CN102590491A - 一种用于早期筛查或辅助诊断泌尿系统疾病的检测试剂盒、检测方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于早期筛查或辅助诊断泌尿系统疾病的检测试剂盒和检测方法。本发明的试剂盒包含至少一种检测试剂和捕捉试剂,其能够特异识别并准确定量在健康人群尿液中稳定表达的COL6A1、GC、RBP4、DNASE1、GAA、SERPING1、CTSD、KNG1、UMOD、PIGR、AHSG、A1BG、AMBP、AZGP1、PTGDS、HPX、CD14、ORM1蛋白中的任一种或它们的任意组合。本发明的检测方法可以检测待测者尿液中上述18个蛋白中任一种的含量是否异常,以提示泌尿系统疾病发生,达到早期筛查或疾病辅助诊断的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于早期筛查或辅助诊断泌尿系统疾病或病理状况的检测试剂盒和检测方法。具体地,本发明涉及针对在健康人群尿液中稳定表达的18种标志物候选蛋白的筛选,以及它们的用途、包含它们作为泌尿系统疾病标志物的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
通过早期筛查发现或辅助诊断泌尿系统疾病,尤其是泌尿系统恶性疾病如肿瘤等,对预防和根治疾病有重要意义。而尿液来源简单方便无损伤,病人容易接受,无不适感,没有禁忌症。尿液可以反应肾脏的整体情况,可以更及时准确地反应肾脏的生理状态和功能水平。因此尿液是一种理想的用于疾病诊断的生物样品。
目前临床上通过检测尿液的各项生化指标来反映泌尿系统功能的改变,协助临床诊疗。但这些指标是不能在肾功能的发生显著改变的疾病早期给予提示。这将导致错过治疗泌尿系统恶性疾病的最佳时机。对此,大量的研究集中在尿液中寻找一些疾病相关蛋白标志物,能够早期灵敏地提示某些恶性疾病的发生,并且报道了大量的这样一些蛋白标志物。然而,由于尿液蛋白的来源十分复杂,并且受环境饮食等因素影响,生理波动十分巨大,从而导致了这些疾病相关蛋白标志物由于特异性和稳定性等问题而都没有被临床广泛应用。
本发明通过对大规模健康人群尿液进行蛋白质组学系统分析,ELISA反复验证,最终寻找到了18个在健康人尿液中稳定表达的蛋白。进一步的研究发现这18个蛋白所组成的表达谱型能够反映泌尿系统的健康状态,如果这18个蛋白所组成的表达谱型明显改变将提示泌尿系统的疾病状态,进而利用这18个尿蛋白研制早期筛查泌尿系统疾病的检测试剂盒将会产 生极大的市场价值。
发明内容
发明人经过对大规模健康人群尿液进行蛋白质组学系统分析,ELISA反复验证,最终寻找到了18个在健康人尿液中稳定表达的蛋白。进一步的研究发现这18个蛋白所组成的表达谱型能够反映泌尿系统的健康状态,且这18个蛋白所组成的表达谱型明显改变可以提示泌尿系统的疾病状态。发明人通过实验发现,α1-酸性糖蛋白(ORM1)、α2-HS糖蛋白(AHSG)、α1微球蛋白bikunin前体蛋白(AMBP)、锌2-糖蛋白(AZGP1)、组织蛋白酶D(CTSD)、血红素结合蛋白(Hpx)、激肽原1(Kininogen 1,KNG1)、丝氨酸蛋白酶肽酶抑制剂1(SERPING1)、多聚免疫球蛋白受体(PIGR)、前列腺素D合成酶(PTGDS)、UMOD、糖盏蛋白(GC)、视黄醇结合蛋白4(RBP4)、α1-B糖蛋白(A1BG)、脱氧核糖核酸酶(DNASE1)、Alpha 1胶原蛋白VI(Alpha 1 collagen VI、COL6A1)、酸性Alpha葡萄糖酶(Glucosidase Alpha acid,GaA)和CD14(白细胞分化抗原14)不但在健康人尿液中稳定表达,并且这些蛋白的变化与泌尿系统的疾病密切相关。鉴于以上原因,发明人不仅通过实验验证了上述蛋白作为早期筛查或辅助诊断泌尿系统疾病的可行性,而且利用这些蛋白标志物进一步开发用于泌尿系统疾病早期筛查和诊断的检测试剂盒。
因此,在第一个方面,本发明提供了一种用于早期筛查或辅助诊断泌尿系统疾病或病理状况的检测试剂盒,其包含一种或多种检测试剂和一种或多种捕捉试剂,所述捕捉试剂能够特异性结合待测样品中可能存在的泌尿系统疾病标志物,所述检测试剂能够检测与所述标志物特异性结合的捕捉试剂,其中所述标志物为选自COL6A1、GC、RBP4、DNASE1、GAA、SERPING1、CTSD、KNG1、UMOD、PIGR、AHSG、A1BG、AMBP、AZGP1、PTGDS、HPX、CD14和ORM1蛋白中的任一种或多种的任意组合。
在第二个方面,本发明提供了一种检查样品中的泌尿系统疾病标志物的方法(下面简称“本发明的方法”)。
在本发明的方法的一个实施方案中,所述方法包括以下步骤:
1)提供分别包含一种或多种检测试剂和一种或多种捕捉试剂的溶液,所述捕捉试剂能够特异性结合样品中的泌尿系统疾病标志物,所述检测试剂能够检测与所述标志物特异性结合的捕捉试剂,其中所述标志物为选自COL6A1、GC、RBP4、DNASE1、GAA、SERPING1、CTSD、KNG1、UMOD、PIGR、AHSG、A1BG、AMBP、AZGP1、PTGDS、HPX、CD14和ORM1蛋白中的任一种或多种的任意组合;
2)向样品中加入所述捕捉试剂并在适于所述捕捉试剂与所述泌尿系统疾病标志物特异性结合或反应的条件下结合或反应形成第一混合溶液,
3)向第一混合溶液中加入与所述捕捉试剂相应的检测试剂并形成第二混合溶液;
4)通过与所述检测试剂对应的检测方法在适合所述检测方法检测的条件下检测所述第二混合溶液中任一种所述泌尿系统疾病标志物的含量。
在本发明的方法的另一个实施方案中,所述方法包括以下步骤:
1)提供固定有一种或多种捕捉试剂的芯片,所述捕捉试剂能够特异性结合样品中的泌尿系统疾病标志物,其中所述标志物为选自COL6A1、GC、RBP4、DNASE1、GAA、SERPING1、CTSD、KNG1、UMOD、PIGR、AHSG、A1BG、AMBP、AZGP1、PTGDS、HPX、CD14和ORM1蛋白中的任一种或多种的任意组合;
2)将样品加入至所述芯片上在适于所述泌尿系统疾病标志物与所述捕捉试剂特异性结合或反应的条件下结合或反应,
3)在清洗掉未结合或反应的样品后向芯片上加入与所述捕捉试剂相应的检测试剂,所述检测试剂能够检测与所述标志物特异性结合的捕捉试剂,
