CN109154619A - 用于判定糖尿病的血液试样的分析方法及系统 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供从血液试样基于D型和L型的氨基酸量，在肾损伤对象中用于判定糖尿病并发的血液试样的分析方法、糖尿病并发的检查方法、以及输出关于糖尿病并发的病态信息的试样分析系统。为了判定糖尿病并发，通过使用选自D‑天冬氨酸、D‑脯氨酸、L‑谷氨酰胺、和L‑异亮氨酸中的至少1种氨基酸，来达到本发明的目的。

Description

用于判定糖尿病的血液试样的分析方法及系统
技术领域
本发明涉及用于从血液试样基于D型和L型的氨基酸量来判定糖尿病的血液试样的分析方法、糖尿病的检查方法、以及输出关于糖尿病的病态信息的试样分析系统。
背景技术
糖尿病是以高血糖作为特征的代谢紊乱，大致区分为1型和2型糖尿病。已知1型糖尿病是由于遗传因素和病毒感染，诱发免疫反应，β细胞被选择性地破坏而发病的疾病，通常，由于自身免疫而发生，偶尔突发。2型糖尿病是以胰岛素分泌降低和敏感性降低这两者作为原因的糖尿病。2型糖尿病被分类为生活习惯病，其原因并未完全明确。认为遗传上易于形成糖尿病的体质(遗传因素)的人由于有易于形成糖尿病那样的生活习惯(环境因素)从而2型糖尿病发病。
胰岛素主要具有抑制血糖的作用，并具有通过骨骼肌中的葡萄糖、氨基酸、钾的摄取促进与蛋白质合成的促进、肝脏中的糖新生的抑制、糖原的合成促进/分解抑制、脂肪组织中的糖的摄取与利用促进、脂肪的合成促进/分解抑制等作用来抑制血糖，促进糖原、脂肪等各种储存物质的新生的作用。健康者通过胰岛素的作用而血中的血糖常保持一定范围。血糖作为能量源是重要的，另一方面，高浓度的葡萄糖由于其醛基的反应性高，因此与生物体内的蛋白质反应而发生糖化反应，对生物体带来有害的作用。因此，因为胰岛素恒常性的异常而产生的过剩血糖会引起神经病变、微血管病变，从而糖尿病性神经病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病等发病。最终，导致包含失明、皮肤溃疡形成、截肢、心脏病、和肾损伤的多种并发症。
糖尿病的诊断中，通常使用作为蛋白质生物标志物的血红蛋白A1C(HbA1C)。由于血红蛋白在血中的寿命长，因此HbA1C发挥作为血糖管理的长期尺度的作用。另一方面，HbA1C也为了确认患者的糖尿病治疗效果而使用，但有时在接受治疗的患者中产生矛盾的结果。因此，糖尿病的判定时，通常，将HbA1C与空腹时血糖值分别作为标志物而并用，在两个标志物都指示为糖尿病的情况下，诊断为糖尿病，另一方面，在仅一个标志物指示为糖尿病的情况下，通过进一步观察糖尿病的典型症状来进行糖尿病的诊断。因此，依然最终依赖于进行诊断的医师的解释和判断。此外，HbA1C不适于接受糖尿病治疗的患者中的短期治疗效果的判定，通过并用1,5-脱水-D-葡萄糖醇、糖化白蛋白(glycoalbumin)等短期糖尿病标志物来进行治疗效果的判定、过程观察。
因此，期望开发出能够排除医师的解释、判断而进行诊断的糖尿病标志物，生物体试样中的ApoCIII蛋白质、氨酰tRNA合成酶、OLMF4多肽等作为新的糖尿病标志物被发现(专利文献1～3)，但还未得到可以代替HbA1C而使用那样的令人满意的标志物。
作为糖尿病的并发症，已知糖尿病性肾病。如果因为糖尿病而血糖值高的状态持续，则损伤肾脏的肾小球，肾功能降低。作为慢性肾衰竭的原因之一，可举出糖尿病，由于糖尿病并发肾衰竭患者与糖尿病非并发肾衰竭患者的治疗方案不同，因此需要更简便并且精度高地进行肾衰竭患者中的糖尿病并发的诊断。在肾衰竭患者中尿白蛋白值或尿白蛋白/肌酸酐比作为糖尿病并发的标志物是已知的，但在定量性、灵敏度、成本等方面存在问题。
以往，被认为在哺乳类生物体中不存在的D-氨基酸，随着检测技术的发达(专利文献4)，明确了在各种组织中存在，预测承担某些生理功能。已知体液中的若干D-氨基酸与L-氨基酸独立变动，显示出根据疾病的种类而变动(专利文献5)。专利文献5中，研究了糖尿病患者中的D-氨基酸和L-氨基酸的变动，但确认到这些40种手性氨基酸之中，D-丙氨酸、L-半胱氨酸和L-谷氨酸在糖尿病患者中变动，另一方面，未确认其它氨基酸的变动。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第5876826号公报
专利文献2：日本专利第5571696号公报
专利文献3：日本专利第5698254号公报
专利文献4：日本专利第4291628号公报
专利文献5：国际公开第2013/140785号
非专利文献
非专利文献1:Transl Res.2012Apr；159(4):303-12.
