CN116121374A - 血液外泌体分子标志物及其在制备肝癌诊断产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及外泌体mRNA作为诊断肝细胞癌的分子标志物及其应用。本发明所述外泌体mRNA为HMMR与B4GALT2。血液Exo‑HMMR和Exo‑B4GALT2是新型生物标志物，二者构成的风险评分RiskScore，较准确地区分肝细胞癌受试者与非肝细胞癌受试者（包括乙型肝炎患者、肝硬化、正常人等），将大大提高肝细胞癌早期诊断的灵敏度、特异度和准确性，从而避免临床上不必要的穿刺活检，该生物标志物的开发有助于肝细胞癌的预后预警，并为其他肿瘤类似生物标志物的研制提供借鉴。

Description

血液外泌体分子标志物及其在制备肝癌诊断产品中的应用

技术领域

本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及外泌体mRNA作为肝细胞癌的分子标志物及其应用。

背景技术

肝细胞癌(HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率高，近年来呈上升趋势，使人类健康处于危险之中。现有的预后预测模型(例如，Okuda，TNM，BCLC，JI，CUPI，CLIP，GRETCH，CIS)主要基于肿瘤的临床病理学特征，但它们只能提供模糊的预后预测能力，开发基于分子生物标志物的有效工具至关重要，用于筛查肝癌患者，并指导治疗。

糖酵解速率的增加以及随后产生的乳酸的积累是HCC细胞中代谢异常的标志之一。Otto Warburg等人在1920年提出，暴露于缺氧甚至有氧环境的肿瘤细胞主要依靠糖酵解获得能量，这被称为Warburg效应或有氧糖酵解。根据大量研究，已知恶性肿瘤细胞具有增加的葡萄糖摄取能力，糖酵解相关基因的活性表达和相对高的酶活性。因为糖酵解为肿瘤细胞提供了大量能量，所以增加糖酵解与增加肿瘤侵袭和增殖有关并不奇怪。这表明基于肝癌细胞代谢的临床诊断模型可能是有用的。我们希望研究整套糖酵解调节因子和信号通路分子，以及糖酵解与肝癌发展之间的联系，并开发基于糖酵解相关分子的诊断模型。

外泌体是具有直径为50-150nm的杯状磷脂双层膜结构的细胞外囊泡，通过运输细胞内mRNA、miRNA、lncRNA和蛋白质促进细胞间通讯。外泌体在肿瘤侵袭和转移中起重要作用，这意味着外泌体可用于肿瘤的诊断和治疗。外泌体可以从亲代细胞中携带重要的分子和遗传信息，使其成为观察和分析亲代肿瘤细胞进行临床诊断的理想工具，无需进行侵入性组织活检。因此，外泌体可以通过充当液相活检的窗口来为肿瘤提供代谢相关的循环源信息。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种用于肝癌诊断的生物分子标志物。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种扩增所述的生物分子标志物的引物对。

本发明还要解决的技术问题是提供了所述的生物分子标志物、所述的引物对在制备肝癌诊断产品或肝癌预后评估产品的无创诊断产品中的应用。

本发明最后要解决的技术问题是提供了一种诊断肝癌或用于肝癌预后评估的诊断试剂盒。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于肝癌诊断的生物分子标志物，所述生物分子标志物为血浆外泌体mRNA，所述血浆外泌体mRNA包括HMMR和B4GALT2。

其中，所述HMMR的genbank登录号为Gene ID:3161，所述B4GALT2的genbank登录号为Gene ID:8704。

本发明内容还包括扩增或检测所述的生物分子标志物的引物对，扩增或检测HMMR的引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，扩增或检测B4GALT2的引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

