CN111485020A - Linc01419作为诊断和治疗肝细胞癌标志物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于诊断和治疗肝细胞癌的长链非编码RNA标志物，具体的所述长链非编码RNA为LINC01419。本发明公开了LINC01419在制备诊断肝细胞癌的产品以及治疗肝细胞癌的药物组合物中的应用。本发明同时公开了一种诊断肝细胞癌的试剂盒以及治疗肝细胞癌的药物组合物。本发明的试剂盒能够作为肝细胞癌早期诊断的手段之一。本发明的药物组合物对肝细胞癌有较好的抑制作用，在肝细胞癌治疗中具有重要的参考和现实意义。

Description

LINC01419作为诊断和治疗肝细胞癌标志物的应用

技术领域

本发明涉及一种与肝细胞癌相关的长链非编码RNA及其应用，所述的长链非编码RNA为LINC01419。属于生物医药领域，具体属于分子生物学技术领域。

背景技术

原发性肝癌(primary carcinoma of liver)简称肝癌，是一种发生于肝细胞或肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤，也是我国最常见的恶性肿瘤之一。在我国，每年死于肝癌者大于10万人，且呈逐年增高的趋势，肝癌的诊断和治疗成为我国公共卫生和临床的关注的重点。目前，研究者们对于肝癌的病因及发病机制尚没有明确的定论。传统观念认为，肝炎病毒、黄曲霉毒素、酒精等因素都可能影响肝癌的发生发展。随着对肝癌分子生物学机制的研究的逐步深入，研究者们发现在肝癌发生、侵袭和转移过程中，很多细胞信号通路参与并发生作用。长链非编码RNALINC01419表观沉默GSTP1基因介导JNK信号通路也参与肝癌发生。

长链非编码RNA(LncRNAs)是非编码RNA(non-codingRNA，ncRNA)中的重要组成部分，其长度多于200bp，开放阅读框一般少于100bp。最初认为LncRNA不具有转录能力，是基因进化过程中的非功能片段。近来随着分子生物学技术的发展，发现LncRNA在生物体的多个方面产生作用，如细胞新陈代谢、组织机构的发生、发展和凋亡等。LINC01419是LncRNAs的一种重要组成部分，对多种肿瘤的发生发展起着重要的影响，例如食管癌、肝癌。研究发现，肿瘤细胞的增殖，迁移和侵袭能力会受到LINC01419沉默的抑制。

Jun氨基末端激酶(c.JunNH2.teminal Kinase，JNK)信号转导通路是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPKs)通路中重要的一种，负责参与及调控细胞周期、增殖、凋亡和细胞应激等的过程。人类基因组包含三个密切相关的JNK基因：JNK1，JNK2和JNK3。所有这三个基因都编码400个氨基酸的非酸性蛋白质，所含蛋白质几乎不超过标准的Ser/Thr蛋白激酶结构域。在未受刺激的细胞中，JNK主要存在于胞质内，但核内也有一定分布。在受到刺激后，JNK通过关键激酶MKK4和MKK7而被磷酸化激活，位置从胞浆变化到细胞核，使下游转录因子特殊基因的表达发生变化，从而起到调控细胞的增殖、分化和凋亡，JNK信号通路在肿瘤中存在促进肿瘤发展和抑制肿瘤发育的双重作用。目前认为JNK主要通过转录因子途径和线粒体途径两种机制介导细胞凋亡的。但是，在某些细胞类型及刺激方式作用下JNK并不引起细胞凋亡，而可促进细胞的增殖分化。这表明JNK信号通路对细胞的功能具有双向调控作用。

谷胱甘肽巯基转移酶(Glutathione S-transferase，GST)是一个超蛋白家族，目前认为该家族包括8个家族成员，分别是alpha(GSTA)，mu(GSTM)，pi(GSTP)，theta(GSTT)，tau(GSTZ)，sigma(GSTS)，omicron(GSTO)和kappa(GSTK)。GST蛋白家族主要负责调控GSH与活性氧、过氧化物等物质的结合，控制细胞的氧化程度从而起到保护作用。GSTP1属于GST-π亚家族，对肝细胞的保护具有重要作用，一般认为GSTP1的过表达代表了转化表型的重要特征。研究发现肝癌患者的GSTPl基因启动子区出现甲基化，GSTP1蛋白表达水平降低，蛋白质的这种翻译后修饰，其中将谷氨硫酮可逆地添加到蛋白质中导致谷胱甘肽化和去谷胱甘肽化的失衡，肝细胞遭受氧化损伤导致肝功能的损害。GSTP1的谷胱甘肽化可能会干扰其与MAPK-JNK的相互作用，是氧化还原敏感的分子机制调节信号因子。以谷胱甘肽为关键决定因素的氧化还原体内稳态在癌症中经常失调，进一步暗示谷胱甘肽酰化在活性调节中的重要作用细胞死亡和存活中涉及的不同信号分子的变化。

