este método permite que una persona
investigue en cuanto a la existencia de fragmentos presentes en una
población de "probadores" de secuencias de ADN que no están
presentes en una población afín de "conductores". Dichos
fragmentos únicos son designados como secuencias "dianas". En
la primera operación del RDA, se obtienen "representaciones"
de ambas poblaciones. Estas representaciones consisten en
subconjuntos de menor complejidad de las poblaciones de secuencias
originales. En la realización de la técnica, practicada de un modo
sumamente amplio, una representación se obtiene sometiendo por
separado ambas poblaciones a una digestión con una endonucleasa de
restricción, ligando un primer conjunto de adaptadores a los
extremos de los fragmentos que así se han generado, y amplificando
por una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores
que son complementarios con el primer conjunto de adaptadores, en
unas condiciones en las que se amplifican solamente unos fragmentos
relativamente cortos (con menos de 2 kilo(pares de bases)).
Los primeros adaptadores se retiran luego de los fragmentos
amplificados de ambas poblaciones mediante una digestión con enzimas
de restricción y un segundo conjunto de adaptadores (que tienen una
secuencia diferente de la del primer conjunto) se fija, por
ligación, a fragmentos amplificados procedentes solamente de la
población de los ADN's probadores.
Los fragmentos amplificados, que contienen
adaptadores, procedentes de la población de probadores, se combinan
seguidamente con un exceso de fragmentos amplificados procedentes de
la población de conductores (que carece de adaptadores), y la
mezcla se incuba en condiciones de desnaturalización y asociación,
seguido por otra ronda de amplificación por PCR, usando cebadores
que son complementarios con el segundo conjunto de adaptadores.
Durante la operación de asociación, se formarán varios tipos de
dúplex. Puesto que los fragmentos de conductores están presentes en
exceso, la enorme mayoría de fragmentos que contienen secuencias
comunes para ambas poblaciones, tanto la de probadores como la de
conductores, formarán o bien unos dúplex de conductor y conductor
(que no contienen ningún adaptador) o unos dúplex de probador y
conductor (que contienen un único adaptador en la hebra (cadena)
derivada del fragmento de probador). Los fragmentos que contienen
secuencias que son únicas para la población de probadores, son
capaces de asociarse consigo mismos para generar unos dúplex que
poseen un adaptador en cada extremo. Consiguientemente, durante la
operación de PCR subsiguiente al asociación, los dúplex de probador
y probador serán amplificados exponencialmente. Por otro lado, los
dúplex de probador y conductor, que poseen solamente un único
adaptador, serán amplificados de una manera lineal y por lo tanto
pasarán a formar solamente una pequeña fracción de la población de
secuencias amplificadas. Unos dúplex de conductor y conductor, que
carecen de adaptadores, no serán amplificados de ninguna de las
maneras. Se consigue de esta manera una amplificación selectiva de
fragmentos que contienen secuencias dianas, en virtud del hecho de
que, antes de la asociación, solamente los fragmentos procedentes
de la población de probadores poseen adaptadores, confiriendo a los
dúplex de probador y probador el potencial para su amplificación
exponencial.
Las operaciones de retirar los adaptadores
presentes en los fragmentos dianas enriquecidos, que se han
obtenido a partir de una operación previa, añadir nuevos
adaptadores, incubar en condiciones desnaturalizadoras y
asociadoras con un exceso de fragmentos procedentes de la población
de conductores, y amplificar por una PCR, se repiten hasta que se
alcance un grado deseado de enriquecimiento.
Se ha descrito recientemente, por Hubank &
Schatz en Nucleic Acids Research 22:
5640-5648 (1994), una adaptación del RDA, denominada
RDA de ADNc, en el que dos poblaciones de ADNc's se comparan en
cuanto a la presencia de un fragmento de ADNc que representa o bien
un ARNm único para una de las dos poblaciones de un ARNm que es
expresado diferencialmente en las dos poblaciones. El RDA de ADNc
difiere del protocolo original de RDA en los siguientes aspectos.
1) Puesto que la complejidad de la población de ARNm`s de una típica
célula de mamífero es solamente \sim (alrededor) de
1-2% de la complejidad de un genoma, no se requiere
la generación de una representación para la práctica de un ARD de
ADNc. Por lo tanto, se puede obtener un análisis más completo de las
diferencias en un único experimento. 2) Una amplificación de
fragmentos, de los que ya se conoce que difieren entre las dos
poblaciones, se puede reducir al mínimo por adición de tales
fragmentos al conductor. 3) Una amplificación de fragmentos que
representan ARNm's presentes a diferentes niveles en las dos
poblaciones (en vez de estar ausentes en una población) se puede
conseguir agotando las poblaciones de secuencias presentes en baja
abundancia (por hibridación a un bajo valor de C_{0}t) antes de la
amplificación, y disminuyendo la relación de conductores a
probadores durante las hibridaciones subsiguientes a la generación
del primer producto de diferencia. Esto convierte de manera eficaz
una secuencia regulada en sentido creciente en una secuencia única,
para las finalidades del ensayo. Una limitación del RDA de ADNc es
la incapacidad de detectar diferencias debidas a mutaciones
puntuales, pequeñas supresiones o pequeñas inserciones, a menos que
éstas afecten a un particular sitio de reconocimiento por enzimas de
restricción. El RDA de ADNc se ha usado para detectar transcritos de
un gen transfectado en células cultivadas y para clonar ADNc's que
representan genes cuya transcripción es regulada en sentido
creciente como respuesta a un estímulo ambiental.
El RDA y el RDA de ADNc dependen de una
amplificación selectiva para el enriquecimiento de polinucleótidos
que contienen secuencias que son únicas para, o están enriquecidas
en, una población particular de secuencias de ácidos nucleicos. Una
amplificación selectiva de secuencias únicas se combinaba con la
degradación selectiva de secuencias comunes para ambas poblaciones
en la técnica de substracción con degradación enzimática. Zeng y
colaboradores, Nucleic Acids Research 22:
4381-4385 (1994); patente de los EE.UU 5.525.471. En
este procedimiento, los extremos de los fragmentos de ADNc`s
amplificados que comprenden la población de probadores, son
bloqueados por la adición enzimática de nucleótidos modificados con
\alpha-fósforotioatos. La hibridación de
fragmentos de probadores bloqueados con un exceso de fragmentos de
conductores no bloqueados se realiza seguidamente en unas
condiciones que aceleran la velocidad de asociación, permitiendo el
uso de concentraciones relativamente bajas de conductores. Después
de la hibridación, el tratamiento con una exonucleasa III (que es
una nucleasa específica para hebras dobles, que ataca desde el
extremo 3') y la exonucleasa VII (una nucleasa específica para
hebras únicas) destruirá a los dúplex de conductor y conductor y a
los de probador y conductor. Sin embargo, los extremos bloqueados
por fósforotioatos de híbridos de probador y probador harán que
estos dúplex sean resistentes al tratamiento con nucleasas
combinadas. Los dúplex de probador y probador, que sobreviven a un
tratamiento con nucleasas, se someten a una segunda ronda de
substracción y luego se amplifican por una reacción en cadena de la
polimerasa. Se pueden realizar, según sea necesario, rondas
adicionales de substracción y amplificación.
Puesto que la técnica de RDA ha pasado a ser
practicada más ampliamente en los últimos años recientes, han
resultado evidentes varias desventajas. Un problema principal
resulta de la ineficiencia de las múltiples reacciones de digestión
por restricción y ligación que se utilizan en la técnica. La falta
de una completa digestión por restricción conducirá a una
incompleta retirada del primer conjunto de adaptadores a partir de
la población de fragmentos de probadores, dando como resultado una
incapacidad de fijarse al segundo conjunto de adaptadores.
Similarmente, una ineficiente operación de ligación conduciría a
una incompleta fijación del segundo conjunto de adaptadores,
incluso en sitios a partir de los cuales se ha retirado el primer
conjunto. Puesto que los cebadores de la amplificación son
complementarios con el segundo conjunto de adaptadores, una
fijación incompleta del segundo conjunto de adaptadores reducirá el
grado de amplificación de secuencias dianas, que se puede conseguir.
Además, la necesidad de tratar muestras a través de operaciones
múltiples, y posiblemente de purificar el material entre
operaciones, conduce a pérdidas de un material experimental que ya
es escaso. Una posible consecuencia de unas ineficientes
operaciones de digestión por restricción y/o de ligación es la
generación de falsos resultados positivos, en que la pérdida de una
particular secuencia de conductor, por fallo en ser amplificada,
conduce a la inapropiada identificación de su complemento en el
probador como una secuencia diana.
Otra desventaja de un RDA, tal como se práctica
corrientemente, procede del uso de un gran número de ciclos de
reacciones en cadena de la polimerasa, durante la operación de
amplificación. Típicamente, se usan 20 ciclos de una PCR para
generar las representaciones y se usan 25-30 ciclos
de una PCR durante cada ronda de hibridación y amplificación de un
RDA. Si, tal como es corriente, se realizan tres rondas de
hibridación y amplificación, los ácidos nucleicos dianas habrán
sido sometidos a 95-110 rondas de amplificación en
el momento en que hayan sido aislados. Unas rondas de amplificación
adicionales se usan corrientemente para clonar y secuenciar el
producto de la diferencia, aislado por un RDA. Se ha conocido desde
hace algún tiempo que, con altos números de ciclos de una
amplificación por PCR, se observa un "efecto de meseta". Innis
y Gelfland en "PCR Protocols: A guide to methods and
applications" [Protocolos de PCR: Una guía para métodos y
aplicaciones] coordinadores de edición Innis y colaboradores,
Academic Press (1990) páginas 3-12. Este efecto
está caracterizado por una disminución en la velocidad exponencial
de acumulación de un producto de amplificación, que se establece
durante ciclos postreros. Unas potenciales causas del efecto de
meseta incluyen: 1) un agotamiento de substratos, 2) una pérdida de
actividad de una enzima, 3) una degradación de substratos, 4) una
inhibición de productos finales, 5) una competencia en cuanto a
reaccionantes por productos no específicos, 6) una
desnaturalización incompleta de un producto en alta concentración
del producto y 7) una reasociación de un producto en alta
concentración de producto (que puede bloquear una asociación y/o una
prolongación de cebadores).
Estas ultimas dos características de los ciclos
postreros de una reacción en cadena de la polimerasa son
especialmente importantes para un RDA y técnicas afines, puesto
que, además de conducir a una amplificación menos que exponencial,
pueden dar como resultado también un sesgo de la representación de
productos en reacciones, tales como un RDA, en el que se están
amplificando múltiples fragmentos. En particular,
Mathieu-Daudé y colaboradores, Nucleic Acids
Research 24: 2080-2086 (1996) han
mostrado, que en ciclos postreros, la velocidad de amplificación de
productos abundantes disminuye con mayor rapidez que la de
productos menos abundantes en la misma reacción. Esto es debido a
una reasociación preferente de los productos más abundantes, que
impide la fijación y/o la prolongación de cebadores para estas
especies abundantes. Este fenómeno es compatible con el hecho de
que la velocidad de asociación es proporcional a las
concentraciones de las hebras que reaccionan. La consecuencia de
este efecto para la práctica de un RDA de ADNc es que será reducida
al mínimo la capacidad de detectar los ARNm's presentes en
diferentes concentraciones en dos poblaciones (al contrario que los
ARNm's que son únicos para una de las poblaciones) para los ARNm's
cuyos ADNc's están presentes en altas concentraciones en la
población de partida.
Una fuente potencial adicional de aberraciones en
el procedimiento actual para un RDA es la utilización de diez
ciclos de PCR que siguen inmediatamente a la primera operación de
hibridación. Solamente después de que se hayan realizado estos diez
ciclos de amplificación, el material es tratado con una nucleasa
para degradar al material no hibridado. Esta secuencia de sucesos
tiene el efecto potencialmente indeseable de someter a unos dúplex
de probador y probador (es decir, el producto deseado) a diez
operaciones de desnaturalización, con el consiguiente riesgo de que
algunos de estos dúplex dejarán de volverse a formar, debido, por
ejemplo, a una degradación de sus hebras constituyentes mientras que
éstas están en el estado desnaturalizado.