4)通过与检测试剂对应的检测方法在适合所述检测方法检测的条件下检测所述芯片中任一种所述泌尿系统疾病标志物的含量。
在本发明的方法的又一个实施方案中,所述方法包括以下步骤:
1)提供已经结合有捕捉试剂和与所述捕捉试剂偶联的检测试剂的一个或多个试纸,所述捕捉试剂能够特异性结合样品中的泌尿系统疾病标志物,所述检测试剂能够检测与所述标志物特异性结合或反应的捕捉试剂,其中所述标志物为选自COL6A1、GC、RBP4、DNASE1、GAA、SERPING1、 CTSD、KNG1、UMOD、PIGR、AHSG、A1BG、AMBP、AZGP1、PTGDS、HPX、CD14和ORM1蛋白中的任一种或多种的任意组合;
2)将样品加入至所述试纸上,
其中当所述捕捉试剂与任一种泌尿系统疾病标志物特异性结合或反应时,所述试纸发生颜色变化或其他可识别标识以提供关于任一种所述标志物是否存在的指示。
本发明的检测试剂盒和检测方法利用生物化学手段来分析待测个体尿液中稳定表达的特异蛋白标志物,达到早期筛查或辅助诊断泌尿系统疾病或病理状况的目的,检测方法独特,特异性高,稳定性好,因此具有极大的市场前景。
附图说明
图1为通过蛋白质组系统分析健康人群尿液流程图。其中:HPLC,高效液相色谱;pI,蛋白等电点;MW,分子量;RP,反相色谱;MS,质谱;1DSDS,一维凝胶电泳;MARs,高丰度蛋白去除系统;SCX,强阳离子交换。
图2为尿蛋白的一维凝胶电泳图和反相色谱分离馏分图。
图3为GC蛋白在不同健康个体尿液中相对含量的生理波动变化。
图4为AHSG蛋白在不同健康个体尿液中相对含量的生理波动变化。
图5为GAA蛋白在不同健康个体尿液中相对含量的生理波动变化。
图6为AZGP蛋白在不同健康个体尿液中相对含量的生理波动变化。
图7为UMOD蛋白在不同健康个体尿液中相对含量的生理波动变化。
图8为AMBP蛋白在不同健康个体尿液中相对含量的生理波动变化。
图9为PIGR蛋白在不同健康个体尿液中相对含量的生理波动变化。
图10为A1BG蛋白在不同健康个体尿液中相对含量的生理波动变化。
图11为COL6A1蛋白在不同健康个体尿液中相对含量的生理波动变化。
图12为Dnase1蛋白在不同健康个体尿液中相对含量的生理波动变化。
图13为CTSD蛋白在不同健康个体尿液中相对含量的生理波动变化。
图14为RBP4蛋白在不同健康个体尿液中相对含量的生理波动变化。
图15为CD14蛋白在不同健康个体尿液中相对含量的生理波动变化。
图16为KNG1蛋白在不同健康个体尿液中相对含量的生理波动变化。
图17为HPX蛋白在不同健康个体尿液中相对含量的生理波动变化。
图18为PTGDS蛋白在不同健康个体尿液中相对含量的生理波动变化。
图19为SERPING1蛋白在不同健康个体尿液中相对含量的生理波动变化。
图20为ORM1蛋白在不同健康个体尿液中相对含量的生理波动变化。
具体实施方式
部分术语定义:
泌尿系统疾病标志物:在本发明中该术语是指与泌尿系统疾病、其相关症状、病理状况、临床病理表现或甚至是上述疾病、症状、病理状况、临床表现恶化可能高度相关的或是所述疾病、症状、病理状况、病理表现和/或病情恶化的高危因子的蛋白标志物,其可以存在于细胞表面上,组织中,间质中,体液如血液、血清、尿液、粘液中,分泌物中,等等。
泌尿系统疾病:在本发明中该术语包括原发性、继发性、遗传性疾病(也称为先天性疾病)或后天获得性疾病等,并且包括累及泌尿系统各器官、组织、间质或细胞的疾病、病症或综合征,其包括但不限于本说明书中所提及的那些疾病或病症。
本发明的泌尿系统疾病标志物:
本发明人通过对大规模健康人群的尿液进行蛋白质组学系统分析和ELISA反复验证,寻找到了18种在健康人尿液中稳定表达的蛋白。这18个蛋白所组成的表达谱型能够反映泌尿系统的健康状态,且这18种蛋白所组成的表达谱型的变化可以提示泌尿系统的疾病状态,下面分别对它们进行描述:
α1-酸性糖蛋白(ORM1)即人类血清类枯蛋白,早期称为血清类黏蛋 白,是糖类含量极高的蛋白质,被认为是脂质运载蛋白(lipocalin)超家族一员。ORM是急性时相反应蛋白,在急性损伤时受炎症因子刺激含量升高(1)。
α2-HS糖蛋白(AHSG)又称为热稳定性糖蛋白或胎球蛋白A,大部分由肝脏合成,是骨基质的一种组成成分,在血中的半衰期为4~5天。免疫电泳位置比结合珠蛋白稍快,位于Gc球蛋白与结合珠蛋白之间。属于半胱氨酸蛋白酶抑制因子超家族成员之一,是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂(2)。
α1微球蛋白bikunin前体蛋白(AMBP)是存在于血清中的一种复合糖蛋白,降解为两种不同功能的蛋白质包括α1微球蛋白和bikunin。α1微球蛋白属于载脂转运蛋白超家族成员,在炎症过程中起调节作用。bikunin是一种尿胰蛋白酶抑制剂,是Kunitz-type蛋白酶抑制因子超家族的一员,在许多病理生理过程中起着重要作用(3)。
锌2-糖蛋白(AZGP1)是一种广泛存在于人体内的可溶性糖蛋白,是人类主要组织相容性复合物(MHC-I)家族中的一员,AZGP被认为是不同类型癌可能的生物标志物,由于它的氨基酸序列与脂质动员因子(LMF)高度同源,因此它被认为是一个新的脂肪因子。它的表达受多种因素调控,在人体内能够发挥重要的功能(4)。
组织蛋白酶D(CTSD)是一类雌激素调节的溶解性蛋白水解酶,广泛存在于不同的组织细胞和肿瘤细胞。因CTSD对基底膜的多种组织成分如纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、各种类型胶原、蛋白粘多糖的核心蛋白等均有降解、破坏作用,从而在恶性肿瘤细胞的浸润和转移机制上起着重要的作用(5)。
血红素结合蛋白(Hpx)是一种已知的与血红素亲和性结合最高的血浆蛋白。其主要在肝脏表达,属于炎症引起的急性期反应物。HPX是血浆中运输血红素的主要工具,从而防止血红素介导的氧化应激和减少铁的损失(6)。
激肽原1(Kininogen 1,KNG1)又称高分子量激肽原、Williams-Fitzgerald-Flaujeac因子、α-2-巯基蛋白酶抑制剂、Fitzgerald因子。KNG1包含三个半胱氨酸结构域的分泌型蛋白,其以碎片的形式存在于尿 液中,并与卵巢癌等相关(7)。