本发明内容还包括所述的生物分子标志物、所述的引物对在制备肝癌诊断产品中的应用。

本发明内容还包括所述的所述的生物分子标志物、所述的引物对在制备肝癌预后评估产品的无创诊断产品中的应用。

本发明通过检测外泌体HMMR与B4GALT2来诊断肝癌，尤其是肝癌预后评估，具体通过检测外泌体HMMR与B4GALT2存在与否或表达高低的方法来进行诊断和评估。

其中，所述产品包括任何用于检测外泌体-HMMR或B4GALT2存在与否或表达高低的方法中所使用的试剂。

其中，所述方法包括但不仅限于逆转录PCR或实时荧光定量PCR。

本发明内容还包括一种诊断肝癌或用于肝癌预后评估的诊断试剂盒，所述试剂盒包括所述的产品或所述的方法中所使用的的试剂。

本发明通过检测泌体HMMR与B4GALT2来进行肝癌转移风险预警和预后评估的诊断，具体通过检测外泌体HMMR与B4GALT2存在与否或表达高低的方法来进行诊断。

其中，所述试剂盒包括所述的引物对。

其中，所述试剂盒还包括逆转录试剂或实时荧光定量PCR试剂。

进一步，所述试剂盒还包括分离外泌体所用的试剂、裂解外泌体所用的试剂。

其中，所述分离外泌体所用的试剂包括任何能够分离外泌体的方法中使用的试剂。

其中，分离外泌体的方法包括但不局限于超速离心法、沉淀法、分子排阻层析、亲和分离法、免疫磁珠法、超滤法等。

本发明用于肝癌转移风险预警和预后评估的外泌体来自体液，所述体液包括血液、尿液、唾液、腹水、脑脊液等。优选地，本发明的用于肝癌诊断的外泌体来自血液。

本发明的诊断产品进行肝癌转移风险预警和预后评估的步骤包括：

(1)从体液中分离外泌体；

(2)检测外泌体HMMR与B4GALT2表达水平；

(3)根据外泌体HMMR与B4GALT2表达信息帮助肝癌预后评估。

有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：

1、本发明首次将血液外泌体HMMR与B4GALT2作为新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该生物标志物的开发有助于肝癌的诊断及预后预警，并为其他肿瘤类似生物标志物的研制提供借鉴。

2、本发明通过血液外泌体HMMR与B4GALT2的含量来判断肝癌预后的方法，可为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供依据。

附图说明

图1～图7的患者情况如下：

HCC：未经治疗的肝细胞癌确诊患者；HC：健康对照；CHB+LC：肝炎或肝硬化患者；AFP-HCC：甲胎蛋白阴性的肝细胞癌患者；Early-HCC：根据巴塞罗那分期为早期的肝细胞癌患者。n表示人数。

图1为HCCEGGscore在各组的分布情况。

*表示＜0.05，**表示＜0.01，***表示＜0.001。

图2为HCCEGGscore与AFP在诊断肝细胞癌(HCC)与健康对照(HC)的ROC结果。图3为HCCEGGscore与AFP在诊断肝细胞癌(HCC)与肝炎或肝硬化高危患者(CHB+LC)的ROC结果。

图4为HCCEGGscore与AFP在诊断肝细胞癌(HCC)与非肝癌受试者(CHB+LC+HC)的ROC结果。

图5为HCCEGGscore与AFP在诊断早期肝细胞癌(EarlyHCC)与肝炎或肝硬化高危患者(CHB+LC)的ROC结果。

图6为HCCEGGscore与AFP在诊断早期肝细胞癌(EarlyHCC)与非肝癌受试者(CHB+LC+HC)的ROC结果。

图7为不同HCCEGGscore得分的HCC患者的总生存时间具有统计学差异。

图8为本发明的实验流程示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。

1、血浆的分离

本发明中收集的全血标本均使用EDTA抗凝，经4℃2000×g离心5分钟去除血细胞，12000×g离心5分钟去除剩余细胞碎片后上清即为血浆，吸取上清转入新EP管中冻存于-80℃冰箱备用。

2、血浆外泌体的分离提取

本发明使用Invitrogen公司血浆外泌体提取试剂盒进行血浆外泌体的分离提取工作。首先将300μl血浆转移至新的EP管中并加入1×PBS 150μl振荡混匀，然后加入15μl蛋白酶K振荡混匀，于37℃静置10分钟。随后加入90μl外泌体沉淀剂，充分振荡混匀后于2-8℃静置30分钟。然后在室温下10000×g离心5分钟，小心弃去上清液后，外泌体即包含在EP管底部的沉淀中。最后加入1×PBS 300μl重悬，冻存于-80℃冰箱备用。