Finalmente, la presencia de un ADN conductor en
exceso durante los diez ciclos de PCR antes de un tratamiento con
una nucleasa puede dar como resultado una eficiencia reducida de
una amplificación de híbridos de probador y probador, debido al
potencial de que los dúplex residuales de conductor y conductor y de
conductor y probador actúen como un sumidero para cebadores,
substratos, iones de signo contrario y enzimas.
En la práctica del presente invento, estas
desventajas son superadas por métodos que usan menos ciclos de PCR,
una digestión con nucleasas antes de una amplificación, y un único
adaptador diseñado para su uso con cebadores múltiples. Son
presentadas por el invento también ventajas adicionales, tal como
se expone a continuación.
El invento proporciona métodos mejorados para la
identificación y el aislamiento de polinucleótidos que comprenden
secuencias de ácidos nucleicos presentes en una primera célula (de
muestra), un primer tipo de célula o una primera población de
células, que no están presentes en una o más otra(s) células
(testigo(s)), uno o más otro(s) tipo(s) de
células o una o más otra(s) poblacion(poblaciones) de
células. Dichos polinucleótidos serán identificados como
"fragmentos únicos" o "productos de diferencia" usando los
métodos del invento. Los fragmentos únicos se pueden obtener como un
resultado de unas diferencias en el contenido de una secuencia,
tales como por inserción o supresión, o por diferencias en la
organización de una secuencia, tal como por inversión o
translocación. El método del invento no adolece de los problemas que
están asociados con métodos anteriores de hibridación substractiva,
tales como las pérdidas de material que están asociadas con
repetidas operaciones de digestión por restricción y ligación,
representaciones sesgadas que resultan de excesivos ciclos de
amplificación, e interferencia con las operaciones de amplificación
por grandes cantidades de secuencias testigos indeseadas.
El invento proporciona un método para obtener un
fragmento único presente en una población de polinucleótidos de
muestra, que no está presente en una población de polinucleótidos
de testigo, comprendiendo dicho método:
- a)
- fragmentar ambas poblaciones de polinucleótidos por el mismo método para generar poblaciones de fragmentos de muestra y de testigo,
- b)
- fijar por enlaces covalentes a ambas poblaciones de fragmentos un oligonucleótido que comprende sitios desplazados hacia dentro de fijación a cebadores, comprendiendo dichos sitios de fijación a cebadores un sitio más exterior de fijación a cebadores, un sitio más interior de fijación a cebadores, y por lo menos un sitio más interior de fijación a cebadores situado entre ellos, para producir poblaciones de fragmentos de muestra y de testigo, marcados con oligonucleótidos;
- c)
- amplificar la población de fragmentos de muestra, marcados con oligonucleótidos, usando un cebador no director, que es complementario con el sitio más exterior de fijación a cebadores de dicho oligonucleótido, para generar una población de fragmentos amplificados de muestra;
- d)
- amplificar la población de fragmentos de testigo, marcados con oligonucleótidos, usando un cebador director, que es complementario con el sitio más interior de fijación a cebadores de dicho oligonucleótido, para generar una población de fragmentos amplificados de testigo;
- e)
- combinar dicha población de fragmentos amplificados de muestra con un exceso de dicha población de fragmentos amplificados de testigo, desnaturalizarlas, e incubarlas en condiciones de asociación para proporcionar una mezcla de asociación;
- f)
- someter la mezcla de asociación a unas condiciones en las que serán degradados todos los fragmentos, excepto los fragmentos de doble hebra que contienen un cebador no director en cada hebra; y
- g)
- someter subsiguientemente la mezcla de asociación, tratada como en la operación (f), a una amplificación, usando cebadores no directores que son complementarios con uno de dichos sitios interiores de fijación a cebadores, para generar un primer producto de diferencia.
El invento proporciona también un método que
comprende adicionalmente operaciones (e) hasta (g) repetidas, en las
que un producto de diferencia es reemplazado por la población de
fragmentos amplificados de muestra, y en que la mezcla tratada de
asociación es sometida a una amplificación usando un cebador no
director, que es complementario con un sitio de fijación a cebadores
que es diferente del usado en la operación precedente, para
proporcionar adicionales productos de diferencia.
El invento proporciona adicionalmente un método
para obtener un fragmento único, presente en una población de
polinucleótidos de muestra, que no están presentes en una población
de polinucleótidos de testigo, comprendiendo dicho método:
- a)
- fragmentar ambas poblaciones de polinucleótidos por el mismo método para generar poblaciones de fragmentos de muestra y de testigo;
- b)
- fijar por enlaces covalentes a ambas poblaciones de fragmentos un oligonucleótido que contiene o codifica sitios desplazados hacia dentro de fijación a cebadores, comprendiendo dichos sitios de fijación a cebadores un sitio más exterior de fijación a cebadores, un sitio más interior de fijación a cebadores, y por lo menos un sitio más interior de fijación a cebadores, situado entre ellos, para producir poblaciones de fragmentos de muestra y de testigo, marcados con oligonucleótidos;
- c)
- amplificar la población de fragmentos de muestra, marcados con oligonucleótidos, usando un cebador no director que es complementario con el sitio más exterior de fijación a cebadores de dicho oligonucleótido, para generar una población de fragmentos amplificados de muestra;
- d)
- amplificar la población de fragmentos de testigo, marcados con oligonucleótidos, usando un cebador director que es complementario con el sitio más interior de fijación a cebadores de dicho oligonucleótido, para generar una población de fragmentos amplificados de testigo;
- e)
- combinar dicha población de fragmentos amplificados de muestra con un exceso de dicha población de fragmentos amplificados de testigo, desnaturalizarlas, e incubarlas en condiciones de asociación para proporcionar una mezcla de asociación;
- f)
- someter la mezcla de asociación a unas condiciones en las que serán degradados todos los fragmentos, excepto los fragmentos de doble hebra que contienen un cebador no director en cada hebra; y
- g)
- someter subsiguientemente la mezcla de asociación tratada como en la operación (f) a una amplificación, usando cebadores no directores que son complementarios con uno de dichos sitios interiores de fijación a cebadores, con el fin de generar un primer producto de diferencia.
El invento proporciona también un método para
obtener adicionales productos de diferencia, repitiendo las series
precedentes de operaciones (e) hasta (g), en que el primer producto
de diferencia (o un subsiguiente producto de diferencia) es
sustituido por la población de fragmentos amplificados de muestra,
y en que la mezcla de asociación tratada es sometida a una
amplificación usando un cebador no director que es complementario
con un sitio interior de fijación a cebadores, que es diferente del
usado en la operación precedente, o un cebador no director que es
complementario con el sitio más interior de fijación a cebadores,
con el fin de proporcionar adicionales productos de diferencia.
El invento proporciona también una realización
del invento para obtener adicionales productos de diferencia por
repetición de las precedentes series de operaciones (e), en que el
primer producto de diferencia (o un subsiguiente producto de
diferencia) es sustituido por la población de fragmentos
amplificados de muestra, y en que la mezcla de asociación tratada es
sometida a una amplificación usando un cebador no director, que es
complementario con un sitio interior de fijación a cebadores, que
es diferente del usado en la operación precedente, o un cebador no
director que es complementario con el sitio más interior de
fijación a cebadores.
En una realización preferida, se proporcionan
métodos para obtener fragmentos de ADNc únicos, que son
representativos de diferencias en la población de ARNm's de dos o
más diferentes células, tipos de células o poblaciones de
células.
En otra realización, se proporcionan métodos para
obtener un producto de diferencia, que comprende uno o más
fragmentos de polinucleótidos, que difieren entre dos poblaciones
de polinucleótidos.
En otra realización, se proporcionan métodos para
obtener fragmentos que representan diferencias de secuencias entre
dos genomas.
En otra realización, se proporcionan métodos para
obtener ADNc's que representan moléculas de ARN's que son únicas
para una población particular de polinucleótidos.
En otra realización, se proporcionan métodos para
obtener ADNc's que representan moléculas de ARN's que son
expresadas de manera preferente en una población particular de
polinucleótidos.
En otra realización, se proporciona un método
mejorado de análisis de diferencias de representaciones, en el que
se evitan múltiples operaciones de digestión por restricción y de
ligación.
En otra realización, se proporciona un método de
dirigir una población de polinucleótidos para su degradación
selectiva.
En otra realización, se proporciona un método de
conseguir una amplificación selectiva de una población de
polinucleótidos.
En otra realización, se proporciona un
oligonucleótido que tiene múltiples sitios de fijación a cebadores
para usarse en el método del invento y en métodos afines.
En otra realización, se proporciona un
oligonucleótido que tiene múltiples sitios de fijación a cebadores
con temperaturas crecientes de asociación desde el extremo 5' al
extremo 3', para usarse en el método del invento y en métodos
afines.
La Figura 1 representa un diagrama de flujos para
una realización preferida del método del invento.
El presente invento proporciona métodos mejorados
para la hibridación substractiva con el fin de identificar
fragmentos de polinucleótidos que son únicos para una particular
población de polinucleótidos de muestra. El método se puede usar
para aislar, entre otras cosas, fragmentos de polinucleótidos tales
como ADNc's, que son característicos de un particular estado
patológico o relativo al desarrollo. Este método es más rápido que
los métodos existentes, proporciona un mayor rendimiento de
producto auténtico, y genera una colección más representativa de
fragmentos únicos que lo que hacen los métodos anteriores.
A menos que se indique otra cosa distinta, la
práctica del presente invento empleará técnicas convencionales de
biología molecular, bioquímica, microbiología, ADN recombinante,
hibridación de ácidos nucleicos, genética, inmunología, embriología
y oncología, que están dentro de la experiencia de la especialidad.
Dichas técnicas son explicadas completamente en la bibliografía.
Véanse, por ejemplo, las citas de Maniatis, Fritsch & Sambrook,
MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL [Clonación molecular: un
manual de laboratorio], Cold Spring Harbor Laboratory Press (1982);
Sambrook, Fritsch & Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY
MANUAL, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press
(1989); Ausubel y colaboradores, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR
BIOLOGY [Actuales protocolos en biología molecular], John Wiley
& Sons (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995,
1996); Glover, DNA CLONING: A PRACTICAL APPROACH [Clonación de ADN:
un enfoque práctico], volúmenes I y II, IRL Press (1985), volumen
III, IRL Press (1987); Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR
CLONING [Una guía práctica para la clonación molecular], John Wiley
& Sons (1984); Rigby (coordinador de edición), La serie GENETIC
ENGINEERING [Ingenieria genética] (Academic Press); Setlow &
Hollaender (coordinadores de edición), La serie GENETIC
ENGINEERING: PRINCIPLES AND METHODS [Principios y métodos], Plenum
Press; La serie METHODS IN ENZYMOLOGY [Métodos en enzimología]
(Academic Press); Silhavy, Berman & Enquist, EXPERIMENTS WITH
GENE FUSION [Experimentos con fusiones de genes], Cold Spring
Harbor Laboratory Press (1984); Gait (coordinador de edición),
OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS: A PRACTICAL APPROACH [Síntesis de
oligonucleótidos: un enfoque práctico], IRL Pres (1984, 1985);
Eckstein (coordinador de edición) OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A
PRACTICAL APPROACH [Oligonucleótidos y compuestos análogos: un
enfoque práctico, IRL Press (1991); Hames & Higgins, NUCLEIC
ACID HIBRIDIZATION: A PRACTICAL APPROACH [Hibridación de ácidos
nucleicos: un enfoque práctico], IRL Press (1985); Hames &
Higgins, TRANSCRIPTION AND TRANSLATION: A PRACTICAL APPROACH
[Transcripción y traducción, un enfoque práctico], IRL Press (1984);
Freshney, ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH [Cultivación de
células de animales: un enfoque práctico], IRL Press (1986); Mahy,
VIROLOGY: A PRACTICAL APPROACH [Virología, un enfoque práctico], IRL
Press (1985); Woodward; IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES: A PRACTICAL
APPROACH [Células y enzimas inmovilizadas: un enfoque práctico], IRL
Press (1985); Miller & Calos (coordinadores de edición) GENE
TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS [Vectores de transferencia de
genes para células de mamíferos, Cold Springer Harbor Laboratory
Press (1987), Erlich (coordinador de edición) PCR TECHNOLOGY
[Tecnología de PCR], Stockton Press (1989), Innis y colaboradores,
PCR PROTOCOLS [Protocolos de PCR], Academic Press (1990).
