CN108624684A

CN108624684A - 基于多个基因诊断结肠癌患者的检测试剂盒

Info

Publication number: CN108624684A
Application number: CN201710184381.7A
Authority: CN
Inventors: 李明明; 索伟克; 蒲珏
Original assignee: Beijing Ai Kelun Medical Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Ai Kelun Medical Science And Technology Co Ltd
Priority date: 2017-03-24
Filing date: 2017-03-24
Publication date: 2018-10-09
Anticipated expiration: 2037-03-24
Also published as: CN108624684B

Abstract

本发明涉及一种基于多个基因诊断结肠癌患者的检测试剂盒，试剂盒包括引物探针组合物甲、引物探针组合物乙、引物探针组合物丙、引物探针组合物丁、引物探针组合物戊、引物组合物己和引物组合物庚；每个引物探针组合物均包括相应的特异性引物对、封闭引物和探针。本发明提供的试剂盒，可以应用于诊断结肠癌，为结肠癌的诊断提供了一条快速、可靠、准确的新途径，本发明将在医学检测领域发挥重要作用。

Description

基于多个基因诊断结肠癌患者的检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于多个基因诊断结肠癌患者的检测试剂盒。

背景技术

结肠癌的确切发病机制尚未明确，但在散发性结肠癌的发病中，表遗传学改变比遗传学改变占有更重要的地位。近20年的研究发现，作为表遗传学的重要组成部分，表观遗传学(epigenetics)是研究转录前基因在染色质水平的结构修饰对基因功能的影响，这种修饰可通过细胞分裂和增殖周期进行传递，并适当的调控基因转录表达，以保证细胞进行正常的增殖-分化-成熟-衰老的发育进程。长期以来，人们一直认为肿瘤的发生是基因突变累积的结果，然而近年随着表观遗传学的研究进展，已越来越清楚地发现表观遗传机制在肿瘤的发生中起着非常重要的作用。表观遗传修饰包括DNA甲基化修饰、组蛋白修饰和染色体印迹等。而DNA甲基化是肿瘤中最常见的分子改变之一，CpG岛甲基化导致抑癌基因失活是引起细胞恶化的重要步骤。以种系特异性基因为例：体细胞中需要保持永久关闭的关键基因在胚胎干细胞中被甲基化，然而一旦甲基化丢失则将导致细胞的去分化，并向着肿瘤相关的表型发展，如果抑癌基因再发生高甲基化或/和基因突变，则导致肿瘤的形成。DNA甲基化改变调控基因表达、与肿瘤的发生发展密切相关的概念是人类基因组计划完成之后，表观遗传学研究的一个重要的成果。启动子甲基化是结肠癌发生的早期事件，因此相关基因甲基化状态有望成为结肠癌风险预测有效指标。DNA甲基化是基因表达调控的一种中间形式最可能的调控作用是通过抑制关键基因的表达，从而决定该细胞的命运，如对于肿瘤细胞中DNA甲基化异常现象的研究已经在多种肿瘤中取得了许多重大的进展。哺乳动物中，甲基化仅影响DNA链上鸟嘌呤前的胞嘧啶(CpG)。正常细胞中CpG双核苷酸的甲基化分布并不均一，大约50％的基因在启动子区域有CpG集中分布的CpG岛存在，长度从0.5～2kb不等，该区域与基因的转录调控有着密切关系。人体某些基因调控区域的CpG岛甲基化在相关癌细胞组织中频繁出现，显示出与某些肿瘤的发病、病程进展和预后、用药敏感性等相关。

迄今为止，已在大多数人类肿瘤中发现了基因甲基化异常。研究发现在癌细胞中表观遗传编码发生紊乱，首先表现在DNA甲基化水平紊乱，又称为甲基化重排，即促进增殖的基因低甲基化、高表达；促进细胞分化的基因高甲基化、低表达；DNA甲基化转移酶家族(DNMT family)高表达。癌症中甲基化重排涉及的基因包括：细胞周期调控基因、DNA修复基因、血管形成基因、细胞凋亡相关基因、细胞黏附迁移相关基因、激素受体基因、核转录因子、酶类等等。通过对DNA甲基化修饰的研究，有可能为肿瘤发病机制的阐明、肿瘤早期诊断和治疗开辟新的有效途径，达到肿瘤治疗的目的。由于CpG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，因此，DNA甲基化的检测可以用于肿瘤发生的早期诊断。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测Septin9、ALX4、BMP3、NDRG4、SDC2、BCAT1和IKZF1基因及其片段的甲基化的试剂盒，包括引物探针组合物甲、引物探针组合物乙、引物探针组合物丙、引物探针组合物丁、引物探针组合物戊、引物探针组合物己和引物探针组合物庚；引物探针组合物甲包括特异性引物对甲、封闭引物甲和探针甲；引物探针组合物乙包括特异性引物对乙、封闭引物乙和探针乙；引物探针组合物丙包括特异性引物对丙、封闭引物丙和探针丙；引物探针组合物丁包括特异性引物对丁、封闭引物丁和探针丁；引物探针组合物戊包括特异性引物对戊、封闭引物戊和探针戊；引物探针组合物己包括特异性引物对己、封闭引物己和探针己；引物探针组合物庚包括特异性引物对庚、封闭引物庚和探针庚；引物探针组合物甲为第一引物探针组合物甲或第二引物探针组合物甲；第一引物探针组合物甲中：特异性引物对甲为序列表的序列8所示DNA和序列表的序列9所示DNA组成的引物对，封闭引物甲的核苷酸序列如序列表的序列10所示，探针甲的核苷酸序列如序列表的序列11所示；第二引物探针组合物甲中：特异性引物对甲为序列表的序列12所示DNA和序列表的序列13所示DNA组成的引物对，封闭引物甲的核苷酸序列如序列表的序列14所示，探针甲的核苷酸序列如序列表的序列15所示；引物探针组合物乙为第三引物探针组合物乙或第四引物探针组合物乙；第三引物探针组合物乙中：特异性引物对乙为序列表的序列16所示DNA和序列表的序列17所示DNA组成的引物对，封闭引物乙的核苷酸序列如序列表的序列18所示，探针乙的核苷酸序列如序列表的序列19所示；第四引物探针组合物乙中：特异性引物对乙为序列表的序列20所示DNA和序列表的序列21所示DNA组成的引物对，封闭引物乙的核苷酸序列如序列表的序列22所示，探针乙的核苷酸序列如序列表的序列23所示；引物探针组合物丙为第五引物探针组合物丙或第六引物探针组合物丙；第五引物探针组合物丙中：特异性引物对丙为序列表的序列24所示DNA和序列表的序列25所示DNA组成的引物对，封闭引物丙的核苷酸序列如序列表的序列26所示，探针丙的核苷酸序列如序列表的序列27所示；第六引物探针组合物丙中：特异性引物对丙为序列表的序列28所示DNA和序列表的序列29所示DNA组成的引物对，封闭引物丙的核苷酸序列如序列表的序列30所示，探针丙的核苷酸序列如序列表的序列31所示；引物探针组合物丁为第七引物探针组合物丁或第八引物探针组合物丁；第七引物探针组合物丁中：特异性引物对丁为序列表的序列32所示DNA和序列表的序列33所示DNA组成的引物对，封闭引物丁的核苷酸序列如序列表的序列34所示，探针丁的核苷酸序列如序列表的序列35所示；第八引物探针组合物丁中：特异性引物对丁为序列表的序列36所示DNA和序列表的序列37所示DNA组成的引物对，封闭引物丁的核苷酸序列如序列表的序列38所示，探针丁的核苷酸序列如序列表的序列39所示；引物探针组合物戊为第九引物探针组合物戊或第十引物探针组合物戊；第九引物探针组合物戊中：特异性引物对戊为序列表的序列40所示DNA和序列表的序列41所示DNA组成的引物对，封闭引物戊的核苷酸序列如序列表的序列42所示，探针戊的核苷酸序列如序列表的序列43所示；第十引物探针组合物戊中：特异性引物对戊为序列表的序列44所示DNA和序列表的序列45所示DNA组成的引物对，封闭引物戊的核苷酸序列如序列表的序列46所示，探针戊的核苷酸序列如序列表的序列47所示；引物探针组合物己为第十一引物探针组合物己或第十二引物探针组合物己；第十一引物探针组合物己中：特异性引物对己为序列表的序列48所示DNA和序列表的序列49所示DNA组成的引物对，封闭引物己的核苷酸序列如序列表的序列50所示，探针己的核苷酸序列如序列表的序列51所示；第十二引物探针组合物己中：特异性引物对己为序列表的序列52所示DNA和序列表的序列53所示DNA组成的引物对，封闭引物己的核苷酸序列如序列表的序列54所示，探针己的核苷酸序列如序列表的序列55所示；引物探针组合物庚为第十三引物探针组合物庚或第十四引物探针组合物庚；第十三引物探针组合物庚中：特异性引物对庚为序列表的序列56所示DNA和序列表的序列57所示DNA组成的引物对，封闭引物庚的核苷酸序列如序列表的序列58所示，探针庚的核苷酸序列如序列表的序列59所示；第十四引物探针组合物庚中：特异性引物对庚为序列表的序列60所示DNA和序列表的序列61所示DNA组成的引物对，封闭引物庚的核苷酸序列如序列表的序列62所示，探针庚的核苷酸序列如序列表的序列63所示。

