CN109852698B

CN109852698B - 检测环指蛋白32表达水平的试剂的应用和试剂盒

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Publication number: CN109852698B
Application number: CN201910318709.9A
Authority: CN
Inventors: 胡明; 陈刚; 韩宇鹏
Original assignee: FIRST AFFILIATED HOSPITAL OF JIAMUSI UNIVERSITY
Current assignee: FIRST AFFILIATED HOSPITAL OF JIAMUSI UNIVERSITY
Priority date: 2019-04-19
Filing date: 2019-04-19
Publication date: 2021-05-18
Anticipated expiration: 2039-04-19
Also published as: CN109852698A

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及检测RNF32表达水平的试剂的应用和试剂盒。更具体地，涉及检测RNF32表达水平的试剂在制备用于结直肠癌辅助诊断和/或结直肠癌患者预后判断的制剂中的应用以及一种用于结直肠癌辅助诊断和/或结直肠癌患者预后判断的试剂盒。临床样本检测结果显示，结直肠癌中RNF32表达较癌旁组织显著升高(P<0.001)；且RNF32高表达不利于结直肠癌患者总体生存(P＝0.0205)。因此，检测该基因表达变化的试剂可用于结直肠癌预后或者诊断、治疗。

Description

检测环指蛋白32表达水平的试剂的应用和试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及检测环指蛋白32(RNF32)表达水平的试剂在制备用于结直肠癌辅助诊断和/或结直肠癌患者预后判断的制剂中的应用以及一种用于结直肠癌辅助诊断和/或结直肠癌患者预后判断的试剂盒。

背景技术

最新的统计数据显示，癌症死亡占我国居民全部死因的23.91％，俨然已成为人类健康路上最凶猛的拦路虎之一。2019年1月末，国家癌症中心在《中华肿瘤杂志》发布了最新完成的中国恶性肿瘤流行情况报告，分析了2015年我国最新癌症情况(全国肿瘤登记中心的数据通常滞后3年，故本次报告发布数据为2015年登记资料)。据报告估计，2015年全国癌症发病约392.9万例，发病率为285.83/10万，全年死亡约233.8万人，死亡率为170.05/10万。这也意味着平均每分钟有7.5人被诊断为癌症，有4.4人因癌症死亡。近10多年来，我国癌症发病、死亡数持续上升，癌症发病率每年平均增长约3.9％，死亡率每年平均增长2.5％。结直肠癌是目前最常见的消化道肿瘤之一。最新恶性肿瘤流行病学数据发现，结直肠癌发病率在男性和女性中分别排名第4位及第3位，死亡率为第5位及第4位，城镇居民发病率更高。而在全球范围内，结直肠癌与肺癌发病率并列第一，严重威胁人类健康。

结直肠癌的发病有年轻化趋势，且由于缺乏早期诊断与高效的筛查方法，大多数患者确诊时已发展至晚期或局部晚期，预后较差。随着各种医疗技术的不断发展以及化疗药物、靶向药物的研制，对结直肠癌患者的临床治疗效果有了较大的改善，但从远期生存率来看，大多数患者的生存率并没有得到提高。随着多组学高通量数据的快速增加，一些分子生物学标志物被发现在结直肠癌中表达异常并与预后相关，这使得更准确、有效地诊疗结直肠癌成为可能。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的结直肠癌预后标志物RNF32，由此进一步提供检测RNF32表达水平的试剂在制备用于结直肠癌辅助诊断和/或结直肠癌患者预后判断的制剂中的应用以及一种用于结直肠癌辅助诊断和/或结直肠癌患者预后判断的试剂盒。

环指蛋白32(Ring Finger Protein 32,RNF32)，又名FKSG33、HSD15和LMBR2，定位于7q36.3，包含18个外显子，Gene ID:140545，其编码蛋白质定位于内体、细胞核和细胞质。目前，有关RNF32基因在结直肠癌发生发展中的作用未见报道。本发明的发明人通过癌症和肿瘤基因图谱(Cancer Genome Atlas，TCGA)高通量数据挖掘发现RNF32高表达不利于结直肠癌患者预后，并通过收集临床结直肠癌患者样本和随访信息，进一步验证RNF32表达差异对结直肠癌患者的预后作用。

为了实现上述目的，本发明的第一方面提供检测环指蛋白32(RNF32)表达水平的试剂在制备用于结直肠癌辅助诊断和/或结直肠癌患者预后判断的制剂中的应用。

进一步地，所述检测RNF32表达水平包括检测RNF32的基因表达水平和/或检测RNF32的蛋白表达水平。

更具体地，所述检测RNF32表达水平的方法包括：通过RT-qPCR方法检测结直肠癌和癌旁组织中RNF32的表达量；通过分子探针技术检测结直肠癌和癌旁组织中RNF32mRNA表达量；通过免疫组化或Western-Blot检测结直肠癌和癌旁组织中RNF32蛋白表达量。