Para describir el presente invento, se usará la
siguiente terminología, como se define seguidamente.
Un polinucleótido es un polímero de nucleótidos,
y se pretende que el término abarque polinucleótidos más pequeños
(fragmentos) generados por fragmentación de polinucleótidos más
grandes. Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico"
abarcan tanto ARN's como ADN's, así como polinucleótidos y ácidos
nucleicos de una sola hebra y de doble hebra (monocatenarios y
bicatenarios). Los polinucleótidos incluyen también polinucleótidos
y ácidos nucleicos modificados, que contienen las modificaciones de
los grupos de bases, azúcares o fosfatos que son conocidas en la
especialidad.
Una población de polinucleótidos es cualquier
colección de polinucleótidos que se componen de diferentes
secuencias de nucleótidos. Ejemplos de poblaciones de
polinucleótidos incluyen, pero no se limitan a, el genoma de una
célula normal, el genoma de una célula infectada, el genoma de
célula neoplásica, el genoma de una célula existente en un estado
patológico, el ADN que es característico de una célula, una
estructura multicelular, un organismo, un estado de diferenciación,
un estado patológico o no patológico, particulares, la población
total de ARN's de una célula, la población de ARN's poliadenilados
de una célula, o una población de ADNc's que es representativa de
la población de ARNm's de una célula, una estructura multicelular,
un organismo, un estado de diferenciación, un estado patológico o no
patológico, particulares.
Usando los métodos de este invento, una persona
investigará una población de polinucleótidos de muestra para
encontrar fragmentos que comprendan una o más secuencias de
polinucleótidos que sean únicas con respecto a una población de
polinucleótidos de testigo. Una población de muestra se obtendrá,
por ejemplo, a partir de una célula, un tipo de célula, una célula
infectada, una célula patológica, particulares, o células en un
estado particular de desarrollo o una progresión particular de una
enfermedad, y se ensayará en cuanto a la presencia de uno o más
fragmentos únicos, por comparación con una población de testigo, de
acuerdo con los métodos del invento. Por vía de ejemplo, si se
obtiene una población de muestra a partir de células infectadas con
virus, la población de testigo se obtendría a partir de células no
infectadas del mismo tipo. En ciertas situaciones, tales como una
identificación de una secuencia que es suprimida en un estado
patológico particular, se pueden usar células normales (no
patológicas) como la población de muestra.
La complejidad de una secuencia, o una
complejidad, se define como la longitud de una secuencia no
repetida de nucleótidos que está presente en una población de
polinucleótidos.
Un subconjunto de complejidad más baja de una
población de polinucleótidos o de fragmentos es una colección que
contiene algunas (algunos), pero no todas las secuencias ni todos
los fragmentos presentes en la población original.
Un fragmento de un ácido nucleico es un trozo
menor de ese ácido nucleico. La fragmentación es el proceso
mediante el cual se obtienen fragmentos. La fragmentación se puede
conseguir por cualquier método conocido en la especialidad; por
ejemplo, por vía enzimática, química, mecánica, etc., con la
condición de que el método genere de una manera reproducible el
mismo conjunto de fragmentos para una población dada de
polinucleótidos. Un método corriente de fragmentación de una
población de polinucleótidos consiste en someter la población a la
acción de una endonucleasa de restricción.
Se obtiene una población de fragmentos cuando un
ácido nucleico o una población de polinucleótidos se somete a una
fragmentación.
Como se usa en el presente contexto, una
marcación se refiere a un método mediante el cual se añaden
secuencias adicionales a un polinucleótido o a un fragmento de
ácido nucleico. Una población marcada de fragmentos de
polinucleótidos se puede generar, por ejemplo, mediante la fijación
de engarzadores o adaptadores de oligonucleótidos a una población
de fragmentos de polinucleótidos. Una marcación diferencial se
refiere a una situación en la que la presencia de las secuencias
adicionales se aprovecha para distinguir entre ellas dos o más
poblaciones de polinucleótidos o de fragmentos de
polinucleótidos.
La desnaturalización se refiere al proceso
mediante el cual un ácido nucleico de doble hebra es convertido en
sus hebras simples constituyentes. La desnaturalización se puede
conseguir, por ejemplo, mediante el uso de una alta temperatura,
una baja fuerza iónica, un pH ácido o alcalino, y/o ciertos
disolventes orgánicos. Los métodos para desnaturalizar ácidos
nucleicos son bien conocidos en la especialidad.
La asociación (algunas veces denominada
hibridación) se refiere al proceso mediante el cual ácidos nucleicos
complementarios de una sola hebra forman una estructura de doble
hebra, o dúplex, mediada por unión con enlaces de hidrógeno entre
bases complementarias en las dos hebras.
Las condiciones de asociación son los valores,
por ejemplo, de la temperatura, de la fuerza iónica, del pH y del
disolvente, que permitirán que se realice una asociación. Muchas
combinaciones diferentes de las variables antes mencionadas serán
conducentes a una asociación. Las condiciones apropiadas para
asociar son bien conocidas en la especialidad, y generalmente
incluirán una fuerza iónica de 50 mM o mayor de un catión
monovalente y/o divalente a un pH neutro o próximo al neutro.
Una mezcla de asociación es una composición que
contiene un ácido nucleico de una sola hebra a los apropiados
valores de temperatura, pH y fuerza iónica para permitir que se
realice una asociación entre moléculas que comparten regiones con
secuencias complementarias.
Un dúplex se refiere a un polinucleótido de doble
hebra.
La amplificación es el proceso mediante el cual
se generan copias adicionales de una secuencia de ácido nucleico o
de una colección de secuencias de ácidos nucleicos. La
amplificación se consigue generalmente por vía enzimática, usando
una enzima polimerasa de ADN. Las técnicas actuales permiten una
amplificación exponencial de cualquier secuencia que esté flanqueada
por sitios de fijación para un par de cebadores oligonucleótidos,
mediante aplicación reiterativa de operaciones de
desnaturalización, asociación de cebadores y prolongación con una
polimerasa, que son corrientemente conocidas como una reacción en
cadena de la polimerasa, véase la patente de los EE. UU. 4.683.202,
de Saiki y colaboradores, Science 239:
487-491 (1988), Innis y colaboradores, véase cita
anterior, Erlich, véase cita anterior. En las condiciones más
ampliamente practicadas de la reacción en cadena de la polimerasa,
la velocidad de polimerización que es de aproximadamente
1.000-2.000 nucleótidos por minuto. De manera
correspondiente, la longitud máxima de una secuencia amplificable
será limitada por las condiciones de reacción (por ejemplo, la
duración de la operación de prolongación). La capacidad de
controlar la extensión de alargamiento (elongación) en una reacción
en cadena de la polimerasa se puede usar con ventaja para generar
subconjuntos con menor complejidad de fragmentos amplificados a
partir de una colección inicial de fragmentos de alta
complejidad.
La degradación se refiere a la despolimerización
de un polinucleótido. La degradación de un polinucleótido se
realizará generalmente mediante una hidrólisis de enlaces de
fosfodiésteres entre nucleótidos, para liberar oligonucleótidos y/o
mononucleótidos cortos. La degradación se puede conseguir por una
vía ya sea química o bien enzimática. En una realización preferida
del presente invento, los fragmentos de una población de fragmentos
de polinucleótidos de testigo se someterán a una degradación
exonucleolitica preferente, debido a que ellos están marcados
diferencialmente en comparación con una población de fragmentos de
polinucleótidos de muestra.
Un producto de diferencia es un polinucleótido
obtenido como resultado de la práctica del presente invento. Éste
contendrá uno o más polinucleótidos o fragmentos de polinucleótidos
que están presentes en una población de polinucleótidos o
fragmentos de polinucleótidos de muestra que no están presentes en
una población de polinucleótidos o fragmentos de polinucleótidos de
testigo.
Un fragmento único es un fragmento que está
presente en una población de polinucleótidos o de fragmentos de
polinucleótidos de muestra que no están presentes en una población
de polinucleótidos o fragmentos de polinucleótidos de testigo.
Un cebador es un oligonucleótido capaz de
emparejar bases con un polinucleótido y que sirve como un sitio a
partir del que se puede iniciar una polimerización. Un cebador que
tiene propiedades tales que su producto de prolongación será
susceptible a una degradación es conocido como un cebador director;
un cebador que tiene propiedades tales que su producto de
prolongación está protegido con respecto de una degradación es
conocido como un cebador no director. Más generalmente, una
población dirigida de polinucleótidos es una que es susceptible
preferentemente a una degradación en virtud de alguna propiedad
única o un constituyente único que no está compartido con una
población no dirigida de polinucleótidos.
Un sitio de fijación a cebadores se refiere a una
región de un polinucleótido, tal como un adaptador o una secuencia
codificada por un adaptador, que es capaz de emparejar bases con un
cebador, o que codifica una secuencia que es capaz de emparejar
bases con un cebador. Por vía de ejemplo, los adaptadores del
presente invento pueden contener dentro de su secuencia o codificar
múltiples sitios de fijación a cebadores. En el caso de múltiples
sitios de fijación a cebadores, el sitio más exterior de fijación a
cebadores es el sitio de fijación a cebadores que está situado más
cercano al extremo 3' de la hebra de ácido nucleico en la que él
reside. El sitio más interior de fijación a cebadores está situado
más alejado del extremo 3' de la hebra de ácido nucleico en la que
él reside. Uno o más sitio(s) interior(es) de
fijación a cebadores puede(n) estar presente(s) entre
los sitios más exteriores y más interiores de fijación a cebadores.
Deberá señalarse que puesto que la polimerización se realiza en una
dirección de 5' a 3' y un sitio de fijación a cebadores es
complementario con el cebador a partir del que se inicia la
polimerización, un sitio más exterior de fijación a cebadores
codifica una secuencia más próxima al extremo 5' del producto de la
polimerización, en comparación con los sitios interiores o más
interiores de fijación a cebadores.
Un oligonucleótido es un ácido nucleico corto,
generalmente un ADN y generalmente de una sola hebra. Generalmente,
un oligonucleótido será más corto que 200 nucleótidos, más
particularmente, más corto que 100 nucleótidos, de modo sumamente
particular, de 50 nucleótidos o más corto.
Una nucleasa es una enzima capaz de degradar a
ácidos nucleicos. Una exonucleasa degrada desde los extremos de una
molécula de ácido nucleico. Una exonucleasa específica para 5'
comenzará la degradación en el extremo 5' de una molécula de ácido
nucleico, y una exonucleasa específica para 3' comenzará la
degradación en el extremo 3' de una molécula de ácido nucleico. Unas
exonucleasas específicas para 5' pueden adicionalmente ser
específicas para otros extremos terminados con fosfato en 5' o con
hidroxilo en 5'. Similarmente, unas exonucleasas específicas para 3'
pueden ser específicas para otros extremos terminados con fosfato
en 3' o con hidroxilo en 3'. Una endonucleasa se degrada
interiormente en una molécula de ácido nucleico. Una nucleasa
específica para una sola hebra es capaz de degradar ácidos nucleicos
de una sola hebra, ya sea exonucleolíticamente o
endonucleolíticamente, pero es incapaz de degradar a un ácido
nucleico de doble hebra.
Un ADN genómico es un ADN obtenido a partir de
una célula que representa la totalidad o una parte del genoma de
esa célula.
Un ADNc o "ADN complementario" es un ADN
obtenido de copiar un ARN por transcripción inversa. Con la mayor
frecuencia, éste representa la población de moléculas de ARNm
encontradas en una célula, un tipo de células, un estado de
desarrollo o un estado patológico particular.