丝氨酸蛋白酶肽酶抑制剂1(SERPING1)是个高度糖化血浆蛋白,其是一个丝氨酸蛋白酶大家族的成员,是调节补体活化经典途径的一个关键蛋白,参与调节补体级联,通过抑制激活C1R和C1s的第一补体成分,从而调节补体活化(8)。
多聚免疫球蛋白受体(PIGR)属于I型跨膜糖蛋白,为免疫球蛋白超家族中的一员,是多聚免疫球蛋白A(PIGA)和多聚免疫球蛋白M(PIGM)的特异性受体。PIGR通过介导细胞内多聚免疫球蛋白的转运,可以在粘膜的腔面阻止病原体粘附,在上皮细胞内中和病毒,也可以将固有层内的抗原分泌出去(9)。
前列腺素D合成酶(PTGDS)有两种,脑型脂质运载蛋白PTGDS(lipocalin-PGDS,L-PTGDS)和生血型PTGDS(hematopoietic PTGDS,hPTGDS),二者的生化和免疫功能截然不同,其中对L-PTGDS的研究更为广泛。L-PTGDS是一种糖基化、双功能、单体蛋白质,它能转运亲脂性物质,如视黄醛、类固醇等,还能催化前列腺素D2(PTGD2)的合成。L-PTGDS在中枢神经系统、雄性生殖器官和人与猴的心脏等器官中有分布,并被分泌到脑脊液、精浆及血浆内(10)。
UMOD是正常尿液中含量较为丰富的蛋白质,是用亲和层析法自孕妇尿中提取的一种酸性糖蛋白,分子量为85kd(11)。由肾小管髓袢升支(TAL)和远曲小管近端的上皮细胞合成分泌,并特异地以膜蛋白形式分布于该部上皮细胞腔面膜、基质膜以及高尔基复合体膜和内质网膜上(12)。
糖盏蛋白(GC)是血小板膜糖蛋白GPIb胞外部分,有两个亚单位GPIbα和GPIbβ,二者以二硫键相连而成(13)。GPIbα对蛋白酶极为敏感,能被循环中的纤溶酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶等水解释放出氨基端GC,是一个直接反应血小板反转和破坏的分子标志物(14)。
视黄醇结合蛋白4(RBP4)是一类相对分子质量为21Ku的维生素A运载蛋白,RBP4是新近发现的脂肪细胞因子之一。多项研究表明,其水平升高和胰岛素抵抗、2型糖尿病、肥胖以及心血管疾病危险因素(如脂谱的改变)有关。其基因多态性也与上述疾病密切相关(15)。
α1-B糖蛋白(A1BG)是一个功能未知的血浆糖蛋白,属于免疫球蛋 白超家族的一个新成员,可能在细胞识别和细胞行为的调节方面起作用(16)。
脱氧核糖核酸酶(DNASE1)是一种糖蛋白,当结合阳离子后以序列依赖的方式降解dsDNA的核酸内切酶,在细胞更新代谢较快的部位,其含量较高(17)。
α1胶原蛋白VI(Alpha 1 collagen VI、COL6A1)属于超家族的蛋白质,在保持各组织的完整性中发挥着重要作用,是以三重螺旋结构域为普遍结构的胞外基质蛋白。COL6A1是微丝的主要结构成分,基本的结构单元是α1(VI)、α2(VI)、α3(VI)结合的异三聚体(18)。
酸性α葡萄糖酶(Glucosidase Alpha acid,GaA)是生物体中一类非常重要的酶,在自然界分布广泛,它参与体内碳水化合物的消化、蛋白和糖脂的加工等(18)。
α-1抗胰凝乳蛋白酶(AACT)属于serpin超家族,是存在于人血清中的一个糖蛋白。它可以在体内抑制胰凝乳蛋白酶样的蛋白酶和体内的细胞毒性T淋巴细胞活性,这个蛋白具有调控免疫和炎症过程的活性,还可作为肿瘤标志物。
上述标志物蛋白可以用于制备辅助诊断泌尿系统疾病的检测试剂盒、检测芯片或检测试纸等检测产品。
本发明的泌尿系统疾病标志物的用途:
在本发明中,对待测样品中上述筛选的18种蛋白中任一种或其任意组合的的检测可以用于早期筛查或提示某些泌尿系统疾病或病理状况。所述泌尿系统疾病或病理状况的实例包括但不限于Bethlem肌病、GC1/GC2多态性疾病、视黄醇结合蛋白缺乏症、系统性红斑狼疮、体内酸性α-葡糖苷酶缺乏、血管性水肿、神经元蜡样脂褐质沉积病、费姿哲特徵病、肾小球膀胱肾病伴高尿酸血症和等渗尿、IgA肾病、消瘦症、急性肾脏损伤、II型糖尿病、IgA肾病、间质性膀胱炎/痛苦膀胱综合征、多囊性肾脏疾病、肾脏移植后急性排斥反应、肾细胞癌、膀胱癌等。
本发明的泌尿系统疾病检测试剂盒
本发明筛选的上述18种蛋白中的任一种或多种的任意组合可以用于制备早期筛查或辅助诊断泌尿系统疾病或病理状况的检测试剂盒。在该试剂盒中主要包含一种或多种检测试剂和一种或多种捕捉试剂,所述捕捉试剂能够特异性结合样品中的泌尿系统疾病标志物,所述检测试剂能够检测与所述标志物特异性结合的捕捉试剂,其中所述标志物为选自COL6A1、GC、RBP4、DNASE1、GAA、SERPING1、CTSD、KNG1、UMOD、PIGR、AHSG、A1BG、AMBP、AZGP1、PTGDS、HPX、CD14和ORM1蛋白中的任一种或多种的组合。
在本发明的试剂盒中,捕捉试剂优选是针对COL6A1、GC、RBP4、DNASE1、GAA、SERPING1、CTSD、KNG1、UMOD、PIGR、AHSG、A1BG、AMBP、AZGP1、PTGDS、HPX、CD14和ORM1蛋白中的任何一个或几个(包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或全部)的单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、重组抗体或特异性抗体片段等。上述抗体可通过商业途径获得,还可以通过抗体制备的常规方法来完成,如通过重组方法制备的杭体,如噬菌体展示抗体,从转基因动物(如小鼠)中分离的抗体,用转入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体,从重组组合抗体文库中分离的抗体。此外,也可以通过表达和纯化上述人源的标志物蛋白,用其免疫动物以获得免疫血清,再用常规的方法纯化血清中的抗体而获得。
上述捕捉试剂还可以是能够和COL6A1、GC、RBP4、DNASE1、GAA、SERPING1、CTSD、KNG1、UMOD、PIGR、AHSG、A1BG、AMBP、AZGP1、PTGDS、HPX、CD14、ORM1蛋白或其任意组合特异识别的其它试剂,只要这些试剂能够特异识别上述标志物蛋白。所述特异性识别除了抗体抗原结合以外,包括但不限于,受体配体结合方式、酶与其特异性底物的结合方式等。因此,所述捕捉试剂可以是所述标志物的特异性受体或配体,或特异性酶底物,其选择可以由本领域技术人员根据标志物蛋白自身的性质(例如,各种特异性结合作用的敏感性、特异性和检测方法的可行性和可获得性等等)、在样品中的可能含量范围、检测方法的精度和检测限等而定。