需要说明的是，引物探针组合物甲用于检测Septin9基因核酸序列的甲基化，引物探针组合物乙用于检测ALX4基因核酸序列的甲基化，引物探针组合物丙用于检测BMP3基因核酸序列的甲基化，引物探针组合物丁用于检测NDRG4基因核酸序列的甲基化，引物探针组合物戊用于检测SDC2基因核酸序列的甲基化，引物探针组合物己用于检测BCAT1基因核酸序列的甲基化，引物探针组合物庚用于检测IKZF1基因核酸序列的甲基化，不同的引物探针组合物分别检测对应基因靶区域核酸序列中至少一段核酸序列的甲基化；其中，靶区域分别选自序列表的序列1所示、序列表的序列2所示、序列表的序列3所示、序列表的序列4所示、序列表的序列5所示、序列表的序列6所示和序列表的序列7所示的序列中的连续的至少15个碱基长度的片段；核酸序列分别等同、互补或杂交于上述靶区域。试剂盒中，每种引物探针组合物均可以单独包装。

试剂盒还包括针对内参基因的内参引物和内参探针，内参基因为ACTB(NCBI基因库序列号：NM_001101.3)和/或GSTP1(NCBI基因库序列号：NM_000852.3)。

内参基因ACTB的内参引物对为序列表的序64所示DNA和序列表的序列65所示DNA组成的引物对；内参基因ACTB的内参探针的核苷酸序列如序列表的序列66所示；内参基因GSTP1的内参引物对为序列表的序列67所示DNA和序列表的序列68所示DNA组成的引物对；内参基因GSTP1的内参探针的核苷酸序列如序列表的序列69所示。

本发明的目的还在于提供一种用于诊断结肠癌患者的试剂盒，包括如下七个引物探针组合物中的至少一种：引物探针组合物甲、引物探针组合物乙、引物探针组合物丙、引物探针组合物丁、引物探针组合物戊、引物探针组合物己和引物探针组合物庚，不同的引物探针组合物包括的引物对、封闭引物和探针分别同上述的引物探针组合物。也就是说，引物探针组合物甲、引物探针组合物乙、引物探针组合物丙、引物探针组合物丁、引物探针组合物戊、引物探针组合物己和引物探针组合物庚可以分别检测Septin9、ALX4、BMP3、NDRG4、SDC2、BCAT1和IKZF1基因及其片段的甲基化，七种甲基化结果共同用于诊断是否为结肠癌患者；当然，也可以挑选引物探针组合物甲、引物探针组合物乙、引物探针组合物丙、引物探针组合物丁、引物探针组合物戊、引物探针组合物己和引物探针组合物庚中的一种、两种、三种、四种、五种或六种引物探针组合物分别检测对应的基因及其片段的甲基化，根据一种、两种、三种、四种、五种或六种甲基化结果来诊断是否为结肠癌患者。

本发明提供的引物探针组合物甲、引物探针组合物乙、引物探针组合物丙、引物探针组合物丁、引物探针组合物戊、引物探针组合物己和引物探针组合物庚(对应十四个引物探针组)分别对Septin9、ALX4、BMP3、NDRG4、SDC2、BCAT1和IKZF1基因及其片段的甲基化具有较高的特异性，只是七种引物探针组合物联合诊断时的灵敏度最高。

试剂盒还包括针对内参基因的内参引物和内参探针，内参基因为ACTB和/或GSTP1，基因序列同上所述，内参基因ACTB和GSTP1的内参引物对同上所述。

试剂盒还包括DNA提取试剂和亚硫酸氢盐试剂；DNA提取试剂包括裂解缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液；其中，裂解缓冲液包括蛋白变性剂、去垢剂、pH缓冲剂和核酸酶抑制剂；清洗缓冲液分为清洗缓冲液A和清洗缓冲液B，清洗缓冲液A包括蛋白质变性剂、核酸酶抑制剂、pH缓冲剂、乙醇，清洗缓冲液B包括核酸酶抑制剂、pH缓冲剂、乙醇；洗脱缓冲液包括核酸酶抑制剂和pH缓冲剂；蛋白变性剂选自异硫氰酸胍、盐酸胍和尿素中的一种或几种；去垢剂选自Tween20、Tween40、Triton X-100、NP-40和SDS中的一种或几种；pH缓冲剂选自Tris、硼酸、磷酸盐、MES和HEPES中的一种或几种；核酸酶抑制剂选自EDTA、EGTA和DEPC中的一种或几种；亚硫酸氢盐试剂包括亚硫酸氢盐缓冲液和保护缓冲液；其中，亚硫酸氢盐缓冲液选自重亚硫酸钠、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢铵和亚硫酸铵中的一种或几种；保护缓冲液包括氧自由基清除剂，氧自由基清除剂选自对苯二酚、维生素E、维生素E衍生物、没食子酸、Trolox、三羟基苯甲酸和三羟基苯甲酸衍生物中的一种或多种。

本发明还保护上述试剂盒在制备检测结肠癌产品中的应用。

本发明还保护试剂盒检测Septin9、ALX4、BMP3、NDRG4、SDC2、BCAT1和IKZF1基因及其片段的甲基化的方法，包括如下步骤：S1：采用DNA提取试剂提取人源样本的DNA；S2：将提取得到的DNA采用亚硫酸氢盐试剂进行处理；S3：以处理后的DNA为模板，采用引物探针组合物和内参基因的内参引物及内参探针进行PCR扩增。人源样本选自细胞系、组织切片、活检组织、石蜡包埋的组织、唾液、痰液、支气管液、胃液、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血和从血液中分离的细胞中的一种或多种。

具体地，S1采用DNA提取试剂提取人源样本(如血浆)的DNA包括如下步骤：(1)取1～5ml血浆，加入相同体积的裂解缓冲液，再加入终浓度为10～500mg/L的蛋白酶K和0.01～10μg/ml Carrier RNA，震荡混匀，55℃温育10～30min；(2)加入100μl磁珠，振荡孵育0.5～1小时；(3)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液；(4)加入0.5～2ml清洗缓冲液A重悬磁珠，震荡清洗1min；(5)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清；(6)加入0.5～2ml清洗缓冲液B重悬磁珠，震荡清洗1min；(7)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液；(8)10000rpm快速离心1min，用磁分离器吸附磁珠，去除残余上清溶液；(9)将装有磁珠的离心管开盖放置在55℃的金属浴上，晾干3～10min；(10)加入50～500ul洗脱缓冲液重悬磁珠，放置在65℃金属浴上，震荡洗脱10min；(11)用磁分离器吸附磁珠，取出含有目的DNA的缓冲液，定量DNA，做好标记；(12)洗脱后的DNA存放于4℃冰箱待用，或者保存于-20℃冰箱长期保存。

具体地，S2将提取得到的DNA采用亚硫酸氢盐试剂进行处理包括如下步骤：(1)配制亚硫酸氢盐缓冲液，用重亚硫酸钠、亚硫酸铵等配制1～12M缓冲液，根据DNA含量，可以选用不同浓度亚硫酸氢盐缓冲液；(2)配制保护缓冲液，用氧自由基清除剂的一种或者多种配制浓度0.01～5M保护缓冲液，浓度及组分取决于DNA含量及所用样本类型；(3)将100μl DNA溶液(DNA含量10pg～10μg)、200μl亚硫酸氢盐缓冲液和50μl保护液混合，震荡混合均匀；(4)热循环：95℃5min，50℃30min，95℃5min，50℃2h，95℃5min，50℃5h，4℃；(5)将0.5～5ml DNA结合缓冲液加入到亚硫酸氢盐处理后的DNA溶液中，再加入20～200μl磁珠，震荡孵育30min～1h；(6)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液；(7)加入0.5～2ml清洗缓冲液A重悬磁珠，震荡清洗1min；(8)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清；(9)加入0.5～2ml清洗缓冲液B重悬磁珠，震荡清洗1min；(10)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液。(11)10000rpm快速离心1min，用磁分离器吸附磁珠，去除残余上清溶液；(12)将装有磁珠的离心管放置在55℃的金属浴上，开盖晾干3～10min；(13)加入50～500μl洗脱缓冲液重悬磁珠，放置在65℃金属浴上，震荡洗脱10min；(14)用磁分离器吸附磁珠，取出含有目的DNA的缓冲液，定量DNA，做好标记。

具体地，S3以处理后的DNA为模板，采用引物探针组合物和内参基因的内参引物及内参探针进行PCR扩增。检测基因为Septin9、ALX4、BMP3、NDRG4、SDC2、BCAT1和IKZF1基因，内参基因为ACTB和/或GSTP1。引物探针组合物甲用于检测Septin9基因核酸序列的甲基化，引物探针组合物乙用于检测ALX4基因核酸序列的甲基化，引物探针组合物丙用于检测BMP3基因核酸序列的甲基化，引物探针组合物丁用于检测NDRG4基因核酸序列的甲基化，引物探针组合物戊用于检测SDC2基因核酸序列的甲基化。DNA甲基化标志物基因(Septin9、ALX4、BMP3、NDRG4、SDC2、BCAT1和IKZF1基因)的探针和内参基因(ACTB、GSTP1基因)的探针5'端报告荧光基团为FAM、JOE、TET、HEX、Cy3、Texas Red、Rox和Cy5中的一种或多种；甲基化基因的探针和内参基因的探针3'端的猝灭基团为BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL中一种或多种；甲基化基因的封闭引物3'端修饰集团为C3Spacer、C6Spacer、inverted 3'end中的一种或多种。荧光定量PCR扩增反应体系的终浓度组成为：1～10×PCR缓冲液、0.1～1mM dNTPs、0.1～1μM目的基因检测引物、0.1～1μM目的基因荧光探针、0.1～1μM目的基因封闭引物、0.1～1μM内参基因引物、0.1～1μM内参基因荧光探针、0.001～2ng/μl模板DNA、0.01～0.10U/μl热启动TaqDNA聚合酶。dNTPs中包括10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP和10mM dGTP，PCR缓冲液中包含Tris-HCl、氯化钾、硫酸铵和氯化镁。荧光定量PCR扩增反应的具体过程为：92～97℃预变性5～35分钟，再进行聚合酶链式反应扩增阶段，92～97℃变性10～30s，50～65℃退火延伸10～60s，并进行40～55个循环。