非专利文献2:International Diabetes Fegderation Managing Older Peoplewith type 2 diabetes Global Guide line
发明内容
发明所要解决的课题
期望开发出对代替空腹时血糖值、HbA1C等现有的糖尿病的诊断标志物、和尿白蛋白值或尿白蛋白/肌酸酐比这样的肾损伤中的糖尿病并发诊断标志物的诊断标志物进行鉴定并分析的技术、以及由此准确判定、检查或诊断糖尿病的技术。
用于解决课题的手段
本发明人等进行了患有肾损伤的群组(cohort)的血中手性氨基酸的解析，结果在该群组中，令人惊讶地发现若干手性氨基酸与糖尿病关联地变动，从而完成了本发明。
因此，本发明涉及一种分析方法，是用于判定糖尿病的血液试样的分析方法，其可以基于手性氨基酸之中的至少1种氨基酸的量，来判定糖尿病。
进一步其它方案中，涉及可以实施本发明的分析方法的试样分析系统。这样的试样分析系统包含存储部、输入部、分析测定部、数据处理部、和输出部，可以分析血液试样，输出糖尿病的病态信息。
进一步其它方案中，也涉及能够安装到本发明的试样分析系统的程序和存储该程序的存储介质。
发明的效果
可以提供能够基于与蛋白质的糖化、由于肾功能的降低而尿中出现的白蛋白量不同的原理而变动的新的糖尿病标志物，通过并用使用多个手性氨基酸量，能够进行精度更高的判定。
附图说明
图1A表示关于采用D-Asp进行的糖尿病的诊断的灵敏度/特异度的ROC曲线。
图1B表示关于采用D-Pro进行的糖尿病的诊断的灵敏度/特异度的ROC曲线。
图1C表示关于采用L-Gln进行的糖尿病的诊断的灵敏度/特异度的ROC曲线。
图1D表示关于采用L-Ile进行的糖尿病的诊断的灵敏度/特异度的ROC曲线。
图2A表示患有糖尿病的对象、与未患有糖尿病的对象中的D-Asp的量。
图2B表示患有糖尿病的对象、与未患有糖尿病的对象中的D-Pro的量。
图2C表示患有糖尿病的对象、与未患有糖尿病的对象中的L-Gln的量。
图2D表示患有糖尿病的对象、与未患有糖尿病的对象中的L-Ile的量。
图3A中，(1)表示年龄与D-Ala值的相关，(2)表示ROC曲线，(3)表示年龄与D/L％值间的ROC曲线。
图3B中，(1)表示年龄与D-Pro值的相关，(2)表示ROC曲线，(3)表示年龄与D/L％值间的ROC曲线。
图3C中，(1)表示年龄与D-allo-Ile值的相关，(2)表示ROC曲线。
图3D中，(1)表示年龄与D-Leu值的相关，(2)表示ROC曲线。
图3E中，(1)表示年龄与L-Ile值的相关，(2)表示ROC曲线。
图3F中，(1)表示年龄与L-Ser值的相关，(2)表示ROC曲线。
图4A是表示推定肾小球滤过量(eGFR)与(1)L-Asn值、(2)D-Asn值、和(3)D/L-Asn值的相关的图。
图4B是表示推定肾小球滤过量(eGFR)与(1)L-Ser值、(2)D-Ser值、和(3)D/L-Ser值的相关的图。
图4C是表示推定肾小球滤过量(eGFR)与(1)L-Asp值、(2)D-Asp值、和(3)D/L-Asp值的相关的图。
图4D是表示推定肾小球滤过量(eGFR)与(1)L-Ala值、(2)D-Ala值、和(3)D/L-Ala值的相关的图。
图4E是表示推定肾小球滤过量(eGFR)与(1)L-Ile值、和(2)D-allo-Ile值的相关的图。
图4F是表示推定肾小球滤过量(eGFR)与(1)L-Phe值、(2)D-Phe值、和(3)D/L-Phe值的相关的图。
图4G是表示推定肾小球滤过量(eGFR)与(1)L-Lys值、(2)D-Lys值、和(3)D/L-Lys值的相关的图。
图4H是表示推定肾小球滤过量(eGFR)与(1)L-Thr值、和(2)D-allo-Thr值的相关的图。
图4I是表示推定肾小球滤过量(eGFR)与(1)L-Pro值、(2)D-Pro值、和(3)D/L-Pro值的相关的图。
图4J是表示推定肾小球滤过量(eGFR)与(1)L-Leu值、(2)D-Leu值、和(3)D/L-Leu值的相关的图。
图4K是表示推定肾小球滤过量(eGFR)与(1)L-Trp值的相关的图。
图4L是表示推定肾小球滤过量(eGFR)与(1)L-Tyr值的相关的图。
图4M是表示推定肾小球滤过量(eGFR)与(1)L-His值、(2)D-His值、和(3)D/L-His值的相关的图。
图5是本发明的分析系统的结构图。
图6是表示用于确定糖尿病并发的动作的例子的流程图。
图7是表示用于确定肾损伤和糖尿病并发的动作的例子的流程图。
具体实施方式
本发明涉及一种分析方法，是在对象中用于判定糖尿病的血液试样的分析方法，其包含下述工序：测定手性氨基酸中的至少1种氨基酸的量的工序；和以该至少1种氨基酸的测定量为基础，判定糖尿病的工序。通过本发明的分析方法，可以判断糖尿病的病态，因此在其它方案中，本发明也可以称为诊断方法。
测定手性氨基酸的量的工序可以仅测定目标的手性氨基酸，也可以与其它手性氨基酸统一测定。此外，手性氨基酸能够成为其它疾病的诊断标志物。因此，从一次性解析多个疾病的观点考虑，优选对血液试样中的20种构成蛋白质的氨基酸，统一测定D型和L型。也可以在测定手性氨基酸的量的工序之前，进行取得血液试样的工序、对取得的血液试样进行处理的工序。血液试样只要为来源于血液、血清、血浆等血液的试样，就可以为任意的试样。