在本发明的试剂盒中,检测试剂包含可检测的标记成份,所述标记成 份包括酶、辅基、荧光物质、发光物质,生物发光物质和放射活性物质中的一种。通过上述可检测的标记分子可以定性或定量测定与捕捉试剂特异性结合的样品中的标志物蛋白。需注意,当捕捉试剂采用受体配体结合方式的试剂时,检测试剂或可检测的标记成分可以不单独存在,而是直接与受体或配体结合或偶联,可检测标记成分如放射性核素,例如H3、I131、P32等可以在检测前就与作为捕捉试剂的受体或配体结合在一起。在捕捉试剂为酶特异性底物的情况下,检测试剂或可检测的标记成分可以检测酶反应产物(因而阳性结果为酶反应产物的量增加),或也可以检测特异性底物(因而阳性结果为酶特异性底物即捕捉试剂的量减少)。因此,在一些情况下,检测试剂可以本身即是可检测的标记成分,如放射性同位素标记的受体或配体,当特异性结合时发光的物质等等。
酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖酶或乙酰胆碱醋酶;辅基的例子包括链霉菌抗生物素蛋白/生物素蛋白和抗生物素蛋白/生物素蛋白;荧光物质的例子包括伞形酮,荧光素,荧光素异硫氰酸醋,若丹明,丹磺酰氯或藻红蛋白;发光物质的例子包括发光氨,生物发光物质的例子包括但不限于荧光素酶,荧光素和水母发光蛋白;放射活性物质包括125I、35S、14C、3H、或Mg52。
在本发明的试剂盒中,检测试剂可以和捕捉试剂分装,也可以和捕捉试剂偶联。
在一个优选的实施方案中,本发明的试剂盒还可以包含检测载体,所述检测载体的形式不受限制,可以是常见的溶液、芯片或检测试纸的形式,它们的制备、选择和使用是本领域技术人员所公知的。
例如,当载体为芯片时,一种或多种捕捉试剂可以预先固定在芯片上,固定在芯片上的捕捉试剂可以偶联或不偶联相应的检测试剂,从节约成本和简化操作的角度,优选所述捕捉试剂已经偶联了检测试剂。
另外,当载体是试纸时,试纸上可以预先结合有捕捉试剂,所述捕捉试剂已经偶联或没有偶联相应的检测试剂,从节约成本和简化操作的角度,优选所述捕捉试剂已经偶联了检测试剂,这样可以一步获得结果。当待查样品中存在某种泌尿系统疾病标志物时,所述试纸发生颜色变化或其他可识别标识以提供关于任一种所述标志物是否存在的指示。所述可识别 标识可以使用本领域技术人员所熟悉的任何形式,例如标识线,当出现该标识线时表示存在某种标志物(如早孕试纸中的标识线)。
此外,本发明的试剂盒还可以包含稀释试剂、缓冲试剂或洗涤试剂,以及任选地包含使用说明书。上述稀释试剂、缓冲试剂或洗涤试剂等的选择不受限制,主要根据捕捉试剂、检测试剂和检测方法及其相应条件而定。
在本发明中,待测样品优选是来自需要早期筛查或辅助诊断泌尿系统疾病或病理状况的待查个体的尿液或来自所述个体泌尿系统的其他病理标本,如血尿、粘液或分泌物,所述个体可以是哺乳动物,优选是人。
当在制备本发明的各种检测试剂盒时,可以通过市场商业途径获得试剂盒中的捕捉试剂、检测试剂和必要的稀释缓冲液,其中本发明的实施例中的捕捉试剂采用的是商业来源的特异抗体,当然也可以按常规抗体制备的方法制备得到。上述试剂盒的各组分只需常规使用,无需特别操作,可以按照各组成试剂使用说明来进行或按照常规实验方法操作,本领域技术人员能够结合样品的特点正确使用检测试剂盒。
根据本发明的上述教导,本领域技术人员可以根据自身的技术能力、技术和实验条件以及可获得的设备、试剂等条件选择适合的形式和制备方法以制备本发明的各种试剂盒。
下面分别简述本发明的用于各种用途的检测试剂盒。
1.泌尿系统疾病或病理状况的早期筛查试剂盒
本发明的试剂盒可以特异识别与泌尿系统疾病相关的早期出现的蛋白标志物表达改变,因此可以用于泌尿系统疾病的早期预警。因而可以利用上述18种蛋白制成泌尿系统疾病早期筛查试剂盒,通过检测这18个蛋白所形成的表达谱型能够反映泌尿系统的健康状态,而这种表达谱型的变化可以提示泌尿系统的疾病状态,从而实现早期预警的目的。
因此,本发明提供了用于早期筛查泌尿系统疾病的试剂盒,其包含检测试剂和针对所有上述18种泌尿系统疾病标志物的捕捉试剂。如上所述所述捕捉试剂可以包括这18种标志物的特异性抗体,例如单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、重组抗体或特异性抗体片段等(它们的来源如上所述);特异性受体或配体;或特异性酶底物等,其选择可以由本领域技术人 员根据标志物蛋白自身的性质(例如,各种特异性结合作用的敏感性、特异性和检测方法的可行性和可获得性等等)、在样品中的可能含量范围、检测方法的精度和检测限等而定。
在该试剂盒中,捕捉试剂的选择不受限制,可以根据具体情况选择适合形式的捕捉试剂,例如,对于某几种提供特异性抗体,而对另外几种提供特异性受体,还可以对其中几种提供特异性酶底物,等等。这种选择可以由本领域技术人员根据自身的技术、设备和使用条件等情况酌情确定,没有具体的限制,只要捕捉试剂能够与相应的标志物特异性地结合或反应。
所述检测试剂能够检测与所述标志物特异性结合的捕捉试剂,其可包含可检测的标记成份,所述标记成份包括酶、辅基、荧光物质、发光物质,生物发光物质和放射活性物质中的任一种,通过上述可检测的标记分子可以定性或定量测定与捕捉试剂特异性结合的样品中的标志物。可检测的标记分子的例子如上所述。
具体地,例如,当捕捉试剂均为抗体时,所述检测试剂可以是该抗体的二抗,该二抗上缀合或偶联有可检测的标记分子,如荧光物质,这种选择是本领域技术人员公知的。
此外如上所述,在试剂盒中存在不同形式的捕捉试剂的情况下,如同时存在某种或多种标志物的特异性抗体、其受体或配体、其酶特异性底物或其任意组合的情况下,则所述检测试剂可以分别是相应的缀合或偶联有可检测的标记分子的二抗、缀合或偶联有可检测的标记分子的配体或受体、与所述特异性底物特异性反应以显色的试剂或其任意组合。
该试剂盒的其他选择和具体实施方案如上所述,在此不再赘述。
