CN112553341A - 一种肾透明细胞癌scnn1引物、诊断试剂盒及其应用 - Google Patents

一种肾透明细胞癌scnn1引物、诊断试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供的用于快速诊断肾透明细胞癌的SCNN1引物包括内参引物对为GAPDH，具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的SCNN1A基因的mRNA序列正向引物和反向引物、具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的SCNN1B基因的mRNA序列正向引物和反向引物、具有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的SCNN1G基因的mRNA序列正向引物和反向引物，以人的GAPDH为内参对照，具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列的正向引物和反向引物。还制备了相应的试剂盒。该试剂盒含有以下试剂：组织裂解液Trizol、SYBRGreen Master Mix反应液、逆转录反应液、阴性对照和阳性对照。本发明能消除临床样本检测的假阴性和假阳性，且安全、可靠、准确性高，适合临床推广。

Description

一种肾透明细胞癌SCNN1引物、诊断试剂盒及其应用
技术领域
本发明属生物技术领域，具体涉及一种肾透明细胞癌SCNN1引物、诊断试剂盒及其应用。
背景技术
肾细胞癌是泌尿系统肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一，起源于肾小管细胞，其中肾透明细胞癌(clear cell nuclear cell carcinoma，ccRCC)占85％，在泌尿系恶性肿瘤居第2位。随着肿瘤检测手段与治疗方法的进步，肾透明细胞癌患者的存活率得到显著提高，但总体生存期以及无进展生存期仍然较低。肾透明细胞癌是一种发展相对较慢的肿瘤，其早期症状常缺乏特异性，很多肾透明细胞癌发现时已属中晚期，且超过1/3的病人在诊断时已经发生了转移。因此对于肾透明细胞癌的治疗还是应注重早期发现早期诊断和早期治疗。此外，肾透明细胞癌对化疗和放疗均不敏感，手术切除是唯一治愈的方法，临床上常选用免疫治疗和靶向药物治疗作为术后的辅助治疗，然而，近30％的患者术后肿瘤复发。因此，如果能够通过有效的早期诊断肾透明细胞癌或者判断患者预后，预测肿瘤复发，可降低复发转移率，延长患者的生存期。而筛选出可靠的诊断或预测肾透明细胞癌的分子标志物是需要迫切解决的问题，对于诊断肾透明细胞癌、降低复发转移率，延长患者的生存时间有重要的临床意义。
SCNN1家族，包括SCNN1A,SCNN1B,SCNN1G，分别编码上皮细胞钠离子通道(EnaC)的α、β和γ亚基，在阳离子转运中发挥重要作用。ENaC主要存在于肾、肺、结肠等上皮细胞表面，负责将Na+转运至细胞。ENaC在许多肿瘤的发生发展中起着重要的作用，研究发现胶质瘤中， SCNN1家族调节迁移和细胞周期进展；另有研究表明，SCNN1B与胃癌患者、非小细胞肺癌患者不良的疾病特异性和生存率显著相关。
现如今，RT-PCR技术常被用于肿瘤检测，敏感性比IHC提高10-100倍，在基因表达水平分析和定量检测等方面得到广泛应用。实时荧光定量RT-PCR是在实时RT-PCR基础上发展起来的一项新技术，其探针特异地同目的模板结合，与其他RT-PCR技术相比，实时RT-PCR对mRNA的检测和定量能提供更多的信息，耗时更少，灵敏性、特异性、准确性都大大提高。
目前尚无SCNN1家族在肾透明细胞癌中相关的研究报道，SCNN1家族在肾透明细胞癌发生发展中的分子机制仍不清楚。并且目前还未见SCNN1家族在制备肾透明细胞癌诊断或预测肾透明细胞癌患者预后的应用的研究报道。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种能为肾透明细胞癌的早期诊断和预后治疗提供重要辅助指标的一种肾透明细胞癌SCNN1引物、诊断试剂盒及其应用，具体方案如下：
用于快速诊断肾透明细胞癌的SCNN1引物，包括内参引物对为GAPDH，具有SEQ IDNO:1 和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的SCNN1A基因的mRNA序列正向引物和反向引物、具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的SCNN1B基因的mRNA序列正向引物和反向引物、具有 SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的SCNN1G基因的mRNA序列正向引物和反向引物，以人的GAPDH为内参对照，具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列的正向引物和反向引物。
一种肾透明细胞癌SCNN1快速诊断试剂盒，所述试剂盒含有内参引物对为GAPDH，具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的SCNN1A基因的mRNA序列正向引物和反向引物、具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的SCNN1B基因的mRNA序列正向引物和反向引物、具有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的SCNN1G基因的mRNA序列正向引物和反向引物，以人的GAPDH为内参对照，具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列的正向引物和反向引物。
进一步地，该试剂盒含有以下试剂：组织裂解液Trizol、SYBRGreen Master Mix反应液、逆转录反应液、阴性对照和阳性对照。
进一步地，所述逆转录反应液包括Oligo(dT)引物、无RNA酶水、逆转录预混液、RNA酶抑制剂和DNA聚合酶。
进一步地，所述阴性对照为不含有SCNN1mRNA的RNA样本，阳性对照为含有SCNN1mRNA 的RNA样品。
所述的SCNN1引物在PCR扩增中的应用。
进一步地，所述PCR扩增中的反应条件：95℃10min，1个循环；95℃15s，60℃1min，共40个循环。
所述用于快速诊断肾透明细胞癌SCNN1引物在制备快速诊断试剂盒中的应用。
本发明的优点
(1)以本发明标记物为基础，构建肾透明细胞癌的诊断模型，该诊断模型特异性好，检测基因在肾透明细胞癌中几乎不表达，与正常组织有极为显著的对比，不仅能使用目前市场上存在的所有类型的荧光定量仪器，更重要的是能快速对肾透明细胞癌诊断的新标志基因SCNN1A、 SCNN1B、SCNN1G进行定量检测，为肾透明细胞癌的早期诊断和预后治疗的提供重要辅助指标。 (2)能对肿瘤的良性和恶性进行初步鉴别，AUC能达到0.997，诊断效果快速且良好。