3、血浆及血浆外泌体RNA提取

RNA提取试剂盒用于提取血浆及外泌体中总RNA，首选在300μL血浆(外泌体用300μL 1xPBS重悬)中加入裂解液900μL，震荡混匀后加入180μL氯仿，震荡15秒后室温孵育5分钟，随后4℃12000rpm离心10分钟取上层水相600μL，加入等体积70％乙醇振荡混匀后转入吸附柱，10000rpm离心3分钟弃废液，随后依次加入700μL漂洗液、500μL去蛋白液、500μL漂洗液，均12000rpm离心3分钟后弃废液。4℃环境下12000rpm离心4分钟后将吸附柱转入一个新的无RNA酶EP管中，向吸附柱中加入预先65-70℃水浴的DEPC水30μL，12000rpm离心3分钟，EP管中即为血浆(血浆外泌体)中的总RNA。

4、总RNA浓度和纯度的检测

取1μL RNA溶液，按照nanodrop2000使用说明书进行浓度和纯度的测定，记录OD(260/280)、OD(260/230)和RNA的浓度。RNA纯度越高，OD(260/280)越接近2.0，DNA纯度越高，二者之比越接近1.8。在一般情况下当OD(260/280)介于1.7到2.1之间时，认为本次RNA提取质量较好。本实施例中OD(260/280)均在2.0以上，OD(260/230)均在1.2以上，RNA的浓度均在100ng/uL以上。

5、RNA逆转录

制冰，以下操作如非特别说明均在冰上操作，已经去除基因组DNA的RNA样本及相关试剂解冻后短暂震荡，离心混匀；依照下表将ReverTra

qPCR RT Kit-东洋纺(上海)生物科技有限公司FSQ-101加入无酶EP管内，进行逆转录实验。同样为保证反应液配置的准确性，进行各项反应时，先按反应数加2的量配置Master Mix，然后再分装到每个反应管。

逆转录反应条件：37℃15min，98℃变性5s，4℃放置。逆转录的cDNA于-20℃储存备用。

Primer Mix分别包括针对目的基因HMMR或B4GALT2设计的引物对。

其中，HMMR的Primer Mix包括上游引物：TCAGTTGTCGAGGAGTGCCAG(SEQ ID NO.1)和下游引物：ATGGTGCACAACCAGAAGGGT(SEQ ID NO.2)

B4GALT2的Primer Mix包括上游引物：AACCACTTCCCACCATGGCTC(SEQ ID NO.3)和下游引物：AGTAGAGGATGACGGCCACGA(SEQ ID NO.4)

6、实时荧光定量PCR扩增反应

(1)引物合成

内参GAPDH及目的基因HMMR与B4GALT2的引物使用NCBI/Primer-BLAST网页在线设计，经BLAST比对后交由生工生物工程(上海)股份有限公司官方合成。

HMMR PCR上游引物：TCAGTTGTCGAGGAGTGCCAG(SEQ ID NO.1)

HMMR PCR下游引物：ATGGTGCACAACCAGAAGGGT(SEQ ID NO.2)

B4GALT2 PCR上游引物：AACCACTTCCCACCATGGCTC(SEQ ID NO.3)

B4GALT2 PCR下游引物：AGTAGAGGATGACGGCCACGA(SEQ ID NO.4)

(2)实时荧光定量PCR

操作台紫外消毒至少半小时以上，制冰，使用SYBR Premix EX TaqII-康为世纪生物有限公司，SYBR Premix EX Taq II尽可能在避光条件下保存，配置相应Master Mix。该反应体系为20μl，体系中包含2×SYBR Premix EX Taq II 10μl；目的基因HMMR或B4GALT2上下游引物各0.8μl；模板(逆转录合成的cDNA 1μl；经高压灭菌去离子水7.4μl。将以上相关试剂按序加入无酶PCR八联管内，瞬时离心后，进行Real-time PCR反应。每个样本重复设置两个副孔。

Real time PCR扩增条件的设置：

Step1：预变性95℃30s，step2：变性95℃30s，退火61℃30s，延伸72℃30s；step3：重复step240个循环；step 4：溶解曲线：95℃10s，65℃5s，95℃5s。

7、数据处理与结果分析

(1)表达量分析

所有样品的表达量均为根据内参基因GADPH标准化后的相对表达量；采用2^-ΔCt对两目的基因定量数据分析。即，ΔCt＝目的基因的Ct值-内参基因的Ct，目的基因Ct值为用实时荧光定量技术检测到的目的基因HMMR与B4GALT2的Ct值。将目的基因HMMR与B4GALT2的2^-ΔCt代入血液外泌体糖酵解标志物模型，得到HCCEGGscore。