采用该早期筛查试剂盒,可以对以下的疾病或病理状况提出预警:Bethlem肌病、GC1/GC2多态性疾病、视黄醇结合蛋白缺乏症、系统性红斑狼疮、体内酸性α-葡糖苷酶缺乏、血管性水肿、神经元蜡样脂褐质沉积病、费姿哲特徵病、肾小球膀胱肾病伴高尿酸血症和等渗尿、IgA肾病、消瘦症、急性肾脏损伤、II型糖尿病、IgA肾病、间质性膀胱炎/痛苦膀胱综合征、多囊性肾脏疾病、肾脏移植后急性排斥反应、肾细胞癌、膀胱癌等。
2.泌尿系统遗传疾病的早期诊断试剂盒
在泌尿系统疾病中,很大一部分疾病属于遗传性疾病,这些疾病的早期诊断有利于对这些疾病的防治,尤其是妊娠早期的女性和新生儿。
因此,在本发明中还提供了用于某些泌尿系统遗传性疾病的早期辅助诊断试剂盒,其包含检测试剂和针对COL6A1、GC、RBP4、DNASE1、GAA、SERPING1、CTSD、KNG1、UMOD、PIGR和AHSG中的一种或多种的捕捉试剂。如上所述,所述捕捉试剂可以包括这11种标志物中任两种或多种的特异性抗体,如单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、重组抗体或特异性抗体片段等(它们的来源如上所述);特异性受体或配体;或特异性酶底物等。
采用该早期诊断试剂盒,可以对以下的疾病提供辅助诊断信息:Bethlem肌病、GC1/GC2多态性疾病、视黄醇结合蛋白缺乏症、系统性红斑狼疮、体内酸性α-葡糖苷酶缺乏、血管性水肿、神经元蜡样脂褐质沉积病、费姿哲特徵病、肾小球膀胱肾病伴高尿酸血症和等渗尿、IgA肾病和消瘦症等。
本领域技术人员可以理解的是,本发明的此早期诊断试剂盒可以根据某个国家、地区、地域或特定人种或人群进行定制设计,如只选择其中两种或多种(3、4、5、6、7、8、9、10或11种)标志物制成相应的检测试剂盒,即只诊断与该两种或多种标志物相对应的疾病,或也可以包括全部这11种标志物的捕捉试剂从而达到与上面的早期筛查试剂盒类似的筛查目的。
这11种标志物与泌尿系统遗传性疾病的对应关系如下:
COL6A1 Bethlem肌病
GC GC1/GC2多态性疾病
RBP4 视黄醇结合蛋白缺乏症
DNASE1 系统性红斑狼疮
GAA 体内酸性α-葡糖苷酶缺乏
SERPING1 血管性水肿(常染色体隐性遗传)
CTSD 神经元蜡样脂褐质沉积病
KNG1 费姿哲特徵病
UMOD 肾小球膀胱肾病伴高尿酸血症和等渗尿
PIGR IgA肾病
AHSG 消瘦症
在本发明的这些早期诊断试剂盒中,关于捕捉试剂、检测试剂、其他成分的选择和具体实施方案参见上面的叙述。
3.其他辅助诊断试剂盒
上述18种标志物蛋白中一部分标志物的组合可以制成检测试剂盒,通过检测这些标志物可以提供诊断某些泌尿系统疾病或病理状况的辅助信息,从而有利于医生综合其他临床信息对这些泌尿系统疾病做出诊断。
可选的组合如下:
1)癌症:肾细胞癌(AHSG,AZGP1,CTSD,KNG1,GC和DNASE1中的任两者或更多种的任意组合)、膀胱癌(UMOD,AZGP1,PIGR,KNG1,CD14,COL6A1和GAA中的任两者或更多种的任意组合)、或肾细胞癌和膀胱癌(AHSG,AZGP1,CTSD,KNG1,GC和DNASE1中的任两者或更多种的任意组合与UMOD,AZGP1,PIGR,KNG1,CD14,COL6A1和GAA中的任两者或更多种的任意组合相结合);
2)急性肾脏损伤:AHSG,AMBP,AZGP1,PTGDS,A1BG,DNASE1和COL6A1中的任两种或更多种的任意组合;
3)II型糖尿病:AMBP,AZGP1,PTGDS,RBP4,A1BG和GAA中的任两种或更多种的任意组合;
4)IgA肾病:AMBP,UMOD,SERPING1,CD14和PIGR中的任两种或更多种的任意组合;
5)间质性膀胱炎/痛苦膀胱综合征:ORM1,HPX,UMOD和SERPING1中的任两种或更多种的任意组合;
6)多囊性肾脏疾病:CD14,UMOD和PIGR中的任两种或更多种的任意组合;
7)肾脏移植后急性排斥反应:AZGP1,KNG1,SERPING1,UMOD,GC,A1BG,PIGR,DNASE1,COL6A1和GAA中的任两种或更多 种的任意组合。
在本发明的这些辅助诊断试剂盒中,关于捕捉试剂、检测试剂、其他成分的选择和具体实施方案参见上面的叙述。
泌尿系统疾病或病理状况的早期筛查或检测方法
在本发明的方法的一个实施方案中,所述方法包括以下步骤:
1)提供分别包含至少一种检测试剂和至少一种捕捉试剂的溶液,所述捕捉试剂能够特异性结合样品中的泌尿系统疾病标志物,所述检测试剂能够检测与所述标志物特异性结合的捕捉试剂,其中所述标志物为选自COL6A1、GC、RBP4、DNASE1、GAA、SERPING1、CTSD、KNG1、UMOD、PIGR、AHSG、A1BG、AMBP、AZGP1、PTGDS、HPX、CD14和ORM1蛋白中的任一种、任两种或更多种的任意组合;
2)向样品中加入所述捕捉试剂并在适于所述捕捉试剂与所述泌尿系统疾病标志物特异性结合或反应的条件下结合或反应形成第一混合溶液,
3)向第一混合溶液中加入与所述捕捉试剂相应的检测试剂并形成第二混合溶液;
4)通过与所述检测试剂对应的检测方法在适合所述检测方法检测的条件下检测所述第二混合溶液中任一种所述泌尿系统疾病标志物的含量。
在本发明的方法的另一个实施方案中,所述方法包括以下步骤:
1)提供固定有一种或多种捕捉试剂的芯片,所述捕捉试剂能够特异性结合样品中的泌尿系统疾病标志物,其中所述标志物为选自COL6A1、GC、RBP4、DNASE1、GAA、SERPING1、CTSD、KNG1、UMOD、PIGR、AHSG、A1BG、AMBP、AZGP1、PTGDS、HPX、CD14和ORM1蛋白中的任一种、任两种或更多种的任意组合;
2)将样品加入至所述芯片上在适于所述泌尿系统疾病标志物与所述捕捉试剂特异性结合或反应的条件下结合或反应,
3)在清洗掉未结合或反应的样品后向芯片上加入与所述捕捉试剂相应的检测试剂,所述检测试剂能够检测与所述标志物特异性结合的捕捉试剂,
4)通过与检测试剂对应的检测方法在适合所述检测方法检测的条件 下检测所述芯片中任一种所述泌尿系统疾病标志物的含量。
在本发明的方法的又一个实施方案中,所述方法包括以下步骤:
1)提供已经结合有捕捉试剂和与所述捕捉试剂偶联的检测试剂的一个或多个试纸,所述捕捉试剂能够特异性结合样品中的泌尿系统疾病标志物,所述检测试剂能够检测与所述标志物特异性结合或反应的捕捉试剂,其中所述标志物为选自COL6A1、GC、RBP4、DNASE1、GAA、SERPING1、CTSD、KNG1、UMOD、PIGR、AHSG、A1BG、AMBP、AZGP1、PTGDS、HPX、CD14和ORM1蛋白中的任一种、任两种或更多种的任意组合;
2)将样品加入至所述试纸上,
其中当所述捕捉试剂与任一种泌尿系统疾病标志物特异性结合或反应时,所述试纸发生颜色变化或其他可识别标识以提供关于任一种所述标志物是否存在的指示。
在本发明的这些方法中,关于捕捉试剂、检测试剂、其他成分、待测样品以及泌尿系统疾病和病理状况的具体实施方案参见上面的叙述。
本领域技术人员要理解的是,本发明的早期筛查和检测方法只是提供关于待测样品中是否存在上述标志物或上述标志物的水平是否异常的信息,即只是提供了中间数据或结果。因为尽管这些标志物的存在与某种或某些疾病高度相关,但显而易见的是缺少其他临床资料(如患者一般资料、既往病史、现病史、主诉、其他共病或并发症、疾病的严重程度、症状、临床表现、病理学资料、影像学资料、化验室检查、其他辅助检查等等)以及主治医生的判断(包括诊断和鉴别诊断),本领域技术人员(甚至是临床专家)仅凭这些中间数据或结果难以获得准确或甚至怀疑的诊断结果,或换句话说,不可能诊断相应疾病或病理状况。因此本发明的这些方法不能被认为是诊断方法而不能获得授权。
为更进一步阐述本发明为达成发明目的所采取的技术手段及有益效果,以下结合附图及较佳实施例,详细说明本发明。
实施例1
本实施例说明选择尿液作为寻找健康人群稳定尿蛋白标志物的研究对象,寻找健康人群尿液中稳定蛋白标志物来作为早期筛查泌尿系统疾病 发生的指标。
一、实验方法
1、健康供体筛选
从重庆第三军医大学学员中选取100名体检健康男性和100名检健康女性。具体体检指标见表1。
表一
2、标本收集
每两个月收集一次尿标本,一共收集3次。每次与上午8:00收集中段晨尿50ml,4℃条件下,3000rpm/min离心20分钟,留取上清液,4℃保存。
3、尿液的处理
在尿液收集后,立即在每50ml尿液中加入一蛋白酶抑制剂鸡尾酒小片(CompleteTM;Roche Diagnostics,Mannheim,Germany),避免样品中蛋白溶解。尿液收集在聚丙烯管子(NUNC,Roskilde,Denmark)中,使用前储存在-70℃。溶解后,在4℃下于10,000g将尿标本离心30分钟。通过显微镜检查证实去除细胞和碎片。将上清转移到Centriprep YM-1膜浓缩器(Millipore,Billerica,MA,USA),变换PBS缓冲液,将体积降低到20ml左右。浓缩尿中的蛋白量用Coomassie Protein Assay Kit(Pierce,Rockford,IL,USA)检测,浓缩物储存在-80℃。上250μg的尿总蛋白到亲和去除柱中(4.6mm内径×50mm长的柱子;MARS-High Abundance Protein Affinity Removal column,Agilent Technologies,Palo Alto,CA.USA),去除高丰度蛋白。
4、人尿蛋白一维SDS-PAGE以及胶内酶解
然后去除了高丰度蛋白的尿标本上样到4-12% Bis-Tris胶(Novex;Invitrogen,Carlsbad,CA,USA),用2-(N-吗啉代)-甲磺酸或者3-(N-吗啉代)丙磺酸SDS电泳缓冲液(Invitrogen),与厂商的说明书一致。(图2)在Coomassie(Invitrogen)染色后,将胶条切成10到14个片断进行胶内酶解。胶条片断脱色,冲洗,在二硫苏糖醇还原以及碘乙酰胺烷化后,蛋白在37℃用猪胰蛋白酶(modified sequencing grade;Promega,Madison,WI,USA)消化过夜。用30%乙腈、0.3%三氟乙酸(TFA)、以及100%乙腈将得到的胰蛋白酶肽从胶条片段中提取出来。提取物在真空离心机内蒸发脱水,去除有机溶剂,然后在逆相C18 StageTips(Agilent Technologies,Palo Alto,CA.USA.)中除盐以及浓缩。
5、人尿蛋白逆相HPLC以及溶液内酶解
上250μg的尿总蛋白到亲和去除柱中(4.6mm内径×50mm长的柱子;MARS-High Abundance Protein Affinity Removal column,Agilent Technologies,Palo Alto,CA.USA),去除血清白蛋白。将尿素和乙酸加入到去除了白蛋白的蛋白混合物中,终浓度分别为6mol/1和1.0%。使用线性多节梯度在80℃在逆相HPLC柱中分离已经去除了白蛋白的蛋白混合物(4.6mm内径×50mm长的柱子;mRP-C18 High-Recovery protein column,Agilent Technologies,Palo Alto,CA,USA)。用97%的溶剂A(含0.1% TFA的水)和3%溶剂B(含0.08% TFA的乙腈)冲洗10分钟后,在12分钟时用线性梯度到15%的溶剂B冲洗,在40分钟时用35%的溶剂B,46分钟时用100%,51分钟时100%,在55分钟时达到3%,采用的流率为750ul/分钟.按时间收集组分,以2分钟为时间片断,从10分钟开始收集直到54分钟,(总共22个组分)(图3)。每个组分分为两份,用真空离心机干燥,用尿素为变性剂,进行溶液内酶解。
分开的蛋白溶解在含6mol/l的尿素以及mol/l硫脲的缓冲液中,还原,烷化,以及酶解。为了还原二硫键,在蛋白溶液中加入0.5μg的DTT,在室温下孵育0.5小时。游离的硫醇(-SH)基团随后用2.5μg的碘乙酰胺在暗室中常温下烷化30分钟。还原和烷化的蛋白混合物用50mmol/l NH4HCO3(pH 8.0)稀释到含1.5mol/l的尿素,然后用0.5μg胰蛋白酶在37℃下酶解 过夜。
最后,得到的蛋白混合物在逆相C18 StageTips中脱盐,用0.1% TFA稀释,进行nano-HPLC-MS分析。
6、人尿蛋白的溶液内酶解以及OFFGEL电泳分离多肽
