KR20130116433A

KR20130116433A - 췌장암 진단용 마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20130116433A
Application number: KR1020120027653A
Authority: KR
Inventors: 김영수; 장진영; 김경곤; 유지영; 강미주
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2012-03-19
Filing date: 2012-03-19
Publication date: 2013-10-24
Also published as: KR101384211B1

Abstract

알파-1-안티키모트립신, 알파-1-안티트립신, 알파-2-마크로글로불린, 세룰로플라스민, 보체인자 B 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질을 포함하는 췌장암 진단용 마커가 개시된다. 본 발명에 의해 췌장암 환자에서 특이적으로 과량 발현되거나 적게 발현되는 것으로 밝혀진 단백질들은 췌장암을 진단할 수 있는 바이오 마커로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

췌장암 진단용 마커 및 이의 용도 {Markers for diagnosing pancreatic cancer and its use}

본 발명은 췌장암 진단 분야에 관한 것으로, 구체적으로 췌장암의 진단 예후가 가능한 바이오 마커에 관한 것이다.

췌장암은 다른 암에 비해 치료 성적이 극히 불량하여 유병율이 종양 사망률에 가까울 정도로 매우 치명적인 암으로 생존기간이 14개월에 불과하다. 2008년 국가암등록통계에 의하면 췌장암은 전체 암종 중 발생분율 9위 (10만명당 8.7명 발생)를 차지한 반면, 사망분율 5위를 차지하고 있다. 우리나라 전체 췌장암 환자의 5년 생존율은 평균 7.6%로서, 종양 의학의 지속적인 발전에 힘입어 전체 암 환자의 생존율은 꾸준히 증가추세를 보임에도 불구하고, 다른 암과 다르게 췌장암의 생존율은 지난 20여년간 거의 향상되지 않았다.

국내 췌장암 치료 성적을 좌우하는 가장 중요한 인자는 조기진단 여부이다. 국내 주요 병원의 자료를 통합 분석하면, 1기에서는 75% (stage IA) 또는 40% (stage IB)의 5년 생존율을 보이고 있는 바 췌장암의 경우에는 조기 진단이 더더욱 요구된다고 할 수 있다(도 1). 그럼에도 불구하고 조기 진단이 어려워 췌장암 진단 당시 이미 병기가 상당히 진행된 경우가 많아 수술이 가능한 환자는 20%에 불과한 실정이며, 수술 이후에도 재발과 전이가 빈번하나 뚜렷한 생존율의 향상이 보고된 치료제는 없는 상황이다.

한국 공개특허 2009-0003308는 개체의 혈액 시료에서 REG4 단백질의 발현량을 검출하여 췌장암을 진단하는 방법을 개시하고 있으며, 한국 공개특허 2012-0009781은 개체의 췌장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 개체로부터 분리한 암조직 중 XIST RNA의 발현량을 측정하는 분석방법을, 한국공개특허 2007-0119250은 정상 인간의 췌장 조직과 비교하여 인간 췌장암 조직에서 다르게 발현된 신규 유전자 LBFL313 패밀리를 개시하고 있다. 또한, 미국 공개특허 US 2011/0294136은 케라틴 8 단백질 등의 바이오마커들을 이용한 췌장암 진단방법을 개시하고 있다.

그러나 이들 특허 문헌에 개시되거나 암시된 췌장암 진단 관련 물질들은 단독 마커를 사용하거나, 본 출원의 바이오마커와는 그 종류가 상이하며, 조기 진단 및 정확한 진단을 통한 췌장암의 치료율을 향상시키기 위해 췌장암을 조기에 또는 정확하게 진단할 수 있는 마커의 개발이 무엇보다 시급하다.

이와 같은 배경에서 본 발명은 췌장암 환자의 암 조직 및 정상 조직 부위에 대하여 iTRAQ(Isobaric tags for relative and absolute quantitation) 분석 및 MRM (Mutiple Reaction Monitoring)을 수행하여 암 환자 및 정상 환자에서 발현 차이를 보이는 단백질들을 규명하여 완성한 것으로, 본원은 이들 단백질들을 그 특이성과 민감도에 따라 하나 이상 조합하여 췌장암을 조기 진단할 수 있는 진단 마커 및 그 용도를 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 알파-1-안티키모트립신, 알파-1-안티트립신, 알파-2-마크로글로불린, 세룰로플라스민(ceruloplasmin), 보체 인자 B(complement factor B), 보체 C4A(complement C4A), 보체 C4 감마사슬(complement C4 gamma chain), 보체 C9(complement C9), 하프토글로빈(haptoglobin), 헤모펙신(hemopexin), 키니노젠(kininogen), 혈장 프로테아제 C1 억제제(plasma protease C1 inhibitor), 티록신 결합 글로불린(thyroxine binding globulin), 트랜스페린(transferrin), 비트로넥틴(vitronectin), 아연 알파-2 당단백질(zinc alpha-2-glycoprotein), 아포리포단백질 A1(apolipoprotein A1), 아포리포단백질 A2(apolipoprotein A2), 아포리포단백질 A4(apolipoprotein A4), 갤솔린(gelsolin), 인터-알파-트립신 억제자 중쇄 H1(inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1) 및 색소 상피 유도 인자(pigment epithelium derived factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질을 포함하는 췌장암 진단용 마커를 제공한다. 상기 단백질들은 췌장암 환자 및 정상인으로부터 얻은 생물학적 시료를 iTRAQ 및 MRM으로 분석한 결과, 단백질 발현이 유의하게 차이가 나는 것으로 확인된 것들이다.

즉, 본 발명에서는 췌장암 환자의 암 조직 및 정상 조직 부위에 대하여 iTRAQ (Isobaric tags for relative and absolute quantitation) 실험을 통한 정성 및 정량 분석을 실시하였다. 상기 iTRAQ 분석 결과, 췌장암 조직과 정상 조직에서 440개의 단백질이 1.5배 이상 발현 차이를 보이며, 그 중 204개의 단백질은 정상 조직에 비해 암 조직에서 발현이 증가하였고, 236개의 단백질은 발현이 감소하였음을 확인하였다. 또한, 혈액을 검체로 하여 MRM (Mutiple Reaction Monitoring)을 수행하여 암 환자 및 정상 환자에서 발현 차이를 보이는 22개 단백질을 확인할 수 있었다.

다른 양태에서 본원은 또한 상기 마커를 특이적으로 검출할 수 있는 시약을 포함하는, 췌장암 진단 키트를 제공한다. 상기 진단 키트의 검출 시약은 상기 마커를 단백질 또는 mRNA 수준에서 검출할 수 할 수 있는 것으로, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 기질, 앱타머, 수용체, 리간드 또는 보조인자, 또는 질량분광분석기 검출용 시약 등을 포함한다. 상기 mRNA 수준에서 검출할 수 있는 시약은 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던블랏에 사용되는 시약을 포함한다. 상기 분석 과정에서 수득한 최종적인 시그널의 세기를 분석하여 즉, 정상 시료와의 시그널 대조를 수행함으로써, 췌장암을 진단할 수 있다.

또한 본원은 췌장암 진단용 키트로서, 본원에 따른 하나 이상의 마커를 검출하기 위한 시약, 장치 및 알고리즘이 내장된 컴퓨터를 포함하며, 상기 알고리즘을 통해 상기 마커의 검출 결과를 췌장암의 진단 또는 예후와 연관시키는 것인 췌장암 진단용키트를 제공한다.

아울러, 본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본원은 췌장암 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 췌장암 검사 대상자로부터 마커를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 대상자의 검체에서 알파-1-안티키모트립신, 알파-1-안티트립신, 알파-2-마크로글로불린, 세룰로플라스민(ceruloplasmin), 보체 인자 B(complement factor B), 보체 C4A(complement C4A), 보체 C4 감마사슬(complement C4 gamma chain), 보체 C9(complement C9), 하프토글로빈(haptoglobin), 헤모펙신(hemopexin), 키니노젠(kininogen), 혈장 프로테아제 C1 억제제(plasma protease C1 inhibitor), 티록신 결합 글로불린(thyroxine binding globulin), 트랜스페린(transferrin), 비트로넥틴(vitronectin), 아연 알파-2 당단백질(zinc alpha-2-glycoprotein), 아포리포단백질 A1(apolipoprotein A1), 아포리포단백질 A2(apolipoprotein A2), 아포리포단백질 A4(apolipoprotein A4), 갤솔린(gelsolin), 인터-알파-트립신 억제자 중쇄 H1(inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1) 및 색소 상피 유도 인자(pigment epithelium derived factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커의 존재 또는 양을 검출하는 단계; 및 상기 하나 이상의 마커의 존재 또는 양을 상기 환자의 췌장암의 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함한다.