El material de partida para la práctica del
método del invento consistirá en por lo menos dos poblaciones de
polinucleótidos. Una población de polinucleótidos puede comprender
el genoma de una célula o de un grupo de células y se puede
obtener, por ejemplo, por técnicas conocidas en la especialidad,
tales como una rotura de células, seguida opcionalmente por un
aislamiento de núcleos. Las preparaciones de células rotas o de
núcleos pueden ser sometidas adicionalmente a las acciones de
enzimas proteolíticas y a la extracción con disolventes orgánicos, y
los ácidos nucleicos se pueden purificar por uno cualquiera de
varios métodos conocidos en la especialidad, inclusive los de
cromatografía y precipitación selectiva.
Alternativamente, se pueden usar poblaciones de
ADNc's como material de partida para la práctica del método del
invento. En este caso, un ARN será primeramente purificado a partir
de la célula, del tipo de célula o de la población de célula que
interese, tomando apropiadas precauciones, como las que son
conocidas en la especialidad para reducir al mínimo la degradación
del ARN. Se puede usar un ARN poliadenilado, un ARNm, un ARN
citoplasmático, el ARN celular total o otras poblaciones
seleccionadas de ARN's. Dicho ARN será convertido en un ADNc
("ADN complementario"), por ejemplo, por las acciones
secuenciales de una enzima transcriptasa inversa para generar una
primera hebra y una polimerasa de ADN para convertir la primera
hebra en un dúplex, por métodos bien conocidos en la especialidad
(véanse, por ejemplo las citas de Maniatis y colaboradores,
Sambrook y colaboradores, Ausubel y colaboradores, véanse citas
anteriores).
Se pueden usar como material de partida también
otros tipos de ácidos nucleicos o polinucleótidos, tal como se
consideran por la especialidad.
Para facilitar el proceso de amplificación, las
poblaciones de polinucleótidos se someten a una fragmentación. Una
fragmentación se puede conseguir, por ejemplo, mediante digestión
de ácidos nucleicos con una endonucleasa de restricción. Otros
métodos de fragmentación pueden incluir una digestión con una
nucleasa específica para una sola hebra, tal como la Nucleasa de
Haba Mung o la Nucleasa de S1 a unas temperaturas intermedias entre
la temperatura fisiológica y la temperatura de fusión del
polinucleótido que se ha de fragmentar. En ciertas condiciones,
puede ser adecuada también una fragmentación por cizalladura
mecánica.
Para poblaciones de polinucleótidos de alta
complejidad, por ejemplo el genoma de una célula humana, se pueden
emplear opcionalmente métodos para reducir la complejidad de dicha
población de polinucleótidos. Por ejemplo, una fragmentación de un
polinucleótido o de una población de polinucleótidos, usando un
método que genera reproduciblemente el mismo conjunto de fragmentos,
se puede usar como una primera operación para obtener un
subconjunto de menor complejidad de la población inicial de
polinucleótidos. A continuación de la fragmentación, la selección
de un subconjunto de los fragmentos así generados proporcionará uno
con un subconjunto de la población original de polinucleótidos, que
tenga una menor complejidad que la del material de partida, si es
esto lo que se desea. La selección se puede conseguir por ejemplo,
según los tamaños. La selección según los tamaños se puede
conseguir por muchos métodos que son conocidos en la especialidad,
por ejemplo una electroforesis en gel y una cromatografía en
columna. Un método preferido para conseguir una selección según los
tamaños consiste en digerir una población de polinucleótidos con una
enzima de restricción. Si la población de polinucleótidos se
origina a partir de un ADN genómico, se usa frecuentemente una
enzima de restricción que tiene una secuencia de reconocimiento de
seis nucleótidos. La población de fragmentos generados por digestión
con enzimas de restricción es luego sometida a una amplificación,
por ejemplo por una PCR, en unas condiciones en las que el tamaño
del producto de amplificación es limitado a menos que
aproximadamente 2 kilobases; siendo dichas condiciones conocidas en
la especialidad (Innis y colaboradores, véase cita anterior).
Puesto que una porción de los fragmentos generados por digestión con
una enzima de restricción que tiene una secuencia de reconocimiento
de seis nucleótidos, será mayor que aproximadamente 2 kilobases,
entonces éstos no serán amplificados. Por lo tanto, la población
amplificada contendrá un subconjunto de la población de fragmentos
iniciales.
La selección se puede conseguir por otros métodos
reconocidos en la técnica, además de efectuarse según los tamaños.
Por ejemplo, la densidad flotante, la composición de las secuencias
y la afinidad para un ligando particular son ejemplos no
limitativos de técnicas adicionales de selección.
Ciertas poblaciones de ácidos nucleicos, tales
como las que representan la población de ARNm's de una célula,
pueden ser de complejidad suficientemente baja para que la
generación de un subconjunto de menor complejidad pueda no resultar
necesaria. En este caso, la digestión con una enzima de restricción,
que tiene una secuencia de reconocimiento de cuatro nucleótidos,
facilitará la fijación subsiguiente de adaptadores para
proporcionar una población de fragmentos amplificados, destinada a
usarse en la operación de asociación, y conducir a una amplificación
de virtualmente la totalidad de los fragmentos (puesto que la
mayoría de los fragmentos producidos por disociación con una enzima
de restricción, que tiene una secuencia de reconocimiento de cuatro
nucleótidos, serán más cortos que 2 kilobases).
El presente invento proporciona nuevos
oligonucleótidos adaptadores, cuyo uso conduce a una mayor
eficiencia y a mayores rendimientos de un auténtico producto de
diferencia, evitando la necesidad del reemplazo repetido de
adaptadores por digestión con enzimas de restricción y ligación.
Estos nuevos oligonucleótidos adaptadores contienen o codifican
sitios de fijación para varios cebadores individuales, que se
pueden usar para una amplificación de fragmentos, y, si se desea,
para dirigir ciertos de los fragmentos amplificados resultantes
para una degradación selectiva. Los nuevos oligonucleótidos son de
longitud suficiente como para que contengan varios sitios de
fijación a cebadores, pero no tan largos como para que interfieran
con la especificidad de hibridación (es decir, por contener regiones
de auto-complementariedad). Los múltiples sitios de
fijación a cebadores contenidos dentro de un adaptador, o
codificados por éste, pueden solaparse unos con otros para generar
sitios de fijación a cebadores desplazados hacia dentro, o los
sitios de fijación a cebadores pueden ser discretos.
En una realización preferida, cada secuencia que
codifica un sitio de fijación a cebadores, avanzando desde el
extremo 5' hasta el extremo 3' del adaptador, tendrá una
temperatura de asociación sucesivamente mayor. La diferencia en las
temperaturas de asociación entre sitios adyacentes será de
aproximadamente 10ºC, más preferentemente de 5ºC y con la mayor
preferencia de 3ºC. Consiguientemente, el contenido de guanina +
citosina y/o la longitud de cada sitio de fijación a cebadores
aumentarán también al ir avanzando desde el extremo 5' al extremo
3' del adaptador. Por lo tanto, en general el sitio de fijación a
cebadores más próximo a 5', o más exterior, será más corto, tendrá
un menor contenido de guanina + citosina, y una menor temperatura
de asociación, mientras que el sitio de fijación a cebadores más
próximo a 3', o más interior, será más largo, tendrá un mayor
contenido de guanina + citosina, y una mayor temperatura de
asociación. El intervalo de temperaturas de asociación para los
sitios individuales de fijación a cebadores del adaptador deberá
ser, en el extremo inferior, lo suficientemente alto como para
evitar una hibridación específica y, en el extremo superior, no
deberá ser inhibitorio para la polimerasa de ADN que se usa para la
amplificación. Este intervalo deberá ser de aproximadamente 20ºC a
90ºC, de modo más preferido de aproximadamente 35ºC a
aproximadamente 85ºC, de modo todavía más preferido de
aproximadamente 45ºC a aproximadamente 80ºC, y de modo sumamente
preferido de aproximadamente 55ºC a aproximadamente 75ºC. En una
realización preferida, el adaptador de oligonucleótidos contiene
cuatro sitios de fijación a cebadores. Sin embargo, está claro que
más o menos de cuatro sitios de fijación a cebadores se podrían
también abarcar por el invento, y que no hay necesidad de que
necesariamente haya alguna relación específica entre las
temperaturas de asociación de los sitios de fijación a
cebadores.
cebadores.
Los adaptadores son fijados a fragmentos por
técnicas que son bien conocidas en la especialidad. Los adaptadores
pueden ser fijados por vía química o enzimática, a través de la
acción de una ligasa de ADN o ARN (p.ej. las citas de Maniatis y
colaboradores, Sambrook y colaboradores, Ausubel y colaboradores,
véanse citas anteriores). En un método preferido para la fijación de
adaptadores, la fragmentación de una población de ADN se conseguirá
por tratamiento con una enzima de restricción que deje un extremo
sobresaliente en 5'. Un corto oligonucleótido, parte del cual es
complementaria con esta parte colgante en 5' y parte del cual es
complementaria con la secuencia en el extremo 3' del adaptador, se
usa para alinear el adaptador para la fijación del extremo terminal
en 3' del adaptador al extremo terminal en 5' del extremo generado
por enzimas de restricción. Después de la fijación del adaptador, el
corto oligonucleótido es retirado por desnaturalización y el
complemento del adaptador es sintetizado por la acción de una
polimerasa de ADN, usando el extremo 3' del fragmento original como
un cebador.
Si se han de generar subconjuntos de menor
complejidad de las poblaciones de polinucleótidos de testigo y de
muestra por amplificación selectiva de pequeños fragmentos, se
fijan adaptadores a los miembros de la población antes de esta
operación; y se prefiere que la población de fragmentos de muestra
sea amplificada usando un cebador no fosforilado que es
complementario con el sitio más exterior de fijación a cebadores,
mientras que la población de fragmentos de testigo es amplificada
usando un cebador fosforilado que es complementario con el sitio
más interior de fijación a cebadores.
Después de la fijación de adaptadores, las
poblaciones de fragmentos de testigo y de muestra son sometidas por
separado a una operación de amplificación inicial, preferiblemente
por una reacción en cadena de la polimerasa. La generación del
complemento de la secuencia de un adaptador, como se acaba de
describir, se puede conseguir antes de la amplificación inicial
realizando una prolongación inicial en la ausencia de un
cebador.
Mediante el proceso de esta operación de
amplificación inicial, los productos de amplificación de las
poblaciones de fragmentos de muestra y de testigo resultarán
marcados diferencialmente. Esta marcación diferencial dirigirá los
fragmentos amplificados de la población de testigo para una
degradación selectiva, y asegurarán que los dúplex no dirigidos (que
surgen durante subsiguientes operaciones de asociación) procedentes
de los fragmentos amplificados de la población de muestra, sean
resistentes a la degradación. Una marcación diferencial se consigue
usando diferentes tipos de cebadores para la amplificación de la
población de fragmentos de testigo y la población de fragmentos de
muestra, como se describirá ahora.
Unos cebadores capaces de asociarse con los
sitios de fijación a cebadores del adaptador de oligonucleótidos
pueden estar o bien fosforilados o no fosforilados en su extremo
5'. Está dentro de la experiencia de la especialidad el hecho de
preparar cualquiera de los tipos de cebadores por una síntesis
automática (véanse, p.ej. el Manual de Usuarios del Sintetizadores
de ADN de Applied Biosystems Modelo 380, e informes técnicos
adicionales, Gait, véase cita anterior, y Eckstein, véase cita
anterior, cuyas divulgaciones se incorporan a la presente por su
referencia). Los oligonucleótidos fosforilados son sintetizados en
un instrumento automático usando un monómero fosforilado en el
ciclo de acoplamiento final. Dicho monómero fosforilado, destinado a
usarse en una síntesis automática, se puede obtener comercialmente,
por ejemplo de Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, o de Applied
Biosystems, Foster City, CA, o de Glen Research, Sterling, VA, o de
otros vendedores comerciales. Alternativamente un oligonucleótido
fosforilado se puede preparar mediante una síntesis automática de
un oligonucleótido terminado por hidroxilo en 5', seguido por una
fosforilación enzimática usando métodos bien conocidos en la
especialidad (p.ej. Maniatis y colaboradores, Sambrook y
colaboradores, Ausubel y colaboradores, véanse citas
anteriores).