肝脏是一个拥有强大再生能力的器官，当肝脏部分切除后lh，JNK信号通路就被活化。JNK信号通路的活化促进细胞周期蛋白(cyclinD)的表达，即使在正常细胞生长受限的环境下，细胞仍可越过G0/S和(或)G1/S过渡点而持续分裂增殖。当药物阻止JNK信号通路活化后，c-Jun的磷酸化和cyclinD的表达减少，最终造成肝细胞再生的延迟。一般认为JNK1-/-的小鼠通过增加p21(细胞周期蛋白依靠性激酶抑制剂家族中的重要成员)和减少c-myc(可抑制p21)的表达来减少肝脏部分切除后的再生。JNK2在肝脏增殖中的作用并不明确，一项实验表明JNK2缺陷后可增加肝细胞的增殖，可能是补偿上调了JNKl的结果。在二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine，DEN)诱发小鼠HCC模型中揭示了JNKl可能依靠促进肝实质细胞的凋亡和促进补偿性增殖而引起HCC的发生。最近也有研究者将小鼠中JNKl与JNK2敲除，显示JNK在HCC中起着双向作用。在这项实验中，肝实质细胞中JNK缺陷的肝细胞受到DEN诱导，更易转化为为HCC；相反，在肝实质细胞核缺陷JNK时，肝脏炎症和HCC的发发病率均降低。表明JNK在肝实质细胞可表现为肿瘤的抑制作用。JNK的持续活化会导致细胞的死亡；而如果活化的时间短，就可能刺激前恶性和癌变肿瘤细胞的扩增。抑制JNK能够防止肝脏损伤但也会抑制肝脏的再生，因此活化的时间和程度非常重要。JNK信号通路在肝癌的发展中也扮演着复杂的角色。JNK信号通路分别通过死亡受体途径和线粒体途径对细胞内外的凋亡信号产生作用，调节多种促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的活性，以促进或抑制肝癌的发生、发展。不同的JNK基因基因敲除小鼠显示JNK1和JNK2对成纤维细胞，巨噬细胞和T细胞具有不同的调节作用。例如亚硝胺诱发的肝肿瘤发生中，JNK1和JNK2的共同表达促进肝脏成纤维细胞的凋亡，这表明JNK1和JNK2的联合作用在肝癌的假小叶形成中起到重要作用；而JNK1/小鼠对亚硝胺的反应较激烈，轻度的刺激作用即可导致Kupffer细胞、自然杀伤性T细胞等的强烈反应，产生严重的细胞毒性损伤，这使肝细胞的再生失衡，提示JNK1可能是肿瘤发展所需的。

GST-π被认为是JNK通路的负调节剂，指导c-jun介导的细胞凋亡，通过长链非编码RNA LINC01419表观沉默GSTP1基因可激活JNK信号通路促进细胞凋亡。GST-π通过蛋白-蛋白质相互作用负调控JNK活化，从而控制磷酸化下游靶蛋白c-jun的表达。JNK通路代表中央氧化应激激活反应，导致凋亡的细胞死亡。降低GST-π可能是合理的原因用于增加氧化应激并随后激活锌暴露动物的JNK和c-jun磷酸化。JNK信号传导导致抗凋亡调节B细胞淋巴瘤蛋白和线粒体Bcl-2相关X蛋白易位引起细胞色素c释放和caspase级联激活导致凋亡性细胞死亡。在静止期细胞中GSTP1与JNK1结合并抑制其活性。在氧化应激环境中，GSTP1与JNK分离，导致JNK激活，并随后对细胞产生影响存活，凋亡和肿瘤发生。GSTP1是在多种癌症类型中过度表达，并已被提议作为克服多药耐药性的治疗靶点。AG和GG基因型GSTP1基因突变增加了HCC的风险。GSTP1甲基化与HCC患者预后不良。GSTP1已被证明具有与JNK通路相关参与细胞存活和死亡信号转导。GSTP1功能隔离复合物中的JNK激酶，从而防止它对下游目标采取行动。

长链非编码RNA LINC01419表观沉默GSTP1基因介导JNK信号通路有望成为肝癌的有效治疗方法。本专利介绍了一种长链非编码RNA LINC01419调控GSTP1基因介导肝细胞癌发生及转移的调控机制，为临床上肝癌的预防和治疗提供了新的思路。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种与肝细胞癌发生发展相关的的lncRNA标志物，所述标志物可以作为肝细胞癌的特异性诊断标志物，应用于肝细胞癌的早期发现；本发明的目的之二在于提供lncRNA标志物在筛选治疗肝细胞癌的候选药物中的应用。

为了研究与肝细胞癌相关的长链非编码RNA在肝细胞癌中的作用，从而筛选合适的长链非编码RNA。我们通过生物信息学技术及现代分子生物学技术从收集的肝细胞癌组织中找到了可以作为肝细胞癌标志物的LINC01419。

因此，本发明一方面提供了一种长链非编码RNA，和检测该长链非编码RNA表达水平的试剂在制备诊断肝细胞癌的产品中的应用，其实，所述的长链非编码RNA为LINC01419。

优先地，本发明所述试剂为特异性扩增LINC01419的引物。

再一方面，本发明在LINC01419应用的基础上，提供了一种诊断早期肝细胞癌的试剂盒，所述试剂盒包括检测LINC01419表达水平的试剂。

优选地，本发明所述试剂为特异性扩增LINC01419的引物。

优选地，本发明所述特异性扩增LINC01419的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。

再一方面，本发明根据LINC01419基因的用途，提供了一种用于制备治疗肝细胞癌、和/或肝细胞癌浸润、和/或肝细胞癌转移的药物组合物。

优选地，本发明所述药物组合物包括LINC01419基因的抑制剂。

再一方面，本发明还提供了一种基于LINC01419基因药物组合物，所述药物组合物为LINC01419基因的抑制剂，所述抑制剂为LINC01419的LINC01419-shRNA。

优选地，本发明所述LINC01419-shRNA的序列如SEQ ID NO.3所示。

优先地，本发明所述的LINC01419-shRNA由慢病毒包载。

本发明通过生物信息学和现有的分子生物学的技术手段，从肝细胞癌组织中筛选到用于肝细胞癌诊断和治疗的标志物LINC01419(LINC01419在肝细胞癌中高表达)。在此基础上，本发明提供了检测LINC01419的试剂在制备诊断肝细胞癌的产品中的应用。该应用包括诊断早期肝细胞癌的试剂盒以及制备治疗肝细胞癌、和/或肝细胞癌浸润、和/或肝细胞癌转移的药物组合物。本发明的试剂盒能够作为肝细胞癌早期诊断的手段之一。本发明的药物组合物对肝细胞癌有较好的抑制作用，在肝细胞癌治疗中具有重要的参考和现实意义。