본 발명에 의해 췌장암 환자/환부에서 특이적으로 과량 발현되거나 적게 발현되는 것으로 밝혀진 단백질들은 췌장암을 진단하거나 예측할 수 있는 바이오 마커로서 유용하게 사용될 수 있으며, 특히 조합으로 사용되어 진단 및 예후의 정확도가 향상될 수 있다.

도 1은 국내 췌장암 환자의 병기에 따른 생존율(장진영 외. 한국간단췌외과학회 2004; 8:85-91)을 나타낸 그래프이다 (1기에서는 75% (stage IA) 또는 40% (stage IB)의 5년 생존율을 보이고 있음).
도 2는 본 발명에서 MRM을 수행하는 개략적인 공정을 보여주는 처리도이다.
도 3은 MIDAS workflow program을 사용하여 트랜지션을 선정하는 과정을 보여주는 캡쳐 화면이다.
도 4는 6명의 췌장암 환자의 암조직 및 정상 조직 부위에 대하여 3번의 iTRAQ 실험을 수행하여 정성 및 정량 분석을 수행하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 5는 30명의 췌장암 환자 및 20명의 정상 대조군의 혈청 샘플로부터 펩타이드를 분리하여 MRM 분석을 진행하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 6a 내지 6v는 MRM 분석에서 발현 차이를 보인 22개 각 단백질들의 ROC (Receiver Operating Characteristic) 커브와 인터랙티브 플롯 (Interactive plot)을 나타낸 그래프이다.
도 7a 내지 도 7e는 본원의 일 실시예에 따른 마커 조합에 대한 ROC 커브를 보체 C9의 커브와 비교하여 나타낸 그래프이다. 7a는 보체 C9와 알파-1 안티키모트립신의 조합으로 AUC (area under curve) 합은 0.923이고, 7b는 보체 C9, 알파-1 안티키모트립, 보체 C4A의 조합으로 AUC 합이 0.933이고, 7c는 보체 C9, 알파-1 안티키모트립신, 보체 C4A 및 보체 인자 B의 조합으로 AUC 합이 0.935이고, 7d는 보체 C9, 알파-1 안티키모트립신, 보체 C4A, 보체 인자 B 및 알파-1 안티트립신의 조합으로 AUC 합이 0.932이고, 7e는 보체 C9, 알파-1 안티키모트립신, 보체 C4A, 보체 인자 B, 알파-1 안티트립 및 아연 알파-2 당단백질의 조합으로 AUC 합이 0.938을 나타낸다.
도 8a 내지 도 8d는 본원의 일 실시예에 따른 마커 조합에 대한 ROC 커브를 보체 C9의 커브와 비교하여 나타낸 그래프이다. 8a는 알파-1-안티트립신, 하프토글로빈, 헤모펙신, 트랜스페린, 아연 알파-2 당단백질 및 아포리포단백질 A4의 조합이고, 8b는 보체 C9, 알파-1-안티키모트립신, 보체 C4A, 보체 인자 B, 알파-1-안티트립신, 아연 알파-2 당단백질 및 갤솔린의 조합이고, 8c는 알파-1-안티키모트립신, 보체 C4A, 보체 인자 B, 알파-1-안티트립신, 아연 알파-2 당단백질 및 갤솔린의 조합이고, 8d는 보체 C4A, 보체 인자 B, 알파-1-안티트립신, 아연 알파-2 당단백질, 갤솔린 및 인터-알파-트립신 억제자 중쇄 H1의 조합이며, 상기 각 조합에 포함된 각 마커의 AUC 합은 1이다.

본 발명에서 용어 "생물학적 시료" 또는 "검체"는 인체나 포유동물로부터 얻어지는 모든 고형 또는 액상의 시료, 예컨대, 특정 장기 유래의 조직, 오줌, 타액, 전혈, 혈장 또는 혈청 시료를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 마커 단백질은 조직 또는 혈액 시료에 포함되어 있다.

본 발명의 명세서에서 "췌장암"은 악성종양인 췌관 선암종(pancreatic ductal adenocarcinoma), 선방세포 암종(acinar cell carcinoma), 신경 내분비 종양(neuroendocrine tumor)과 낭종성 양성종양인 장액성 낭성 종양(serous cystadenoma), 점액성 낭성 종양((mucinous cystic neoplasm), 췌관 내 유두상 점액 종양(intraductal papillary mucinous neoplasm, IPMN),고형 가유두상 종양(solid pseudopapillary tumor)을 포함하는 것이며, 또한 1기, 2기 등과 같이 분류되는 암의 진행단계에 따른 췌장암을 포함한다.

본 발명의 췌장암 마커는 췌장암의 발병 및 진행에 대한 지표가 될 수 있으며, 췌장암의 발병, 질환의 진행, 질환의 진단 또는 예후에 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 마커 단백질은 췌장암 진단용 조성물 또는 키트를 이용하여 췌장암 진단에 필요한 정보를 제공 방법에 사용될 수 있다.

본 발명의 명세서에서 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체 즉 검사 대상자의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본 발명에서 용어 "진단용 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 췌장암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상세포에 비하여 췌장암을 가진 조직이나 부위에서 증가 또는 감소 양상을 보이는 단백질 또는 핵산, 지질 , 당지질, 당단백질 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서, 상기 췌장암 진단 마커는 알파-1-안티키모트립신, 알파-1-안티트립신, 알파-2-마크로글로불린, 세룰로플라스민(ceruloplasmin), 보체 인자 B(complement factor B), 보체 C4A(complement C4A), 보체 C4 감마사슬(complement C4 gamma chain), 보체 C9(complement C9), 하프토글로빈(haptoglobin), 헤모펙신(hemopexin), 키니노젠(kininogen), 혈장 프로테아제 C1 억제제(plasma protease C1 inhibitor), 티록신 결합 글로불린(thyroxine binding globulin), 트랜스페린(transferrin), 비트로넥틴(vitronectin), 아연 알파-2 당단백질(zinc alpha-2-glycoprotein), 아포리포단백질 A1(apolipoprotein A1), 아포리포단백질 A2(apolipoprotein A2), 아포리포단백질 A4(apolipoprotein A4), 갤소린(gelsolin), 인터-알파-트립신 억제자 중쇄 H1(inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1) 및 색소 상피 유도 인자(pigment epithelium derived factor)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 것으로서, 췌장암 조직이나 혈액에서 발현이 증감하는 단백질이다. 상기 마커 중, 아포리포단백질 A1(apolipoprotein A1), 아포리포단백질 A2(apolipoprotein A2), 아포리포단백질 A4(apolipoprotein A4), 갤소린(gelsolin), 인터-알파-트립신 억제자 중쇄 H1(inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1) 및 색소 상피 유도 인자(pigment epithelium derived factor)는 췌장암에서 발현이 감소하며, 나머지는 발현이 증가한다. 췌장암 마커로서 상기 단백질 중 어느 하나의 단백질을 이용할 수도 있으나, 바람직하게는 이들 마커들이 둘 이상 포함된 복합 마커인 것이 좋다.

한 구현예에서 특히 상기 마커들은 두 개 이상의 조합으로 사용되어 정상 대조군으로부터 췌장암 환자의 진단 및/또는 예후, 췌장암의 진행 상태를 구분할 수 있는 변별력을 향상시키는 방법으로 활용 될 수 있다. 본원에 따른 마커 중 이러한 용도에 최적의 효과를 나타내는 조합을 선별하여 사용할 수 있으며, 당업자라면 용도에 맞는 적절한 조합을 선택할 수 있을 것이다. 한 구현예에서는 마커의 조합은 상기 마커 중 AUC 값이 0.897로 가장 큰 보체 C9의 AUC 수치와 같거나 큰 수치가 되도록 조합되며, 일례로 이러한 조합은 보체 C9 및 알파-1 안티키모트립신; 보체 C9, 알파-1 안티키모트립신 및 보체 C4A; 보체 C9, 알파-1 안티키모트립신, 보체 C4A 및 보체 인자 B; 보체 C9, 알파-1 안티키모트립신, 보체 C4A, 보체 인자 B 및 알파-1 안티트립신; 및 보체 C9, 알파-1 안티키모트립신, 보체 C4A, 보체 인자 B, 알파-1 안티트립신 및 아연 알파-2 당단백질의 조합을 포함하며, 이들 조합에 대한 ROC 커브는 도 7a 내지 도 7e에 기재되어 있다.