En una realización preferida del presente invento
se usarán cebadores fosforilados y no fosforilados en la marcación
diferencial de dos poblaciones de fragmentos de polinucleótidos,
como se explica seguidamente. En la amplificación inicial de la
población de fragmentos de testigo, se usa para la amplificación un
cebador fosforilado en 5'. En la amplificación inicial de la
población de muestra, se usa para la amplificación un cebador no
fosforilado en 5'. La presencia de un grupo fosfato en 5' en
fragmentos que comprenden la población de fragmentos amplificados
de testigo, hace que estos fragmentos sean susceptibles a la acción
de nucleasas que inician una degradación exonucleolítica de
extremos terminales de fosfato en 5', tales como una \lambda
exonucleasa. En contraste, la falta de un fosfato en 5' en
fragmentos que comprenden la población de fragmentos de muestra
protege a estos fragmentos con respecto de la acción de nucleasas
específicas para fosfato en 5', tales como una \lambda
exonucleasa. Un cebador, cuyos productos de prolongación son
susceptibles a una degradación, es conocido como un cebador
director y se dice que sus productos de prolongación son dirigidos;
mientras que un cebador cuyos productos de prolongación están
protegidos con respecto de la degradación es conocido como un
cebador no director y se dice que sus productos de prolongación no
son dirigidos. Otros tipos de cebadores no directores incluyen los
que contienen uno o más enlaces de
\alpha-fósforotioato o fosfonato de metilo entre
nucleótidos cerca del extremo 5', o los cebadores cuyo extremo 5'
está bloqueado con grupos amino o tiol, todos los cuales
proporcionan también productos de prolongación que son resistentes a
la degradación por una \lambda exonucleasa. Otros tipos de
modificaciones en el extremo 5' [es decir, estructuras modificadas
de ácidos nucleicos, tales como por ejemplo biciclo ADN, Bolli y
colaboradores (1996) Nucleic Acids Res. 24:
4660-4667, y ácidos nucleicos peptídicos, Nielsen y
colaboradores (1991) Science
254:1497-1500], que hacen que un
oligonucleótido o polinucleótido sea resistente frente a una
exonucleasa específica para 5', son considerados también por el
invento. Además, se pueden usar otros tipos de nucleasas para la
degradación de hebras de ácidos nucleicos dirigidos. Por ejemplo,
la exonucleasa 6 del gen T7 es una exonucleasa específica para
dobles hebras, que hidroliza en una dirección de 5' a 3'. Kerr y
Sadowski (1989) J. Biol. Chem. 247:
311-318. Sin embargo, una digestión por la
exonucleasa 6 del gen T7 puede ser bloqueada por la presencia de
cuatro o más enlaces de fósforotioato en el extremo 5' de una
molécula de ADN de doble hebra. Nikiforov y colaboradores (1994)
PCR Meth. & App. 3: 285-291. Los
monómeros y reactivos útiles para la incorporación de nucleótidos
modificados con amino o con tio durante una síntesis automática de
oligonucleótidos, están disponibles de diferentes suministradores
comerciales, por ejemplo Clontech Laboratories, Palo Alto CA, o
Applied Biosystems, Foster City CA, o Glen Research, Sterling VA, u
otros suministradores.
Para la producción de productos de amplificación
no dirigidos, la amplificación es cebada con un cebador terminado
en hidroxilo en 5', que es complementario con un sitio de fijación
a cebadores diferente del que se ha usado para una amplificación de
la población de fragmentos dirigidos. Generalmente, la población de
fragmentos amplificados de testigo será dirigida y la población de
fragmentos amplificados de muestra no será dirigida.
Otro método de dirigir el subconjunto de menor
complejidad de una población de fragmentos de testigo es el de
hacer crecer las células, a partir de las cuales se ha de derivar
la población de testigo, en unas condiciones en las que se
incorpora en el ADN un uracilo en lugar de una timina (o realizar la
amplificación inicial de la población de fragmentos de testigo
usando trifosfato de desoxiuridina en vez de trifosfato de
timidina). Esto haría que el ADN sustituido con uracilo sea
susceptible a la acción degradadora de la enzima uracil - ADN -
glicosilasa.
En la realización sumamente preferida de la
operación de amplificación inicial del invento, la población de
fragmentos de testigo será amplificada usando un cebador
fosforilado que tenga una secuencia que sea complementaria con el
sitio más interior de fijación a cebadores del adaptador, y la
población de fragmentos de muestra será amplificada usando un
cebador no fosforilado que tenga una secuencia que sea
complementaria con el sitio más exterior de fijación a cebadores
del adaptador.
Las poblaciones de fragmentos de testigo y de
muestra, marcados diferencialmente, que se han generado por las
reacciones de amplificación iniciales, se combinan unas con otras,
se someten a unas condiciones de desnaturalización y luego se
incuban, en unas condiciones de asociación, con fragmentos
procedentes de la población de testigo en exceso. Este exceso (con
respecto a los moles de un nucleótido) puede fluctuar desde 2:1 a
100.000:1, dependiendo de los requisitos del experimento, y
preferiblemente es de 100:1. El exceso de fragmentos de testigo con
respecto a los de muestra puede ser diferente para los diferentes
ciclos de hibridación y amplificación.
Las condiciones que favorecen la
desnaturalización, inclusive una alta temperatura y/o una baja
fuerza iónica y/o una concentración, de moderada a alta, de
disolvente orgánico, son bien conocidas en la especialidad.
Similarmente, las condiciones que favorecen la reasociación o la
renaturalización, tales como una alta fuerza iónica y/o unas
temperaturas más bajas, y la variación de estas condiciones para
ajustar la rigurosidad de hibridación, son bien conocidas en la
especialidad (p.ej. Maniatis y colaboradores, Sambrook y
colaboradores, Ausubel y colaboradores, véanse citas anteriores).
El momento de realizar la asociación se puede hacer variar
dependiendo de la complejidad de las secuencias en la reacción y de
la extensión de la renaturalización que se desee, y se determina
generalmente por uso de la fórmula
C_{0}t_{1/2}=
1/k
en la que C_{0} se refiere a la
concentración inicial de un ADN de una sola hebra, t_{1/2} es el
momento en el que la mitad del ADN de una sola hebra inicial ha
formado un dúplex, y k es la constante de velocidad de reasociación,
que dependen de la complejidad de la población de ADN. Las mezclas
en asociación son tamponadas generalmente cerca de un pH neutro y
pueden contener agentes quelantes, tales como EDTA. Véanse, por
ejemplo, Sambrook y colaboradores, cita anterior, Ausubel y
colaboradores, cita anterior y Hames & Higgins (1985), cita
anterior.
La fuerza iónica de una mezcla de asociación es
ajustada tradicionalmente usando el catión de Na^{+}. Sin
embargo, el catión de Mg^{2+} podría ser preferible por varias
razones. En primer lugar, una concentración dada de Mg^{2+}
proporcionará una fuerza iónica correspondientemente más alta, en
comparación con una concentración igual de un catión monovalente tal
como el de Na^{+} o K^{+}. En segundo lugar, la alta
concentración de un Na^{+} usado en reacciones de asociación (de
manera típica, aproximadamente 1 M) es inhibitoria para las enzimas
polimerasas de ADN usadas para la amplificación, y es demasiado
alta como para permitir una dilución de la mezcla de asociación en
la reacción de amplificación, mientras que se mantienen razonables
volúmenes de reacción, necesitando una precipitación o purificación
del producto asociado antes de la amplificación. Hasta ahora, el
uso de Mg^{2+} en reacciones de asociación estaba excluido por la
frecuente presencia de nucleasas dependientes de Mg^{2+}, que con
frecuencia contaminaban a las preparaciones de ADN y ARN. En el
presente invento, los ácidos nucleicos que se han de amplificar han
sido sometidos generalmente a un número suficiente de operaciones de
purificación (p.ej., antes y después de la ligación de adaptadores)
como para que sea despreciable la contaminación con nucleasas.
Alternativamente, las preparaciones de ácidos nucleicos se pueden
purificar por cromatografía en matrices diseñadas especialmente,
tales como Qiaex II (Qiagen) o GeneClean (Bio 101) para proporcionar
preparaciones exentas de nucleasas. Consiguientemente, el presente
invento considera el uso de Mg^{2+} en la reacción de asociación
en una concentración de 62,5 mM, que es equivalente a 1 M de NaCl
en términos de fuerza iónica. Wetmur y Sninsky en "PCR
Strategies" [Estrategias de PCR], coordinadores de edición Innis
y colaboradores, Academic Press (1995) páginas
69-83. Después de que esté completa la reacción de
asociación, la mezcla de reacción puede simplemente ser diluida para
dar los componentes de la reacción de amplificación, de manera tal
que la concentración de Mg^{2+} esté situada entre 1 y 5 mM.,
dependiendo del valor óptimo de Mg^{2+} de la polimerasa de ADN
que se usa para la amplificación, que es generalmente de
aproximadamente 1,5 mM.
Después de una asociación, la mezcla de
asociación es tratada de manera que los fragmentos dirigidos son
degradados y los fragmentos no dirigidos son a la vez protegidos
con respecto de la degradación y amplificados preferentemente. Los
significados de los términos "dirigidos" y "no dirigidos"
y los métodos, mediante los que se consiguen una degradación
selectiva de fragmentos dirigidos y una amplificación selectiva de
fragmentos no dirigidos, han sido descritos con anterioridad.
Correspondientemente, la operación de asociación
es seguida por una o más operaciones de digestión con nucleasas, en
las que los polinucleótidos dirigidos son susceptibles a
degradación. En una realización preferida, los cebadores directores
contienen un grupo fosfato en 5' y los cebadores no directores no
están fosforilados en sus extremos 5', y se usa para la digestión
una combinación de una Nucleasa de Haba Mung y de una \lambda
exonucleasa. Estas condiciones darán como resultado la destrucción
de un material de una sola hebra por la Nucleasa de Haba Mung, y la
degradación exonucleolítica (por una \lambda exonucleasa) de
cualquier hebra terminada con un grupo de fosfato en 5'. Por lo
tanto, serán degradados los dúplex que contengan ambas hebras
procedentes de la población de fragmentos de testigo. Los dúplex que
contengan una hebra fosforilada en 5' (procedente de la población
de fragmentos de testigo) y una hebra que no esté fosforilada en el
extremo 5' (procedente de la población de fragmentos de muestra)
experimentarán una degradación de la hebra fosforilada en 5' por
una \lambda exonucleasa, después de lo cual la hebra remanente
resulta susceptible a la acción de la Nucleasa de Haba Mung. Los
dúplex que consisten en dos hebras procedentes de la población de
fragmentos amplificados de muestra contendrá dos extremos
terminales con hidroxilo en 5' y por lo tanto son preferentemente
resistentes a la degradación. Dichos dúplex son también
preferentemente amplificables, tal como se describirá seguidamente.
Las digestiones con estas enzimas pueden desarrollarse en cualquier
orden; en una realización preferida, una digestión inicial con una
\lambda exonucleasa es seguida por un tratamiento con la Nucleasa
de Haba Mung. Las enzimas o los tratamientos químicos, que tienen la
misma especificidad que la Nucleasa de Haba Mung y la \lambda
exonucleasa, se consideran también por el presente invento.