判定糖尿病的工序可以通过特定的手性氨基酸量与截止值进行比较来判定是否罹患糖尿病。关于在高值侧或低值侧的哪侧超过截止值，可以根据所使用的手性氨基酸在罹患糖尿病的情况下是增加还是减少来适当选择。例如，在D-Asp、D-Pro、和L-Gln的情况下，由于在糖尿病患者中减少，因此在属于低值群的情况下，可以判定为罹患糖尿病，在属于高值群的情况下，可以判定为未罹患糖尿病。另一方面，在L-Ile的情况下，由于在糖尿病患者中增加，因此在属于高值群的情况下，可以判定为罹患糖尿病，在属于低值群的情况下，可以判定为未罹患糖尿病。可以仅由手性氨基酸的测定量进行判定，也可以使用将手性氨基酸的测定量用任意的变数、常数进行了加工的指标值。因此，测定量中也包含由测定量求出的指标值。本发明中，所谓指标值，可以为氨基酸的测定量，也可以基于测定量计算，可以为例如与对应的异构体(即，如果是D型则为L型，如果是L型则为D型)的浓度比、比例等。作为变数，除了对应的异构体的量以外，还可以利用年龄、体重、性别、BMI等能够影响手性氨基酸量的任意变数。
具体而言，糖尿病的判定可以将血液试样中的至少1种手性氨基酸的量，基于截止值而分类成2或其以上的群，根据其分类来确定糖尿病。由本发明人等发现如果血液中的特定的手性氨基酸的量变为高值或低值，则糖尿病发病，因此在属于高值群或低值群的情况下，可以判定为患有糖尿病。因此，判定可以通过不是医师的医疗辅助者等来进行，分析机构等也可以进行。因此，本发明的分析方法也可以称为诊断的预备方法或辅助方法。
本发明的其它方案中，对于本发明的分析方法，可以代替判定糖尿病的工序，而包含作为用于判定糖尿病的病态指标值而算出的工序。该方法中通过将由分析的结果算出的病态指标值与预先确定的截止值进行比较，可以判定糖尿病发病。
在本发明中，为了判定糖尿病而使用的特定的手性氨基酸，是指构成蛋白质的氨基酸的D型或L型。D型与L型由于体内的动态、代谢不同，因此通过判别D型和L型能够以高精度进行预后预测。作为构成蛋白质的氨基酸，可举出丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、和缬氨酸(Val)。其中，从以更高精度判定糖尿病的观点考虑，优选为D-天冬氨酸(D-Asp)、D-脯氨酸(D-Pro)、L-谷氨酰胺(L-Gln)、和L-异亮氨酸(L-Ile)。进一步优选使用选自D-天冬氨酸(D-Asp)、D-脯氨酸(D-Pro)、L-谷氨酰胺(L-Gln)、和L-异亮氨酸(L-Ile)中的至少1种氨基酸、或它们的任意的组合。
用于判定糖尿病的界限可以通过对群组进行解析，进行统计处理来任意地确定。统计处理的方法只要使用本领域技术人员周知的方法即可，可以使用例如ROC解析、t检验等，也可以使用健康者群或糖尿病患者群的平均值、中心值、X百分比值。这里X可以选择任意的数值，可以适当使用3、5、10、15、20、30、40、60、70、80、85、90、95、97。截止值可以为1个，也可以根据疾病的严重度来分类病态。根据群组的种类，规定界限的截止值不同，作为一例，将本申请实施例中使用的群组通过ROC解析，用于确定糖尿病的截止值在D-天冬氨酸的情况下可以使用0.1μg/ml，在D-脯氨酸的情况下可以使用2.5μg/ml，在L-谷氨酰胺的情况下可以使用665μg/ml，和在L-异亮氨酸的情况下可以使用49.3μg/ml。对象的血中D-氨基酸浓度在比这些截止值高或低的情况下，可以认定为糖尿病发病。然而，并不意图将所使用的截止值限定于上述截止值。
所谓对象，可以为任意的对象，例如能够对健康者、有患糖尿病可能性的人，进行本发明的分析方法。在某方案中，在健康诊断中，使用本发明的分析方法，因此对象中包含任意的对象为好。
本发明的其它方案中，对象为患有肾损伤的对象。在该情况下，在本发明中糖尿病的判定能够在判定为患有肾损伤的患者中判定是否具有糖尿病作为并发症。因此，一方案中，本发明中的所谓对象，是指诊断或判定为肾损伤的患者。肾损伤是指可见肾功能的降低的状态，大致区分为急性肾衰竭和慢性肾衰竭。肾功能的降低通过肾小球滤过量(GFR)的降低来确定，但也可以通过由肌酸酐值，以年龄、性别等变数为基础而算出的推定肾小球滤过量(eGFR)来确定。进一步其它方案中可以通过显示肾功能的降低的肾损伤标志物例如血清肌酸酐浓度、KIM-1、NGAL等来确定。进一步其它方案中，也可以对判定为肾损伤的患者，测定手性氨基酸中肾损伤的判定所使用的至少1种氨基酸的量，基于该测定量而事先或同时判定。
因此，本发明的进一步方案中，也涉及以在任意的对象中，判定肾损伤，并且判定糖尿病并发作为目的的血液试样的分析方法。该分析方法包含下述工序：测定手性氨基酸中肾损伤的判定所使用的至少1种氨基酸、和糖尿病的并发的判定所使用的至少1种氨基酸的量的工序；和以该肾损伤的判定所使用的至少1种氨基酸的测定量为基础，判定肾损伤的工序；和在判定为肾损伤的情况下，以该糖尿病并发的判定所使用的至少1种氨基酸的测定量为基础，判定糖尿病并发的工序。
为了判定糖尿病，以前需要使用空腹时血糖值、HbA1C等现有的糖尿病的诊断标志物，或者在诊断肾损伤的患者中测定尿白蛋白值或尿白蛋白/肌酸酐比。因此，为了诊断患有肾损伤的患者中的糖尿病的并发，需要分别解析肾损伤标志物与糖尿病标志物，但如果使用本发明，则能够以已经取得的手性氨基酸量为基础，在判定肾损伤的基础上，判定糖尿病并发。