다른 구현예에서는 각 마커의 ROC 커브의 AUC 값이 1이 되도록 조합을 선별할 수 있으며, 일례로 이러한 조합은 알파-1-안티트립신, 하프토글로빈, 헤모펙신, 트랜스페린, 아연 알파-2 당단백질 및 아포리포단백질 A4; 보체 C9, 알파-1-안티키모트립신, 보체 C4A, 보체 인자 B, 알파-1-안티트립신, 아연 알파-2 당단백질 및 갤솔린; 알파-1-안티키모트립신, 보체 C4A, 보체 인자 B, 알파-1-안티트립신, 아연 알파-2 당단백질 및 갤솔린; 보체 C4A, 보체 인자 B, 알파-1-안티트립신, 아연 알파-2 당단백질, 갤솔린 및 인터-알파-트립신 억제자 중쇄 H1; 보체 C9, 알파-1-안티키모트립신, 보체 C4A, 보체 인자 B, 알파-1-안티트립신, 아연 알파-2 당단백질, 갤솔린 및 인터-알파-트립신 억제자 중쇄 H1; 보체 C9, 알파-1-안티키모트립신, 보체 C4A, 보체 인자 B, 알파-1-안티트립신, 아연 알파-2 당단백질, 갤솔린, 인터-알파-트립신 억제자 중쇄 H1 및 혈장 프로테아제 C1 억제제; 보체 C9, 알파-1-안티키모트립신, 보체 C4A, 보체 인자 B, 알파-1-안티트립신, 아연 알파-2 당단백질, 갤솔린, 인터-알파-트립신 억제자 중쇄 H1, 혈장 프로테아제 C1 억제제 및 아포리포단백질 A1; 및 보체 C9, 알파-1-안티키모트립신, 보체 C4A, 보체 인자 B, 알파-1-안티트립신, 아연 알파-2 당단백질, 갤솔린, 인터-알파-트립신 억제자 중쇄 H1, 혈장 프로테아제 C1 억제제, 아포리포단백질 A1, 보체 C4 감마 사슬, 비트로넥틴, 트랜스페린, 하프토글로빈, 세룰로플라스민, 알파-2-마크로글로불린, 아포리포단백질 A4, 티록신 결합 글로불린, 키니노젠, 헤모펙신, 아포리포단백질 A2 및 색소 상피 유도인자의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 이들 중 일부 조합에 대한 ROC 커브는 도 8a 내지 도 8d에 기재되어 있다.

다른 구현예에서, 췌장암 진단용 마커가 사용되는 검체는 췌장암 조직, 전혈, 혈장 또는 혈장 중 하나 이상이다. 다른 구현예에서 본원에 사용되는 검체는, 비교 분석을 위해, 췌장암의 판별이 필요한 검사 대상자의 검체는 물론, 정상 대조군, 특정 유형의 췌장암 대조군 유래의 검체가 또한 사용될 수 있다.

본원의 일 실시예에 따르면, 본원의 마커는 정상 대조군에 비해 췌장암 2기 환자군의 혈액에서 증가 또는 감소하는 양상으로 판별되었으므로 정상 대조군에 대하여 췌장암의 진단 및 예후에 유용하게 사용될 수 있으며, 특히 분석 시료의 특성상 정상 대조군에 대해 췌장암 2기 또는 3기의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 각 마커의 단백질은 공지된 것으로 예를 들면 상기 각 마커의 서열은 인간 유래의 서열로 예를 들면 표 4에 기재된 각 DB번호의 서열을 들 수 있으나, 이로 한정하는 것은 아니며, 이의 기능적 동등체를 포함하는 것이다.

본 발명의 마커는 단백질 또는 mRNA 수준에서 검출될 수 있다. 단백질 또는 mRNA 수준의 검출 방법은 공지된 것으로서, 예를 들면 전자는 항원-항체반응, 상기 마커에 특이적으로 결합하는 기질, 핵산 또는 펩타이드 앱타머, 상기 마커와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자와의 반응을 통해 검출될 수 있거나, 또는 질량분광분석기를 이용할 수 있다. 상기 본원의 마커와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)과 함께 사용될 수 있다.

mRNA 수준에서의 검출 및 발현량은 역전사 중합효소연쇄반응/중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 또는 노던블랏 등을 이용한 방식으로 검출될 수 있다. 본원에서 검출이란, 정량 및 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 발현량 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 것 방법을 선택할 수 있을 것이다.

한 구현예에서 본 발명의 췌장암 마커에 특이적으로 결합하는 항체 분자를 이용하여 실시된다.

본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불멸 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석하여 즉, 정상 시료와의 시그널 대조를 수행함으로써, 췌장암을 진단할 수 있다.

역전사 PCR(중합효소연쇄반응)이란, 검체의 RNA를 특히 mRNA를 분리한 후, 이로부터 cDNA를 합성 한 후, 특정 프라이머, 또는 프라이머 및 프로브의 조합을 사용하여, 검체 중의 특정 유전자를 검출하는 것으로, 특정 유전자의 존재/부존재 또는 발현량을 결정할 수 있는 방법이다. 이러한 방법은 예를 들면 (Han, H.; Bearss, D. J.; Browne, L. W.; Calaluce, R.; Nagle, R. B.; Von Hoff, D. D., Identification of differentially expressed genes in pancreatic cancer cells using cDNA microarray. Cancer Res 2002, 62, (10), 2890-6. / Kwang Hyuck Lee, Quatification of DNA as a tumor marker in patients with pancreatic cancer, 대한소화기학회지 2005, 46, 226-32)에 기재되어 있다.

본원에서는 또한 질량분광분석법(Mass spectrometry)를 이용한 마커를 검출할 수 있으며, 검체로부터 단백질을 분리 한 후 예를 들면 본원 실시예에 기재된 방식대로 분석될 수 있으며, 또한 예를 들면 ( Kim, S. J.; Yu, H. G.; Yu, J.; Park, K. S.; Jang, I. J.; Kim, Y., Verification of biomarkers for diabetic retinopathy by multiple reaction monitoring. J Proteome Res 2010, 9, (2), 689-99 / Anderson, L.; Hunter, C. L., Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics 2006, 5, (4), 573-88.)를 참조할 수 있다.

본원의 췌장암 진단마커는 복수개의 마커가 조합으로 사용될 수 있으며, 이 경우, 진단, 예측의 정확도를 향상시키기 위해 알고리즘을 사용하여 분석할 수 있다. 알고리즘에 관하여는 후술한다.

다른 측면에서 본원은 췌장암 진단키트에 관한 것으로, 상기 키트는 알파-1-안티키모트립신, 알파-1-안티트립신, 알파-2-마크로글로불린, 세룰로플라스민(ceruloplasmin), 보체 인자 B(complement factor B), 보체 C4A(complement C4A), 보체 C4 감마사슬(complement C4 gamma chain), 보체 C9(complement C9), 하프토글로빈(haptoglobin), 헤모펙신(hemopexin), 키니노젠(kininogen), 혈장 프로테아제 C1 억제제(plasma protease C1 inhibitor), 티록신 결합 글로불린(thyroxine binding globulin), 트랜스페린(transferrin), 비트로넥틴(vitronectin), 아연 알파-2 당단백질(zinc alpha-2-glycoprotein), 아포리포단백질 A1(apolipoprotein A1), 아포리포단백질 A2(apolipoprotein A2), 아포리포단백질 A4(apolipoprotein A4), 갤솔린(gelsolin), 인터-알파-트립신 억제자 중쇄 H1(inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1) 및 색소 상피 유도 인자(pigment epithelium derived factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 특이적으로 인식할 수 있는 시약을 포함한다. 상기 본원에 따른 키트에 포함되는 마커는 조합으로 사용될 수 있으며, 본원의 일실시예에 따른 마커의 조합과 관련해서는 앞서 언급한 바와 같다.