Septin9、ALX4、BMP3、NDRG4、SDC2、BCAT1和IKZF1基因的甲基化情况是潜在的结肠癌(尤其是早期结肠癌)诊断、预后评估及疗效监测的有意义的临床指标。本发明对于深入了解早期结肠癌的发病机制，认识其发生发展规律，提高我国早期结肠癌诊治水平具有重要的价值，也为寻求新的早期结肠癌靶向治疗策略奠定基础。本发明提供的试剂盒，可以应用于诊断结肠癌，为多发性结肠癌的诊断提供了一条快速、可靠、准确的新途径，为疗效观察、微小残留病的动态观察提供依据，本发明将在医学检测领域发挥重要作用。

本发明的技术方案中，可以将Septin9、ALX4、BMP3、NDRG4、SDC2、BCAT1或IKZF1基因单独进行甲基化检测而进行结肠癌筛查，也可以将Septin9、ALX4、BMP3、NDRG4、SDC2、BCAT1和IKZF1基因结合在一起进行结肠癌筛查，通过将分别检测Septin9基因、ALX4基因、BMP3基因、NDRG4基因、SDC2基因、BCAT1基因和IKZF1及其片段的甲基化核酸序列联合使用，使得结肠癌检测的灵敏度和特异性提高，尤其是灵敏度显著提高。单独检测Septin9的灵敏度为70％、ALX4的灵敏度为67％、BMP3的灵敏度为64％、NDRG4的灵敏度为54.67％，SDC2的灵敏度为72％，BCAT1的灵敏度为70％，IKZF1的灵敏度为65％，七个标志物联合检测时，灵敏度提高到96％。本发明能够根据实时荧光定量PCR的循环阈值(Ct)来快速、便捷地判断样本是否阳性，提供了一种可以用于快速、准确的检测结肠癌的试剂盒。

附图说明

图1为本发明实施例五中检测血浆中Septin9基因的ROC曲线；

图2为本发明实施例五中检测血浆中ALX4基因的ROC曲线；

图3为本发明实施例五中检测血浆中BMP3基因的ROC曲线；

图4为本发明实施例五中检测血浆中NDRG4基因的ROC曲线；

图5为本发明实施例五中检测血浆中SDC2基因的ROC曲线；

图6为本发明实施例五中检测血浆中BCAT1基因的ROC曲线；

图7为本发明实施例五中检测血浆中IKZF1基因的ROC曲线；

图8为本发明实施例五中检测血浆中联合检测Septin9、ALX4、BMP3、NDRG4、SDC2、BCAT1和IKZF1基因的ROC曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例一：DNA提取

DNA提取试剂由裂解缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液组成，见表1；裂解缓冲液由蛋白变性剂、去垢剂、pH缓冲剂和核酸酶抑制剂组成；蛋白变性剂为：盐酸胍(购自sigma公司)；去垢剂为：Tween20(购自sigma公司)；pH缓冲剂为：Tris-HCl(购自阿拉丁公司)；核酸酶抑制剂为：EDTA(购自sigma公司)。

表1 DNA提取所用试剂

本实施例以血浆样本(购自北京301医院)为例，提取血浆循环肿瘤DNA，提取方法包括如下步骤：(1)取1ml血浆，加入相同体积的裂解缓冲液，再加入蛋白酶K和CarrierRNA，使其终浓度分别为100mg/L和1μg/ml，震荡混匀，55℃温育30min；(2)加入100μl磁珠，振荡孵育1小时；(3)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液；(4)加入1ml清洗缓冲液A重悬磁珠，震荡清洗1min；(5)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清；(6)加入1ml清洗缓冲液B重悬磁珠，震荡清洗1min；(7)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液；(8)10000rpm快速离心1min，用磁分离器吸附磁珠，去除残余上清溶液；(9)将装有磁珠的离心管开盖放置在55℃的金属浴上，晾干10min；(10)加入100ul洗脱缓冲液重悬磁珠，放置在65℃金属浴上，震荡洗脱10min；(11)用磁分离器吸附磁珠，取出含有目的DNA的缓冲液，定量DNA，做好标记；(12)洗脱后的DNA存放于4℃冰箱待用，或者保存于-20℃冰箱长期保存。

实施例二：亚硫酸氢盐处理DNA

亚硫酸氢盐处理DNA是采用亚硫酸氢盐试剂进行处理，亚硫酸氢盐试剂由亚硫酸氢盐缓冲液和保护缓冲液组成；亚硫酸氢盐缓冲液为亚硫酸氢钠(购自Sigma公司)和水的混合液体；保护缓冲液为氧自由基清除剂对苯二酚(购自sigma公司)和水的混合液体。蛋白变性剂为盐酸胍(购自sigma公司)；pH缓冲剂为Tris-HCl(购自阿拉丁公司)；核酸酶抑制剂为EDTA(购自sigma公司)。本实施例试剂配方见表2。

表2亚硫酸氢盐处理DNA所用试剂

本实施例二以实施例一提取得到的DNA为处理对象，采用亚硫酸氢盐处理DNA，具体方法包括：(1)配制亚硫酸氢盐缓冲液，称取1g亚硫酸氢钠粉末，加水配制成3M缓冲液。(2)配制保护缓冲液，称取1g对苯二酚试剂，加水配置成0.5M保护缓冲液。(3)将100μl DNA溶液(DNA含量100ng)、200μl亚硫酸氢盐缓冲液和50μl保护液混合，震荡混合均匀。(4)热循环：95℃5min，50℃30min，95℃5min，50℃2h，95℃5min，50℃5h，4℃。(5)将1ml DNA结合缓冲液加入到亚硫酸氢盐处理后的DNA溶液中，再加入50μl磁珠，震荡孵育1h。(6)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液。(7)加入0.5ml清洗缓冲液A重悬磁珠，震荡清洗1min。(8)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清。(9)加入0.5ml清洗缓冲液B重悬磁珠，震荡清洗1min。(10)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液。(11)10000rpm快速离心1min，用磁分离器吸附磁珠，去除残余上清溶液。(12)将装有磁珠的离心管放置在55℃的金属浴上，开盖晾干10min。(13)加入50μl洗脱缓冲液重悬磁珠，放置在65℃金属浴上，震荡洗脱10min。(14)用磁分离器吸附磁珠，取出含有目的DNA的缓冲液，定量DNA，做好标记。

实施例三：荧光定量PCR检测DNA甲基化

本实施例检测基因为Septin9、ALX4、BMP3、NDRG4、SDC2、BCAT1和IKZF1基因，内参基因为ACTB。内参基因ACTB的内参引物对为序列表的序列64所示DNA和序列表的序列65所示DNA组成的引物对；内参基因ACTB的内参探针的核苷酸序列如序列表的序列66所示。本实施例是采用实施例二经过亚硫酸氢盐处理后的DNA为模板进行PCR扩增。

荧光定量PCR扩增反应体系的终浓度组成为：1×PCR缓冲液(购自NEB公司)、0.5mMdNTPs(购自NEB公司)、0.5μM目的基因检测引物、0.2μM目的基因荧光探针、1μM目的基因封闭引物、0.3μM内参基因引物、0.3μM内参基因荧光探针、2ng/μl模板DNA、0.10U/μl热启动TaqDNA聚合酶(购自NEB公司)。引物和探针均购自上海生工公司，dNTPs中包括10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP和10mM dGTP，PCR缓冲液中包含50mM Tris-HCl、20mM氯化钾、10mM硫酸铵和2mM氯化镁。

荧光定量PCR扩增反应的具体过程为：95℃预变性10分钟，再进行聚合酶链式反应扩增阶段，95℃变性10s，60℃退火延伸60s，并进行50个循环。

待测DNA样品、阴性质控品、阳性质控品和无模板对照均进行3个复孔(平行样)检测，PCR仪孔板加样布局见下表。表中PC代表阳性质控品(Positive Control)，NC代表阴性质控品(Negative Control)，NTC代表无模板对照(No Template Control)，S代表检测样本(Sample)。

表3PCR反应加样布局表

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

PC

S6

B

NC

S7

C

NTC

S8

D

S1

S9

E

S2

S10

F

S3

S11

G

S4

S12

H

S5

S13

实施例四：引物、探针封和闭引物筛选

对于Septin9、ALX4、BMP3、NDRG4、SDC2、BCAT1和IKZF1基因，可以设计很多套引物和探针的组合，而每一套探针引物组合的性能可能存在差别，所以需要通过实验进行筛选。DNA甲基化标志物基因的探针和内参基因的探针5'端报告荧光基团为FAM、JOE、TET、HEX、Cy3、Texas Red、Rox、Cy5中的一种或多种；甲基化基因的探针和内参基因的探针3'端的猝灭基团为BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL中一种或多种。甲基化基因的封闭引物3'端修饰集团为C3Spacer、C6Spacer、inverted 3'end中的一种或多种。本发明使用HeavyMethyl的方法检测基因甲基化，所以除了设计普通Taqman引物和探针外，还设计了封闭引物，封闭引物3’-OH引入化学修饰，DNA聚合酶无法扩增，因此用封闭引物结合到样本中没有发生甲基化的模板上，阻止其扩增，提高检测反应的特异性。本实施例中，用人工处理的甲基化和非甲基化模板对Septin9、ALX4、BMP3、NDRG4、SDC2、BCAT1和IKZF1基因的引物和探针进行筛选。具体步骤如下：

设计Septin9、ALX4、BMP3、NDRG4、SDC2、BCAT1和IKZF1的各种引物和探针，只要其分别能等同于、互补于或杂交于序列表的序列1所示、序列表的序列2所示、序列表的序列3所示、序列表的序列4所示、序列表的序列5所示、序列表的序列6所示和序列表的序列7所示的序列的至少15个核苷酸及其互补序列；再用人工合成的甲基化和非甲基化核酸序列作为模板验证引物和探针的有效性；最后通过PCR扩增结果筛选出以下14套最佳的引物和探针组合：