更具体地，所述检测RNF32表达水平的试剂为靶向RNF32编码DNA序列的寡核酸探针、PCR引物，或者为靶向RNF32的抗体。

根据本发明，优选地，所述检测RNF32表达水平的试剂为具有SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示核苷酸序列的实时荧光定量PCR特异性引物。

5’-CCACCACCTCCACTGTCATC-3’，SEQ ID NO：1；

5’-CATGGGAGCATGAAAGCAGC-3’，SEQ ID NO：2。

本发明的第二方面提供一种用于结直肠癌辅助诊断和/或结直肠癌患者预后判断的试剂盒，该试剂盒包括：检测RNF32表达水平的试剂。

进一步地，所述检测RNF32表达水平的试剂为靶向RNF32编码DNA序列的寡核酸探针、PCR引物，或者为靶向RNF32的抗体。

具体地，所述检测RNF32表达水平的试剂为具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的实时荧光定量PCR特异性引物。

根据本发明，所述试剂盒还可以含有其他常规的用于实时荧光定量的试剂，优选地，所述试剂盒还包括以下组分中的至少一种：Trizol、异丙醇、氯仿、无水乙醇、无RNA酶水、随机引物、5×M-MLV缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、M-MLV逆转录酶、具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的ACTB实时荧光定量PCR特异性引物。

5’-CAATGAGCTGCGTGTGGCT-3’，SEQ ID NO：3；

5’-GGATAGCACAGCCTGGATAGCAA-3’，SEQ ID NO：4。

临床样本检测结果显示，结直肠癌中RNF32表达较癌旁组织显著升高(P<0.001)；且RNF32高表达不利于结直肠癌患者总体生存(P＝0.0205)。因此，检测该基因表达变化的试剂可用于结直肠癌预后或者诊断、治疗。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。

图1示出了TCGA高通量数据分析结直肠癌中RNF32的表达。结直肠癌组织中RNF32表达显著高于正常组织(P<0.001)。

图2A-2C示出了TCGA高通量数据分析RNF32高表达对结直肠癌患者生存的影响。结直肠癌患者中RNF32高表达比例为12％(图2A)；RNF32高表达不利于结直肠癌患者总体生存(P<0.001)(图2B)；RNF32高表达不利于患者无病生存(P＝0.0011)(图2C)。图2B和2C中，上方线为非高表达，下方线为高表达。

图3示出了结直肠癌组织中RNF32的表达。结直肠癌组织中RNF32表达显著高于癌旁组织(P<0.001)。

图4示出了结直肠癌组织中RNF32高表达对结直肠癌患者生存的影响。RNF32高表达不利于结直肠癌患者总体生存(P＝0.0205)。其中，上方线为低表达组，下方线为高表达组。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。实施例中未注明具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

本实施例用于说明TCGA高通量数据分析结直肠癌中RNF32的表达变化。

1.TCGA高通量数据分析过程：

登录TCGA门户网站UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)首页，点击“Analysis”，输入基因名称“RNF32”，选择TCGA dataset“Colon adenocarcinoma”，检索，点击“Expression”，记录结果。利用GraphPad 12.0软件作图，统计方法为T检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果：结直肠癌组织中RNF32的表达较正常组织显著升高(P<0.001)，如图1所示。

实施例2

本实施例用于说明TCGA高通量数据分析RNF32高表达与结直肠癌预后关系。

1.TCGA高通量数据分析过程：

登录TCGA门户网站cBioPortal(http://www.cbioportal.org/)，选择肿瘤数据集“Colorectal Adenocarcinoma(TCGA Provisional)(382例)”，组学数据选择“mRNAExpression z-Scores(RNA Seq V2 RSEM)”，基因输入“RNF32：EXP>＝2”，检索，弹出页面中点击“Survival”，记录结果。Kaplan-Meier法绘制生存曲线，log-rank检验生存曲线差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果：结直肠癌患者中RNF32高表达比例为12％(图2A)；RNF32高表达不利于结直肠癌患者总体生存(P<0.001)(图2B)；RNF32高表达不利于患者无病生存(P＝0.0011)(图2C)。

实施例3

本实施例用于说明制备检测RNF32表达量的试剂用于制备结直肠癌患者预后的试剂盒(50次反应)。

1.Trizol 50.0ml；

2.异丙醇50.0ml；

3.氯仿50.0ml；

4.无水乙醇50.0ml；

5.无RNA酶水5.0ml

6.1.0μM随机引物(Random primers)50.0μl；

7.5×M-MLV缓冲液2.0ml；

8.10.0mM三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)100.0μl；

9.40U/μl RNA酶抑制剂50.0μl；

10.200U/μl M-MLV逆转录酶50.0μl；

11.ABI 2×PCR Mix 2.0ml；

12.10.0μM RNF32实时荧光定量PCR特异性引物30.0μl，引物序列见表1；

13.10.0μM ACTB实时荧光定量PCR特异性引物30.0μl，引物序列见表1；

表1荧光定量RT-PCR引物序列

实施例4

本实施例用于说明临床结直肠癌组织样本RNF32的检测。

1.本项研究在患者知情同意下进行。25例结直肠癌患者临床信息来自患者就诊记录。结直肠癌标本分为两部分：一部分在液氮中立即冻结，保存在-80℃直到进行RNA提取，另一部分则用于组织病理学评估。