본원의 방법에서 마커의 존재/부존재 또는 발현양의 검출과 관련해서는 앞서 언급한 바와 같으며, 본원의 마커를 단백질 또는 mRNA 수준에서의 검출에 필요한 시약을 포함할 수 있다. 예를 들면 상기 단백질 수준에서 검출할 수 있는 시약은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 기질, 앱타머, 수용체, 리간드 또는 보조인자 등을 포함할 수 있다. 이러한 시약은 필요한 경우 나노입자 또는 칩에 통합하여 사용할 수 있다. 단백질은 또한 질량분광분석기를 이용하여 검출될 수 있다.

mRNA 수준에서 검출할 수 있는 시약은 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던블랏에 사용되는 시약으로, 예를 들면 각 마커에 특이적인 프라이머, 프로브 등을 포함하는 것이다.

이러한 본원의 마커를 특이적으로 인식하는 물질은 구획이 되어 있는 용기에 개별적으로 분주되어 존재할 수 있으며, 이러한 의미에서 본원은 또한 본원의 마커를 특이적으로 인식할 수 있는 분자를 구획되어 포함하는 장치/기구에 관한 것이다.

본원은 또한 본원의 하나 이상의 마커를 검출하기 위한 시약, 장치 및 알고리즘이 내장된 컴퓨터를 포함하며, 상기 알고리즘을 통해 상기 마커의 검출 결과를 췌장암의 진단 또는 예후와 연관시키는 것인, 췌장암 진단용 키트에 관한 것이다. 상기 연관시키는 단계는 췌장암 검사 대상자, 정상 대조군 또는 특정 유형의 췌장암을 갖는 환자의 상기 하나 이상의 마커의 발현량 수치를 비교하여, 상기 발현량의 차이에 대한 패턴을 도출하도록 상기 알고리즘을 훈련하는 것을 포함한다.

본원의 한 구현예에서 상기 패턴을 도출하는 알고리즘 훈련은 입력값으로 주어지는 상기 마커 발현량을 산출값으로 주어지는 진단 또는 예후 결과와 맵핑하는 알고리즘을 구축하는 단계; 상기 구축된 알고리즘을 실행하여 상기 마커 발현량과 췌장암의 진단 또는 그 부존재를 맵핑하는 단계; 및 상기 구축 실행된 알고리즘의 입력값 및 이에 따른 산출값을 변화시키면서 상기 알고리즘을 수행하여 최적의 알고리즘 맵핑 아키텍쳐가 실현되도록 하는 단계를 포함하며, 상기 최적의 알고리즘 맵핑은 상기 정상 대조군 또는 특정 췌장암을 갖는 환자의 마커 발현량과 상기 췌장암 검사 대상자의 마커 발현량 수치를 이용하여 유의한 차이를 규명하고, 이를 췌장암의 진단 또는 부존재에 이용하는 것이다.

본원에는 공지의 알고리즘이 사용될 수 있는 있으며, 이로 제한하는 것은 아니나, 선형 또는 비선형 회귀 알고리즘; 선행 또는 비선형 classification 알고리즘; ANOVA; 신경망 알고리즘; 유전적 알고리즘; 서포트 벡터 머신 알고리즘; 계층 분석 또는 클러스터링 알고리즘; 결정 트리를 이용한 계층 알고리즘, 또는 Kernel principal components 분석 알고리즘; Markov Blanket 알고리즘; recursive feature elimination 또는 엔트로피-기본 recursive feature elimination algorithms; committee network로 정렬된 복수의 알고리즘; 및 전방 floating search 또는 후방 floating search 알고리즘으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

본원의 키트에 사용되는 검체는 췌장암 조직, 전혈, 혈장 또는 혈장 중 하나 이상의 유래일 수 있으며, 비교 분석을 위해, 췌장암의 판별이 필요한 환자 유래의 검체, 정상 대조군, 또는 췌장암 대조군 유래의 검체가 또한 사용될 수 있다.

본원의 키트는 특히 췌장암의 조기 진단 또는 1기 내지 4기, 특히 2기, 3기의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

다른 양태에서 본원은 췌장암 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 췌장암 검사가 필요한 대상자의 검체로부터 마커를 검출하는 방법으로, 상기 방법은 상기 대상자의 검체에서 알파-1-안티키모트립신, 알파-1-안티트립신, 알파-2-마크로글로불린, 세룰로플라스민(ceruloplasmin), 보체 인자 B(complement factor B), 보체 C4A(complement C4A), 보체 C4 감마사슬(complement C4 gamma chain), 보체 C9(complement C9), 하프토글로빈(haptoglobin), 헤모펙신(hemopexin), 키니노젠(kininogen), 혈장 프로테아제 C1 억제제(plasma protease C1 inhibitor), 티록신 결합 글로불린(thyroxine binding globulin), 트랜스페린(transferrin), 비트로넥틴(vitronectin), 아연 알파-2 당단백질(zinc alpha-2-glycoprotein), 아포리포단백질 A1(apolipoprotein A1), 아포리포단백질 A2(apolipoprotein A2), 아포리포단백질 A4(apolipoprotein A4), 갤솔린(gelsolin), 인터-알파-트립신 억제자 중쇄 H1(inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1) 및 색소 상피 유도 인자(pigment epithelium derived factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 마커의 존재 또는 발현량을 검출하는 단계; 및 상기 하나 이상의 마커의 존재 또는 발현양을 상기 대상자의 췌장암의 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함한다.

본원의 췌장암 진단마커는 복수개의 마커가 조합으로 사용될 수 있으며, 마커의 조합에 관하여는 상술한 바와 같다.

본원의 방법에서 마커의 존재/부존재 또는 발현양의 검출은 단백질 및/또는 mRNA 발현 수준에서 결정될 수 있으며, 이에 관해서는 언급한 바와 같다.

본원의 방법은 췌장암의 진단 또는 예후에 관한 정보를 제공하기 위해, 마커 분석 결과에 추가하여, 환자의 비단백질 임상정보 즉, 마커이외의 임상정보를 추가로 사용할 수 있다. 이러한 비단백질 임상정보란, 예를 들면 환자의 나이, 성별, 체중, 식습관, 체질량, 초음파, 전산화 단층촬영(CT),자기공명영상(MRI), 혈관조영술, 내시경적 역행성 췌담관 조영술, 초음파 내시경, 종양 표지자, 또는 복강경 검사를 포함한다.

본원의 방법에서 췌장암 진단마커는 복수개의 마커가 조합으로 사용될 수 있으며, 이 경우, 진단, 예측의 정확도를 향상시키기 위해 알고리즘을 사용하여 분석할 수 있다.

본원에서 마커의 검출 결과를 췌장암의 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하며, 한 구현예에서 상기 연관시키는 단계는 결정된 각 마커의 단백질 양을 정상 대조군에서 결정된 상기 각 마커에 대한 임계값과 비교하는 것일 수 있다.

다른 구현예에서는 상기 연관시키는 단계는 컴퓨터 알고리즘을 통해서 수행될 수 있다. 상기 알고리즘은 선형 또는 비선형 회귀 알고리즘; 선행 또는 비선형 classification 알고리즘; ANOVA; 신경망 알고리즘; 유전적 알고리즘; 서포트 벡터 머신 알고리즘; 계층 분석 또는 클러스터링 알고리즘; 결정 트리를 이용한 계층 알고리즘, 또는 Kernel principal components 분석 알고리즘; Markov Blanket 알고리즘; recursive feature elimination 또는 엔트로피-기본 recursive feature elimination algorithms; committee network로 정렬된 복수의 알고리즘; 및 전방 floating search 또는 후방 floating search 알고리즘으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.

다른 구현예에서, 본원에서 연관시키는 단계는 또한 a) 상기 췌장암 검사 대상자에서 결정된 마커의 발현량을 정상 대조군 또는 특정 타입의 췌장암을 갖는 대상자에서 결정된 마커의 발현량 수치와 비교하는 단계; 및 b) 상기 비교를 통해 췌장암 진단 또는 그 부존재와 관련된 상기 발현량의 차이에 대한 패턴을 도출하도록 알고리즘을 훈련하는 것을 포함한다. 상기 각 마커의 단백질 발현양은 예를 들면, 이로 제한하는 것은 아니나, 항원-항체반응, 역전사 PCR 또는 질량분광분석기 분석을 통해 결정될 수 있으며, 이에 관하여는 앞서 설명한 바와 같다.