附图说明

其中*表示P<0.05，具有显著性差异。

图1慢病毒表达载体pLVX-IRES-neo图。

图2 lncRNA LINC01419是参与HCC病理进程的长链非编码RNA。其中图2A、图2B：为HCC芯片中LINC01419基因的表达情况(A:GSE40367；B:GSE45267)。图2C：TCGA数据库预测结果图，Tumor表示癌症组织，Normal表示癌旁肝组织。图2D：LINC01419表达与HCC预后关系图。图2E：长链非编码RNA LINC01419亚细胞定位情况。图2F：qRT-PCR检测长链非编码RNALINC01419在细胞核与细胞质的表达情况。

图3 LINC01419在肝细胞癌中高表达。其中图3A：qRT-PCR检测LINC01419在76例配对的HCC组织及癌旁组织的表达情况；图3B：qRT-PCR检测LINC01419在正常细胞与实验组细胞的表达情况。

图4裸鼠成瘤实验。图4A：裸鼠皮下肿瘤示意图；图4B：不同时间点各组小鼠皮下肿瘤体积(n＝4)，除了本发明相关的4组数据外，其它数据与本发明无关；图4C：肿瘤染色图(×200)，其中a：肝肿瘤HE染色图，b：肺转移瘤HE染色图，c：肺血管内瘤栓HE染色图，d：肺转移瘤AFP免疫组化染色图；图4D：不同处理组肺转移灶数量(n＝3)；数据采用均值±标准差表示；多组间采用单因素方差分析(Tucky’s posthoc test)；不同时间点多组比较采用重复测量方差分析(Dunnett’s post hoc test)。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例中所涉及各种原料，如无特别说明，均为市售。

本发明经过广泛而深入的研究，通过生物信息学技术和分子生物学技术，检测肝细胞癌组织和癌旁组织中lncRNA的表达水平，发现其中具有明显表达差异的lncRNA片段，探讨其与肝细胞癌的发生之间的关系，从而为肝细胞癌的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明发现肝细胞癌中LINC01419显著性上调，并且通过大样本实验证明，采用该lncRNA具有较高的阳性检出率；进一步的细胞实验证明，改变LINC01419的表达水平可以影响肝细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，提示LINC01419可以作为药物靶标应用于肝细胞癌的精准治疗。

“生物标志物”与“标志物”可以等同替代，指代具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。在本发明中，“标志物”指与一个或多个生物分子相关的参数(即“生物标志物”)，例如天然或人工合成产生的核酸(即个体基因，以及编码和非编码DNA和RNA)。本发明中的“标志物”还包括指可通过考虑来自两个或多个不同标志物的表达数据计算或以其他方式获得的单个参数。在本发明中，术语“生物标志物”指代与肝细胞癌相关联的基因、基因的片段或变体。

本发明中的LINC01419包括野生型(WT)、突变型(Mut)或其片段。在本发明的实施例中，一种代表性的人LINC01694基因的核苷酸序列SEQ ID NO.4所示。本发明的LINC01419核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。

在本发明中，可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。本发明的lncRNA使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

核酸测序技术的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序。

本发明所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA。

通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测LINC01419的表达。

在某些实施方案中，所述试剂盒包含与一种或多种生物标志物的mRNA特异性结合的一种或多种探针。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含洗涤溶液。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含进行杂交试验的试剂、mRNA分离或纯化工具、检测工具以及阳性和阴性对照。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含使用该试剂盒的说明书。所述试剂盒可以定制供在家使用、临床使用或研究使用。举例说明，本发明提供的试剂盒是基于qRT-PCR实验来源的，本发明不仅提供了一种检测LINC01419的引物，还提供了具体的检测方法，在此基础上，本发明可以提炼出一种用于检测LINC01419表达水平的qRT-PCR检测试剂盒。

这样一种试剂盒可以采用例如试纸条、膜、芯片、盘、测试条、滤器、微球、载片、多孔板或光纤。所述试剂盒的固相支持物可以是例如塑料、硅片、金属、树脂、玻璃、膜、颗粒、沉淀物、凝胶、聚合物、薄片、球、多糖、毛细管、胶片、板或载片。所述生物样品可以是例如细胞培养物、细胞系、组织、口腔组织、胃肠组织、器官、细胞器、生物液体、血液样品、尿液样品或皮肤抑制剂和药物(组合物)。

基于发明人的发现，本发明提供了一种LINC01419的抑制剂，所述抑制剂的性质对本发明来说并不重要，只要它抑制LINC01419基因的功能性表达即可，举例来说，本发明的抑制剂可以是以LINC01419基因为靶序列、且能够抑制LINC01419基因的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA微小RNA、反义核酸的构建物。这些抑制剂作为对于下调LINC01419有用的物质，可用于治疗肝细胞癌。

作为本发明的一种优选方式，所述LINC01419的抑制剂是一种LINC01419特异性的shRNA。如本文所用，所述的“shRNA”通过慢病毒包载，以获得稳定的抑制LINC01419的抑制剂。在本发明的实施例中，该LINC01419-shRNA在肝癌细胞中能够特异性的抑制LINC01419的表达，从而达到靶向抑制肝细胞癌的发生和发展。

本发明的核酸抑制物如shRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。shRNA等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