肾损伤的判定基于血液试样中的至少1种手性氨基酸的量来进行。
由本发明人等发现血液中的选自D-天冬酰胺、D-丝氨酸、D-天冬氨酸、D-别-苏氨酸、D-丙氨酸、D-脯氨酸、D-亮氨酸、L-组氨酸、L-丝氨酸、L-天冬氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-赖氨酸、和L-酪氨酸中的至少1种手性氨基酸的量与eGFR值相关(图4A-L)，因此可以使用这些手性氨基酸量，来判别肾损伤。更具体而言，肾损伤可以通过将血液试样中的至少1种手性氨基酸的量适用到预先分类的2或其以上的群来判定肾损伤，在进一步方案中可以判定肾损伤的严重度。
用于判定肾损伤的界限也同样地可以通过对群组进行解析，进行统计处理来任意地确定。统计处理的方法只要使用本领域技术人员周知的方法即可，可以使用例如ROC解析、t检验等，也可以使用健康者群或患者群的平均值、中心值、X百分比值。这里X可以选择任意的数值，可以适当使用3、5、10、15、20、30、40、60、70、80、85、90、95、97。截止值可以为1个，也可以根据疾病的严重度来分类病态。作为肾损伤的判定所使用的手性氨基酸，可举出D-天冬酰胺、D-丝氨酸、D-天冬氨酸、D-别-苏氨酸、D-丙氨酸、D-脯氨酸、D-亮氨酸、L-组氨酸、L-丝氨酸、L-天冬氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-赖氨酸、和L-酪氨酸，各自的截止值可以进行群组解析来任意地确定。在对象的血中D-氨基酸浓度比截止值高的情况下，可以判定为肾损伤。
本发明的进一步方案中，本发明涉及基于血液试样中的至少1种手性氨基酸的量，来确定eGFR值的方法。该方法中，包含下述工序：测定血液试样中的至少1种手性氨基酸的量的工序；和基于该至少1种手性氨基酸的测定值来确定eGFR值的工序。一方案中，基于手性氨基酸的测定值来确定eGFR值的工序可以基于预先确定的回归曲线来确定。进一步其它方案中，基于手性氨基酸的测定值来确定eGFR值的工序只要预先将群组根据手性氨基酸的量分成多个群，将该群与eGFR值或其范围预先关联起来，并将测定值分类到该群即可。作为这样的手性氨基酸，可以使用选自D-天冬酰胺、D-丝氨酸、D-天冬氨酸、D-别-苏氨酸、D-丙氨酸、D-脯氨酸、D-亮氨酸、L-组氨酸、L-丝氨酸、L-天冬氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-赖氨酸、和L-酪氨酸中的至少1种氨基酸。
手性氨基酸也能够根据其种类而成为肾损伤标志物和糖尿病标志物，因此通过预先网罗地测定手性氨基酸，可以在判定肾损伤的基础上，判定糖尿病的并发症。
在肾损伤患者中未见增加或减少的手性氨基酸在肾损伤患者中判定糖尿病并发方面是优选的，使用选自D-天冬氨酸(D-Asp)、L-谷氨酰胺(L-Gln)、和L-异亮氨酸(L-Ile)中的至少1种氨基酸、或它们的任意的组合。
试样中的手性氨基酸量的测定可以使用本领域技术人员周知的任何方法来实施。例如，通过预先用邻苯二甲醛(OPA)、N-叔丁基氧基羰基-L-半胱氨酸(Boc-L-Cys)等修饰试剂立体异构特异性地将D-和L-氨基酸衍生物化，然后，使用ODS-80TsQA那样的分析柱将100mM的乙酸盐缓冲液(pH6.0)与乙腈的混合液进行梯度洗脱而分离的方法，可以用于氨基酸的D-型和L-型的同时测定。此外，预先用4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并二唑(NBD-F)那样的荧光试剂将D-和L-氨基酸衍生物化，然后，使用ODS-80TsQA、Mightysil RP-18GP等那样的分析柱立体异构非特异性地将各氨基酸分离后，使用Pirkle型手性固定相柱(例如Sumichiral OA-2500S或R)进行光学拆分的方法可以用于构成蛋白质的氨基酸的微量测定(浜濑健司和财津洁，分析化学，53卷，677-690(2004))。本说明书中的光学拆分柱系是指至少使用光学拆分柱的分离分析系，有时包含采用光学拆分柱以外的分析柱进行的分离分析。更具体而言，通过使用光学异构体的分析方法，可以测定试样中的D-/L-氨基酸浓度，上述光学异构体的分析方法的特征在于，包含下述步骤：将包含具有光学异构体的成分的试样，与作为流动相的第一液体一起，通过作为固定相的第一柱填充剂，而将上述试样的上述成分分离的步骤；将上述试样的上述成分各自在多回路(Multiloop)单元中单独保持的步骤；将在上述多回路单元中单独保持的上述试样的上述成分各自，与作为流动相的第二液体一起，通过流路而供给到作为固定相的具有光学活性中心的第二柱填充剂，将上述试样的成分各自所包含的上述光学异构体进行拆分的步骤；和检测上述试样的成分各自所包含的上述光学异构体的步骤(日本专利第4291628号)。替代地，通过使用判别氨基酸的光学异构体的单克隆抗体例如与D-亮氨酸、D-天冬氨酸等特异性地结合的单克隆抗体的免疫学方法，可以定量D-氨基酸(日本特开2009-184981说明书)。