본원에서 상기 패턴을 도출하는 알고리즘 훈련은 입력값으로 주어지는 상기 마커 발현량을 산출값으로 주어지는 진단 또는 예후 결과와 맵핑하는 알고리즘을 구축하는 단계, 상기 구축된 알고리즘을 실행하여 상기 마커 발현량과 췌장암의 진단 또는 그 부존재를 맵핑하는 단계; 및 상기 구축 실행된 알고리즘의 입력값 및 이에 따른 산출값을 변화시키면서 상기 알고리즘을 수행하여 최적의 알고리즘 맵핑 아키텍쳐가 실현되도록 하는 단계를 포함하며, 상기 최적의 알고리즘 맵핑은 상기 정상 대조군 또는 특정 췌장암을 갖는 환자의 마커 발현량과 상기 췌장암 검사 대상자의 마커 발현량 수치를 이용하여 유의한 차이를 규명하고, 이를 췌장암의 진단 또는 부존재에 이용한다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하나 본 발명의 범주가 이로 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: iTRAQ ( Isobaric tags for relative and absolute quantitation )

정상 대조군 췌장 조직과 PDAC 환자의 췌장 조직에서의 정량적 단백질체 분석을 위해 iTRAQ 실험을 수행하였다. 즉 직접적인 표현형을 나타내는 정상 및 암조직에서의 단백질의 변화를 확인하였으며 조직에서의 단백질 변화를 혈청에서 확인하기 위한 단배질 후보군을 발굴하는데 그 목적이 있다.

iTRAQ 시약 (Applied Biosystems, USA)은 모든 펩타이드의 라이신과 N 말단을 표지하는 아민 특이적 동중 동위원소 태그로, 리포터기, 밸런스기, 펩티드 반응성기로 구성되어 있다. 표지한 샘플을 혼합하여 분석을 할 경우, 각각의 샘플이 서로 다른 태그 (m/z 114-117)로 표지 되었더라도, iTRAQ 밸런스기의 영향으로 MS 스펙트럼에서 단일 피크로 보여지게 된다. MS분석에 이어, CID (collision induced dissociation)에 의한 MS/MS 분석이 진행되는 동안, 동중동위원소 태그의 분절부위에서 절단이 일어나 밸런스기가 떨어져 나가고 그 결과 iTRAQ 리포터기가 생성되어 114-117 m/z의 영역에서 아이온 피크로 나타난다. 이 아이온의 피크면적을 정량하여 각 샘플 내에서 주어진 펩타이드의 상대적인 양을 비교하면 시료의 단백질 양을 정량 할 수 있게 된다. 또한 MS/MS 결과, 리포터 아이온 뿐만 아니라 b-아이온과 y-아이온을 얻게 되는데, 이들 아이온은 단백질을 동정하는데 이용하게 된다.

조직 시료 전처리

췌장암 환자의 췌장암의 조직과, 인접한 정상조직 ( 100 ㎍)을 균질화(homogenization)하고 단백질분해효소 억제제(Protease inhibitor cocktail)(Roche Diagnostics Ltd, Mannheim, Germany)를 처리한 차가운 PBS 300㎕ 에 상기 샘플을 재현탁하여 초음파 처리하였다. 이것을 원심분리 (10,000g, 30분, 4℃ )하여 상층액을 수집하고 iTRAQ 표지에 사용될 때까지 -70℃에 보관하였다. 실험에 사용하기 전 Bicinchoninic acid assay (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)를 제조자의 지시대로 이용하여 농도를 측정하였다.

iTRAQ 표지

췌장암 환자의 정상 조직과 암 조직에서 분리해 낸 각각의 단백질 100㎍ 을 speed vac으로 건조한 후 20㎕ 의 dissolution buffer (0.5 M triethylammonium bicarbonate, 0.05% SDS)에 재현탁하였다. 여기에 1㎕의 변성제 (2% SDS)를 처리하고 2㎕의 환원제 (50 mM tris-(2-carboxyethl) phosphine)를 처리한 후 60℃에서 1시간 두었다. 이것을 1㎕의 시스테인 블로킹 제제 (200 mM methyl methanethiosulfonate in isopropanol) 처리 후 20㎕의 0.5㎍／㎕트립신 (Promega, Madison, WI, USA)을 처리하고 37℃ 에서 16시간 반응시켰다. 각각의 샘플에 서로 다른 4개의 iTRAQ reagent (m/z 114-117)를 혼합하여 speed vac으로 건조하였다.

SCX ( Strong cation exchange ) 크로마토그래피

상기에서 Speed vac으로 건조시킨 샘플을 500㎕ 의 buffer A (5 mM ammonium formate, pH 2.7, 25% acetonitrile) 에 재현탁하였다. 500㎕ 의 샘플을 HP1100 series HPLC (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)의 Polysulfoethyl A column (PolyLC, Columbia, MD, USA)에 주입하였다. Buffer A로 5분간 평형화(equilibration) 시킨 뒤 125분 동안 5% 에서 30% 까지 buffer B (1 M ammonium formate, pH 3, 25% acetonitrile)에 선형 농도구배를 주어 펩타이드를 분리하였다. 총 63개의 분획으로 분리된 샘플을 speed vac으로 건조하였다.

LC - MS / MS 분석

QStar Elite (Applied Biosystems,USA)을 사용하여 상기에서 준비된 샘플에 LC-MS/MS 분석을 수행하였다. 건조된 펩티드 샘플은 Buffer A (water/ACN [98:2 v/v] and 0.1 % formic acid) 20㎕ 로 재현탁하여 이 중 5㎕를 nanoLC의 auto-sampler를 사용하여 주입하였다. 펩티드는 trap column (300㎛ i.d x 5 mm, 5㎛ , 100Å , Zorbax 300SB-C18, Agilent Technologies)을 이용하여 capillary flow (20㎕/min)을 이용하여 10분간 탈염하고 Buffer B (water/ACN [2:98 v/v] 및 0.1 % formic acid)의 농도 구배에 따라 Zorbax 300SB-C18 capillary column (75㎛ i.d x 150 mm, 3.5㎛ , 100Å )에 의해 nanoflow (300nl/min)으로 분리하였다. 분리된 펩티드는 온라인으로 연결된 hybrid Quadrupole-TOF LC-MS/MS spectrometer를 이용하여 정성 및 정량 분석하였다. 분석 결과인 질량 스펙트럼은 ProteinPilot (ver.2.0.1)을 사용하여 분석하였고, 데이터베이스는 human CDS database (human_UnicombinedPANTHER_20061012.fasta)를 이용하였다.

실시예 2: Multiple Reaction Monitoring ( MRM )

혈액 시료 전처리

30명의 췌장암 환자 및 20명의 정상인의 각 혈청 시료를 브래드포드를 이용하여 정량하여 이중 200 ㎍에 해당하는 혈장을 취해 우레아로 변성시키고 DTT 및 이오도아세트산(iodoacetic acid)를 사용하여 환원 및 알킬화시켰다. 여기에 트립신을 50 : 1 (단백질 : 트립신, w/w)의 비율로 16시간 처리하여 변성된 단백질을 펩티드로 만든 후 이것을 C18 ZipTip (Millipore, USA)을 사용하여 탈염하고 동결 건조하였다. 이를 solution A (95% Distilled Water, 5% acetonitrile, 0.1% formic acid)에 녹이고 여기에 내부 표준인 베타-갈락토시다아제 펩티드 50 fmole을 추가 한 후, 이에 대하여 MRM 분석을 수행하였다.