引物和探针组1(扩增甲基化Septin9基因)

引物1：SEQ ID NO 8:5’-AAATAATCCCATCCAACTA-3’

引物2：SEQ ID NO 9:5’-GATTCGTTGTTTATTAGTTATTATGT-3

封闭引物：SEQ ID NO 10:5’-GTTATTATGTTGGATTTTGTGGTTAATGTGTAG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 11:FAM-5’-TTAACCGCGAAATCCGAC-BHQ1-3’

引物和探针组2(扩增甲基化Septin9基因)

引物1：SEQ ID NO 12:5’-GTTAGTTTTGTATTGTAGGAGCG-3’

引物2：SEQ ID NO 13:5’-AAAAACAACGACGAAAAAACG-3’

封闭引物：SEQ ID NO 14:5’-ATTGTAGGAGTGTGGGTGTGGTGTTTTAG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 15:FAM-5’-CGACGAAACCCGAACCCTACGCG-BHQ1-3’

引物和探针组3(扩增甲基化ALX4基因)

引物1：SEQ ID NO 16:5’-GCGGTTTCGATTTTAATGCG-3’

引物2：SEQ ID NO 17:5’-CGTCGCAACGCGTACG-3’

封闭引物：SEQ ID NO 18:5’-TTTAATGTGAAGTTTTAAGTGGTTGTGTTAGGAA-C3-3’

探针：SEQ ID NO 19:5’-JOE-ACTCCGACTTAACCCGACGATCG-BHQ1-3’

引物和探针组4(扩增甲基化ALX4基因)

引物1：SEQ ID NO 20:5’-CGCGGTTTCGATTTTAATGC-3’

引物2：SEQ ID NO 21:5’-ACTCCGACTTAACCCGACGAT-3’

封闭引物：SEQ ID NO 22:5’-TTTTAATGTGAAGTTTTAAGTGGTTGTGTTAGG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 23:5’-JOE-CGACGAAATTCCTAACGCAACCGCTTAA-BHQ1-3’

引物和探针组5(扩增甲基化BMP3基因)

引物1：SEQ ID NO 24:5’-AATATTCGGGTTATATACGTCGC-3’

引物2：SEQ ID NO 25:5’-CCTCACCCGCGCAAAACG-3’

封闭引物：SEQ ID NO 26:5’-TATATGTTGTGATTTATAGTTTTTTTTTAGTGTT-C3-3’

探针：SEQ ID NO 27:5’-TEXAS RED-CGAACGCCGTCTCCACTCCAACGCTA-BHQ2-3’

引物和探针组6(扩增甲基化BMP3基因)

引物1：SEQ ID NO 28:5’-CGTAGTAAGTGGGGTTGGTCGTT-3’

引物2：SEQ ID NO 29:5’-AAAATTAAACTCCAAACCAACTAAA-3’

封闭引物：SEQ ID NO 30:5’-GGTTGGTTGTTATTTTGTTGTATTTGGTTGTG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 31:5’-TEXAS RED-CGAAAACGCACGAAACCCGAAACGCG-BHQ2-3’

引物和探针组7(扩增甲基化NDRG4基因)

引物1：SEQ ID NO 32:5’-TCGCGGTTTTCGTTCGTTT-3’

引物2：SEQ ID NO 33:5’-CGCGCGTAACTTCCGCCT-3’

封闭引物：SEQ ID NO 34:5’-TGTTTGTTTTTTTGTTTGTTTATTGGGTATTTTAG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 35:5’-CY5-CGCGACTAAAATACCCGATAAACGAACG-BHQ3-3’

引物和探针组8(扩增甲基化NDRG4基因)

引物1：SEQ ID NO 36:5’-AGTTTAAATAAAGATTACGG-3’

引物2：SEQ ID NO 37:5’-CCCCTCCAAACCCCCTAT-3’

封闭引物：SEQ ID NO 38:5’-GATTATGGTAGTGTTGTTTTTTTTTTTGGGAATTTG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 39:5’-CY5-CCGCGCGACGTCGAATTCCCG-BHQ3-3’

引物和探针组9(扩增甲基化SDC2基因)

引物1：SEQ ID NO 40：5’-GAAATTAATAAGTGAGAGGGCGTC-3’

引物2：SEQ ID NO 41：5’-AAAACTCGAACTCGAAACTCGAA-3’

封闭引物：SEQ ID NO 42：5’-GAGGGTGT TGTGTTTTTGGGGTGTAGTTGTG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 43：5’-FAM-CGCTCGCTTCCTCCTCCTACGCCTA-BHQ1-3’

引物和探针组10(扩增甲基化SDC2基因)

引物1：SEQ ID NO 44：5’-TTGGGTTTGGTGGTTTGCGTGT-3’

引物2：SEQ ID NO 45：5’-CCTCTCGTAACTTCAAACACCCT-3’

封闭引物：SEQ ID NO 46：5’-GTTTGTGTGTTGGTGGAGTTGGTGAGTGGG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 47：5’-FAM-AACGACGCGCGCATCCTCCGC-BHQ1-3’

引物和探针组11(扩增甲基化BCAT1基因)

引物1：SEQ ID NO 48:5’-TTTGTTGATGTAATTCGTTAGGTCG-3’

引物2：SEQ ID NO 49:5’-CAATACCCGAAACGACGACG-3’

封闭引物：SEQ ID NO 50:5’-TTTGTTAGGTTGTGAGTTTTTGTTGTGAGAGGG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 51:5’-CY5-CGACCCTCTCGCGACGAAAACTCGCG-BHQ3-3’

引物和探针组12(扩增甲基化BCAT1基因)

引物1：SEQ ID NO 52:5’-AGATTTTAAGGGTCGTAGTTTTTGG-3’

引物2：SEQ ID NO 53:5’-CGAACACTACCCCAAATCTTACTACA-3’

封闭引物：SEQ ID NO 54:5’-TGTAGTTTTTGGTTGTGTGGATTGGGTTTGTG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 55:5’-CY5-CCGAAACCGCGCTCTACAACCGC-BHQ3-3’

引物和探针组13(扩增甲基化IKZF1基因)

引物1：SEQ ID NO 56：5’-CGACGTATTTTTTTCGTGTTTCGTT-3’

引物2：SEQ ID NO 57：5’-CGCACCTCTCGACCGC-3’

封闭引物：SEQ ID NO 58：5’-TTGTGTTTTGTTTTGTGTTTTTTTGTGTGTTTTGTT-C3-3’

探针：SEQ ID NO 59：5’-FAM-TCCCGAATCGCTACTCCGATACAAAAAACG-BHQ1-3’

引物和探针组14(扩增甲基化IKZF1基因)

引物1：SEQ ID NO 60：5’-AGGGGGTTAGGTACGGGGTT-3’

引物2：SEQ ID NO 61：5’-CCCAACCGACTCAAACCAAACT-3’

封闭引物：SEQ ID NO 62：5’-TATGGGGTTTGTGGGTGGTGTTGTGTG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 63：5’-FAM-TCGCGCTCCCGACCGACCGACT-BHQ1-3’

实验结果证明引物和探针的设计是合理的，14组引物和探针均能区分甲基化和非甲基化模板，分别可以作为检测Septin9、ALX4、BMP3、NDRG4、SDC2、BCAT1和IKZF1基因甲基化的引物和探针，检测Ct值见表4。虽然不同的引物和探针组合效果略有不同，但是以上引物和探针分别适用于Septin9、ALX4、BMP3、NDRG4、SDC2、BCAT1和IKZF1基因的甲基化检测。

表4不同组合物检测甲基化和非甲基化模板的Ct值均值

组1

组2

组3

组4

组5

组6

组7

甲基化模板

33.55

33.97

35.68

35.23

36.88

37.12

35.67

非甲基化模板

No Ct

组8

组9

组10

组11

组12

组13

组14

甲基化模板

35.31

34.17

34.53

31.61

32.53

34.12

35.11

非甲基化模板

No Ct

采用不同癌症患者和健康人DNA作为模板进一步筛选引物和探针组合物。将5例结肠癌、3例肝癌和5例健康人的血浆样本(购自北京301医院)采用实施例一的DNA提取方法提取DNA，然后采用实施例二的方法，采用亚硫酸氢盐处理DNA模板，利用上述14组引物和探针，采用实施例三的方法进行荧光定量PCR实验。分别测得癌症样本和健康人样本的各种甲基化基因Ct值，具体见表5。

表5不同组合物检测癌症和健康人样本的Ct值

从以上癌症患者和健康人样本的Septin9、ALX4、BMP3、NDRG4、SDC2、BCAT1和IKZF1基因甲基化检测的Ct值可以看出，以上14组引物和探针对结肠癌甲基化DNA有高度扩增，其它癌症和健康人无扩增或者扩增Ct值大于40。虽然不同组的引物和探针对结肠癌样本的扩增Ct值有些差异，但都明显区别于其它癌症患者和健康人样本，因此以上引物组均适用于结肠癌早期检测。在实际应用中可采用单组引物和探针检测目的基因甲基化，也可以两组或两组以上联合使用。