本发明中，可以将血液试样中的单独一种的手性氨基酸量用于糖尿病的判定，也可以与可以用于糖尿病的判定的其它1种以上的手性氨基酸量组合使用。此外，本发明的分析方法可以进一步包含测定与糖尿病有关的变数的工序，将手性氨基酸量与这样的变数组合，可以使用于糖尿病的判定。作为这样的变数，可举出糖尿病的病史、年龄、性别、空腹时血糖的有无，进一步也可以举出已知的糖尿病标志物、糖尿病并发标志物。作为这样的已知的标志物，可举出HbA1C、空腹时血糖值、1,5-脱水-D-葡萄糖醇、糖化白蛋白、尿白蛋白值或尿白蛋白/肌酸酐比等。
在通过本发明的分析方法判定糖尿病或糖尿病与肾损伤的并发的情况下，选择进行适于糖尿病和/或糖尿病性肾病的治疗。不限定于以下治疗，例如需要进一步进行血糖值管理、生活习惯改善等治疗。以血糖值管理作为目的，以胰岛素抵抗性改善、胰岛素分泌促进、糖吸收排泄调节作为目的，进行双胍药、噻唑烷药、磺酰脲药、胰岛素分泌促进药、DPP4抑制药、α-葡糖苷酶抑制药、SGLT2抑制药等的给药治疗。作为生活习惯的改善，指导例如禁烟、用于降低BMI值的运动、饮食限制。这些治疗方案基于手性氨基酸量，在接受医师问诊后确定。因此，本发明的其它方案中，涉及糖尿病并发肾损伤的治疗方法，其包含实施本发明的分析方法，进一步进行糖尿病并发的肾损伤的治疗。关于治疗方法的详细内容，可以通过参照例如非专利文献1、非专利文献2来适当选择。这些文献援用到本说明书中。
本发明的进一步方案中，涉及使用手性氨基酸，确定对象的推定年龄的确定方法。该方法包含下述工序：测定血液试样中的选自D-丙氨酸、D-亮氨酸、D-别-异亮氨酸、D-脯氨酸、L-丝氨酸、和L-异亮氨酸中的至少1种氨基酸的量的工序；和基于上述至少1种氨基酸的测定量、与预先确定的年龄与D-氨基酸值的相关曲线来确定年龄的工序。该方法基于发现了血中的手性氨基酸中的若干氨基酸与年龄具有相关性(图3A～F)。通过预先在任意的群组中在年龄与年龄判定用的手性氨基酸之间取得回归曲线、截止值，与测定值进行比较，从而可以基于年龄判定用的手性氨基酸值，来确定推定年龄。根据这样的方法，能够在意识模糊者、痴呆患者中进行年龄的推定。
作为截止值，例如作为可以判别超过70岁的对象的截止值，在使用本发明的群组计算的情况下，在D-丙氨酸(D-Ala)的情况下为4.7μg/ml以上，在D-脯氨酸(D-Pro)的情况下为2.5μg/ml以上，在D-别异亮氨酸(D-allo-Ile)的情况下为0.1μg/ml以上，在D-亮氨酸(D-Leu)的情况下为0.50以上，在L-丝氨酸(L-Ser)的情况下为134.6以下，在L-异亮氨酸(L-Ile)的情况下可以选择58.6以下。相对于年龄的截止值可以适当选择。相对于年龄的截止值可以适当选择。
本发明的试样分析系统和程序以实施本发明的方法的方式构成。图5是本发明的试样分析系统的结构图。这样的试样分析系统10包含存储部11、输入部12、分析测定部13、数据处理部14、和输出部15，可以分析对象的血液的试样，输出病态信息。更具体而言，在本发明的试样分析系统10中，
存储部11存储从输入部12输入的用于判别糖尿病的、血中手性氨基酸量的截止值与糖尿病的病态信息，
分析测定部13将上述对象的血液试样中的构成蛋白质的氨基酸中的至少1种用于判别糖尿病的手性氨基酸分离并进行定量，
数据处理部14通过将上述至少1种手性氨基酸的量的测定值与存储在存储部11的截止值进行比较，来确定对象的糖尿病的信息，
输出部15可以输出关于对象的糖尿病的病态信息。
在本发明的试样分析系统和程序中，进一步可以包含：
存储部11存储从输入部12输入的用于判别肾损伤的血中手性氨基酸量的截止值与肾损伤的信息，
分析测定部13将上述对象的血液试样中的构成蛋白质的氨基酸中的至少1种用于判定肾损伤的手性氨基酸分离并进行定量，
数据处理部14通过将上述至少1种用于判别肾损伤的手性氨基酸的量的测定值与存储在存储部11的用于判别肾损伤的手性氨基酸的截止值进行比较，来确定对象的肾损伤的信息，
由此输出部15可以与对象的肾损伤的信息一起输出关于糖尿病的病态信息。
存储部11具有RAM、ROM、闪速存储器等存储器装置、硬磁盘驱动器等固定磁盘装置、或软磁盘、光磁盘等可移动的存储装置等。存储部11除了存储通过分析测定部测定的数据、从输入部12输入的数据和指示、通过数据处理部14进行的演算处理结果等以外，还存储信息处理装置的各种处理所使用的计算机程序、数据库等。计算机程序可以经由例如CD-ROM、DVD-ROM等计算机可读取的记录介质、因特网而安装。计算机程序使用公知的安装程序等而安装于存储部。
输入部12为接口等，也包含键盘、鼠标等操作部。由此，输入部可以输入通过分析测定部13测定的数据、通过数据处理部14进行的演算处理的指示等。此外，关于输入部12，例如在分析测定部13位于外部的情况下，与操作部分开，可以包含可以将测定的数据等经由网络、存储介质而输入的接口部。
分析测定部13进行血液试样中的手性氨基酸的量的测定工序。因此，分析测定部13具有能够进行手性氨基酸的分离和测定的结构。氨基酸可以1个个分析，但也可以对一部分或全部种类的氨基酸统一分析。分析测定部13并不意图限定于以下结构，但例如可以为具备试样导入部、光学拆分柱、检测部的高效液相色谱系统(HPLC)。分析测定部13可以与试样分析系统10分开构成，可以将测定的数据等使用网络、存储介质经由输入部12输入。