트랜지션 선정

MRM 분석을 수행하기 위해 특정 단백질의 특징적인 전하대 질량비 (m/z) 를 가지는 펩타이드를 선정하고(Q1) 이 펩타이드를 전기적인 충격으로 단편화시켰을 때 발생하는 여러 절편 이온 중 해당 펩타이드에 대해 특징적인 m/z를 가지는 단편 이온을 선정한다 (Q3). 이 Q1와 Q3의 조합은 특정 단백질에 특이적인 이온들의 조합으로서 이를 트랜지션이라 명칭하며, 고분해능 (triple quadrupole) 질량 분광 분석기에서 이 특징적인 Q1과 Q3로 이온들을 순차적으로 통과시켰을 때 얻어지는 신호를 정량적 정보로 환산하여 정량 분석을 수행한다. 트랜지션을 선정하기 위해 후보 단백질들을 아래와 같은 두 그룹으로 선정하였다. 일차로 iTRAQ 기반의 정상 췌장 조직 및 췌장암 조직을 이용한 정량 단백체 실험 결과에서 발굴한 췌장암 특이적 발현 단백질들이며 이차로는 혈청에서 질량 분광 분석기로 검출이 가능한 고발현단백질 (high abundant protein)들이다. 이차 그룹은 일차 조직 iTRAQ 데이터가 조직 유래 단백질 및 일부 혈청 단백질들을 포함하므로 보다 많은 후보군을 발굴하기 위해 추가한 단백질 후보군이다. 두 가지로 선정된 단백질들에 대해 각각 MS/MS 분석을 하였다. 이를 바탕으로 각 단백질에 대한 대표 펩티드를 선정하고 (Q1 transition) 이 펩티드를 전기적으로 깨서 발생하는 단편화 이온(fragmentation ion) 중 가장 강도가 높은 이온을 (Q3) 선정하였다. 각 단백질 당 2개의 펩티드를 선정하고 각 펩티드 당 2개의 단편화 이온을 선정하여 Q1/Q3를 하나의 단백질에 대한 4개의 트랜지션으로 결정하였다. 일부 피크가 낮게 나와서 실험적으로 선정하기 어려운 트랜지션에 대해서는 MIDAS (MRM-Initiated Detection and Sequencing) workflow program (MRMPliot, version 2.0, Appliedbiosystems, USA)을 사용하여 트랜지션을 선정하였다. 상기 MIDAS workflow program로도 잡히지 않은 트랜지션은 PeptideAtlas database (www.peptideatlas.org)를 활용하여 관찰된 수가 높은 펩티드를 선별하여 트랜지션을 선정하였다.

LC 및 MRM

LC는 MDS사의 MDLC nanoflow TempoLC를 사용하였다. 펩티드의 분리를 위해 직경 3㎛, pore size 200Å 의 C18 레진을 길이 15 cm, 내경 100 ㎛의 fused sillica capillary column을 사용하여 직접 충진하였다. 펩티드 시료 1.0 ㎕를 Trap column을 거치지 않고 분석용 컬럼으로 바로 주입되는 직접 주입 방법으로 주입하였으며 유속은 400 nl/min으로 하였다. Column을 SolA (95% Distilled Water, 5% acetonitrile, 0.1% formic acid)으로 10 분간 평형화한 후 SolB (5% Distilled Water, 95% acetonitrile, 0.1% formic acid)로 30 분간 5%에서 85%까지, 5분간 85%의 농도 구배를 통해 펩티드를 용출하였다.

질량 분석기는 Applied Biosystems의 hybrid triple quadrupole/linear ion trap인 4000 QTrap 장비를 이용하여 상기 1차 및 2차로 선정한 췌장암 특이적 후보 단백질들에 대한 트랜지션에 대해 MRM 모드로 모니터링 하였다. 이온 볼트는 2000V를 사용하였으며 Quadruple 1(Q1)과 Quadruple 3 (Q3)에서의 해상능은 유니트로 설정하였다. 트랜지션에 대한 드웰시간은 20 밀리초(millisecond)로 설정하여 총 사이클 시간은 2.5초가 되도록 하였다. 분무가스 (Nebulizing gas)는 5 유니트로 사용하였으며 가열기 온도는 150℃로 설정하여 분석하였다. 배치간 변이를 증명하기 위해 각각의 샘플에 스파이킹된 50 fmole 베타-갈락토시다아제 펩티드 (Transition 411.3/495.3)도 동시에 모니터링 하였다. MS 구동시간(run time)은 LC와 시간 동조로 60분 동안 진행하며 MS 및 LC는 Analyst 2.1.2를 사용하여 구동하였다.

데이터 분석

상대 정량을 위해 베타-갈락토시다아제 펩티드 (Transition 411.3/495.3)를 사용하여 blank, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0, 25.0, 50.0, 100.0 fmole 총 8개의 농도 점에서 MRM 정량하여 표준 곡선 (Standard curve)를 결정하였다. 각 개인별 MRM 결과는 MultiQuant (Applied Biosystems, ver1.0)을 사용하여 해당 MRM 트랜지션의 이온 추출 크로마토그래피 (XIC, Extract ion chromatography)를 생성하였으며 각 트랜지션의 피크 면적을 계산하고 이를 다시 시간 경과에 따라 도식화하였다. 각 XIC한 피크의 면적을 내부 표준인 베타-갈락토시다아제 펩티드(Transition 411.3/495.3)의 XIC된 피크 면적으로 normailization하고 이 값으로 각 단백질 별로 상대 정량 분석을 수행하였다. 통계 분석을 위해서 MedCalc (MedCalc Software, Belgium, vesion 11.3.3)을 이용하여 ROC (Receiver Operating Characteristic) 커브 및 인터랙티브 플롯을 작성하였으며 ANOVA (Analysis of variance) 통계 분석을 수행하였다. 일부 도표 작성과 t-TEST 분석을 위해 Sigma Plot (Systat Software Inc, USA,version 10.1)을 사용하였다.

실험결과 ( 마커선별 )

iTRAQ 및 MRM 분석에 사용한 샘플의 기원에 대한 정보는 표 1에 나타내었다.

[표 1]

췌장암 조직을 이용한 단백질체 분석

6명의 췌장암 환자의 암 조직 및 정상 조직 부위 각각에 대해서 3번의 iTRAQ (Isobaric tags for relative and absolute quantitation) 실험을 진행하여 정성 및 정량 분석을 수행하였다 (도 4 참조). iTRAQ 실험 결과 총 1376개의 단백질을 동정하였고, 440개의 단백질이 1.5배 차이 이상 증감의 발현 차이를 보이는 것을 확인하였다 (표 2 참조).

[표 2]

[표 3]

이 중 6명 환자에서 모두 증가한 단백질은 4개, 5명 환자에서 증가한 단백질은 12개, 4명의 환자에서 증가한 단백질은 14개, 3명의 환자에서 증가한 단백질은 21개 순이었고, 4명의 환자에서 감소한 단백질은 8개, 3명의 환자에서 감소한 단백질은 26개였다(표 3 참조).

MRM 결과

췌장암 환자 30명, 정상 대조군 20명의 혈청 샘플로부터 펩타이드를 분리하여 MRM 분석을 진행하였다. MRM 분석 후 Wiff file로부터 MultiQuant (ABI, USA, version 1.1)로 트랜지션에 대한 피크를 추출하여 피크 면적을 구하였다. 각각의 피크 면적은 내부 표준 펩티드의 피크 면적을 이용하여 평준화(normalization)하여 batch간 스프레이 편차에 따른 오차를 보정하였으며 단백질에 대한 결과를 암별, 성별로 구분하여 인터랙티브 플롯 및 ROC (Receiver Operating Characteristic) 커브를 작성하였다. 진단 방법의 효율성을 판단하는 방법 중 널리 사용되는 것이 ROC 커브 이다. 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)가 어떤 관계를 갖고 변하는지를 이차원 평면상에 표현한 것이 ROC 커브인데, ROC 커브 아래의 면적(AUC, area under curve)이 넓을수록 좋은 진단 방법이라 할 수 있다.

도 6은 상기 각 22개 단백질들의 ROC 커브와 인터랙티브 플롯을 나타낸다. 총 22개의 단백질이 발현 차이를 보였는데 이중 16개가 정상대조군과 비교하여 췌장암에서 증가하였고 6개는 췌장암에서 감소하였다. 아래의 표 4에 각 단백질의 정상대조군 대 췌장암의 AUC를 정리하였다. 이들 발현 차이를 보이는 단백질들은 그 특이성과 민감도에 따라 하나 이상 조합하여 췌장암을 조기 진단할 수 있는 진단 마커로 개발될 수 있다.

iTRAQ은 암의 기원이 되는 조직에서의 단백질 발현양을 본 것으로 발굴단계이고, 검증 단계로 혈청에서 마커를 검증하는 것이다. 상기 22개의 단백질 중 complement C4A, factor B, TBG, plasma protease C1 inhibitor를 제외한 18개가 iTRAQ에서 규명되었고 18개 중 6개의 단백질(antitrypsin, haptoglobin, hemopexin, transferrin, zinc-alpha 2 protein, apolipoprotein A4)이 MRM 결과와 일치하였다.