A continuación de un tratamiento con una
nucleasa, los polinucleótidos no digeridos sobrevivientes, son
amplificados usando un cebador no director que es complementario
con uno de los sitios interiores de fijación a cebadores, con
preferencia el primer sitio interior de fijación a cebadores, que
está adyacente al sitio más exterior de fijación a cebadores. Como
se describe con anterioridad, los dúplex que contengan secuencias
únicas para la población de muestra habrán sobrevivido a una
degradación por nucleasas en virtud de sus extremos no fosforilados
en 5'. Éstos estarán disponibles por lo tanto para una amplificación
exponencial. Todas las otras especies de dúplex o de
polinucleótidos de una sola hebra habrán sido degradadas por el
precedente tratamiento con nucleasas. Consiguientemente, el
producto de la amplificación estará altamente enriquecido en cuanto
a fragmentos que sean únicos para la población de muestra.
El material amplificado, obtenido a partir de la
operación precedente, se puede combinar con un exceso (de 2 veces a
100.000 veces, preferiblemente de 100 veces) de fragmentos
amplificados procedentes de la población de testigo, y el ciclo de
asociación, digestión con nucleasa y amplificación puede ser
repetido hasta que se obtengan uno o más deseados productos de
diferencia. En cada ciclo, un diferente cebador no director se usa
para la operación de amplificación. En una realización preferida,
el cebador de amplificación en cualquier ciclo dado se
corresponderá con el siguiente sitio de fijación a cebadores que sea
interior con relación al usado en el ciclo anterior. Se puede usar,
si es necesario, un cebador no director que es complementario con
el sitio más interior de fijación a cebadores.
La relación de los fragmentos de testigo a los de
muestra es mantenida en 100:1. Según van desarrollándose las rondas
de substracción, los raros productos de diferencia aumentarán en
proporción en la población de fragmentos amplificados de muestra.
Este aumento permitirá que los raros productos de diferencia
encuentren apareamientos idénticos durante la hibridación (una
reacción cinética de segundo orden) con mayor rapidez. Esto debería
reducir el número de rondas de hibridación substractiva que se
necesitan para encontrar mensajes raros y en las últimas rondas
puede permitir que el largo tiempo de hibridación (20 horas) sea
acortado a un valor tan pequeño como uno de 6-8
horas, y/o permitir una disminución en el número de ciclos que se
requieren para amplificar los productos de diferencia.
Para evitar la obtención de "conocidas"
secuencias indeseadas en el producto de diferencia, la población de
fragmentos amplificados de testigo se puede suplementar con las
secuencias "conocidas" o la población de fragmentos
amplificados de muestra se puede hibridar con una biblioteca de
supresiones que contenga secuencias "conocidas" indeseadas.
Cualquiera de estos métodos se realizará de una manera sumamente
eficiente en la generación de los segundos (o subsiguientes)
productos de diferencia.
El enriquecimiento de mensajes raros puede ser
aumentado usando una población agotada de fragmentos de testigo en
la generación del segundo (o subsiguiente) producto de diferencia.
La población agotada de fragmentos de testigo es generada usando la
población de fragmentos de testigo en una cantidad limitada y
substrayéndola con un exceso de la población de fragmentos de
muestra. Las poblaciones agotadas de fragmentos de testigo deberán
ser usadas en las rondas finales de la hibridación
substractiva.
Los productos de diferencia, obtenidos por la
práctica del invento, se pueden usar directamente como sondas, o se
pueden clonar y propagar para la determinación de secuencias, para
su uso como sondas, etc.
En un ejemplo no limitativo de la práctica del
invento, se proporciona el siguiente producto para el análisis de
la diferencia entre dos poblaciones de ADNc. El TE (o 1 X TE) es
una mezcla de 10 mM de Tris-Cl (pH 8,0 a 20ºC) y de
0,1 mM de ácido
etilen-diamina-tetraacético. El
tampón 3 X EE es una mezcla de 30 mM de EPPS (Sigma Chemical Co),
de pH 8,0 (a 20ºC) y de 3 mM de ácido
etilen-diamina-tetraacético.
Se usan puntas biseladas para cargar geles con el
fin de eliminar los materiales sobrenadantes a partir de
sedimentos, con el fin de reducir la pérdida de sedimento debida a
un desplazamiento de la punta. Con el fin de aumentar el
rendimiento de las precipitaciones, se usan tubos
Hi-Yield® (Robbins Scientific Corporation,
Sunnyvale, CA). Se usan tubos para PCR de paredes delgadas (tubos
de reacción MicroAmp®, Perkin Elmer, Norwalk, CT) para las
operaciones de amplificación.
Las diferencias en las condiciones de realización
de un ciclo entre termocicladores y las incoherencias entre
pocillos se pueden evitar usando un programa PCR de toque para las
operaciones de amplificación. Don R.H., y colaboradores (1991),
"Touchdown" PCR to circumvent spurious priming during gene
amplification [PCR de "toque" para evitar la cebadura espuria
durante una amplificación de gen]. Nucleic Acids Research
19: 4008, cuya divulgación se incorpora a la presente por su
referencia.
Los siguientes oligonucleótidos se preparan por
síntesis química automática, usando un sintetizador de ADN de
Applied Biosystems 380D:
AO: oligonucleótido adaptador 45 mero
5'-CGATAGTCAC TCTACCACTC
AGCCTACGCA CGAGACGATG TACTC-3'
\hskip0.7cmSEQ ID NO: 1
LA: adaptador - engarzador 13 mero
5'-GATCGAGTAC
ATC-3'
\hskip8.4cmSEQ ID NO: 2
P1: cebador oligonucleótido 22 mero (T_{m} =
58,4ºC)
5'CGATAGTCAC TCTACCACTC AG-3'
\hskip6.3cmSEQ ID NO:3
P2: cebador oligonucleótido 24 mero (T_{m} =
61,9ºC)
5'-TAGTCACTCT ACCACTCAGC
CTAC-3'
\hskip5.7cmSEQ ID NO:4
P3: cebador oligonucleótido 24 mero (T_{m} =
72,1ºC)
5'-TACCACTCAG CCTACGCACG
AGAC-3'
\hskip5.3cmSEQ ID NO: 5
P4: cebador oligonucleótido 26 mero (T_{m} =
74,9ºC)
5'-CAGCCTACGC ACGAGACGAT
GTACTC-3'
\hskip4.9cmSEQ ID NO: 6
PP4: cebador oligonucleótido
5'-fosfato 26-mero
5'-p- CAGCCTACGC ACGAGACGAT
GTACTC-3'
\hskip4.4cmSEQ IN NO: 7
Un ARNm poli A^{+} se prepara a partir de
células eucarióticas o tejidos, preferiblemente usando una lisis
parcial para generar un ARNm citoplasmático. Si son células
procarióticas la fuente de ARN, se pueden usar preparaciones de ARN
total. Se tiene cuidado de retener grandes transcritos de plena
longitud (p.ej. usando reactivos estériles, exentos de ribonucleasas
y dispositivos de pipeteo) y para asegurar que las muestras han
sido tratadas idénticamente, y se encuentran en etapas similares de
crecimiento.
Un ADNc de doble hebra se prepara usando un
cebador oligo 5'-T_{30}MN-3' (M =
A, G ó C y N = A, G, C ó T) siguiendo el protocolo de producción de
un ADNc de doble hebra que acompaña a la enzima transcriptasa
inversa Super-script® II RT. Las preparaciones de
ADNc se producen a partir de las poblaciones de ARN's tanto de
muestra como de testigo, en condiciones idénticas dentro de
recipientes de reacción dispuestos por separado.
Las siguientes operaciones se realizan de una
manera idéntica, pero en recipientes de reacción dispuestos por
separado para las poblaciones de ADNc's tanto de muestra como de
testigo. Dos microgramos de un ADNc se digieren con DpnII (New
England Biolabs, Inc., Beverly, MA), en 100 \mul a 37ºC durante 2
a 4 horas, en unas condiciones recomendadas por el suministrador,
usando tampones estériles y un aparato de pipeteo. El progreso de
la digestión se puede vigilar mediante una electroforesis en gel de
agarosa de una parte alícuota de la reacción de digestión. Después
de haberse completado la digestión, la mezcla de digestión se
extrae dos veces con una mezcla de fenol, cloroformo y alcohol
isoamílico, y una vez con una mezcla de cloroformo y alcohol
isoamílico. A la fase acuosa se le añaden 2 g de un vehículo de
glicógeno, 50 \mul de NH_{4}OAc 10 M, y 650 \mul de EtOH al
100%. La mezcla se dispone sobre hielo durante 20 minutos, después
de lo cual se la somete a centrifugación a 14.000 rpm durante 14
minutos a 4ºC. El sedimento se lava con EtOH al 85%, luego se seca
y se vuelve a suspender en 20 \mul de TE.
Las siguientes operaciones se realizan de una
manera idéntica, pero en recipientes de reacción dispuestos por
separado para las poblaciones de ADNc's de muestra y de testigo. Se
combinan los siguientes componentes (usando tampones estériles y
H_{2}O):
- 12 \mul (aproximadamente 1,2 \mug) de un ADNc digerido por restricción (ya sea una población de fragmentos de muestra o una población de fragmentos de testigo).
- 7,5 \mul de AO oligo 45 mero desalinizado (2 mg/ml) [SEQ ID NO: 1]
- 4,3 \mul de LA oligo Engarzador Adaptador [Linker Adapter] 13 mero desalinizado (1 ng/ml) [SEQ ID Nº 2].
- 6 \mul de 10 X Tampón de Ligasa (New England Biolabs, Inc. Beverly, MA); 27,2 \mul de H_{2}O.
Para permitir la asociación, las mezclas se
incuban en un termociclador PTC 100® (M J Research, Watertown, MA)
con Hot Bonnet a 50ºC durante 1 minuto, seguido por un enfriamiento
a 10ºC en el curso de 1 hora. Para la ligación, se añaden 3 \mul
de una Ligasa de ADN de T4 (400 unidades/\mul, New England
Biolabs, Beverly, MA) y se continúa la incubación a
12-16ºC durante una noche. La mezcla de ligación se
diluye por la adición de 140 \mul de TE.
Las reacciones de amplificación iniciales se
pueden usar para generar subconjuntos de menor complejidad de las
poblaciones de fragmentos de muestra y/o de testigo. Esto se puede
conseguir escogiendo una apropiada combinación de una enzima de
restricción para la digestión por restricción (operación C, más
arriba) y unas condiciones de amplificación tales que los fragmentos
mayores en la población dejan de ser amplificados.
Alternativamente, la población amplificada puede retener la
complejidad del material de partida, usándose la amplificación
inicial simplemente para aumentar la cantidad de material
disponible para operaciones subsiguientes. Las siguientes
condiciones se han diseñado para proporcionar 0,5-1
mg de un material amplificado para cada población que se
amplifica.
Tandas de reacción de 200 \mul se recogen en
tubos de microcentrífuga con una capacidad de 0,5 ml, y se preparan
20-30 tandas de reacción. Para la población de
fragmentos de muestra, cada tanda de reacción contiene los
siguientes componentes, añadidos en el orden mostrado:
- 169,2 \mul de H_{2}O estéril
- 20 \mul de un tampón para PCR 10X Vent® (New England Biolabs, Beverly, MA)
- 6,8 \mul de una mezcla de nucleótidos para PCR (10 mM de cada uno de los dATP, dCPT, dGTP, dTTP; Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN)
- 2 \mul de un Cebador P1 (1 mg/ml) [SEQ ID NO: 3]
- 2 \mul de una población de fragmentos de muestra, ligados con un adaptador, que se ha diluido como en la operación D anterior.
Las tandas de reacción se disponen en un
termociclador PTC 100® (MJ Research, Watertown MA) con Hot Bonnet y
se incuban durante 3 minutos a 72ºC (para disociar los Engarzadores
Adaptadores 13-meros procedentes de la operación
D). Se añade un microlitro (5 unidades) de la polimerasa de ADN
Vent® (New England Biolabs, Inc. Beverly, MA) y se continúa la
incubación a 72ºC durante 5 minutos. Esto rellena los extremos que
son complementarios con el oligonucleótido adaptador 45 mero, que
se había ligado con los fragmentos en la operación D, generando con
ello un conjunto de sitios de fijación a cebadores. A continuación,
las mezclas de reacción se someten a veinte ciclos de 1 minuto a
95ºC, 30 segundos a 58,4ºC, y 3 minutos a 72ºC. Se realiza una
prolongación final de 10 minutos a 72ºC, y luego las tandas de
reacción se enfrían a 4ºC. Es importante no aumentar el número de
ciclos más allá de 20, puesto que se producirá un sesgo hacia
productos de amplificación más pequeños, lo cual influirá en la
subsiguiente substracción. Si se requiere más cantidad de producto
se debería aumentar el número de tandas de reacción.