数据处理部14以通过将测定的手性氨基酸的量与存储在存储部11的截止值进行比较，来判定糖尿病的并发的方式构成。数据处理部14按照存储在存储部11的程序，对通过分析测定部13测定并存储在存储部11的数据，执行各种演算处理。演算处理通过数据处理部14所包含的CPU来进行。该CPU可以包含控制分析测定部13、输入部12、存储部11、和输出部15的功能模块，进行各种控制。这些各部可以由各自独立的集成电路、微处理器、固件等构成。
输出部15以输出作为通过数据处理部14进行演算处理的结果的病态指标值和/或病态信息的方式构成。数据处理部14中的演算处理结果可以直接输出到输出部15，也可以暂时存储在存储部11，然后根据需要输出到输出部15。输出部15可以为直接表示演算处理的结果的液晶显示器等显示装置、打印机等输出机构，也可以为用于向外部存储装置的输出或经由网络而输出的接口部。
图6是表示采用本发明的程序的用于确定糖尿病的动作的例子的流程图。
具体而言，本发明的程序是使包含输入部12、输出部15、数据处理部14、存储部11的信息处理装置确定糖尿病的信息的程序。本发明的程序包含用于使上述信息处理装置执行以下动作的指令：
使从输入部12输入的至少1种手性氨基酸的预先确定的截止值与糖尿病的信息存储在存储部11；
使从输入部12输入的至少1种手性氨基酸的量的测定值存储在存储部11，
在数据处理部14中，使存储在存储部11的截止值、与存储在存储部11的测定值进行比较，来确定糖尿病的信息；以及
使糖尿病的信息输出到输出部15。
本发明的程序可以存储在存储介质，也可以经由因特网或LAN等电信线路来提供。
图7是表示采用本发明的程序的用于与肾损伤的病态信息一起，确定糖尿病并发的动作的例子的流程图。
具体而言，本发明的程序是使包含输入部12、输出部15、数据处理部14、存储部11的信息处理装置确定糖尿病并发的信息的程序。本发明的程序包含用于使上述信息处理装置执行以下动作的指令：
使从输入部12输入的用于判定肾损伤的至少1种手性氨基酸和用于判定糖尿病的至少1种手性氨基酸的预先确定的截止值分别与肾损伤和糖尿病并发的信息一并存储；
使从输入部12输入的用于判定肾损伤的至少1种手性氨基酸和用于判定糖尿病的至少1种手性氨基酸的测定值分别存储在存储部11，
在数据处理部14中，使存储在存储部11的截止值、与存储在存储部11的测定值分别进行比较，确定肾损伤和糖尿病并发的信息；
使肾损伤和糖尿病的信息输出到输出部15。
本发明的程序可以存储在存储介质，也可以经由因特网或LAN等电信线路来提供。
本发明的其它方案中，本发明的系统可以为推定年龄的确定系统。该系统包含存储部、输入部、数据处理部、和输出部，可以进行以下动作：
从输入部输入用于判定年龄的血中手性氨基酸中的至少1种氨基酸的量与年龄的回归曲线或截止值，存储在存储部，
从输入部输入对象的血液试样中的手性氨基酸中的至少1种氨基酸的量的测定值，存储在存储部，
数据处理部基于存储的上述氨基酸的量的测定值、与上述回归曲线或截止值，来确定对象的推定年龄；
将推定年龄输出到输出部。
本发明的进一步方案中，本发明也涉及执行本发明的确定eGFR值的方法的eGFR值的确定系统。该系统包含存储部、输入部、数据处理部、和输出部，可以进行以下动作：
从输入部输入用于判定eGFR值的血中手性氨基酸中的至少1种氨基酸的量与eGFR值的回归曲线或截止值，存储在存储部，
从输入部输入对象的血液试样中的手性氨基酸中的至少1种氨基酸的量的测定值，存储在存储部，
数据处理部基于存储的上述氨基酸的量的测定值、与上述回归曲线或截止值，来确定对象的eGFR值；
将eGFR值输出到输出部。
信息处理装置在具备分析测定部13的情况下，代替从输入部12输入至少1种手性氨基酸的量的值，分析测定部13可以包含用于使信息处理装置执行从血液试样测定该值并使其存储在存储部11的指令。
在本说明书中提及的全部文献的整体通过引用而并入到本说明书中。
以下说明的本发明的实施例仅以例示作为目的，不限定本发明的技术范围。本发明的技术范围仅仅受权利要求的记载限定。以不超出本发明的宗旨作为条件，可以进行本发明的变更，例如本发明的构成要件的追加、删除和替换。
实施例
组和样品的分析
本发明人等在2005年8月～2009年1月，从りんくう综合医疗中心(Rinku GeneralMedical Centre)的第一肾脏内科，将未接受透析的患有CKD 3期、4期和5期的118名连续患者登记到前瞻性调查。在一晚的禁食后，从患者取得基线血液试样，装入到塑料制管而调制血浆。先除去只能取得不充分的血液试样的患者。
本试验是被りんくう综合医疗中心的伦理委员会承认的试验，而且基于赫尔辛基宣言来进行。
基线的包含基准设为年龄小于90岁，没有关于恶性肿瘤的并发症，和没有对感染症的感染。除去只能获得不完全的基线数据的患者(n＝2)或只能取得不充分的量的血浆试样的患者(n＝4)、和在登记后1月以内开始肾替代疗法的患者(n＝4)。本试验被りんくう综合医疗中心的设施内伦理委员会和大阪综合医疗中心承认，而且对全部患者，关于参加本试验，获得了记入式的知情同意。肾功能基于针对日本人新开发的等式使用推定肾小球滤过量(eGFR)，由在本医院最初接受诊断时的基线数据评价。
式如下所述：
[数学式1]
eGFR＝194×血清肌酸酐(SCr)-1.094×年龄-0.287