(3)本发明的检测方法改进现有荧光定量RT—PCR技术，并建立了一套完整的质量控制方法，使之具有灵敏、稳定、操作简便等的特点，消除了SCNN1A、SCNN1B、SCNN1G基因mRNA 荧光定量RT-PCR检测的假阳性和假阴性，使之成为一种肾透明细胞癌临床诊断的实用性诊断方法。
(4)耗时短，仅需要4小时左右完成测试，需要检测的样品量极少。
(5)该检测方法建立了质控品，为严格对PCR检测进行定量控制提供了必要条件，在量化处理肾透明细胞癌临床诊断结果方面，为消除SCNN1A/B/G基因荧光定量RT-PCR检测的假阳性和假阴性打下了基础。
(6)该检测方法建立了一套完整的质量控制方法，重点在消除临床样本检测的假阴性和假阳性，这一套完整的质量控制方法是互相联系，不可分割的，具有可靠性和安全性，不仅对于肾透明细胞癌临床样本检测的准确性有较大很高，而具有广泛的实用性，能在临床上推广，对于其它mRNA荧光定量RT-PCR检测的实用性，临床上推广也具有重要参考价值。
附图说明
图1为根据TCGA数据库中522例肾透明细胞癌患者癌组织及癌旁正常组织中SCNN1A、 SCNN1B、SCNN1G的表达量绘制出的ROC曲线图。
图2为15例肾透明细胞癌和癌旁组织的cDNA芯片中SCNN1A的差异表达图。
图3为图2的ROC曲线图。
图4为15例肾透明细胞癌和癌旁组织的cDNA芯片中SCNN1B的差异表达图。
图5为图4的ROC曲线图。
图6为15例肾透明细胞癌和癌旁组织的cDNA芯片中SCNN1G的差异表达图。
图7为图6的和ROC曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的解释和说明，需要注意的是，本具体实用例不用于对本发明权利范围的限定。
一、引物设计
选取来自上海芯超生物科技有限公司的15个肾癌病人肾癌组织及相应癌旁组织的cDNA 芯片，每孔cDNA模板量为20ng，采用RT-PCR方法检测SCNN1A、SCNN1B、SCNN1G在肾透明细胞癌患者癌组织及癌旁正常组织的表达量，并绘制ROC曲线，如图1至图7所示，具体步骤如下:
引物设计及合成：
人SCNN1A-Forward：5’-CAGCACAACCGCATGAAGAC-3’
SCNN1A-Reverse：5’-ACGAGCTTGTCCGAGTTGAG-3’
SCNN1B-Forward：5’-ACCCTCACTATGGCAACTGT-3’
SCNN1B-Reverse：5’-GAATTCAGTTCCAGGGTTGGC-3’
SCNN1G-Forward：5’-CTTCAGCTCGGGAATCAATGC-3’
SCNN1G-Reverse：5’-GGCATCACAGGACACTCCATC-3’
内参对照为GAPDH，Forward：5’-GCTCAGACACCATGGGGAAG-3’
Reverse：5’-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGGG-3’。
二、试剂盒组成：
根据以上研究结果，组装诊断试剂盒以方便使用。
试剂盒含有内参引物对为GAPDH，具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的SCNN1A 基因的mRNA序列正向引物和反向引物、具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的 SCNN1B基因的mRNA序列正向引物和反向引物、具有SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示核苷酸序列的SCNN1G基因的mRNA序列正向引物和反向引物，以人的GAPDH为内参对照，具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列的正向引物和反向引物，组织裂解液Trizol (ThermoFisher公司)、SYBR Green Master Mix(ThermoFisher公司)、逆转录反应液、阴性对照和阳性对照。逆转录反应液包括Oligo(dT)引物、无RNA酶水(Transgen公司)、逆转录预混液、RNA酶抑制剂和DNA聚合酶。阴性对照为不含有SCNN1mRNA的RNA样本，阳性对照为含有SCNN1mRNA的RNA样品。
三、肾透明细胞癌SCNN1快速诊断试剂盒的使用方法
(1)样品总RNA的提取
用组织裂解液Trizol总RNA提取液从待测样品中提取总RNA；
(2)逆转录反应
2ug的总RNA用于cDNA第一链的合成，逆转录反应总体系为20μl，包括Oligo(dT)引物(1U/μl)1μl、无RNA酶水5μl、逆转录预混液10ul、DNA聚合酶(1U/μl)1μl、 RNA酶抑制剂(1U/μl)1μl、RNA2μl；
(3)荧光定量PCR
优化的实时定量RT-PCR体系为:PCR定量反应液10ul，上游引物0.5ul，下游引物0.5ul， RNase free H2O 9ul，反应总体系为20ul。反应条件：95℃10min，1个循环；95℃15s，60℃ 1min，共40个循环。每个样本做3个重复。根据标准曲线计算2-ΔΔct计算出SCNN1A,SCNN1B,SCNN1G的相对表达量。
SCNN1A、SCNN1B、SCNN1G在肾脏正常组织或良性病变中有很高的特异性表达，而在肾透明细胞癌中几乎不表达，因此检测患者的外周血、肿瘤组织等标本中有无SCNN1A、SCNN1B、 SCNN1G的表达，本具体实施例的肾透明细胞癌SCNN1快速诊断试剂盒能对肾透明细胞癌的诊断，尤其是对肿瘤良性和恶性的鉴别以及预后治疗提供有力的证据，还能为肿瘤转移和复发情况的监测提供帮助。
序列表
<110> 广西医科大学
<120> 一种肾透明细胞癌SCNN1引物、诊断试剂盒及其应用
<130> LWY20200092
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagcacaacc gcatgaagac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgagcttgt ccgagttgag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
accctcacta tggcaactgt 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaattcagtt ccagggttgg c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cttcagctcg ggaatcaatg c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggcatcacag gacactccat c 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gctcagacac catggggaag 20
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgtagttgag gtcaatgaag ggg 23