模型如下：

HCCEGGscore＝0.075×(HMMR)+0.035×(B4GALT2)；

其中(HMMR)、(B4GALT2)是HMMR和B4GALT2在外泌体中的表达量2^-ΔCt。结果如图1所示，HCCEGGscore在肝癌患者(HCC，n＝160)外泌体的得分低于健康对照组(HC，n＝30)、高危组(CHB+LC，n＝20)且差异有显著性。

血液外泌体糖酵解标志物模型构建方法为，从TCGA数据库(https://cancergenome.nih.gov/)下载HCC患者的肿瘤组织及相邻mRNA表达谱和相关的临床信息。在TCGA的数据下载主页选择并限定HCC肿瘤，在具体数据类别中选择表达谱测序谱，并下载相应病例的临床数据。利用Perl语言进行表达谱的基因ID转换，得到mRNA的HCC表达矩阵，用于下一步分析。临床信息包括患者总数，性别，年龄，TNM分期等。糖酵解基因集来自于MSigDB(The Molecular Signatures Database)，MSigDB作为已知定义的基因数据集，将glycolysis作为关键词进行检索，可得到包含了糖酵解相关的基因集。使用GSEA提取了来自TCGA数据库的HCC患者的糖酵解相关基因的表达。使用归一化的p值(p<0.05)和归一化的富集得分(NES)来确定要进行进一步分析的功能，p小于等于0.05被认为具有统计学意义，在这一步得到了通过糖酵解途径富集的基因。为了鉴定与患者生存相关的糖酵解基因用于临床预后评估，我们使用TCGA来源的患者生存信息，包括生存状态与生存时间等临床数据，使用R语言，将肝细胞癌患者的糖酵解基因表达数据与生存信息进行匹配，其中基因表达量通过log2进行了归一化。将匹配后的数据构建表达-生存矩阵，通过R语言进行单因素Cox回归分析，从而得到与肝细胞癌患者生存显著相关的糖酵解基因。再使用多因素Cox回归分析，将得到的基因进行拟合，进一步确认从先前分析中获得的预后基因，以确认最优解释及最优效应的风险评分模型。其模型的构建如下：风险评分＝基因1×β1+基因2×β2+…+基因n×βn。当HCCEGGscore与AFP联合时，在SPSS 22.0软件构建联合诊断的Logistic回归模型，并计算两指标联合的预测概率，以预测概率画ROC曲线，并计算曲线下面积，用GraphpadPrism 8软件进行统计分析以及作图。

(2)HCC诊断效能分析

对疾病组和参照组测定结果进行分析，确定测定值的上下限、组距以及截断点，按选择的组距间隔列出累积频数分布表，分别计算出所有截断点的敏感性、特异性和假阳性率(1-特异性)。以敏感性为纵坐标代表真阳性率，(1-特异性)为横坐标代表假阳性率，作图绘成ROC曲线。ROC曲线下的面积值在1.0和0.5之间。在AUC>0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5～0.7时有较低准确性，AUC在0.7～0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。AUC＝0.5时，说明诊断方法完全不起作用，无诊断价值。AUC<0.5不符合真实情况，在实际中极少出现。采用成组比较法进行两种诊断方法的统计学比较。用Graphpad Prism 8软件进行统计分析以及作图，并利用SPSS 22.0软件计算曲线下的面积，评估HCCEGGscore的诊断效能。ROC分析HCCEGGscore在肝癌患者的诊断价值；结果如图2～4和表1所示，HCCEGGscore与AFP联合时可明显提高AFP的诊断效能好，敏感性和特异性都达到80％以上，表明联合HCCEGGscore能较好的诊断HCC。当HCCEGGscore与AFP联合时，联合分数为>0.01995的提示为肝癌患者。HCCEGGscore单独使用灵敏度为0.75，特异度为0.90，AUC为0.88(0.83 to 0.92)，二者联合后在整体的非癌症组与癌症组的诊断效能提高。