2.组织中总RNA提取：本实验在冰浴中进行。取30～50mg组织(新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可)置1.5ml离心管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置5min；每管加入200μl氯仿，剧烈混匀30sec，静置15min，4℃ 12000rpm离心15min；轻轻吸取上层液体400μl至另一新离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，4℃ 12000rpm离心10min；弃上清，加入1ml 75％酒精洗涤沉淀物，4℃ 12000rpm离心10min；尽可能弃掉上清，室温下晾干10min，每管加入10μl无RNA酶水，溶解(65℃促溶10-15min)。测定OD260，计算RNA浓度。

RNA(mg/ml)＝40×OD₂₆₀×稀释倍数(n)/1000

3.反转录：每25μl反转录体系包括100pmol随机引物，2μg总RNA，M-MLV反转录酶1μl，RNase抑制剂0.625μl，dNTPs(10mM)1.25μl，5×M-MLV缓冲液5μl，无RNA酶水补齐至25μl。反应条件为：37℃ 1h，95℃ 5min。

4.定量PCR：每20μl反应体系包含2×PCR Mix 10μl，上、下游引物各0.4μl，cDNA 1μl，ddH₂O 8.2μl。反应条件为：94℃ 2min，94℃ 15s，60℃ 40s，40个循环。

5.2^-ΔΔCT法计算RNF32相对表达量：本实验检测25例结直肠癌组织和12例癌旁组织中RNF32的相对表达量变化。ACTB作为内参基因，将qPCR测得的靶基因RNF32C_T值与同组织来源的内参基因ACTB的C_T值相减得到ΔC_T，再将ΔC_T与对照组ΔC_T相减得到ΔΔC_T(取癌旁样本ΔC_T的平均值为ΔC_T对照)，利用Excell表格中Power函数计算每组RNF32相对表达量。利用软件GraphPad Prism 6.0绘图，T检验分析结直肠癌和癌旁RNF32表达差异，P<0.05为差异具有统计学意义。

6.RNF32高表达与结直肠癌患者预后：患者随访时间为1-32个月，成功接受随访患者数为25例。RNF32相对表达量高于癌旁组织相对表达量均数2倍的为高表达，共10例，其他为RNF32低表达，共15例。Kaplan-Meier法绘制生存曲线，log-rank检验生存曲线差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

7.结果：

临床样本检测结果显示，结直肠癌中RNF32表达较癌旁组织显著升高(P<0.001)，如图3所示；且RNF32高表达不利于结直肠癌患者总体生存(P＝0.0205)，如图4所示。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

序列表

<110> 佳木斯大学附属第一医院

<120> 检测环指蛋白32表达水平的试剂的应用和试剂盒

<130> BJI1900189JMSU

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccaccacctc cactgtcatc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catgggagca tgaaagcagc 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caatgagctg cgtgtggct 19

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggatagcaca gcctggatag caa 23

Claims

1.检测环指蛋白32(RNF32)表达水平的试剂在制备用于结直肠癌辅助诊断和/或结直肠癌患者预后判断的制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述检测RNF32表达水平包括检测RNF32的基因表达水平和/或检测RNF32的蛋白表达水平。

3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述检测RNF32表达水平的方法包括：通过RT-qPCR方法检测结直肠癌和癌旁组织中RNF32的表达量；通过分子探针技术检测结直肠癌和癌旁组织中RNF32 mRNA表达量；通过免疫组化或Western-Blot检测结直肠癌和癌旁组织中RNF32蛋白表达量。

4.根据权利要求1所述的应用，其中，所述检测RNF32表达水平的试剂为靶向RNF32编码DNA序列的寡核酸探针、PCR引物，或者为靶向RNF32的抗体。

5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述检测RNF32表达水平的试剂为具有SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的实时荧光定量PCR特异性引物。

6.一种用于结直肠癌辅助诊断和/或结直肠癌患者预后判断的试剂盒，该试剂盒包括：检测RNF32表达水平的试剂；所述检测RNF32表达水平的试剂为具有SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示核苷酸序列的实时荧光定量PCR特异性引物。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括以下组分中的至少一种：Trizol、异丙醇、氯仿、无水乙醇、无RNA酶水、随机引物、5×M-MLV缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、M-MLV逆转录酶、具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的ACTB实时荧光定量PCR特异性引物。