本发明的药物组合物包括LINC01419的抑制剂以及药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。优先地，本发明使用慢病毒包载LINC01419-shRNA，在本发明的实施例中，本发明的药物组合物通过转染试剂转染肝癌细胞后能够显著抑制LINC01419的表达，从而达到靶向抑制肝细胞癌的发生和发展。另外，在本发明的另一实施例中，在裸鼠成瘤模型中，本发明的药物组合物具有良好的抑制肝细胞癌发生和发展的作用。

当然，本发明的药物组合物还可与其他治疗肝细胞癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实验方法：:

方法1：HCC组织及癌旁组织收集

采集2012年7月至2014年7月我院76例肝癌患者手术切除的标本，术后病理诊断为HCC。其中男43例，女33例，年龄23～63岁，平均年龄(45.7±9.4)岁，所有患者术前均未行任何治疗。毎例组织标本分别由本院两位高年资医师独立诊断，依照UICC2002年TNM分期标准及Edmondeon病理分级标准进行组织学分级。毎例均取癌及对应癌旁肝组织(距肿瘤边缘至少2cm)，部分标本快速入液氮速冻，之后移至-80℃冰箱冻存，用于后续实验。所有患者术前签订知情同意书，研究方案经医院伦理委员会批准。

方法2：qRT-PCR

采用Trizol(15596026，Invitrogen，Car，Cal，USA)一步法提取组织和各组细胞总RNA，紫外分光光度仪计(DU640，Backman，USA)检测RNA纯度和浓度，A260/A280比值在1.8～2.0之间认为纯度较高。按照PrimeScript RT reagent Kit(RR047A，Takara，Japan)说明书将RNA反转录成cDNA。反应条件为：37℃，15min；85℃，5s；体系20μL。使用SYBR Premix EXTaq试剂盒(RR420A，Takara)在实时荧光定量PCR仪(ABI 7500，ABI，Foster City，CA，USA)进行PCR反应，反应体系：SYBR Mix 9μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，cDNA 2μL，RNaseFree dH2O 8μL。反应条件：95℃10min，95℃15s，60℃1min，连续进行40个循环。每个孔均设置3个重复。引物由上海吉凯基因化学技术有限公司合成(引物序列见表2)。记录各孔Ct值，以GAPDH和U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算产物相对表达量。△△Ct＝(实验组目的基因平均Ct值-实验组管家基因平均Ct值)-(对照组目的基因平均Ct值-对照组管家基因平均Ct值)。

表1引物序列

注：LINC01419：long intergenic non-protein coding RNA 1419；GAPDH：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；U6：hypothetical protein[Humanherpesvirus 6B]

方法3：细胞培养

正常人肝细胞(上海哈灵生物科技有限公司)和HCC(SMMC7721&SK-Hep-1)细胞(购于赛百慷(上海)生物技术股份有限公司)用含10％胎牛血清(购自美国HyClone公司)的RPMI1640培养液(购自美国HyClone公司)，在37℃、CO₂体积分数为5％且饱和湿度的培养箱中常规培养。细胞贴壁生长良好，每天换液1次，传代3～4天，收集对数生长期细胞，用于后续实验。

方法4：慢病毒载体的构建

利用慢病毒包装构建长链非编码RNA LINC01419稳定过表达与稳定低表达的HCC癌细胞系，以便后续研究。

合成带有Xhol和Notl限制性酶切位点的LINC01419 cDNA(SEQ ID NO.5)(来自Ensembl数据库)及正对其设计的shRNA序列(SEQ ID NO.3)，使用T4连接酶分别将列连接到慢病毒表达载体pLVX-IRES-neo(图1)(美国Clontech实验室)上，导入感受态大肠杆菌。37℃下培养24h扩增，提取质粒。测序鉴定后，LINC01419及其shRNA的真核表达载体即构建完成。

用脂质体转染剂Lipofectamin2000(Invitrogen美国)将包装质粒(LINC01419-cDNA质粒，LINC01419-shRNA质粒，空质粒)以及表达载体瞬时共转染人胚肾细胞系293T(购自细胞生物学研究所菌种保藏中心(上海，下属于中国科学院)，并传代少于6个月，使用RPMI1640培养基(已添加了10％胎牛血清和1×抗生素/抗真菌剂)，置于5％CO₂、37℃的恒温培养箱中进行培养)。在转染之前将293T细胞接种于6孔培养板上，每孔大约1ⅹ10⁶个细胞。待细胞达到70％～80％融合，即可进行细胞转染。具体实验步骤如下：将12.5μg包装混合质粒稀释于250μL无血清无双抗的RPMI1640培养基中，轻轻混匀，室温孵育5min。同样将9μL脂质体转染剂稀释于250μL无血清无双抗的RPMI1640培养基中，轻轻混匀，室温孵育5min。将混匀的质粒溶液和脂质体溶液轻轻混匀，室温孵育20min。将6孔板中待转染细胞的培养基置换为无血清无双抗RPMI1640培养基，加入质粒-脂质体转染混合物，前后轻轻摇匀，置于37℃恒温箱中培养，6～8h后更换为完全培养基继续培养。转染48～72h后，收集含慢病毒的细胞上清。2000rpm离心20min，去除细胞沉淀，用孔径0.45μm的细胞过滤器过滤掉细胞碎片获得高浓度的病毒浓缩液，-80℃贮存备用。

方法5：细胞分组与转染

将收集的处于对数期的SMMC7721细胞分为4组：Blank组(不做任何处理)，LINC01419-cDNA组(转染LINC01419-cDNA慢病毒)，LINC01419-shRNA组(转染LINC01419-shRNA慢病毒)，NC组(Negative Control，NC)(转染阴性对照病毒载体)。