[표 4]

Claims

알파-1-안티키모트립신, 알파-1-안티트립신, 알파-2-마크로글로불린, 세룰로플라스민(ceruloplasmin), 보체 인자 B(complement factor B), 보체 C4A(complement C4A), 보체 C4 감마사슬(complement C4 gamma chain), 보체 C9(complement C9), 하프토글로빈(haptoglobin), 헤모펙신(hemopexin), 키니노젠(kininogen), 혈장 프로테아제 C1 억제제(plasma protease C1 inhibitor), 티록신 결합 글로불린(thyroxine binding globulin), 트랜스페린(transferrin), 비트로넥틴(vitronectin), 아연 알파-2 당단백질(zinc alpha-2-glycoprotein), 아포리포단백질 A1(apolipoprotein A1), 아포리포단백질 A2(apolipoprotein A2), 아포리포단백질 A4(apolipoprotein A4), 갤솔린(gelsolin), 인터-알파-트립신 억제자 중쇄 H1(inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1) 및 색소 상피 유도인자(pigment epithelium derived factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 췌장암 진단용 마커.
제 1 항에 있어서, 상기 1 종이상의 마커는, 상기 보체 C9의 ROC 커브의 AUC 수치와 같거나 또는 이 보다 큰 수치가 되도록 조합되는, 췌장암 진단용 마커.
제 2 항에 있어서, 상기 조합은
보체 C9 및 알파-1 안티키모트립신;
보체 C9, 알파-1 안티키모트립신 및 보체 C4A;
보체 C9, 알파-1 안티키모트립신, 보체 C4A 및 보체 인자 B;
보체 C9, 알파-1 안티키모트립신, 보체 C4A, 보체 인자 B 및 알파-1 안티트립신; 및
보체 C9, 알파-1 안티키모트립신, 보체 C4A, 보체 인자 B, 알파-1 안티트립신 및 아연 알파-2 당단백질의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 췌장암 진단용 마커.
제 1 항에 있어서, 상기 1 종이상의 마커는, 상기 각 마커의 AUC 수치의 합이 1이 되도록 조합되는, 췌장암 진단용 마커.
제 4 항에 있어서, 상기 조합은
알파-1-안티트립신, 하프토글로빈, 헤모펙신, 트랜스페린, 아연 알파-2 당단백질 및 아포리포단백질 A4;
보체 C9, 알파-1-안티키모트립신, 보체 C4A, 보체 인자 B, 알파-1-안티트립신, 아연 알파-2 당단백질 및 갤솔린;
알파-1-안티키모트립신, 보체 C4A, 보체 인자 B, 알파-1-안티트립신, 아연 알파-2 당단백질 및 갤솔린;
보체 C4A, 보체 인자 B, 알파-1-안티트립신, 아연 알파-2 당단백질, 갤솔린 및 인터-알파-트립신 억제자 중쇄 H1;
보체 C9, 알파-1-안티키모트립신, 보체 C4A, 보체 인자 B, 알파-1-안티트립신, 아연 알파-2 당단백질, 갤솔린 및 인터-알파-트립신 억제자 중쇄 H1;
보체 C9, 알파-1-안티키모트립신, 보체 C4A, 보체 인자 B, 알파-1-안티트립신, 아연 알파-2 당단백질, 갤솔린, 인터-알파-트립신 억제자 중쇄 H1 및 혈장 프로테아제 C1 억제제;
보체 C9, 알파-1-안티키모트립신, 보체 C4A, 보체 인자 B, 알파-1-안티트립신, 아연 알파-2 당단백질, 갤솔린, 인터-알파-트립신 억제자 중쇄 H1, 혈장 프로테아제 C1 억제제 및 아포리포단백질 A1; 및
보체 C9, 알파-1-안티키모트립신, 보체 C4A, 보체 인자 B, 알파-1-안티트립신, 아연 알파-2 당단백질, 갤솔린, 인터-알파-트립신 억제자 중쇄 H1, 혈장 프로테아제 C1 억제제, 아포리포단백질 A1, 보체 C4 감마 사슬, 비트로넥틴, 트랜스페린, 하프토글로빈, 세룰로플라스민, 알파-2-마크로글로불린, 아포리포단백질 A4, 티록신 결합 글로불린, 키니노젠, 헤모펙신, 아포리포단백질 A2 및 색소 상피 유도인자의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 췌장암 진단용 마커.
제 1 항에 있어서, 상기 췌장암 진단은 조직, 전혈, 혈장 또는 혈장 중 하나 이상의 검체를 이용하는 것인 췌장암 진단용 마커.
제 1 항에 있어서, 상기 췌장암은 2기 또는 3기인, 췌장암 진단용 마커.
췌장암 진단용 키트로서, 상기 키트는 알파-1-안티키모트립신, 알파-1-안티트립신, 알파-2-마크로글로불린, 세룰로플라스민(ceruloplasmin), 보체 인자 B(complement factor B), 보체 C4A(complement C4A), 보체 C4 감마사슬(complement C4 gamma chain), 보체 C9(complement C9), 하프토글로빈(haptoglobin), 헤모펙신(hemopexin), 키니노젠(kininogen), 혈장 프로테아제 C1 억제제(plasma protease C1 inhibitor), 티록신 결합 글로불린(thyroxine binding globulin), 트랜스페린(transferrin), 비트로넥틴(vitronectin), 아연 알파-2 당단백질(zinc alpha-2-glycoprotein), 아포리포단백질 A1(apolipoprotein A1), 아포리포단백질 A2(apolipoprotein A2), 아포리포단백질 A4(apolipoprotein A4), 갤솔린(gelsolin), 인터-알파-트립신 억제자 중쇄 H1(inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1) 및 색소 상피 유도 인자(pigment epithelium derived factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커 검출 시약을 포함하는 검체의 췌장암 진단 키트.
제 8 항에 있어서, 상기 검출 시약은 상기 마커를 단백질 또는 mRNA 수준에서 검출할 수 있는 시약인, 췌장암 진단 키트.
제 9 항에 있어서, 상기 단백질 수준에서 검출할 수 있는 시약은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 기질, 앱타머, 수용체, 리간드 또는 보조인자, 또는 질량분광분석기 검출용 시약인, 췌장암 진단 키트.
제 9 항에 있어서, 상기 mRNA 수준에서 검출할 수 있는 시약은 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던블랏에 사용되는 시약인, 췌장암 진단 키트.
제 8 항에 있어서, 상기 마커는 조합으로 사용되며, 상기 조합은 상기 마커 중 보체 C9의 ROC 커브의 AUC 수치와 같거나 또는 이보다 크게, 또는 상기 각 마커의 AUC 수치의 합이 1이 되도록 선택되는, 췌장암 진단 키트.
제 12 항에 있어서,
상기 보체 C9의 ROC 커브의 AUC 수치보다 같거나 큰 값이 되도록 선택되는 조합은: 보체 C9 및 알파-1 안티키모트립신; 보체 C9, 알파-1 안티키모트립신 및 보체 C4A; 보체 C9, 알파-1 안티키모트립신, 보체 C4A 및 보체 인자 B; 보체 C9, 알파-1 안티키모트립신, 보체 C4A, 보체 인자 B 및 알파-1 안티트립신; 또는 보체 C9, 알파-1 안티키모트립신, 보체 C4A, 보체 인자 B, 알파-1 안티트립신 및 아연 알파-2 당단백질의 조합이고,
상기 각 마커의 AUC 수치의 합이 1이 되도록 선택되는 조합은:
알파-1-안티트립신, 하프토글로빈, 헤모펙신, 트랜스페린, 아연 알파-2 당단백질 및 아포리포단백질 A4; 보체 C9, 알파-1-안티키모트립신, 보체 C4A, 보체 인자 B, 알파-1-안티트립신, 아연 알파-2 당단백질 및 갤솔린; 알파-1-안티키모트립신, 보체 C4A, 보체 인자 B, 알파-1-안티트립신, 아연 알파-2 당단백질 및 갤솔린; 보체 C4A, 보체 인자 B, 알파-1-안티트립신, 아연 알파-2 당단백질, 갤솔린 및 인터-알파-트립신 억제자 중쇄 H1; 보체 C9, 알파-1-안티키모트립신, 보체 C4A, 보체 인자 B, 알파-1-안티트립신, 아연 알파-2 당단백질, 갤솔린 및 인터-알파-트립신 억제자 중쇄 H1; 보체 C9, 알파-1-안티키모트립신, 보체 C4A, 보체 인자 B, 알파-1-안티트립신, 아연 알파-2 당단백질, 갤솔린, 인터-알파-트립신 억제자 중쇄 H1 및 혈장 프로테아제 C1 억제제; 보체 C9, 알파-1-안티키모트립신, 보체 C4A, 보체 인자 B, 알파-1-안티트립신, 아연 알파-2 당단백질, 갤솔린, 인터-알파-트립신 억제자 중쇄 H1, 혈장 프로테아제 C1 억제제 및 아포리포단백질 A1; 또는 보체 C9, 알파-1-안티키모트립신, 보체 C4A, 보체 인자 B, 알파-1-안티트립신, 아연 알파-2 당단백질, 갤솔린, 인터-알파-트립신 억제자 중쇄 H1, 혈장 프로테아제 C1 억제제, 아포리포단백질 A1, 보체 C4 감마 사슬, 비트로넥틴, 트랜스페린, 하프토글로빈, 세룰로플라스민, 알파-2-마크로글로불린, 아포리포단백질 A4, 티록신 결합 글로불린, 키니노젠, 헤모펙신, 아포리포단백질 A2 및 색소 상피 유도인자의 조합인, 췌장암 진단 키트.
제 8 항에 있어서, 상기 검체는 조직, 전혈, 혈장 또는 혈장 중 하나 이상인, 췌장암 진단 키트.
제 8 항에 있어서, 상기 췌장암은 2기 또는 3기 진단용 췌장암 진단 키트.
췌장암 진단용 키트로서, 상기 키트는 제 1 항에 따른 1종 이상의 마커를 검출하기 위한 시약 및 장치 및 알고리즘이 내장된 컴퓨터를 포함하며, 상기 알고리즘은 이를 통해 상기 마커의 검출 결과를 췌장암의 진단 또는 예후와 연관시키는 것인, 췌장암 진단 키트.
제 16 항에 있어서, 상기 연관시키는 단계는 췌장암 검사 대상자, 정상 대조군 또는 특정 유형의 췌장암을 갖는 환자의 상기 하나 이상의 마커의 발현량 수치를 비교하여, 상기 발현량의 차이에 대한 패턴을 도출하도록 상기 알고리즘을 훈련하는 것을 포함하는, 췌장암 진단 키트.
제 17 항에 있어서, 상기 패턴을 도출하는 알고리즘 훈련은
입력값으로 주어지는 상기 마커 발현량을 산출값으로 주어지는 진단 또는 예후 결과와 맵핑하는 알고리즘을 구축하는 단계;
상기 구축된 알고리즘을 실행하여 상기 마커 발현량과 췌장암의 진단 또는 그 부존재를 맵핑하는 단계; 및
상기 구축 실행된 알고리즘의 입력값 및 이에 따른 산출값을 변화시키면서 상기 알고리즘을 수행하여 최적의 알고리즘 맵핑 아키텍쳐가 실현되도록 하는 단계를 포함하며, 상기 최적의 알고리즘 맵핑은 상기 정상 대조군 또는 특정 췌장암을 갖는 환자의 마커 발현량과 상기 췌장암 검사 대상자의 마커 발현량 수치를 이용하여 유의한 차이를 규명하고, 이를 췌장암의 진단 또는 부존재에 이용하는 것인, 췌장암 진단 키트.
제 18 항에 있어서, 상기 알고리즘은 선형 또는 비선형 회귀 알고리즘; 선행 또는 비선형 classification 알고리즘; ANOVA; 신경망 알고리즘; 유전적 알고리즘; 서포트 벡터 머신 알고리즘; 계층 분석 또는 클러스터링 알고리즘; 결정 트리를 이용한 계층 알고리즘, 또는 Kernel principal components 분석 알고리즘; Markov Blanket 알고리즘; recursive feature elimination 또는 엔트로피-기본 recursive feature elimination algorithms; committee network로 정렬된 복수의 알고리즘; 및 전방 floating search 또는 후방 floating search 알고리즘으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 췌장암 진단 키트.
췌장암 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 췌장암 검사 대상자의 검체로부터 마커를 검출하는 방법으로, 상기 방법은
상기 환자의 검체에서 알파-1-안티키모트립신, 알파-1-안티트립신, 알파-2-마크로글로불린, 세룰로플라스민(ceruloplasmin), 보체 인자 B(complement factor B), 보체 C4A(complement C4A), 보체 C4 감마사슬(complement C4 gamma chain), 보체 C9(complement C9), 하프토글로빈(haptoglobin), 헤모펙신(hemopexin), 키니노젠(kininogen), 혈장 프로테아제 C1 억제제(plasma protease C1 inhibitor), 티록신 결합 글로불린(thyroxine binding globulin), 트랜스페린(transferrin), 비트로넥틴(vitronectin), 아연 알파-2 당단백질(zinc alpha-2-glycoprotein), 아포리포단백질 A1(apolipoprotein A1), 아포리포단백질 A2(apolipoprotein A2), 아포리포단백질 A4(apolipoprotein A4), 갤솔린(gelsolin), 인터-알파-트립신 억제자 중쇄 H1(inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1) 및 색소 상피 유도 인자(pigment epithelium derived factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 마커의 존재 또는 양을 검출하는 단계; 및
상기 하나 이상의 마커의 존재 또는 양을 상기 검사 대상자의 췌장암의 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하는, 방법.
제 20 항에 있어서, 상기 마커의 존재 또는 양은 단백질 또는 mRNA 발현 수준에서 결정되는 것인, 방법.
제 20 항에 있어서, 상기 연관시키는 단계는 상기 췌장암 검사 대상자의 비마커 임상정보를 추가로 사용하는 것인, 방법.
제 22 항에 있어서, 상기 검사 대상자의 비마커 임상정보는 상기 대상자의 나이, 성별, 체중, 식습관, 체질량, 초음파, 전산화 단층촬영(CT),자기공명영상(MRI), 혈관조영술, 내시경적 역행성 췌담관 조영술, 초음파 내시경, 종양 표지자, 또는 복강경 검사 중 하나 이상인, 방법.
제 20 항에 있어서, 상기 연관시키는 단계는 상기 결정된 각 마커의 단백질 양을 정상 대조군에서 결정된 상기 각 마커에 대한 임계값과 비교하는 것인, 방법.
제 20 항에 있어서, 연관시키는 단계는 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 수행되는 하나 이상의 단백질 마커를 검출하는 방법.
제 20 항에 있어서, 연관시키는 단계는 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 수행되는 하나 이상의 단백질 마커를 검출하는 방법.
제 20 항에 있어서, 상기 연관시키는 단계는
a) 상기 췌장암 검사 대상자에서 결정된 마커의 발현량을 정상 대조군 또는 특정 타입의 췌장암을 갖는 대상자에서 결정된 마커의 발현량 수치와 비교하는 단계; 및
b) 상기 비교를 통해 췌장암 진단 또는 그 부존재와 관련된 상기 발현량의 차이에 대한 패턴을 도출하도록 알고리즘을 훈련하는 것을 포함하는, 방법.
제 27 항에 있어서, 상기 패턴을 도출하는 알고리즘 훈련은
입력값으로 주어지는 상기 마커 발현량을 산출값으로 주어지는 진단 또는 예후 결과와 맵핑하는 알고리즘을 구축하는 단계;
상기 구축된 알고리즘을 실행하여 상기 마커 발현량과 췌장암의 진단 또는 그 부존재를 맵핑하는 단계; 및
상기 구축 실행된 알고리즘의 입력값 및 이에 따른 산출값을 변화시키면서 상기 알고리즘을 수행하여 최적의 알고리즘 맵핑 아키텍쳐가 실현되도록 하는 단계를 포함하며, 상기 최적의 알고리즘 맵핑은 상기 정상 대조군 또는 특정 췌장암을 갖는 환자의 마커 발현량과 상기 췌장암 검사 대상자의 마커 발현량 수치를 이용하여 유의한 차이를 규명하고, 이를 췌장암의 진단 또는 부존재에 이용하는 것인, 방법.