用50% 2,2,2-三氟代乙醇和200mM二硫苏糖醇在95℃还原和变性已经去除了高峰度蛋白的尿标本20分钟。然后用碘乙酰胺在常温下1小时。还原和烷化的样品稀释成1∶10。胰蛋白酶(Promega,Madison,WI)以酶∶底物为1∶20比例加入,然后样品在37℃孵育过夜。消化产物分装,干燥,冷冻保存到使用。
对基于pI的肽段分离,我们根据供货厂商提供的方案使用具有24孔装置的3100 OFFGEL Fractionator和OFFGEL Kit pH 3-10(都是Agilent Technologies产品)。在上样前十分钟,在组合装置中将用25μl/每孔的聚焦缓冲将长24cm的3到10线性pH梯度的IPG胶条水化。用聚焦缓冲液稀释200ug的E.coli胰蛋白酶消化产物,终体积为3.6ml,每孔加入150μl的样品。样品在最大电流为50μA、典型电压从500到4000V直到24h后达到50kVh下聚焦。回收的部分(体积在100到150μl之间)用5μl的甲酸酸化。
7、HPLC-Chip RP(高效液相-微流控反相分离柱芯片)进一步肽段分离
每一次运行,上2μL的重新溶解配成原来浓度的肽段混合物到Agilent HPLC-Chip(G4240-66666)。HPLC-chip有一5μm Zorbax SB 念珠的75μm(内径)×150mm(长度)RP C18分析柱以及一个160nL RP C18样品富集柱(也是5μm Zorbax SB 念珠)。The HPLC-Chip安置于使用Agilent’s Chip Cube(G4240A)的Agilent XCT-Ultra质谱仪前。位于HPLC-Chip前端的HPLC是Agilent 1200系列的HPLC系统。
使用溶剂A(0.1%甲酸)将样品首先装到HPLC-Chip 1的富集柱1.5分钟,流率为4μL/分钟(4μL冲洗容积)。从富集柱反冲后,样品被装到RP分析柱。在两分钟之内用梯度到15%的溶剂B(0.1%甲酸溶于水/ACN(1∶9,v/v))将肽段以300nL/分钟的流率从这一柱子里洗脱,然后在下一个30分钟用45%的溶剂B,然后1分钟内到70%的溶剂B。
8、MS/MS质谱分析:
质谱仪参数:分离器电压设置在40.0V;Cap Exit为250.2V;Oct1 DC为12.0V;Oct2 DC为4.62V;Trap Drive为85.0;Oct RF为216.3 Vpp;Lens 1设置为-5V,Lens 2为-60V。对两种设置来说,MS分析在标准增强模式下进行。最大累计时间设置为150ms,在300和2200Th之间扫描,取5位平均数。在每个MS扫描后,允许两个先驱离子进一步分裂,在四个光谱之后具有活性排斥,在先驱离子最后一次分裂1分钟后排斥解除。在MS/MS时,采用40ms的扫描时间,MS/MS断裂幅度从1.3V的30%到200%(SmartFrag)。在MS/MS分析时,使用1位平均数、3.0Th的分离宽度过度扫描模式。MS/MS的ICC智能目标设置为500000,扫描范围在200 2000之间。毛细管电压设置为1900V。最后干气流和温度设置为4L/分钟,275℃。
9、质谱数据分析:
采用Spectrum Mill proteomics software(Rev A.03.02.060;Agilent)分析数据。以胰酶为蛋白酶,在默认的条件下获得原始数据,然后在NCBInr数据库中搜索针对牛的和哺乳动物的序列,允许两个不完全裂解位点,并且包括在搜索中氧化甲硫氨酸和N-末端谷胺酰胺转化成5-氧-2-吡咯烷羧酸的变量修正。如果前向-逆转得分大于2,列1-列2得分大于2,得分阈值大于7.67,得分百分比峰强度大于70%,我们认为肽段是有效的。只有当蛋白具有两个或两个以上的有效肽段、总得分大于25的时候,认为是有效的,可以报告。为了比较处理组间的坚定的蛋白,我们采用每个蛋白光谱的数目和肽段的总计离子强度(总离子强度)作为蛋白量的指标。
10、ELISA分析验证
为了验证本发明中筛选的18个标志物蛋白,随机挑选4例健康男性和4健康女性两个月内收集5次的尿液标本。尿样处理同前,将处理好的尿蛋白,用Bradford法蛋白定量后,将蛋白浓度调成一致。通过ELISA试剂盒(美国Milipore公司)分别定量这18尿蛋白的浓度。
二、实验结果:
1、通过蛋白质组学方法鉴定了在健康人群尿液中18个稳定表达蛋白。 如表一所示,通过4不同蛋白质组学分离方法在健康人群尿液中共鉴定出1641个高可信度蛋白。在尽量减少尿蛋白组个体差异、性别差异和生理波动后,进一步通过对比我们以前的2D电泳结果,选择出18个在健康人群尿液中稳定表达的具有完整形式的蛋白(表三)。
表二
表三
2、验证结果
通过随机选取8个健康个体,对他们在两个月内的5个不同时相点进行回复性验证。验证结果显示GC(图3),AHSG(图4),GAA(图5),AZGP1(图6),UMOD(图7),AMBP(图8),PIGR(图9),A1BG(图10),COL6A1(图11),DNASE1(图12),CTSD(图13),RBP4(图14),CD14(图15),KNG1(图16),HPX(图17),PTGDS(图18),SERPING1(图19)和ORM1蛋白(图20)这18个蛋白这8个健康供体尿液中稳定出现,并且其含量的生理波动小(表四)。
随机选取不同泌尿系统疾病患者的晨尿,检测结果显示COL6A1,GC,RBP4,DNASE1,GAA,SERPING1,CTSD,KNG1,UMOD,PIGR,AHSG,A1BG,AMBP,AZGP1,PTGDS,HPX,CD14和ORM1蛋白这18个蛋白中的某一个或几个蛋白含量发生明显改变(表五)。
根据本实验结果,根据COL6A1,GC,RBP4,DNASE1,GAA,SERPING1,CTSD,KNG1,UMOD,PIGR,AHSG,A1BG,AMBP,AZGP1,PTGDS,HPX,CD14和ORM1这18个蛋白的变化趋势和验证结果,认为这18个蛋白所组成的谱型能够反映泌尿系统的健康状态;而当其中某一个或几个蛋白发生明显改变时则提示泌尿系统疾病的发生,可作为检测泌尿系统疾病早期筛查的标志物蛋白。将针对上述18种蛋白的特异抗体用作捕捉试剂,结合适当的检测试剂可以定性或定量检测这两种标志物蛋白。检测时可以单独使用或将这18个蛋白的特异抗体同时使用,抗体可以和检测试剂偶联使用,以提高检测效率和诊断的特异性。