慢病毒转染步骤如下：将SMMC7721细胞接种于6孔板中，待细胞融合度达到70～80％后，用不同滴度的LINC01419-cDNA慢病毒，LINC01419-shRNA慢病毒和空载体病毒分别感染细胞，24h后每孔更换成新鲜的含有500μg/ml G418(法国Gibco公司)的筛选培养基。根据细胞生长状态，每2～3天更换一次筛选培养基。大约感染12～15天，以后每隔4～5天再用含有500μg/ml G418的筛选培养基筛选一次直至筛选出耐药的稳转细胞群。

方法6：裸鼠成瘤实验

BALA/C裸鼠，4～6周龄，体重17-21克，雌雄不限，40，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，SPF环境下饲养,将裸鼠随机分成4组，每组4只。所有动物实验均按照国家研究院动物健康护理指南的原则和程序进行，下述实验动物均用于医学研究，所有操作均经我院动物委员会讨论批准后进行。

建立裸鼠皮下种植瘤模型，首先构建稳定转染的细胞系并制作成细胞悬液，然后分别将相同数目(10⁶个)的不同处理组SMMC7721细胞溶解于200μL生理盐水中皮下注射于裸小鼠背上，每组接种4只，定期观察并记录肿瘤形成和生长情况，以研究长链非编码RNALINC01419对肿瘤发生和生长的影响。当肿瘤明显可见时，每两天用游标卡尺测量肿瘤的两个最大边长，用公式LⅹW²ⅹ0.5(L为长度，W为宽度)来计算肿瘤的体积，绘制肿瘤生长曲线。建立裸鼠原位肝脏种植瘤模型，在皮下肿瘤直径长至10mm左右时注射麻醉法处死裸鼠，取肿瘤组织，切成约1mm³小块待用，30g/L硫酸戊巴比妥钠腹腔注射法麻醉裸鼠，左肋缘下行1-2cm切口进入腹腔，暴露肝左叶，将上述肝组织植入肝内，每组3只，每只3块瘤组织，逐层缝合腹壁，无菌饲养，接种42天后处死裸鼠，观察肝脏肿瘤组织侵犯周围器官、组织情况，切除所有肺组织行石蜡包埋，双肺蜡块取5个冠状切面，每个切面连续切5张，每张厚4-5μm，每个切面之间相距0.8mm，HE染色在镜下进行肺转移结节计数，比较各组肺转移结节数目，SP法行AFP免疫组化染色对转移灶定性观察。

实施例1：lncRNA LINC01419是参与HCC病理进程的长链非编码RNA

通过对HCC相关芯片表达谱数据(GSE40367和GSE45267)进行分析发现，lncRNALINC01419是HCC中表达最显著的上调长链非编码RNA(图2A和图2B)；TCGA数据库进一步确定了LINC01419在HCC中高表达，并跟预后相关(图2C和图2D)；故选择LINC01419作为本研究的长链非编码RNA。

lncATLAS网站预测lncRNALINC01419亚细胞定位于细胞核(图2E)，通过qRT-PCR检测发现，主要位于细胞质的GAPDH的mRNA基本上都存在于细胞质组分中，主要存在于细胞核的U6基本上都存在于细胞核组分中，说明细胞核与细胞质已充分分离，长链非编码RNALINC01419的检测结果与U6趋势一致，80％以上存在于细胞核内(图2F)，提示长链非编码RNA LINC01419主要在细胞核内起作用，与lncATLAS网站预测结果一致。

实施例2：LINC01419在肝细胞癌中高表达

qRT-PCR分别检测HCC组织及癌旁组织中lncRNA LINC01419表达水平发现,lncRNALINC01419在HCC组织中的表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05)，具体见图3A。

qRT-PCR分别检测正常人肝细胞和SMMC7721细胞中lncRNALINC01419表达水平发现，lncRNALINC01419在HCC(SMMC7721)细胞显著高于正常人肝细胞(P<0.05)(图3B)；另外，从从图3B中可以看出，LINC01419-shRNA组能够显著下调lncRNA LINC01419的表达。其中，Blank组(不做任何处理)，LINC01419-cDNA组(转染LINC01419-cDNA慢病毒)，LINC01419-shRNA组(转染LINC01419-shRNA慢病毒)，NC组(Negative Control，NC)(转染阴性对照病毒载体)，具体实验方法参见本发明的方法4和方法5。

实施例3：裸鼠成瘤实验

实验过程中，小鼠均无意外死亡，皮下成瘤小鼠肿瘤生长迅速，肿瘤表面可见红色粗大的肿瘤血管，分离瘤块时发现，肿瘤组织呈鱼肉状，质脆且易出血，瘤块中间可见坏死组织，肿瘤与深部组织呈浸润生长；原位成瘤小鼠42天后衰竭，处死裸鼠并打开腹腔后发现，肝脏表面有凹凸不平结节状、血管丰富的瘤块，肿瘤侵犯大部分肝脏，并侵犯肺部、肠系膜等其他部位，巨检可见双肺呈暗红色，镜检可见转移灶分布于周边肺，以间质内微转移瘤和血管内瘤栓为主，灶内癌细胞体积明显增大，核大浆少，多见病理性核分裂像。通过检测皮下成瘤与原位成瘤小鼠相关指标，结果如图4所示，沉默lncRNA LINC01419可以显著抑制HCC细胞在裸鼠体内的生长及转移(P<0.05)，而高表达lncRNA LINC01419可以显著促进HCC细胞在裸鼠体内的生长及转移(P<0.05)。上述结果说明，沉默lncRNA LINC01419(LINC01419-shRNA组)抑制HCC细胞在裸鼠体内的生长与转移。