Para la purificación del producto de
amplificación, cuatro tandas de reacción se combinan por cada tubo
Eppendorf de 1,5 ml de capacidad. Cada mezcla se extrae dos veces
con 700 \mul de una mezcla de fenol, cloroformo y alcohol
isoamílico y una vez con una mezcla de cloroformo y alcohol
isoamílico. Seguidamente, se añaden y mezclan 75 \mul de NaOAc 3
M (de pH 5,3) y 800 \mug de isopropanol, y los tubos se colocan
sobre hielo durante 20 minutos. Los tubos se centrifugan luego a
14.000 rpm durante 14 minutos a 4ºC. El sedimento se lava con EtOH
al 85%, se seca, y se vuelve a suspender a una concentración de
ácido nucleico de 0,5 mg/ml (aproximadamente 100-150
\mul por cada tubo con cuatro tandas de reacción).
Para la población de fragmentos de testigo, unas
tandas de reacción 200 \mul se reúnen en tubos de microcentrífuga
con una capacidad de 0,5 ml y se preparan 20-30
tandas de reacción. Cada tanda de reacción contiene los siguientes
componentes, añadidos en el orden mostrado:
- 169,2 \mul de H_{2}O estéril
- 20 \mul de un tampón para PCR 10X Vent® (New England Biolabs, Beverly, MA).
- 6,8 \mul de mezcla de nucleótidos para PCR (10 mM de cada uno de los dATP, dCPT, dGTP, dTTP, Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN).
- 2 \mul del cebador PP4 (1 mg/ml) [SEQ ID NO: 7].
- 2 \mul de una población de fragmentos de testigo, ligados con un adaptador, diluida como en la operación D anterior.
Las tandas de reacción se disponen en un
termociclador PTC 100® (M J Research, Watertown, MA) con Hot Bonnet
y se incuban durante 3 minutos a 80ºC (para disociar los
Engarzadores Adaptadores 13 meros procedentes de la operación D).
Se añade un microlitro (5 unidades) de la polimerasa de ADN Vent®
(exo^{-}) (New England Biolabs, Beverly, MA) y se continúa la
incubación a 80ºC durante 5 minutos. Esto rellena los extremos que
son complementarios con el oligonucleótido adaptador 45 mero, que
se había ligado con los fragmentos en la operación D, generando de
este modo un conjunto de sitios de fijación a cebadores. A
continuación, las mezclas de reacción se someten a veinte ciclos de
1 minuto a 95ºC y 3 minutos a 74,9ºC. Se realiza una prolongación
final durante 10 minutos a 75ºC, y luego las tandas de reacción se
enfrían a 4ºC. Es importante no aumentar el número de ciclos más
allá de 20, puesto que se producirá un sesgo hacía productos de
amplificación de menor tamaño, lo cual influirá sobre la
substracción subsiguiente. Si se requiere más cantidad de producto,
se debería aumentar el número de reacciones.
Para la purificación del producto de
amplificación, se combinan cuatro tandas de reacción por cada tubo
Eppendorf con una capacidad de 1,5 ml. Cada mezcla se extrae dos
veces con 700 \mul de una mezcla de fenol, cloroformo y alcohol
isoamílico, y una vez con una mezcla de cloroformo y alcohol
isoamílico. Luego se añaden y mezclan 75 \mul de NaOAc 3 M (pH
5,3) y 800 \mul de isopropanol, y los tubos se disponen sobre
hielo durante 20 minutos. Luego los tubos se centrifugan a 14.000
rpm durante 14 minutos a 4ºC. El sedimento se lava con EtOH al 85%
y se vuelve a suspender a una concentración de ácido nucleico de
0,5 mg/ml (aproximadamente 100-150 \mul por cada
tubo con cuatro tandas de reacción).
Para preparar una mezcla de asociación, 80 \mul
de la población de fragmentos de testigo, ligados con un adaptador
y amplificados, que procede de la operación E anterior (40 \mug),
se mezclan con 40 \mul de una dilución a 50 veces de la población
de fragmentos de muestra, ligados con un adaptador y amplificados,
que procede de la operación E anterior (0,4 \mug), en un tubo
para microcentrífuga Eppendorf con una capacidad de 0,5 ml. La
mezcla se extrae una vez con una mezcla de fenol y cloroformo y una
vez con cloroformo. Los ácidos nucleicos se precipitan por adición
de 30 \mul de NH_{4}OAc 10 M, 380 \mul de EtOH al 100% y por
incubación a -70ºC durante 10 minutos. La mezcla se calienta a 37ºC
durante 1 a 2 minutos (con el fin de reducir al mínimo la
precipitación de sales), y luego se somete a una centrifugación a
14.000 rpm durante 14 minutos a 4ºC. El sedimento se lava dos veces
con EtOH al 85%, cada vez con una breve centrifugación, y luego se
seca mediante un vacío durante tres minutos.
El sedimento se vuelve a suspender a fondo en 4
\mul de un tampón 3X EE [30 mM de EPPS (de Sigma Chemical Co.),
pH 8,0 (a 20ºC) / 3 mM de EDTA) pipeteando durante al menos 2
minutos, y luego se calienta a 37ºC durante 5 minutos. El contenido
se mezcla por tratamiento con vórtice y el líquido se lleva al
fondo del tubo mediante una breve centrifugación, luego se cubre con
35 \mul de un aceite mineral, previamente calentado a 37ºC.
La mezcla se incuba luego a 98ºC durante 5
minutos en un termociclador para desnaturalizar los ácidos
nucleicos. Se enfría a 67ºC, y se añaden inmediatamente 1 \mul de
NaCl 5 M (previamente calentado a 67ºC) de manera directa a la
mezcla de hibridación substractiva. La incubación a 67ºC se
continúa durante 20 horas.
La mezcla de hibridación substractiva se retira
desde por debajo del aceite mineral y se diluye de un modo
escalonado, usando soluciones previamente calentadas para reducir
al mínimo una hibridación indeseada, inducida por cambios en la
temperatura. Primeramente, la mezcla de hibridación substractiva
procedente de la operación F anterior, que ha sido incubada durante
20 horas a 67ºC, se añade a 15 \mul de TE, que se ha calentado
previamente a 67ºC. Manteniendo el tubo dentro del termociclador,
la mezcla se pipetea enérgicamente. Finalmente, se añaden 65 \mul
adicionales de TE (previamente calentado a 67ºC), y la mezcla se
pipetea enérgicamente una vez más. Finalmente, se añaden
315 \mul de H_{2}O estéril (previamente calentada a 67ºC) y la mezcla se trata a fondo con vórtice. La mezcla de hibridación substractiva está ahora en 0,2 X TE y está presta para una digestión ya sea con \lambda exonucleasa o con Nucleasa de Haba Mung. Ésta se puede almacenar sobre hielo o congelar a -70ºC para un almacenamiento a largo plazo.
315 \mul de H_{2}O estéril (previamente calentada a 67ºC) y la mezcla se trata a fondo con vórtice. La mezcla de hibridación substractiva está ahora en 0,2 X TE y está presta para una digestión ya sea con \lambda exonucleasa o con Nucleasa de Haba Mung. Ésta se puede almacenar sobre hielo o congelar a -70ºC para un almacenamiento a largo plazo.
A 200 \mul de la mezcla de hibridación
substractiva diluida procedente de la operación G.1 anterior, se
les añaden 30 \mul de un tampón 10 X para \lambda exonucleasa
(Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ), 60 \mul de agua y 10 \mul
de \lambda exonucleasa (10 unidades/\mul, Pharmacia Biotech,
Piscataway, NJ). La mezcla de reacción se incuba a 37ºC durante 30
minutos. La digestión se termina por incubación de la mezcla de
reacción a 75ºC durante 10 minutos, seguida por un enfriamiento a
la temperatura ambiente durante 5 minutos, el tubo de reacción se
centrifuga brevemente para recoger el material condensado, y se
añaden y mezclan 100 \mul de agua. La mezcla de reacción se
extrae dos veces con un volumen igual de una mezcla de fenol,
cloroformo y alcohol isoamílico (25:24:1, v/v/v) y una vez con un
volumen igual de una mezcla de cloroformo y alcohol isoamílico
(24:1, v/v). La fase acuosa se divide (a 200 \mul en cada uno de
dos tubos para microcentrífuga con una capacidad de 1,5 ml), y a
cada tubo se le añaden 4 \mug de un vehículo de glicógeno, 0,1 ml
de acetato de amonio 10 M y 1,3 ml de etanol absoluto. Después de
haber mezclado e incubado sobre hielo seco durante 20 min, el ácido
nucleico precipitado se recoge por centrifugación a 14.000 rpm
durante 14 min a 4ºC. Los sedimentos se lavan con etanol al 85%, se
desecan en vacío durante 3 min y se vuelven a suspender en 50
\mul de agua estéril por cada sedimento. Los sedimentos vueltos a
suspender se combinan dentro de uno de los dos tubos, y el otro se
lava dos veces con 50 \mul de agua estéril y los líquidos de
lavado se combinan con los sedimentos vueltos a suspender.
Como un testigo positivo para las digestiones con
exonucleasa, se puede usar un conjunto de marcadores del peso
molecular fosforilados en 5', que están disponibles comercialmente.
Como un testigo negativo, los mismos marcadores se pueden
desfosforilar (por ejemplo, por tratamiento con fosfatasas alcalinas
bacterianas o de intestino de ternero). La presencia o ausencia de
productos de digestión se puede detectar por un análisis de
transferencia Southern.
A 200 \mul de la mezcla de digestión con
\lambda exonucleasa, procedente de la operación G.2 anterior, se
les añaden los siguientes componentes:
- 40 \mul de un tampón 10 X de Nucleasa de Haba Mung (New Eng. Biolabs, Beverly. MA).
- 4 \mum de ZnSO_{4}.
- 136 \mul de H_{2}O estéril.
- 20 \mul de Nucleasa de Haba Mung (10 unidades/\mul, New Eng. Biolabs, Beverly, MA).
La mezcla de digestión se incuba a 30ºC durante
35 minutos. Luego se extrae dos veces con una mezcla de fenol,
cloroformo y alcohol isoamílico y una vez con una mezcla de
cloroformo y alcohol isoamílico y se divide dentro de dos tubos
para microcentrífuga con una capacidad de 1,5 ml, cada uno de los
cuales contiene 200 \mul. Después de la adición de 4 \mug de un
vehículo de glicógeno, 100 ml de NH_{4}OAc, y 1.300 ml de EtOH al
100%, la mezcla se dispone sobre hielo seco durante 20 minutos. Los
ácidos nucleicos se recogen por centrifugación a 14.000 rpm durante
14 minutos a 4ºC. Los sedimentos se lavan con EtOH al 85%, se
desecan en vacío durante 3 minutos y cada uno de ellos se vuelve a
suspender en 50 \mul de agua estéril. Los ácidos nucleicos se
pueden purificar a partir de la reacción con la Nucleasa de Haba
Mung usando la Columna de Pharmacia Microspin® S-200
(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) siguiendo el protocolo
proporcionado por el fabricante. Los efluentes de la columna
se
combinan.
combinan.
Veinte microlitros del material digerido con
Nucleasa de Haba Mung y con \lambda exonucleasa procedente de la
operación G.3, se añaden, sobre hielo, a cada uno de cuatro tubos,
cada uno de los cuales contiene los siguientes componentes, que se
han reunido previamente sobre hielo:
- 169,2 \mul de H_{2}O estéril,
- 20 \mul de 10 X tampón Vent® (New England Biolabs, Beverly, MA).