Claims (8)

1.用于快速诊断肾透明细胞癌的SCNN1引物，其特征于，包括内参引物对为GAPDH，具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的SCNN1A基因的mRNA序列正向引物和反向引物、具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的SCNN1B基因的mRNA序列正向引物和反向引物、具有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的SCNN1G基因的mRNA序列正向引物和反向引物，以人的GAPDH为内参对照，具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列的正向引物和反向引物。
2.一种肾透明细胞癌SCNN1快速诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有内参引物对为GAPDH，具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的SCNN1A基因的mRNA序列正向引物和反向引物、具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的SCNN1B基因的mRNA序列正向引物和反向引物、具有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的SCNN1G基因的mRNA序列正向引物和反向引物，以人的GAPDH为内参对照，具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列的正向引物和反向引物。
3.根据权利要求2所述的肾透明细胞癌SCNN1快速诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒还含有以下试剂：组织裂解液Trizol、SYBRGreen Master Mix反应液、逆转录反应液、阴性对照和阳性对照。
4.根据权利要求3所述的肾透明细胞癌SCNN1快速诊断试剂盒，其特征在于，所述逆转录反应液包括Oligo(dT)引物、无RNA酶水、逆转录预混液、RNA酶抑制剂和DNA聚合酶。
5.根据权利要求3所述的肾透明细胞癌SCNN1快速诊断试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为不含有SCNN1 mRNA的RNA样品，阳性对照为含有SCNN1 mRNA的RNA样品。
6.权利要求1所述的SCNN1引物在PCR扩增中的应用。
7.权利要求6所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增中的反应条件：95℃10min，1个循环；95℃15s，60℃1min，共40个循环。
8.权利要求1所述用于快速诊断肾透明细胞癌SCNN1引物在制备快速诊断试剂盒中的应用。
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