上述说明并非对发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

<110> 湖南省科域生物医药科技有限公司

<120> LINC01419作为诊断和治疗肝细胞癌标志物的应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaactccga acacatctg 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttctcctgct ggttgatt 18

<210> 3

<211> 66

<212> DNA

<213> LINC01419-shRNA序列

<400> 3

gatccgcgga cacaatttct tggctttcaa gagaagccaa gaaattgtgt ccgtttttta 60

cgcgtg 66

<210> 4

<211> 6735

<212> DNA

<213> LINC01694基因的核苷酸序列

<400> 4

ctcattttct cttgctgccg ccatgattct gaggcctccc cagccatgtg gaactgcaat 60

actttaaaga cacaaagtct caacaaccat cttccgcttg acgagacaga tcattctaat 120

ttgagcagaa gctactatgt cctgcccttt gaacgcggcg gcccggacag ctgacaagga 180

cacactgtgt atttccattc caattctggg agtgctctga ggcctctggg ggagaaggac 240

ccatgaaata ttcaaaacat aagtgaataa aatatctagg tgctagatat gggccaggaa 300

gagccctcgg ccctgcaaag tgtgtgtgat ggtgagaagc taccggaaga gatggtccct 360

gtgcttggtt cattccttgg acatttatca agctgacgaa tgtagcagag gtgcttcagt 420

cggctgtaat tccacgggtg gagtgctggc tggagagtta cctggggctg tcacactgca 480

tgggctccgg gacactgtgg ctgcccttat gtggtgtccc cggagggccc tgcaggtgtc 540

acaccgctgc tccacactgc cacctgctgt cagcatctgt gcaacgtatc caggtctctg 600

ggggctagaa tgaaaaacat gcatctcgta accaatgaaa tcgggcttgt cctgaagacc 660

tcgtgcattc atccattctc acactgctat aaagacatac ctaagactgg gcacttcatg 720

aagaaaagag gtttaattgg ctcacggttc tgcaggcttt acaggaagca tagcagcttc 780

cacttctagg gaggcctcag gaaacttata gtcatggtgg aaggtgaagg cgggacaagg 840

cgtctcacat gggagcagta gagagagaaa aagagggggt gccgcacact ttgaaacaac 900

cagatctaac gataactcac tatcatgaga acagcaccaa gaagctggcg ctaacccact 960

tgtgaaggac caccaccatg atccaatccc ttcccaccag gtcccacttc caacgttggg 1020

gattacactt cacggtgaga tttgtgcaga gaggacacag gtccaaacca tatcacctgc 1080

tgtcttttta tttatttatt tatttattta tttattgaga cagagttgct tcgtcaccca 1140

ggctggagtg cagtggcgtg atctcggctc actgcaagct ccgcctcccg ggttcgcacc 1200

attctcctgc ctcagcctcc cgagtagctg ggacaacagg cgcctgccac cacacccagc 1260

taattttttg tatttttagt agagacgggg tttcaccatg ttagccagga tggtctccat 1320

ctcctgacct cgtgatccgc ccgcctcggc cttccaaagt gctgggatta cagacatgag 1380

ccactgcgcc tggcctattg atttattttt gagatggggt ttcgctcttg tggcccaggc 1440

tggagtgcaa tggcacgatc tcggctcact gcaacctccg cctcccaagt tcaagtgatt 1500

ctcctgtctc agtctcccaa gtagctggga ttacaggcat gcgccaccat gcccagctaa 1560

ttttgtattt ttagtagaga cagggtttct ccatgttgtt caggctggtc tcgagctccc 1620

gaccttaggt gatccacccg cctcagcctc ccaaagtgct gggattacag gtgtgagcca 1680

ctgcgccttg cccacctgct gtctttttgc atcttccaag tagacatcaa agattggttt 1740

gctatcagtg tcacttctat aatccgtggt tctatatgaa gaaaacaaaa tcccaattgg 1800

ggaaaatgaa cccatggcat tttgtttctt actctggagc cgtttctggc agtttgccag 1860

caagcacaca gacccacagg acaagcttgg ttcatggcct ggagtgctgg tcttgctcat 1920

ggacacgcaa tcagaagcag tattttgata cccctgtgct catggcaagg agctgcgtgg 1980

gctttcaggg tggaaccagg gcttcaggga accccttcat cccgacaggc atcacccaga 2040

gcacacccag agcagcctgc agcggcgtgg aaggggcttg cactggcccc aaggtgcagg 2100

ggagccctgc ctgcctgtct cctgctaggc ttgcctgggc tcccgcctac agaccatgag 2160

aattcttcta gcatgggaag agagtctgac caaagtgaca acagccatcc cctgactgcc 2220

cagcactgtt cacttcttcc cagatactcc taccagacca ggtcagccct tcttttactg 2280

gggggccaga aaggtccccc caatccagtc caggactcca gatgatgccc atttctctgc 2340

cagtcccagc aatctccctt ctcagcatct ggcatcctgg gatgtaccct aaagttcact 2400

ggctcagagc accctaacta tggctgcggc gaggggggag ggcgggatca ggtcggcgtg 2460

ctgcacatgg gtcctggggc gggaacagta ttctggctat gctcctgcag ctgggccctc 2520

acaaggggca gcgtctgcac cctctcaagg ctttgcagat aagggtttat tgaagaggga 2580

ggtgacccac accatcccca ctgagggatc tggttagggg gctcccccca gaatgtaggc 2640

aagagggcag catcttgata gtgagggttg gtcacccggg aaccacagta acgtctgcag 2700

ggaccttccc ccagtggcac gcacttccca gaatgctcac ggtcaccctc agctttcaac 2760