- 6,8 \mul de una mezcla de nucleótidos para PCR (10 mM de cada uno de los dATP, dCTP, dGTP, dTTP; Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN).
- 2 \mul del cebador P2 (1 mg/ml) [SEQ ID NO:4].
Las mezclas se incuban en un termociclador
durante 1 minuto a 95ºC, luego se enfrían a 80ºC, después de lo cual
se añade 1 \mul (5 unidades) de la polimerasa de ADN Vent®
(exo^{-}) (New England Biolabs, Beverly, MA). Luego se llevan a
cabo veintidós ciclos de amplificación, de acuerdo con el siguiente
protocolo: 1 minuto a 95ºC, 30 segundos a 61,9ºC y 3 minutos a 72ºC.
Se realiza una prolongación final durante 5 minutos a 72ºC, y las
tandas de reacción se enfrían a 4ºC.
Las 4 tandas de reacción de amplificación se
combinan luego dentro de un tubo Eppendorf con una capacidad de 1,5
ml, se extraen dos veces con una mezcla de fenol, cloroformo y
alcohol isoamílico, y una vez con una mezcla de cloroformo y
alcohol isoamílico. Los ácidos nucleicos se precipitan por la
adición de 75 \mul de NaOAc 3 M (pH 5,3) y 800 \mul de
isopropanol, seguido por una incubación sobre hielo durante 20
minutos. El precipitado se recoge por centrifugación a 14.000 rpm
durante 14 minutos a 4ºC. Los sedimentos se lavan con EtOH al 85%,
se desecan en vacío durante 3 minutos y se vuelven a suspender en
100 \mul de TE, para dar una concentración de ácido nucleico de
aproximadamente 0,5 \mug/\mul. Éste es el Producto de Diferencia
1 (DP1).
El DP-1 se diluye hasta 10
ng/\mul con TE. Las operaciones de hibridación substractiva (F),
de dilución (G.1), de digestión con Nucleasa de Haba Mung (G.2), de
digestión con \lambda exonucleasa (G.3) y de amplificación (G.4)
se repiten, siguiendo los procesos antes descritos, con los
siguientes cambios. En la operación F, el DP-1
reemplaza a la población de fragmentos de muestra, ligados con un
adaptador y amplificados; en la operación G.4, el cebador P3 [SEQ
ID NO: 5] reemplaza al cebador P2 [SEQ ID NO: 4], y se usa el
siguiente programa de ciclo para la amplificación usando el cebador
P3: 1 minuto a 95ºC y 3 minutos a 62,1ºC.
El DP-2 se diluye hasta 10
ng/\mul con TE. Las operaciones de hibridación substractiva (F),
de dilución (G.1), de digestión con Nucleasa de Haba Mung (G.2), de
digestión con \lambda exonucleasa (G.3) y de amplificación (G.4)
se repiten siguiendo los procesos antes descritos, con los
siguientes cambios. En la operación F, el DP-2
reemplaza a la población de fragmentos de muestra, ligados con un
adaptador y amplificados; en la operación G.4, el cebador P.4 [SEQ
ID NO: 6] reemplaza al cebador P2 [SEQ ID NO: 4] y se realiza el
siguiente programa de ciclo para la amplificación usando el cebador
P4: 1 minuto a 95ºC y 3 minutos a 74,9ºC.
Si se desea, cualquiera de los productos de
diferencia se puede analizar mediante digestión por restricción y
electroforesis en gel, de la siguiente manera. Se determina la
concentración de ADN del producto de diferencia (por ejemplo, por
absorbencia de rayos ultravioletas) y el ADN se digiere de acuerdo
con el siguiente protocolo. Se combinan:
1,0 \mul (500 mg) de ADN (DP1, DP2 ó DP3)
1,0 \mul de tampón 10 X para Dpn II (New
England Biolabs, Beverly, MA)
0,5 \mul de Dpn II (50 U/\mul, New England
Biolabs, Beverly, MA)
7,5 \mul de H_{2}O estéril.
La mezcla de digestión se incuba a 37ºC durante 2
a 4 horas. Los productos de digestión (500 ng), junto con partes
alícuotas de 500 ng de un producto de diferencia sin digerir; la
población de fragmentos de testigo ligados con un adaptador y
amplificados; y la población de fragmentos de muestra ligados con un
adaptador y amplificados, se analizan en un
mini-gel de agarosa al 2,0% Seakerm® GTG® (FMC
BioProducts, Rockland ME) que se hace pasar por un tampón TAE (40 mM
de Tris-acetato y 10 mM de ácido
etilen-diamina-tetraacético, pH 8,3
a 23ºC). Las pistas de marcadores incluyen 1 \mug de cada uno de
los marcadores IX y III (Boehringer Mannheim, Indianápolis,
IN).
Los productos de amplificación deberán variar en
cuanto al tamaño entre 200 y 1.300 pares de bases. Según va
aumentando el número de rondas de hibridación substractiva y de
amplificación selectiva, la presencia de bandas descritas
individuales debería ir aumentado en intensidad. Si las bandas son
untuosas, se vuelven a amplificar con fragmentos de muestra diluidos
y/o disminuye el número de ciclos de amplificación. Finalmente,
siempre es preferible usar una PCR en un formato Hotstart.
Aunque el presente invento se ha descrito
anteriormente por medio de ciertos/as ejemplos y realizaciones
específicos/as, éste es limitado solamente por el alcance de las
reivindicaciones adjuntas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: LINDEMANN, GARRETT SCHUELER, PAULA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DEL INVENTO: PROCEDIMIENTO PARA LA HIBRIDACIÓN SUBSTRACTIVA Y EL ANÁLISIS DIFERENCIAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: MORRISON & FOERSTER
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 755 PAGE MILL ROAD
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: PALO ALTO
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: CALIFORNIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL ZIP: 99304-1018
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA LÓGICO - SOFTWARE: Patent In Release nº1.0, Versión nº1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE LA SOLICITUD: US
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL AGENTE/ABOGADO
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Brennan, Sean M.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 39.917
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/AGENTE: 33746-20001.00
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (415) 813-5500
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (415) 494-0792
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TÉLEX: 706141
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID. NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CARÁCTER DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID. NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGATAGTCAC TCTACCACTC AGCCTACGCA CGAGACGATG TACTC
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID. NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CARÁCTER DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID. NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCGAGTAC ATC
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID. NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CARÁCTER DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID. NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGATAGTCAC TCTACCACTC AG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID. NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CARÁCTER DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA; SEQ ID. NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAGTCACTCT ACCACTCAGC CTAC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID. NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CARÁCTER DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA; SEQ ID. NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTACCACTCAG CCTACGCACG AGAC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID. NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CARÁCTER DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA; SEQ ID. NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGCCTACGC ACGAGACGAT GTACTC
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID. NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CARÁCTER DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA; SEQ ID. NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGCCTACGC ACGAGACGAT GTACTC
\hfill26
Claims (16)
1. Un método para obtener un fragmento único
presente en una población de polinucleótidos de muestra que no está
presente en una población de polinucleótidos de testigo,
comprendiendo dicho método:
- a)
- fragmentar ambas poblaciones de polinucleótidos por el mismo método para generar poblaciones de fragmentos de muestra y de testigo,
- b)
- fijar por enlaces covalentes a ambas poblaciones de fragmentos un oligonucleótido que comprende sitios desplazados hacia dentro de fijación a cebadores, comprendiendo dichos sitios de fijación a cebadores un sitio más exterior de fijación a cebadores, un sitio más interior de fijación a cebadores, y por lo menos un sitio más interior de fijación a cebadores situado entre ellos, para producir poblaciones de fragmentos de muestra y de testigo, marcados con oligonucleótidos;
- c)
- amplificar la población de fragmentos de muestra, marcados con oligonucleótidos, usando un cebador no director, que es complementario con el sitio más exterior de fijación a cebadores de dicho oligonucleótido, para generar una población de fragmentos amplificados de muestra;
- d)
- amplificar la población de fragmentos de testigo, marcados con oligonucleótidos, usando un cebador director, que es complementario con el sitio más interior de fijación a cebadores de dicho oligonucleótido, para generar una población de fragmentos amplificados de testigo;
- e)
- combinar dicha población de fragmentos amplificados de muestra con un exceso de dicha población de fragmentos amplificados de testigo, desnaturalizarlas, e incubarlas en condiciones de asociación para proporcionar una mezcla de asociación;
- f)
- someter la mezcla de asociación a unas condiciones en las que serán degradados todos los fragmentos, excepto los fragmentos de doble hebra que contienen un cebador no director en cada hebra; y
- g)
- someter subsiguientemente la mezcla de asociación, tratada como en la operación (f), a una amplificación, usando cebadores no directores que son complementarios con uno de dichos sitios interiores de fijación a cebadores, para generar un primer producto de diferencia.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
que comprende adicionalmente repetir las operaciones (e) hasta (g),
en el que un producto de diferencia reemplaza a la población de
fragmentos amplificados de muestra, y en el que la mezcla de
asociación tratada se somete a una amplificación usando un cebador
no director, que es complementario con un sitio de fijación a
cebadores que es diferente del usado en la operación precedente,
para proporcionar productos de diferencia adicionales.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó
2, en el que el cebador director comprende un grupo fosfato en 5' y
el cebador no director carece de un grupo fosfato en 5'.
4. El método de la reivindicación 3, en el que
las condiciones en las que todos los fragmentos serán degradados,
excepto los fragmentos de doble hebra, que contienen un cebador no
director en cada hebra, comprenden las acciones de una nucleasa
específica para una sola hebra y de una exonucleasa específica para
ácidos nucleicos terminados en 5'-fosfato.
5. El método de la reivindicación 4, en el que la
nucleasa específica para una sola hebra es una Nucleasa de Haba
Mung.
6. El método de la reivindicación 4, en el que la
exonucleasa específica para ácidos nucleicos terminados en
5'-fosfato es una \lambda exonucleasa.
7. El método de la reivindicación 1, en el que
dichos sitios de fijación a cebadores tienen diferentes temperaturas
de asociación.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7,
en el que dichos sitios de fijación a cebadores que avanzan desde el
extremo 5' al extremo 3' de dicho oligonucleótido tienen unas
temperaturas de asociación sucesivamente más altas.
9. Un método de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho oligonucleótido contiene
cuatro o más sitios de fijación a cebadores.
10. Un método de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que la fijación por enlace covalente
se realiza a través de la acción de una ligasa de ADN o ARN.
11. Un método de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha fragmentación se consigue
por tratamiento con una enzima de restricción que deja un extremo
sobresaliente en 5'.
12. Un método de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que dichas poblaciones de
polinucleótidos de muestra y de testigo comprenden un ADNc.
13. Un método de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que dichas poblaciones de
polinucleótidos de muestra y de testigo comprenden un ADN
genómico.
14. Un método de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 12, que comprende además clonar por lo menos
uno de los productos de diferencia.
15. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que ambas poblaciones en la operación (b) son colecciones que
contienen algunos de, pero no todos, los fragmentos de las
poblaciones origínales.
16. Un estuche para el aislamiento de uno o más
fragmentos de polinucleótidos presentes en una población de
polinucleótidos de muestra y no están presentes en una población de
polinucleótidos de testigo, comprendiendo dicho estuche:
- a)
- un oligonucleótido que comprende múltiples sitios de fijación a cebadores;
- b)
- reactivos, enzimas, tampones, cebadores capaces de asociarse a dichos sitios de fijación a cebadores de dicho oligonucleótido, y nucleótidos para la amplificación de ácidos nucleicos;
- c)
- una nucleasa específica para una sola hebra;
- d)
- una exonucleasa específica para ácidos nucleicos que tienen extremos terminados en 5'-fosfato;
- e)
- reactivos, sales y tampones para realizar una reacción de asociación;
- f)
- reactivos y enzimas para la ligación de ADN; y
- g)
- reactivos y enzimas para la síntesis de ADNc.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US08/823,111 US5958738A (en) | 1997-03-24 | 1997-03-24 | Procedure for subtractive hybridization and difference analysis |
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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