表1.HCCEGGscore在诊断HCC时的结果

(3)HCCEGGscore在HCC早期诊断效能分析

早期肝癌为巴塞罗那Stage0-A级(Early-stage HCC)，高危组为肝炎肝硬化组(CHB+LC)，对照组为健康人(HC)。对疾病组和参照组测定结果进行分析，确定测定值的上下限、组距以及截断点，按选择的组距间隔列出累积频数分布表，分别计算出所有截断点的敏感性、特异性和假阳性率(1-特异性)。以敏感性为纵坐标代表真阳性率，(1-特异性)为横坐标代表假阳性率，作图绘成ROC曲线。ROC曲线下的面积值在1.0和0.5之间。在AUC>0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5～0.7时有较低准确性，AUC在0.7～0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。AUC＝0.5时，说明诊断方法完全不起作用，无诊断价值。AUC<0.5不符合真实情况，在实际中极少出现。采用成组比较法进行两种诊断方法的统计学比较。用Graphpad Prism 8软件进行统计分析以及作图，并利用SPSS 22.0软件计算曲线下的面积，评估HCCEGGscore的诊断效能。评估HCCEGGscore对早期HCC的诊断能力。在87.5％的早期阳性HCC患者中检测到循环外泌体中的HCCEGGscore，而AFP为57.5％。循环外泌体中HCCEGGscore诊断参数的AUC(AUC＝0.8825)高于早期HCC与高风险对照(CHB+LC)的AFP(AUC＝0.7714)。结果表明，循环外泌体中的HCCEGGscore是检测早期HCC的有效标志物，其准确性优于AFP(图5与图6)。评估AFP阴性患者HCCEGGscore的表现。ROC分析显示，HCCEGGscore可区分AFP阴性的HCC患者与所有非癌受试者(HC+CHB+LC)，其AUC为0.9761，灵敏度为43.0％，特异性为90.0％。当HCCEGGscore>0.03067的提示为肝癌早期患者。

这些结果表明循环外泌体中的HCCEGGscore可用于检测AFP阴性HCC和AFP阴性早期HCC(表2)。

表2.HCCEGGscore在诊断AFP阴性HCC时的结果

(4)HCCEGGscore是HCC总存活时间的独立预测因子

对55名患者可获得详细的生存数据。以死亡为结局，HCCEGGscore为主要研究因素，每个研究对象都有生存时间(随访开始到死亡、失访或随访结束的时间)。使用单变量和多变量Cox回归确定HCCEGGscore和其他临床特征对总生存时间的预测意义。利用SPSS软件，选择Analyze→Survival→Cox Regression。在单变量和多变量中，HCCEGGscore被确定为死亡率的独立预测因子(表3)，高HCCEGGscore与低HCCEGGscore间的生存时间具有明显差异(图7)。

表3.HCC患者总生存时间的独立危险因素分析(n＝55)

HR：风险值，HR>1，高风险基因，说明该基因的表达越高，病人的风险越高，HR<1，低风险基因，说明该基因的表达越高，病人的风险越低。

HR.95L、HR.95H：HR波动范围，HR 95％CI。

Pvalue：该基因跟生存相关性的统计学p值，p<0.05，说明该基因跟生存是相关的。

从表3可以看出，肝癌患者治疗前循环外泌体的高HCCEGG评分(HCCEGG>＝2)被确定为死亡的独立预测因子。从图7可以看出，治疗前循环外泌体的HCCEGG评分高(HCCEGG>＝2)的患者总生存时间短。

Claims (10)

1.一种用于肝癌诊断的生物分子标志物，其特征在于，所述生物分子标志物为血浆外泌体mRNA，所述血浆外泌体mRNA包括HMMR和B4GALT2。

2.根据权利要求1所述的用于肝癌诊断的生物分子标志物，其特征在于，所述HMMR的genbank登录号为Gene ID：3161，所述B4GALT2的genbank登录号为 Gene ID：8704。

3.扩增或检测权利要求1或2所述的生物分子标志物的引物对，其特征在于，扩增或检测HMMR的引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，扩增或检测B4GALT2的引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

4.权利要求1或2所述的生物分子标志物、权利要求3所述的引物对在制备肝癌诊断产品中的应用。

5.权利要求1或2所述的生物分子标志物、权利要求3所述的引物对在制备肝癌预后评估产品的无创诊断产品中的应用。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述产品包括任何用于检测Exo-HMMR或B4GALT2存在与否或表达高低的方法中所使用的试剂。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述方法包括逆转录PCR或实时荧光定量PCR。

8.一种诊断肝癌或用于肝癌预后评估的诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求6所述的产品或权利要求7所述的方法中所使用的的试剂。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3所述的引物对。

10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括逆转录试剂或实时荧光定量PCR试剂。

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