tgtggggacc taacgcgtct cctggtagag tcctcactcc cttggctaaa acttctgaaa 2820

gcagcgaggc cgggctccct ggctaggatg gctctggccc tgagcaggtc atttgcgtca 2880

agtttcacca cccagcaccc tgtgctttcc ccagctggct gcacgctggg cctccgggaa 2940

gccggcaagc ccacctgatt ctggatcctc cctccgagcc tgggtgacgc tgtcatgaaa 3000

gaagctgcca gaagcccaca gcagggcagt taggcaggga atgcgagtcc gtgtccagag 3060

caagggtgac tccagtccct ccaggacgga gaagccagtg cgacccactg tcccaggccc 3120

ccatggccct ggctgctcct ggcggacaga ggggcatgtt gcccacgcta tgccttgttc 3180

cctctgggct gccatggccc ctggaacaat tcctgggaca gcctggggag gaggctgaca 3240

atcatgcaag gtggatgcag cttggcccct cccagtcacc tatgtgttcc ttcctcagac 3300

tcccgtgggg ctggagtcat gattttgctc cccatcccat ctgtaggccg cccctgcctg 3360

gatgagacca cgctgacact cacacgcctc cctccaggag gaccttgcct ccactttctc 3420

cagggccacc tgtgatgcac caggatccat cctgtaatcc cagctacttg ggaggctgag 3480

gcaggagaat cacttgaacc tgggaggcga gaggcagagg ttgcagtaat aagccaagat 3540

tggaccacag cactccagcc ttagcaatag agagagactt cgtttcaaaa aaaaaaacct 3600

atgcaaatcc caattacaca cgctgagtgg catgttcagc tgagccacct gcccaaggcg 3660

ggaccctctc ttcctccgtc tgcaggtcac atggagatgg cagagcacct gcacgtgcac 3720

ctggagaccc tctcaagcct cgtctcctgg cactgcctcc tcctgacatt ggaggctgct 3780

gggagtacca gcctgtaacc ctcgttgtga tggcacctgc ctggtgctat aattcagaca 3840

tttgtctccc caacctcatg ttgaaatttg aaccccaatg ttggaggtgg gacctgacag 3900

aaggtgccta ggacatgaga gcttggtgct gtcctcgcgg tcatgaatgc attcatgctt 3960

tattccttct cacaagaact gattgttaaa aacgcttggc acctcctctg cccactctct 4020

cttgctccct ctctcaccat atggtctgca tgcacctgct cccatcgcct tctgccatga 4080

gtggacactt cctgaggcct caccagaagc agatgctggc accatgcttc ttgtacagcc 4140

tgcagaactg tgtgccaaat aaacctcttt tctttataaa tcacccaacc tcccaacaca 4200

aatcgtccaa gacacctggt gtcccccaaa cagctccttg gtcaacctca gattcaggac 4260

caatctgaga gctgtttccg tgaagggagg agaggagagt tgttagctga agaggacatg 4320

ggtttgctca agatccctgc attctccact atggctctct gattctcctc tctgagcttg 4380

tggcagacac ggcagatacc tcaagcatgg ctgggcagca gatgctggct gagaggaagt 4440

ggctgagccc aacttgtccc tcctcagacc ccagaattgc caagaccaga gtcctccata 4500

aagacctcac aaacaggcaa tcactgcatg cttttccaca attaaatatg tgcacatctt 4560

aaggaaagga cctaacatcc ttcagcagta tctctttcca gggcagggag tgactgcgtc 4620

agcagcctca agtacctgga aactgtccac atcaggcaaa gtggtgggag agacacagat 4680

gtttccacca gcatttaaaa gaaaggaaag aaaattattg acaagaagcc tccatggtgg 4740

atcaggcttc aacgttttga tggacctggc ctctcttgga agcaaatccc tggatggagc 4800

ccatgtctct ttgggccccc aaaggcagcc tgaccttgac acggagtgca aagcagactc 4860

agctgcttgt gtttaatggg gattcgcata gttggttttt ggttttgttt ttgttttgtt 4920

ttgttttttg tttttttttg agatggagtc ttgctgtgtt gcctaggctg gaatgcagta 4980

gcgtgatctc tgctcactgc ctgcaacctc tgcctcccca gttcaagtga ttctcttgct 5040

tcagcctccc gagtagctgg gatcacaggc acgtgccacc atgccctgct aatttttgta 5100

tttttagtgg agatggggtt tcaccatgtt ggccaggcag gtctcgaact cctgacctca 5160

agtgatcctc ccaccgcagc ctcgaacaat gctgggaaaa caggcgtgag ccactgtacc 5220

cagctgggat ttgtgtagtt ttgtccgtgc tgttatatgg tgcactgggc agagccagcc 5280

agtcccgcct cgagccccgt tactttggtc tctgatgcag atgttgtgtg gcagtggaac 5340

ggcctcatca gccccacctg ggacctggca ggggatgggt ctgagcagcc ctagaggagg 5400

gtccccaggg cccacagcaa gggtgacatg acccacacca tccccactga tgggacccac 5460

acagtgaacc tcctcccaca ccccctcccc agccggccac ttggaccaga gagacgttat 5520

caaagtgccc tctcagaaac gtcgccttca tccaccatcc tcttttaacc cactgggctt 5580

ggtcaggaag ccgttggtca gcagggggca ggtggggttg gggggcaccc ttatgtcctg 5640

tgagacccta gcaggcactc cagcttggga tttccagagg ctctgaggtg gctaagaaca 5700

ggatgacaaa tcgactccaa ggttcaactc ttcccctcat ggacactcct ccctatgctg 5760

ttctcatctc aaattttacc tgtttttctc aaagtagctc accagaggtt ggaaatgaga 5820

tcaaaggtca gcgtggatct caacattatt attcatcagg gaaatgcaaa tcacaccaga 5880

gatgagacgc catgacactc acactagcag ggctaaaatt taaaagtcta gctggggctg 5940