实施例五：试剂盒检测结肠癌、健康人血浆的灵敏度和特异性

本实施例采用300例健康人和300例结肠癌患者的血浆样本(购自北京301医院)为检测对象测试我们的结肠癌检测试剂的灵敏度和特异性。采用实施例一的DNA提取方法提取DNA，然后采用实施例二的方法，采用亚硫酸氢盐处理DNA模板，利用实施例四的探针引物组，采用实施例三的内参基因ACTB的内参引物和相关方法进行荧光定量PCR实验，检测Septin9、ALX4、BMP3、NDRG4、SDC2、BCAT1和IKZF1基因和内参基因ACTB，最后得出正常人和结肠癌患者样本的Ct值。检测Septin9基因采用的是引物和探针组1，检测ALX4基因采用的是引物和探针组3，检测BMP3基因采用的是引物和探针组6，检测NDRG4基因采用的是引物和探针组7，检测SDC2基因采用的是引物和探针组9，检测BCAT1基因采用的是引物和探针组11，检测IKZF1基因采用的是引物和探针组14，内参基因ACTB的内参引物对为序列表的序列64所示DNA和序列表的序列65所示DNA组成的引物对；内参基因ACTB的内参探针的核苷酸序列如序列表的序列66所示。

根据Septin9、ALX4、BMP3、NDRG4、SDC2、BCAT1和IKZF1各自的ROC曲线，见图1-7所示，确定各自的Cutoff值为37.2、38.4、39.1、38.8、38.2、37.3和38.6，即样本Ct值小于Cutoff值为阳性，样本Ct值大于Cutoff值为阴性，在此判定标准下单标志物的灵敏度最高。将七个标志物组合在一起来检测结肠癌，只要有一个基因为阳性，即判定该样本为阳性，其它视为阴性，ROC曲线见图8。根据上述判定标准以及表6的检测结果，Septin9的灵敏度为70％、ALX4的灵敏度为67％、BMP3的灵敏度为64％、NDRG4的灵敏度为54.67％，SDC2的灵敏度为72％，BCAT1的灵敏度为70％，IKZF1的灵敏度为65％，七个标志物联合检测时，灵敏度提高到96％，特异性为75％。

表6检测Septin9、ALX4、BMP3、NDRG4、SDC2、BCAT1和IKZF1基因甲基化诊断结肠癌灵敏度和特异性

为了达到不同的预期用途和目的，本发明提供的检测试剂盒可通过调整Cutoff值达到不同的灵敏度和特异性指标。在实施例五中，为了提高灵敏度，设定Cutoff值并不代表本发明仅能用此为Cutoff值，可根据本发明提供的ROC曲线，选取不同的Cutoff值作为判定标准。

本发明提供的技术方案，通过联合利用分别用于检测Septin9、ALX4、BMP3、NDRG4、SDC2、BCAT1和IKZF1基因及其片段的甲基化的核酸序列，使得结肠癌检测的灵敏度和特异性得到了提高，从而保证了检测结果的正确性和可靠性。并且，通过利用实时PCR分析血浆样本中的DNA的方法，能方便地实现针对Septin9、ALX4、BMP3、NDRG4、SDC2、BCAT1和IKZF1这五个生物标记物的同时检测，并且能根据实时PCR的循环阈值(Ct)值来快速、便捷地判断样本是否呈阳性，提供了一种用于无创性的快速癌症的检测方法的试剂盒。最后，本申请还公开了至少一组的效果较好的、设计达到最优化的用于检测Septin9、ALX4、BMP3、NDRG4、SDC2、BCAT1和IKZF1基因及其片段是否甲基化的引物和探针组合及其筛选方法，确保检测效果达到最优化。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；本领域的普通技术人员应当理解：可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，其均应涵盖在本发明说明书的范围中。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京艾克伦医疗科技有限公司