表四
表五
实施例2
本实施例给出了本发明的试剂盒的多个实施方案,本领域技术人员可以根据下面举例的实施方案,结合本发明的教导对这些实施方案进行改动,本发明的范围也包括这些改动的实施方案。
为了描述方便,在下面表六中,如没有具体指明,则抗体抗原结合方式的捕捉试剂均以单克隆抗体为例;受体配体结合方式以高亲和性受体或配体为例。同时为了简化叙述,表6中列举的试剂盒均只列举主要成分,如捕捉试剂、检测试剂、可检测的标记分子等,而其他可选成分如稀释剂、缓冲剂、清洗剂等则省略。同时,下面的叙述和表格中仅给出可检测的标记分子的检测方法,其相应的方法步骤、试剂、底物液等则省略。这些省略的内容可参见本领域技术人员所熟悉的相关工具书和文献。
表六
本领域技术人员要理解上述实施例仅是本发明的较佳实施方式而已,而不能被解释为是对本发明的任何限制。任何本领域技术人员,可以在不 脱离本发明的范围的前提下,依据本发明的技术实质对以上实施例作出任何修改和改动,由此获得的本发明的实施方案的改型、变体或等同形式包涵在本发明的范围内。
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Claims (11)
1.一种用于早期筛查或辅助诊断泌尿系统疾病或病理状况的检测试剂盒,其包含一种或多种检测试剂和一种或多种捕捉试剂,所述捕捉试剂能够特异性结合泌尿系统疾病标志物,所述检测试剂能够检测与所述标志物特异性结合的捕捉试剂,其中所述标志物为选自COL6A1、GC、RBP4、DNASE1、GAA、SERPING1、CTSD、KNG1、UMOD、PIGR、AHSG、A1BG、AMBP、AZGP1、PTGDS、HPX、CD14和ORM1蛋白中的任一种或多种的任意组合。
2.权利要求1所述的检测试剂盒,其还包含检测载体,所述检测载体是溶液、芯片或检测试纸。
3.COL6A1、GC、RBP4、DNASE1、GAA、SERPING1、CTSD、KNG1、UMOD、PIGR、AHSG、A1BG、AMBP、AZGP1、PTGDS、HPX、CD14和ORM1蛋白中的任一种或多种的任意组合在制备泌尿系统疾病或病理状况诊断试剂盒中的用途。
4.一种检查待测样品中的泌尿系统疾病标志物的方法,所述方法包括以下步骤:
1)提供分别包含一种或多种检测试剂和一种或多种捕捉试剂的溶液,所述捕捉试剂能够特异性结合样品中的泌尿系统疾病标志物,所述检测试剂能够检测与所述标志物特异性结合的捕捉试剂,其中所述标志物为选自COL6A1、GC、RBP4、DNASE1、GAA、SERPING1、CTSD、KNG1、UMOD、PIGR、AHSG、A1BG、AMBP、AZGP1、PTGDS、HPX、CD14和ORM1蛋白中的任一种或多种的任意组合;
2)向样品中加入所述捕捉试剂并在适于所述捕捉试剂与所述泌尿系统疾病标志物特异性结合或反应的条件下结合或反应形成第一混合溶液,
3)向第一混合溶液中加入与所述捕捉试剂相应的检测试剂并形成第二混合溶液;
4)通过与所述检测试剂对应的检测方法在适合所述检测方法检测的条件下检测所述第二混合溶液中任一种所述泌尿系统疾病标志物的含量。
5.一种检查待测样品中的泌尿系统疾病标志物的方法,所述方法包括以下步骤:
1)提供固定有一种或多种捕捉试剂的芯片,所述捕捉试剂能够特异性结合样品中的泌尿系统疾病标志物,其中所述标志物为选自COL6A1、GC、RBP4、DNASE1、GAA、SERPING1、CTSD、KNG1、UMOD、PIGR、AHSG、A1BG、AMBP、AZGP1、PTGDS、HPX、CD14和ORM1蛋白中的任一种或多种的任意组合;
2)将样品加入至所述芯片上在适于所述泌尿系统疾病标志物与所述捕捉试剂特异性结合或反应的条件下结合或反应,
3)在清洗掉未结合或反应的样品后向芯片上加入与所述捕捉试剂相应的检测试剂,所述检测试剂能够检测与所述标志物特异性结合的捕捉试剂,
4)通过与检测试剂对应的检测方法在适合所述检测方法检测的条件下检测所述芯片中任一种所述泌尿系统疾病标志物的含量。
6.一种检查待测样品中的泌尿系统疾病标志物的方法,所述方法包括以下步骤:
1)提供已经结合有捕捉试剂和与所述捕捉试剂偶联的检测试剂的一个或多个试纸,所述捕捉试剂能够特异性结合样品中的泌尿系统疾病标志物,所述检测试剂能够检测与所述标志物特异性结合或反应的捕捉试剂,其中所述标志物为选自COL6A1、GC、RBP4、DNASE1、GAA、SERPING1、CTSD、KNG1、UMOD、PIGR、AHSG、A1BG、AMBP、AZGP1、PTGDS、HPX、CD14和ORM1蛋白中的任一种或多种的任意组合;
2)将样品加入至所述试纸上,
其中当所述捕捉试剂与任一种泌尿系统疾病标志物特异性结合或反应时,所述试纸发生颜色变化或其他可识别标识以提供关于任一种所述标志物是否存在的指示。
7.权利要求1-6中任一项所述的检测试剂盒或方法,其特征在于所述检测试剂包括可检测标记分子,所述可检测标记分子选自酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射活性物质中的一种。
8.权利要求1-7中任一项所述的检测试剂盒或方法,其特征在于所述检测试剂与捕捉试剂分装或与捕捉试剂偶联。
9.权利要求1-8中任一项所述的检测试剂盒或方法,其特征在于所述捕捉试剂是所述标志物的特异性抗体,优选单克隆抗体、多克隆抗体、抗血清、单链抗体、重组抗体或特异性抗体片段。
10.权利要求1-9中任一项所述的检测试剂盒或方法,其特征在于所述捕捉试剂是所述标志物的特异性受体或配体或特异性酶底物。
11.权利要求1-10中任一项所述的检测试剂盒或方法,其特征在于所述泌尿系统疾病或病理状况选自Bethlem肌病、GC1/GC2多态性疾病、视黄醇结合蛋白缺乏症、系统性红斑狼疮、体内酸性α-葡糖苷酶缺乏、血管性水肿、神经元蜡样脂褐质沉积病、费姿哲特徵病、肾小球膀胱肾病伴高尿酸血症和等渗尿、IgA肾病、消瘦症、急性肾脏损伤、II型糖尿病、IgA肾病、间质性膀胱炎/痛苦膀胱综合征、多囊性肾脏疾病、肾脏移植后急性排斥反应、肾细胞癌和膀胱癌中的任一种或多种的任意组合。
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