{式中，年龄的单位是年，SCr的单位是mg/dL，以及肾小球滤过量(GFR)的单位是mL/min/1.73m2体表面}。
对于女性患者，对数学式的计算值乘以校正系数0.739。
通过该设施内的酶方法计测血清肌酸酐。在确定基线时回收随机的尿试样(10ml)，测定了尿蛋白和肌酸酐的比率。基线中的其它变数为年龄、性别、按照国际疾病分类第10版(ICD10)的规则E10～E14定义的糖尿病、收缩期血压、扩张期血压、血红蛋白、和肾素-血管紧张素系抑制剂、β阻断剂、和钙阻断剂的使用。患者的基线特征如下所述：
[表1]
表1患者的基线特征
特征 全部集合(n＝108)
年龄(yr) 63.5±10.9
男性的比例(％) 75.0
eGFR(mL/min/1.73m<sup>2</sup>) 21.0±12.4
平均血压(mmHg) 95.1±12.9
收缩期血压 139.1±21.7
扩张期血压 73.2±11.7
血红蛋白(g/dL) 11.0±1.9
尿蛋白(g/gCre) 2.8±3.8
疾病的起源(％)
糖尿病 30.6
慢性肾小球肾炎 23.1
良性肾小球硬化 35.2
其它 10.2
ACEi和/或ARB的使用率(％) 68.8
β-阻断剂的使用率(％) 32.4
钙阻断剂的使用率(％) 67.6
数值作为平均±SD或％而表示。
eGFR：推定肾小球滤过率；ACEi：血管紧张素转化酶抑制剂；ARB：血管紧张素受体阻断剂
在本试验中作为“肾脏转归(kidney outcome)”而定义的最初的终点设为需要肾替代疗法的末期肾脏病(ESKD)、与全部死因死亡的合计。患者在门诊受到通常的随访护理。将数据在2011年末作为源文件而回收。将基线和随访数据从医院的医疗记录和出院概要、门诊记录、与初诊和透析护理医师的会面、和死亡诊断书回收。终点由至少2名医师确认。患者的随访可以正确利用。原因是，(i)本设施为大阪府的南部的中央医院，而且该地方没有其它中央医院，和(ii)与初诊和透析护理的医师的地域合作关系良好。
样品调制
来自人血浆的样品调制按照Journal of Chromatography.B,Analyticaltechnologies in the biomedical and life sciences 966,187-192(2014)的记载改变而进行。如果简洁记载，则将20倍量的甲醇加入到血浆中，然后将一定量(由甲醇匀浆获得的10μl的上清液)取到褐色管中，然后进行了NBD衍生化(将0.5μl的血浆用于反应)。将溶液在减压下干燥，加入20μl的200mM硼酸钠缓冲液(pH8.0)和5μl的荧光标记试剂(加有40mM的4-氟-7-硝基2,1,3-苯并二唑(NBD-F)的无水MeCN)，接下来在60℃下加热2分钟。加入0.1％TFA水溶液(75μl)，然后将2μl的反应混合液供于2D-HPLC。
采用2D-HPLC的氨基酸对映体的测定
将氨基酸的对映体，如J Chromatogr A 1217,1056-1062(2010)、或Journal ofchromatography.B,Analytical technologies in the biomedical and life sciences877,2506-2512(2009)所记载的那样，使用micro 2D-HPLC平台来定量。如果简洁记载，则将氨基酸的NBD-衍生物，使用反相柱(单片式ODS柱，0.53mmi.d.×100mm；资生堂)，使用包含MeCN、THF和TFA的水性流动相进行梯度溶出。为了将D型和L型分离而进行测定，使用多回路阀自动回收目标氨基酸的级分，然后供于对映选择性柱(KSAACSP-001S或Sumichiral oA-3200，1.5mmi.e.×250mm；自填充，从资生堂和Sumika Chemical Analysis Service取得材料))。在具有4种立体异构体(L型、D型、L-别型、D-别型)的Ile、Thr的计测时，将L型和D型、与非对映异构体(L-别型和D别型)通过第一维的反相模式进行分离(这些非对映异构体通过反相模式被分离)。接下来将该对映体(L与D、L-别与D-别)通过对映选择性柱以二维分离。流动相为包含柠檬酸或甲酸的MeOH-MeCN的混合溶液，然后在470nm下激发NBD-氨基酸的荧光，在530nm下检测。通过荧光检测取得全部定量数据。使用HPLC-MS/MS，确认实际的生物的基质中的D-氨基酸的存在。
统计处理
糖尿病的判定基于International Classification of Diseases,TenthRevision(ICD-10)codes E10-E14，由二名医师判定。将分离出的各手性氨基酸量以糖尿病患者和未患有糖尿病的患者区分，结果D-Asp、D-Pro、和L-Gle中显示显著低值，在L-Ile中显示显著高值(图2A-2D)。接下来为了研究这些各手性氨基酸的糖尿病的诊断特异性，对本群组描绘ROC曲线(图1A-D)。基于这样的ROC曲线来求出用于判定糖尿病的截止值，结果在D-天冬氨酸的情况下为0.1μg/ml，在D-脯氨酸的情况下为2.5μg/ml，在L-谷氨酰胺的情况下为665μg/ml，和在L-异亮氨酸的情况下为49.3μg/ml。