<120> 基于多个基因诊断结肠癌患者的检测试剂盒

<130> 1

<160> 69

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1818

<212> DNA

<213> 人（Homo Sapiens）

<400> 1

cgtcgcccgt ccctggcttc tctgacagcc gtgttccatc cccgccctgt gccccttctc 60

ccggacagtg ccttctccag ggctcaccca ggagggtgca gcggtggccc ccggggcggt 120

ggtcgtggtg ggggtgttag ctgcaggggt gccctcggtg ggtgggagtt ggtggcctct 180

cgctggtgcc atgggactcg catgttcgcc ctgcgcccct cggctcttga gcccacaggc 240

cgggatcctg cctgccagcc gcgtgcgctg ccgtttaacc cttgcaggcg cagagcgcgc 300

ggcggcggtg acagagaact ttgtttggct gcccaaatac agcctcctgc agaaggaccc 360

tgcgcccggg gaaggggagg aatctcttcc cctctgggcg cccgccctcc tcgccatggc 420

ccggcctcca catccgccca catctggccg cagcggggcg cccgggggga ggggctgagg 480

ccgcgtctct cgccgtcccc tgggcgcggg ccaggcgggg aggagggggg cgctccggtc 540

gtgtgcccag gactgtcccc cagcggccac tcgggcccca gccccccagg cctggccttg 600

acaggcgggc ggagcagcca gtgcgagaca gggaggccgg tgcgggtgcg ggaacctgat 660

ccgcccggga ggcgggggcg gggcgggggc gcagcgcgcg gggaggggcc ggcgcccgcc 720

ttcctccccc attcattcag ctgagccagg gggcctaggg gctcctccgg cggctagctc 780

tgcactgcag gagcgcgggc gcggcgcccc agccagcgcg cagggcccgg gccccgccgg 840

gggcgcttcc tcgccgctgc cctccgcgcg acccgctgcc caccagccat catgtcggac 900

cccgcggtca acgcgcagct ggatgggatc atttcggact tcgaaggtgg gtgctgggct 960

ggctgctgcg gccgcggacg tgctggagag gaccctgcgg gtgggcctgg cgcgggacgg 1020

gggtgcgctg aggggagacg ggagtgcgct gaggggagac gggaccccta atccaggcgc 1080

cctcccgctg agagcgccgc gcgcccccgg ccccgtgccc gcgccgccta cgtgggggac 1140

cctgttaggg gcacccgcgt agaccctgcg cgccctcaca ggaccctgtg ctcgttctgc 1200

gcactgccgc ctgggtttcc ttccttttat tgttgtttgt gtttgccaag cgacagcgac 1260

ctcctcgagg gctcgcgagg ctgcctcgga actctccagg acgcacagtt tcactctggg 1320

aaatccatcg gtcccctccc tttggctctc cccggcggct ctcgggcccc gcttggaccc 1380

ggcaacggga tagggaggtc gttcctcacc tccgactgag tggacagccg cgtcctgctc 1440

gggtggacag ccctcccctc ccccacgcca gtttcggggc cgccaagttg tgcagcccgt 1500

gggccgggag caccgaacgg acacagccca ggtcgtggca gggtctagag tgggatgtcc 1560

catggccccc atccaggcct ggggatatcc tcatccgcct cccagaatcg ggccgtgggg 1620

gacagaaggg gcctgcgtgc gggcagggag agtattttgg ctctctcctg tcttcggggt 1680

ttacaaagtg tgttgggact tgcggggctg ctctgtccaa gcctgggtct ggcgtccgcg 1740

tctctgagcc tgtgagtgcg tgcgctttcc tgcgtcctct tgactgccgg tgctggggct 1800

ctgcgtcctg cgtccgcg 1818

<210> 2

<211> 3079

<212> DNA

<213> 人（Homo Sapiens）

<400> 2

cggtcggctt ccactcgaat tcccccggac ggtatcatca catagccggg tcctcgcagt 60

gttggtttcc caatccgatg actgtcacct cggtgaggac ctgtgctgat ggccggagaa 120

ccctgcgctg cgggcgcaca tggccaggtg gcgcctggca ggcgacgtcc gggtgcagga 180

cggcgctctt accgccccac cccaaaccgt tgcctgggcc taggtccttc ggcttcctga 240

acaggggttt ggggggctaa ggacgctgag gctccggggg caggaagttc tctctggtta 300

agcgttctct cttctctccg gcatacactc ccctacccac ccacctcgcc taccctcggg 360

gcgagaggct caccaaggca gggcgcgccc cccccatgaa tcatcccaag gcctctgagc 420

cgcgggggct ccgggcaact atccccctcc tctcctggcc tcaggcaccc cagtccaggg 480

gtctgcagag aagcccgaag cccggacaaa cgcgccggac gtcaacaacc tctcatccct 540

ggcagcagca aaggccaata tatttccatt tcttatttca gtttgccacc aaaacaaagc 600

tgcgcgcggc tgagggcagg aaggcgctga gaccgagaag aagggacgtc ccggagaaag 660

tgcgcccagc tgatcttaga aaccagagtc ctccgggact tcgccgagat tttctgtagg 720

gcgttttaat ctgttttcct actgcgtgcc ggcgtcgcag cgcgtgcggc tcagggcttg 780

gtgactccgg cttagcccgg cggtcgcggc gaggttcctg gcgcagccgc ttggaacttc 840

gcattagaat cgggaccgcg caaatgccct ggctgaagtg tcaccctatt caagaaacac 900

tgctgtcagg aacaaaatgg ggtccccggt gctccgaagt atcttctgaa attttcttaa 960

aacaacttac aaaaaatgtt tttgctttaa cgttttacaa cgtttaagga aacatgtaaa 1020

tggtctgttt ctttatcgag atggtcgtcc taactaacag tgtacacata cataacaatt 1080

cttccaactt tcctcctcag agctaagcac ttcactatat gtaaattata ataaagaaaa 1140

gattgtgcaa gatcatgcaa gtcgattgac ttaaaatatt gagttttaat ccaggccctc 1200

tgtttttcta tttaacaact tttgtgtttg gaccagactg gtgaagcagg ctatggaaat 1260

taacaaagta aaaaattaaa agcatcttcc ttcgccatcc ctccctccaa aattaaacaa 1320

cagtcgcccc ttcctgagca ggcttcagtc ccaggctcga gttttcctgc gatcacccca 1380

cagtcaccca cagcagctgt tgctgcttct gtcgggtttt cgtttctgcc ttctttgggt 1440

cgtctcttgt atacaaaaca caccccagtt ctctaactaa attcaaatac gaccccggca 1500

gaatttacac atttcgtggt gcatggattg tgtcggtgca ggggaaataa ataccctctg 1560

gtatttaacc actgagtcta attcgaaaaa tcgggactgg gcccctaggc ggcaccccag 1620

gggctccaac ctggcccgcg cctccccaga ccttggcgct gagagcgctg cttttgcggg 1680

tgggtggacg gagaggtaac aatctgcttt caacaaaaac ctgtcgccac cgaatcgaaa 1740

gcgaaaggga agggagaaga ggggcagctt cccgcagcgg ccccgcgtct cgggacaggt 1800

agactaggac cagtacgcgc cggctgcagc tccggcggtc ggatccggag tttgggggcg 1860

aggcgccgga gtccctgccc tgagtacagg gaggctctct gcgtcgctga gaaacgtcgg 1920

atctccaacc cgacatgtct cctgtggccc aggcggcccg ccctggactc gggcaaggaa 1980

ttcaggaggc caaagagcgg acccagagtc tggaggggag aatggtgaag tcttgggttg 2040

caacagaaga gggctcggtg ggggctcttt cgtaaaaacg cggtctccgc acccaaagga 2100

cactgcggag ccgccttaat cgtcgttctt ttagcacatt tggggaaagg aaggcccaag 2160

ttggggtagg gacgcttgca gcccgggagg gtttctctca ccaactcttt ccgcaacccg 2220

gtccagaccc ggccagcaga gactggaggc ggcttccccg ccccgcactc cctcggcttg 2280

gcccaggctc agctgcccgg ggcaccttcc ttgccgagag gcaattggac tctgccggga 2340

gtgggcccag aagttgaggc ccaggaagag gcctccgagc ttcccccttt tgttaggtgt 2400

agttacacac gtgaaagaac agctttcgcc ccgacctcca gggctaggaa tggttgccag 2460

gtctcagctg cctgcctgaa gacggagatc agccagcgcc agtactggca ccaaggccgc 2520

ccctgcctcc gactttccca atgctcctgg gagcgtctaa ggatttttcc ttgaactcca 2580

tttctccgct tttgagtata tacactctca caactgtggg agagaatcgt tgtcaatgca 2640

tgcctcagtt ttcctgcttg ctggcagggt agggatccca ctccagagtc cctcctcctg 2700

gctacttctg ttaagggcag agcctcatct tttgtatcct cagtttctcc atcttagacc 2760

taacgcgcct aatccctttc ctagaaggac cagacatctc ctggctgggg agactcagct 2820

gctgagagag ggaaagaaca aacactgact tgctgtttat tgtttgtggc tttgccccga 2880

gcagtgcctc catcttaggc agcatggagt ggcgtcctgc cggtagttac aggctgcctt 2940

tggtcccagc ctgcagttta tgacccagag cagtggcagg gacttgccct gtcctcagaa 3000

ttgggtgctc tcgagttccc agcggctcgg agatagatag ggatggaaat gtgggtgggg 3060

gttgggaggg gcaggggta 3079

<210> 3

<211> 867

<212> DNA

<213> 人（Homo Sapiens）

<400> 3

cggaccagcc gcgccgcagc tgctccaatc cctggaaaag gcaatcgagc gccctccgga 60

ccgctgcgca cagccccggc tccgacctgg cgcccaaaac agagctagtc ctagtccctc 120

gcgcggccag tttggccggg tgttcccaaa aataaagcga ggagggaagg tacagacaga 180

tcttgaaaac acccgggcca cacacgccgc gacctacagc tctttctcag cgttggagtg 240

gagacggcgc ccgcagcgcc ctgcgcgggt gaggtccgcg cagctgctgg ggaagagccc 300

acctgtcagg ctgcgctggg tcagcgcagc aagtggggct ggccgctatc tcgctgcacc 360

cggccgcgtc ccgggctccg tgcgccctcg ccccagctgg tttggagttc aaccctcggc 420

tccgccgccg gctccttgcg ccttcggagt gtcccgcagc gacgccggga gccgacgcgc 480

cgcgcgggta cctagccatg gctggggcga gcaggctgct ctttctgtgg ctgggctgct 540

tctgcgtgag cctggcgcag ggagagagac cgaagccacc tttcccggag ctccgcaaag 600

ctgtgccagg tgaccgcacg gcaggtggtg gcccggactc cgagctgcag ccgcaagaca 660

aggtctctga acacatgctg cggctctatg acaggtacag cacggtccag gcggcccgga 720

caccgggctc cctggaggga ggctcgcagc cctggcgccc tcggctcctg cgcgaaggca 780

acacggttcg cagctttcgg gcggcagcag caggtgagtg cgcgaggtga gactcccttc 840

ccgcggtccc gccccagctt tctcccg 867

<210> 4

<211> 1562

<212> DNA

<213> 人（Homo Sapiens）

<400> 4

cgggctccga aaacgggggg agggggacga cgccccagag gcccctgagc ccctggttct 60

tcccgaccct aagggctttt ctccctcggt tcccaggcgg cgacggcggg tagcgcgaag 120

cagcaggcgc aggggcgctg ggatggggat gtctctgcag gtctaaggtt ccccttggga 180

gtctaaacaa agactacggc agcgccgtcc cctcccccgg gaacccgacg ccgcgcggcc 240

acagggggcc tggaggggcg ggcagggcct cgcagcgcac ccagcacagt ccgcgcggcg 300

gagcgggtga gaagtcggcg ggggcgcgga tcgaccgggg tgtcccccag gctccgcgtc 360

gcggtccccg ctcgccctcc cgcccgccca ccgggcaccc cagccgcgca gaaggcggaa 420

gccacgcgcg agggaccgcg gtccgtccgg gactagcccc aggcccggca ccgccccgcg 480

ggccgagcgc ccacacccgc caaacccacg cgggcacgcc cccgcggcgc accgccccca 540

gcccggcctc cgcccctgca gccgcgggca cgcggagggg ctcctggctg cccgcacctg 600

cacccgcgcg tcggcggcgc cgaagccccg ctccccgcct gcgcgtctgt ctcgtccgca 660

tctccgcggt gagtcggcgg cgccctcgcc cctgagccca gggccagctt ctctcgccgc 720

cgcggctgct gcgcgcgtcc ccgcccagcc cagcccagcc ccgagcacga ccccagcccc 780

acgcacgacc ctagccccgc gagtcccgca ccgactcgct cccgccccat ttcgcctccg 840