ggcatggtgg ctcatgcctg tgatcccagc actttaggag gccaaggcag gaggattgct 6000

tgaagcccag gagctcaaga ccagccccgg caccaaagca aaactgtacc tctacaagaa 6060

tttttttttt aattggctag atgtggtaca catgcctgtg gtcacagcta cttgggaggc 6120

tgaggaggga ggatcacttg agtccacgag ttcgaggctt ggtgaactgt gatcatgcca 6180

ctgcactcca gtctgggcaa cagagtggga cctcatctct taaaaataaa gaaaaggaaa 6240

ggagtggaaa ggagaggaga ggaagaaact tgatatttca attattttaa atttgttgag 6300

acttgttttg tggcctaaca tatggtctat cctggagaat gttccatgtg ctgaggaaaa 6360

gaatgtatat tctgtacagc tgttggatgg aatggtctgt aaatgtctgt taggtccatt 6420

tggtctaaac catagtttaa atccaatgct tatttgttaa ttttctatct gatgatatgt 6480

tgaaggctga cagtgtgatg ttgaagaccc caactgttac tatattagag tctctctctt 6540

tagatctaat aatattcact ttatatatct ggatgatttg gtgttgggtg catatatatt 6600

tacaattgtt atatcttctt gctgagtcag tccctttatc gttatataat gaccttcatc 6660

tctttgtagt ttttgactta aagtctgttt tatctgatag aaatatagct actatcgctc 6720

aaaaaaaaaa aaaaa 6735

<210> 5

<211> 1521

<212> DNA

<213> LINC01419 cDNA序列

<400> 5

cttccacatc gtggaagctt tgttctttcg ctctttgcaa taaatcttgc tactgctcac 60

tctttgggtc cacgctgctt ttatgagctg taacactcac cgcgaagatc tgcagcttca 120

ctcccgagcc agcgagacca cgaacccacc agaaggaaga aactccgaac acatctgaac 180

atcagaaggg cagactccag acacgccacc ttaagagctg taacactcac cgcgagggtc 240

cacggcttca ttcttgaagt cagtgagacc aagaacccac caattccgga cacaatttct 300

tggctctcag tggcttccat ggaagttctg caatcaacca gcaggagaac cgcttaaacc 360

caggaggcgg aggttgcagt gagccaagta tgcatcactg cactccagcc tggaagacag 420

agtgagaccc tgtctcaaca aaataaatta aaataaaaaa taatatattt ttctaactat 480

catccctttt ccaaatcagg aattcccctt aagttttcct caatttccat ggcaatatct 540

ttgcatagat tcattaagaa tttgtccttt ttaaataaaa aatataaagg gaactattca 600

ttaggcaaca aatgccttgt ctgaaatatc acatttgaga atgctgctca tttaatcaga 660

aaggtacgct actttaaaga actgaggtcc actttctgga gccaaaaact cataaatccc 720

tctcagaaaa acctgatttg ctttgtaggg tctcaggttt agagatgctg aaaaagatat 780

tttcgttgca gacaaaggac ctcagagtat ttggagaact ttgagaagag aggaattctc 840

ccaaatgtat aggtgtcaca ggtaaaatac agtcgagaga ttttcttgga ctttaattcc 900

ttaaatcagg atagcaaata ataggggctt ttacaaattc aatctgtttc cttacaaaaa 960

ttttcagcaa agtaatttca gcaaattaat tttcagcaaa gtaaatgtaa gaagacttat 1020

gtgaaaaatt aacattctcc atgtatctat gaagccaaac ctaataaaac cagctttaat 1080

ttgtgctcaa gaatattatt tcactgagtt ttcttaaatc acaaagggga gactgttatg 1140

aaaactgata taaaataaaa aaaacaagga agaaaagtct actagatgtc tctaatggaa 1200

gactgcattt ttagaacata tccttatagg cgattctagc ctttctctgc tatttggctc 1260

tcacactctt taccgtgcag ataattcaca gcaatgcaaa agaatcctca tctatagcca 1320

tgaaaataag ttatttgtta tttctggtaa aggttcaatt gacctcccct tccaggatga 1380

agaaagtttc atgtctttct gcatcatttc aactattcct tactacatat aaatctgcac 1440

ttgttaactt ctattttgaa ttgattgtgg catctgcctg cttccccatt aaaactgaat 1500

aaaatcttta acacataaaa a 1521

Claims (11)

1.一种长链非编码RNA，所述长链非编码RNA为LINC01419，其特征在于，检测LINC01419表达水平的试剂在制备诊断肝细胞癌的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为特异性扩增LINC01419的引物。

3.一种诊断早期肝细胞癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测LINC01419表达水平的试剂。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂为特异性扩增LINC01419的引物。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增LINC01419的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

6.一种LINC01419基因的用途，其特征在于，用于制备治疗肝细胞癌、和/或肝细胞癌浸润、和/或肝细胞癌转移的药物组合物。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述药物组合物包括LINC01419基因的抑制剂。

8.一种治疗肝细胞癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括LINC01419基因的抑制剂。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述抑制剂为LINC01419的LINC01419-shRNA。

10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述LINC01419-shRNA的序列如SEQ IDNO.3所示。

11.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述的LINC01419-shRNA由慢病毒包载。

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