接下来研究了分离出的各手性氨基酸量与年龄的相关。将年龄与各手性氨基酸量表示于散点图，算出相关系数，结果在D-Ala、D-Pro、D-allo-Ile、D-Leu、L-Ile、和L-Ser中，获得了该血液试样中的量与年龄的相关(p＜0.05)(图3A-F(1))。接下来将患者分成70岁以上的群、和小于70岁的群，为了研究这些各手性氨基酸和年龄的确定特异性，描绘ROC曲线(图3A-F(2))。此外，关于D-Ala和D-Pro，算出与对应的异构体(即L-Ala和L-Pro)的比例、D/L％，关于D/L％，也为了研究同群中的年龄的确定特异性而描绘ROC曲线(图3A-B(3))。基于这样的ROC曲线来求出用于确定超过70岁的对象的截止值，结果在D-Ala的情况下为4.7μg/ml以上，在D-Pro的情况下为2.5μg/ml以上，在D-allo-Ile的情况下为0.1μg/ml以上，在D-Leu的情况下为0.5μg/ml以上，在L-Ser的情况下为134.6以下，在L-Ile的情况下为58.6以下。在D/L％-Ala的情况下为1.3以上，在D/L％-Pro的情况下为1.1以上。
接下来研究分离出的各手性氨基酸量、与推定肾小球滤过量(eGFR)的相关。将eGFR值和各手性氨基酸量表示于散点图，算出相关系数，结果在D-天冬酰胺、D-丝氨酸、D-天冬氨酸、D-别-苏氨酸、D-丙氨酸、D-脯氨酸、D-亮氨酸、L-组氨酸、L-丝氨酸、L-天冬氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-赖氨酸、和L-酪氨酸中，取得了该血液试样中的量与eGFR值的相关(图4A-L(1)～(3))。

Claims (13)

1.一种分析方法，是在对象中用于判定糖尿病的血液试样的分析方法，其包含下述工序：
测定选自D-天冬氨酸、D-脯氨酸、L-谷氨酰胺、和L-异亮氨酸中的至少1种氨基酸的量的工序；
将所述至少1种氨基酸的测定量与预先确定的截止值进行比较，来判定糖尿病的工序。
2.根据权利要求1所述的分析方法，所述截止值基于ROC曲线求出。
3.根据权利要求1或2所述的分析方法，所述截止值在D-天冬氨酸的情况下为0.1μg/ml，在D-脯氨酸的情况下为2.5μg/ml，在L-谷氨酰胺的情况下为665μg/ml，和在L-异亮氨酸的情况下为49.3μg/ml。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的分析方法，所述对象为患有肾损伤的对象。
5.一种血液分析系统，是包含存储部、输入部、数据处理部、和输出部的、在对象中用于判定糖尿病的血液分析系统，在所述血液分析系统中，
从输入部输入用于判定糖尿病的血中手性氨基酸中的至少1种氨基酸的量的截止值与糖尿病的病态信息，存储在存储部，
从输入部输入对象的血液试样中的手性氨基酸中的至少1种氨基酸的量的测定值，存储在存储部，
数据处理部将存储的所述氨基酸的量的测定值与存储的截止值进行比较，来确定对象的糖尿病的病态信息；
将糖尿病的病态信息输出到输出部，
所述用于判定糖尿病的血中手性氨基酸为选自D-天冬氨酸、D-脯氨酸、L-谷氨酰胺、和L-异亮氨酸中的至少1种氨基酸。
6.根据权利要求5所述的血液分析系统，其进一步包含分析测定部，该分析测定部从对象的血液试样分离出所述血中手性氨基酸并进行定量而确定测定值，代替输入部或经由输入部而输入测定值。
7.根据权利要求5或6所述的血液分析系统，所述截止值基于ROC曲线求出。
8.根据权利要求5～7中任一项所述的血液分析系统，所述截止值在D-天冬氨酸的情况下为0.1μg/ml，在D-脯氨酸的情况下为2.5μg/ml，在L-谷氨酰胺的情况下为665μg/ml，和在L-异亮氨酸的情况下为49.3μg/ml。
9.一种推定方法，是在对象中推定年龄的推定方法，其包含下述工序：
测定血液试样中的选自D-丙氨酸、D-亮氨酸、D-别-异亮氨酸、D-脯氨酸、L-丝氨酸、和L-异亮氨酸中的至少1种氨基酸的量的工序，
基于所述至少1种氨基酸的测定量、和预先确定的年龄与氨基酸值来确定年龄的工序。
10.根据权利要求9所述的推定方法，所述确定年龄的工序基于截止值来确定。
11.根据权利要求10所述的推定方法，所述截止值基于ROC曲线确定，用于推定70岁以上的截止值在D-丙氨酸的情况下为4.7μg/ml以上，在D-脯氨酸的情况下为2.5μg/ml以上，在D-别-异亮氨酸的情况下为0.1μg/ml以上，在D-亮氨酸的情况下为0.5以上，在L-丝氨酸的情况下为134.6以下，在L-异亮氨酸的情况下为58.6以下。
12.根据权利要求9所述的推定方法，所述确定年龄的工序基于预先确定的回归曲线来确定。
13.一种确定系统，是包含存储部、输入部、数据处理部、和输出部的、确定对象的推定年龄的确定系统，在所述确定系统中，
从输入部输入用于判定年龄的血中手性氨基酸中的至少1种氨基酸的量与年龄的回归曲线或截止值，存储在存储部，
从输入部输入对象的血液试样中的手性氨基酸中的至少1种氨基酸的量的测定值，存储在存储部，
数据处理部基于存储的所述氨基酸的量的测定值、与所述回归曲线或截止值，来确定对象的推定年龄；
将推定年龄输出到输出部，
所述用于判定年龄的血中手性氨基酸为选自D-丙氨酸、D-亮氨酸、D-别-异亮氨酸、D-脯氨酸、L-丝氨酸、和L-异亮氨酸中的至少1种氨基酸。
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