cgggggcggc gccccctcct ccccgcggct cccgctctcc ttcctcgcct tcccggccgc 900

gctggggacc cccagccgcc gtccgcgacc ccccaccgcg acgcccggag gcggcggggt 960

ctctttgttc gggcggcggg cacgggggac cacctcccac ggtgtcaccg cacccacccc 1020

gcgcccttcc tccgcctcct ggagttcacc gggaccaggt ggcggcgggt gcctttttgg 1080

gggtgcgcgg ccatgcaatt ggtggatttt tttaaaccgt tttggagggg ggagcgcggc 1140

gttgggggcg ggagagcgct cctggctgtg agctgctcct gccgcttcgc tccgcgctct 1200

cctgccgctc cgctccgggt ctcccgcgct cctctccccg gctcggccga gcgcgctgcc 1260

ccgacgccgc cacccagagc cgggccgcgc cgggcgccga gatgaaggtg ctgggacacc 1320

ggctggagct gctcacaggt accgcccgcc tgccccgcag ccggccgcca ctttccgagt 1380

tggagcggac tccgggcgcg gcggccgggg actggggcgg ctcgggtctg agcaggaagg 1440

ggtgcggacc ccaactaagt cctagttttg tgctacctgt ttgtgtgcgg agcccagccc 1500

cgggagagga cttgaggttg tggcgagtcc ctggcgctgg cgtccgggct gcgggagcac 1560

cg 1562

<210> 5

<211> 1860

<212> DNA

<213> 人（Homo Sapiens）

<400> 5

cggtgagcag agccggcgca gccacagcgc ggagccgcgg cgcccactgg tcctcggagc 60

tgccaatcgg cgtgtaatcc tgtaggaatt tctcccgggt ttatctggga gtcacactgc 120

cgcctcctct ccccagtcgc ccaggggagc ccggagaagc aggctcagga gggagggagc 180

cagaggaaaa gaagaggagg agaaggagga ggacccgggg agggaggcgc ggcgcgggag 240

gaggaggggc gcagccgcgg agccagtggc cccgcttgga cgcgctgctc tccagatacc 300

cccggagctc cagccgcgcg gatcgcgcgc tcccgccgct ctgcccctaa acttctgccg 360

tagctccctt tcaagccagc gaatttattc cttaaaacca gaaactgaac ctcggcacgg 420

gaaaggagtc cgcggaggag caaaaccaca gcagagcaag aagagcttca gagagcagcc 480

ttcccggagc accaactccg tgtcgggagt gcagaaacca acaagtgaga gggcgccgcg 540

ttcccggggc gcagctgcgg gcggcgggag caggcgcagg aggaggaagc gagcgccccc 600

gagccccgag cccgagtccc cgagcctgag ccgcaatcgc tgcggtactc tgctccggat 660

tcgtgtgcgc gggctgcgcc gagcgctggg caggaggctt cgttttgccc tggttgcaag 720

cagcggctgg gagcagccgg tccctgggga atatgcggcg cgcgtggatc ctgctcacct 780

tgggcttggt ggcctgcgtg tcggcggagt cggtgagtgg gccaggcgga ggatgcgcgc 840

gccgtttagg gtgtttgaag ctacgagagg agcccgcagg gaatagggga gcgccacctg 900

gggaaccccc agtccccaag tatacaccgg agatccgctg ggacaaatgc gctcgtccgg 960

tcaccctttc cccctcttcc cttcctcaga aaagcgctgc tcgctggcgt taccccgcgg 1020

tccgcgggaa tgggggcacc gagaattgcg gtttggtcta gccgcagagg cccctgaagt 1080

cactcccaac ttcttcgccc tcggcgggtc ttgctgcgtg gtctgggaag gacggagggg 1140

aaagggtggc aggagggggg agcctgggtc gggcccgcga gggaacggct ccactccgcg 1200

cgctcctcga gaccagggat gacctggaaa cttcggggtc ccttcctccg cacaccatcc 1260

cccccgcgcc agctttcctg tttgactgca tgcaagttct ggggagatgg gggccagatt 1320

taagagaccc gcgagtgtcc agagagaaaa gtttgcaaaa gttcttttgt ttgatgctcc 1380

ctgcggctag ggcgaggtaa ccgacactac gtggaatcgc agtaggcgat ccctcaaggg 1440

gatactgggg gaggcacgga acgcgtccga aaatgctggg acgccggcca ctggattccc 1500

agtcctgcgg cgaccccctc ctcgttgagg ggtggaggtt gcaccgcggg gcgtcaggga 1560

cgggaggaca ttttcatagg agttacacgg gagtgccgca agcagggcga ggcggggtac 1620

gtgtgacacg gcgctcggct tcgggtcgcc tggccgctgg gggacagagg cttccctccc 1680

gccacgctcg ccctctctgg ccctggcggg gcgcttctgg ggccgggagg agtctcgtct 1740

ccggcggagc gcctgccggc acccagcttc cctcccccgc cctggcggtg ggaacttgat 1800

ttctcctttt ggtcgcgctt cgggggctgg agcttgtttc cccacgtcgc ccaatgagcg 1860

<210> 6

<211> 786

<212> DNA

<213> 人（Homo Sapiens）

<400> 6

cgttcccaaa agcgaatgtg aaaaagtccg agaaggcacg tcctgcgagt ggaggttaaa 60

ccgaaatctg aacagaatgc acggtccccg caaactacga ttgataaaga agatactgag 120

acgtttgcgg gggatataag ccatggttgt ctcgccttcc tcccctccct gccaactatg 180

tttcttggag aaatcgccgg ttcgattcac gcacacattt ttgtaaaaca cggacaaaac 240

cataagtagt taccttcatt gttccgtcgg ccacgaggga agctcgagct gagcggaggg 300

cagatcccaa gggtcgtagc ccctggccgt gtggaccggg tctgcggctg cagagcgcgg 360

tcccggctgc agcaagacct ggggcagtgc ccgaggcggc ggcgagtaca cgtggcgggc 420

tggattgcag accggccctc tcgcggcgga gactcgcgac ctagcggatt gcatcagcag 480

gaagacacta aggctgctcc cccaggccgc ccccagatgg tggagtctct cccagcccga 540

agattcggag ccagcgccca gacccgagcc tcactcactg ctcactcccg gggtgcaggg 600

cagaggtgcc agtgttgcaa gcaaatgaca cggttacccc cgaatcagcc actgtgggtg 660

cgtatccgag tgtggggatg cccgtgtaac atttatatgg agacgtcaag gaggaggaaa 720

taaacagatc agaggtcaaa tgtgattgcc attccgtcat cactggctcc tgcccacctc 780

cctact 786

<210> 7

<211> 1624

<212> DNA

<213> 人（Homo Sapiens）

<400> 7

cgtagggcga aggggtgcgc tgtcagatgt ggcattcccg ttttacggag acacacggtg 60

tcttacacgc cagggagagg tctgagacgc aaagagccgt cgagcgggct gcgggattgc 120

ttcgctgtca cctccgcctg cagccaccct tccgcacgca cttgtgtgtg cacccaggcc 180

aacatggaag gcgccatcct aacttctgcc gtgagcaggt gggagggaag agagacgaga 240

ggtattccat tggttgtctg ggaaaatgaa ttgcaccttc ccctcccttg cggaggatca 300

acttttccca ccccctcggg tgggcactcg catcctgggg ccggagcctg aacccgggag 360

ccaaggggcc ccagttccag ggacgtgaag ctgagcgtac agcgggcgct cccagacact 420

ggggaaagtg ctttacgatg tcccgagtcc ctccagtctc gccagcgggg cgagcgtgag 480

ggtgccccga ccgaccagcg gccccgggtg cagggtggcg ggcccggcgg cgcgcgtccc 540

cctccccctc ctggcggccc gcacgtgtcg cccgcgccgc gcccccacgg gttacgcgcg 600

ggtcccgcag cgccgcggcc gagccgggct gcccggcccg cggacacagc gccggccgcc 660

gcatcccgtg cggggccgcg gcgcgatgct gcgctggaat gaggaagcgc ggcggcgagg 720

ggagggcccg ggcgcggtgc gcgcgggggt ggcggcggcg cgccgagcgg gcccggcgcg 780

ggcgagcggg ctgcagccgg cggcggcgcc agcaggtacg gcccgcaccc gccgccgccc 840

cggcggcctt tgggggctga gccggagccc ggcgcgattg caaagttttc gtgcgcggcc 900

cctctggccc ggagttgcgg ctgagacgcg cgccgcgcga gccgggggac tcggcgacgg 960

ggcggggacg ggacgacgca ccctctccgt gtcccgctct gcgcccttct gcgcgccccg 1020

ctccctgtac cggagcagcg atccgggagg cggccgagag gtgcgcgcgg ggccgagccg 1080

gctgcggggc aggtcgagca gggaccgcca gcgtgcgtca ccccaaagtt tgcggggtgg 1140

cagggcgcgc gctctggcca cccgccgctc tgggcggcag ctggtggcaa cgcaagggcg 1200

cggcgggggc ggccggcgcg gagggggcca ggtacggggc ccgcgggcgg cgctgtgcgc 1260

gcggggcagc cggtcggccg ggagcgcgaa agcctggtct gagccggctg ggggcgggga 1320

gtgtggcgga gaaatgggga acaatgcgag tgagcaactt caggaagtca ttgtgaaaga 1380

aagctgggaa gagctccgcg gccaagttag caggacactc taacaagtga ctgcgcggcc 1440

cgcgcccggg gcggtgactg cggcaagccc cctgggtccc cgcgcggcgc atcccagcct 1500

gggcgggacg ctcggccgcg gcgaggcggg caagcctggc agggcagagg gagccccggc 1560

tccgaggttg ctcttcgcac ccgaggatca gtcttggccc caaagcgcga cgcacaaatc 1620

cacg 1624

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aaataatccc atccaacta 19

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gattcgttgt ttattagtta ttatgt 26

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gttattatgt tggattttgt ggttaatgtg tag 33

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttaaccgcga aatccgac 18

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gttagttttg tattgtagga gcg 23

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aaaaacaacg acgaaaaaac g 21

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

attgtaggag tgtgggtgtg gtgttttag 29

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cgacgaaacc cgaaccctac gcg 23

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gcggtttcga ttttaatgcg 20

<210> 17

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cgtcgcaacg cgtacg 16

<210> 18

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tttaatgtga agttttaagt ggttgtgtta ggaa 34

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

actccgactt aacccgacga tcg 23

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cgcggtttcg attttaatgc 20

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

actccgactt aacccgacga t 21

<210> 22

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ttttaatgtg aagttttaag tggttgtgtt agg 33

<210> 23

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cgacgaaatt cctaacgcaa ccgcttaa 28

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

aatattcggg ttatatacgt cgc 23

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

cctcacccgc gcaaaacg 18

<210> 26

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

tatatgttgt gatttatagt ttttttttag tgtt 34

<210> 27

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

cgaacgccgt ctccactcca acgcta 26

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

cgtagtaagt ggggttggtc gtt 23

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

aaaattaaac tccaaaccaa ctaaa 25

<210> 30

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ggttggttgt tattttgttg tatttggttg tg 32

<210> 31

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

cgaaaacgca cgaaacccga aacgcg 26

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

tcgcggtttt cgttcgttt 19

<210> 33

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

cgcgcgtaac ttccgcct 18

<210> 34

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

tgtttgtttt tttgtttgtt tattgggtat tttag 35

<210> 35

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

cgcgactaaa atacccgata aacgaacg 28

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

agtttaaata aagattacgg 20

<210> 37

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

cccctccaaa ccccctat 18

<210> 38

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

gattatggta gtgttgtttt tttttttggg aatttg 36

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

ccgcgcgacg tcgaattccc g 21

<210> 40

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

gaaattaata agtgagaggg cgtc 24

<210> 41

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

aaaactcgaa ctcgaaactc gaa 23

<210> 42

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

gagggtgttg tgtttttggg gtgtagttgt g 31

<210> 43

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

cgctcgcttc ctcctcctac gccta 25

<210> 44

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

ttgggtttgg tggtttgcgt gt 22

<210> 45

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

cctctcgtaa cttcaaacac cct 23

<210> 46

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

gtttgtgtgt tggtggagtt ggtgagtggg 30

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

aacgacgcgc gcatcctccg c 21

<210> 48

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

tttgttgatg taattcgtta ggtcg 25

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

caatacccga aacgacgacg 20

<210> 50

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

tttgttaggt tgtgagtttt tgttgtgaga ggg 33

<210> 51

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

cgaccctctc gcgacgaaaa ctcgcg 26

<210> 52

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

agattttaag ggtcgtagtt tttgg 25

<210> 53

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

cgaacactac cccaaatctt actaca 26

<210> 54

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

tgtagttttt ggttgtgtgg attgggtttg tg 32

<210> 55

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

ccgaaaccgc gctctacaac cgc 23

<210> 56

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

cgacgtattt ttttcgtgtt tcgtt 25

<210> 57

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

cgcacctctc gaccgc 16

<210> 58

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

ttgtgttttg ttttgtgttt ttttgtgtgt tttgtt 36

<210> 59

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

tcccgaatcg ctactccgat acaaaaaacg 30

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

agggggttag gtacggggtt 20

<210> 61

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

cccaaccgac tcaaaccaaa ct 22

<210> 62

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

tatggggttt gtgggtggtg ttgtgtg 27

<210> 63

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

tcgcgctccc gaccgaccga ct 22

<210> 64

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

gtgatggagg aggtttagta agtt 24

<210> 65

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

ccaataaaac ctactcctcc cttaa 25

<210> 66

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

ggagtggagg aaattgagat 20

<210> 68

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

ccacacaaca aatactcaaa ac 22

<210> 69

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

tgggtgtttg taatttttgt tttgtgttag gtt 33

Claims

1.一种检测Septin9、ALX4、BMP3、NDRG4、SDC2、BCAT1和IKZF1基因及其片段的甲基化的试剂盒，其特征在于：

包括引物探针组合物甲、引物探针组合物乙、引物探针组合物丙、引物探针组合物丁、引物探针组合物戊、引物探针组合物己和引物探针组合物庚；

所述引物探针组合物甲包括特异性引物对甲、封闭引物甲和探针甲；所述引物探针组合物乙包括特异性引物对乙、封闭引物乙和探针乙；所述引物探针组合物丙包括特异性引物对丙、封闭引物丙和探针丙；所述引物探针组合物丁包括特异性引物对丁、封闭引物丁和探针丁；所述引物探针组合物戊包括特异性引物对戊、封闭引物戊和探针戊；引物探针组合物己包括特异性引物对己、封闭引物己和探针己；引物探针组合物庚包括特异性引物对庚、封闭引物庚和探针庚；

所述引物探针组合物甲为第一引物探针组合物甲或第二引物探针组合物甲；所述第一引物探针组合物甲中：所述特异性引物对甲为序列表的序列8所示DNA和序列表的序列9所示DNA组成的引物对，所述封闭引物甲的核苷酸序列如序列表的序列10所示，所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列11所示；所述第二引物探针组合物甲中：所述特异性引物对甲为序列表的序列12所示DNA和序列表的序列13所示DNA组成的引物对，所述封闭引物甲的核苷酸序列如序列表的序列14所示，所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列15所示；

所述引物探针组合物乙为第三引物探针组合物乙或第四引物探针组合物乙；所述第三引物探针组合物乙中：所述特异性引物对乙为序列表的序列16所示DNA和序列表的序列17所示DNA组成的引物对，所述封闭引物乙的核苷酸序列如序列表的序列18所示，所述探针乙的核苷酸序列如序列表的序列19所示；所述第四引物探针组合物乙中：所述特异性引物对乙为序列表的序列20所示DNA和序列表的序列21所示DNA组成的引物对，所述封闭引物乙的核苷酸序列如序列表的序列22所示，所述探针乙的核苷酸序列如序列表的序列23所示；

所述引物探针组合物丙为第五引物探针组合物丙或第六引物探针组合物丙；所述第五引物探针组合物丙中：所述特异性引物对丙为序列表的序列24所示DNA和序列表的序列25所示DNA组成的引物对，所述封闭引物丙的核苷酸序列如序列表的序列26所示，所述探针丙的核苷酸序列如序列表的序列27所示；所述第六引物探针组合物丙中：所述特异性引物对丙为序列表的序列28所示DNA和序列表的序列29所示DNA组成的引物对，所述封闭引物丙的核苷酸序列如序列表的序列30所示，所述探针丙的核苷酸序列如序列表的序列31所示；

所述引物探针组合物丁为第七引物探针组合物丁或第八引物探针组合物丁；所述第七引物探针组合物丁中：所述特异性引物对丁为序列表的序列32所示DNA和序列表的序列33所示DNA组成的引物对，所述封闭引物丁的核苷酸序列如序列表的序列34所示，所述探针丁的核苷酸序列如序列表的序列35所示；所述第八引物探针组合物丁中：所述特异性引物对丁为序列表的序列36所示DNA和序列表的序列37所示DNA组成的引物对，所述封闭引物丁的核苷酸序列如序列表的序列38所示，所述探针丁的核苷酸序列如序列表的序列39所示；

所述引物探针组合物戊为第九引物探针组合物戊或第十引物探针组合物戊；所述第九引物探针组合物戊中：所述特异性引物对戊为序列表的序列40所示DNA和序列表的序列41所示DNA组成的引物对，所述封闭引物戊的核苷酸序列如序列表的序列42所示，所述探针戊的核苷酸序列如序列表的序列43所示；所述第十引物探针组合物戊中：所述特异性引物对戊为序列表的序列44所示DNA和序列表的序列45所示DNA组成的引物对，所述封闭引物戊的核苷酸序列如序列表的序列46所示，所述探针戊的核苷酸序列如序列表的序列47所示；

所述引物探针组合物己为第十一引物探针组合物己或第十二引物探针组合物己；所述第十一引物探针组合物己中：所述特异性引物对己为序列表的序列48所示DNA和序列表的序列49所示DNA组成的引物对，所述封闭引物己的核苷酸序列如序列表的序列50所示，所述探针己的核苷酸序列如序列表的序列51所示；所述第十二引物探针组合物己中：所述特异性引物对己为序列表的序列52所示DNA和序列表的序列53所示DNA组成的引物对，所述封闭引物己的核苷酸序列如序列表的序列54所示，所述探针己的核苷酸序列如序列表的序列55所示；

所述引物探针组合物庚为第十三引物探针组合物庚或第十四引物探针组合物庚；所述第十三引物探针组合物庚中：所述特异性引物对庚为序列表的序列56所示DNA和序列表的序列57所示DNA组成的引物对，所述封闭引物庚的核苷酸序列如序列表的序列58所示，所述探针庚的核苷酸序列如序列表的序列59所示；所述第十四引物探针组合物庚中：所述特异性引物对庚为序列表的序列60所示DNA和序列表的序列61所示DNA组成的引物对，所述封闭引物庚的核苷酸序列如序列表的序列62所示，所述探针庚的核苷酸序列如序列表的序列63所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：

还包括针对内参基因的内参引物和内参探针，所述内参基因为ACTB和/或GSTP1。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：

所述内参基因ACTB的内参引物对为序列表的序列64所示DNA和序列表的序列65所示DNA组成的引物对；所述内参基因ACTB的内参探针的核苷酸序列如序列表的序列66所示；

所述内参基因GSTP1的内参引物对为序列表的序列67所示DNA和序列表的序列68所示DNA组成的引物对；所述内参基因GSTP1的内参探针的核苷酸序列如序列表的序列69所示。

4.一种用于诊断结肠癌患者的试剂盒，其特征在于，

包括如下七个引物探针组合物中的至少一种：引物探针组合物甲、引物探针组合物乙、引物探针组合物丙、引物探针组合物丁、引物探针组合物戊、引物探针组合物己和引物探针组合物庚；

所述引物探针组合物甲包括特异性引物对甲、封闭引物甲和探针甲；所述引物探针组合物乙包括特异性引物对乙、封闭引物乙和探针乙；所述引物探针组合物丙包括特异性引物对丙、封闭引物丙和探针丙；所述引物探针组合物丁包括特异性引物对丁、封闭引物丁和探针丁；所述引物探针组合物戊包括特异性引物对戊、封闭引物戊和探针戊；所述引物探针组合物己包括特异性引物对己、封闭引物己和探针己；所述引物探针组合物庚包括特异性引物对庚、封闭引物庚和探针庚；

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：

7.根据权利要求2、3、5和6任一项所述的试剂盒，其特征在于，

还包括：DNA提取试剂和亚硫酸氢盐试剂；

所述DNA提取试剂包括裂解缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液；其中，所述裂解缓冲液包括蛋白变性剂、去垢剂、pH缓冲剂和核酸酶抑制剂；所述清洗缓冲液分为清洗缓冲液A和清洗缓冲液B，所述清洗缓冲液A包括蛋白质变性剂、核酸酶抑制剂、pH缓冲剂、乙醇，所述清洗缓冲液B包括核酸酶抑制剂、pH缓冲剂、乙醇；所述洗脱缓冲液包括核酸酶抑制剂和pH缓冲剂；所述蛋白变性剂选自异硫氰酸胍、盐酸胍和尿素中的一种或几种；所述去垢剂选自Tween20、Tween40、Triton X-100、NP-40和SDS中的一种或几种；所述pH缓冲剂选自Tris、硼酸、磷酸盐、MES和HEPES中的一种或几种；所述核酸酶抑制剂选自EDTA、EGTA和DEPC中的一种或几种；

所述亚硫酸氢盐试剂包括亚硫酸氢盐缓冲液和保护缓冲液；其中，所述亚硫酸氢盐缓冲液选自重亚硫酸钠、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢铵和亚硫酸铵中的一种或几种；所述保护缓冲液包括氧自由基清除剂，所述氧自由基清除剂选自对苯二酚、维生素E、维生素E衍生物、没食子酸、Trolox、三羟基苯甲酸和三羟基苯甲酸衍生物中的一种或多种。

8.权利要求1-7任一项所述的试剂盒在制备检测结肠癌产品中的应用。

9.一种采用权利要求7所述的试剂盒检测Septin9、ALX4、BMP3、NDRG4、SDC2、BCAT1和IKZF1基因及其片段的甲基化的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：采用所述DNA提取试剂提取人源样本的DNA；

S2：将提取得到的DNA采用所述亚硫酸氢盐试剂进行处理；

S3：以处理后的DNA为模板，采用所述引物探针组合物和所述内参基因的内参引物及内参探针进行PCR扩增。