SK13012003A3 - Kvantitatívny jednostupňový imunologický test v lyofilizovanej forme - Google Patents
Kvantitatívny jednostupňový imunologický test v lyofilizovanej forme Download PDFInfo
- Publication number
- SK13012003A3 SK13012003A3 SK1301-2003A SK13012003A SK13012003A3 SK 13012003 A3 SK13012003 A3 SK 13012003A3 SK 13012003 A SK13012003 A SK 13012003A SK 13012003 A3 SK13012003 A3 SK 13012003A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- acid
- microtiter plate
- plate
- wells
- sample
- Prior art date
Links
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims abstract description 14
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims abstract description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 34
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 32
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 28
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 21
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 20
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 20
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 18
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 claims description 18
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 16
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims description 12
- -1 ...) Proteins 0.000 claims description 11
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 claims description 8
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 6
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 6
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 claims description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 5
- CDAWCLOXVUBKRW-UHFFFAOYSA-N 2-aminophenol Chemical compound NC1=CC=CC=C1O CDAWCLOXVUBKRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N benzylamine Chemical compound NCC1=CC=CC=C1 WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- PAFZNILMFXTMIY-UHFFFAOYSA-N cyclohexylamine Chemical compound NC1CCCCC1 PAFZNILMFXTMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 4
- QWVGKYWNOKOFNN-UHFFFAOYSA-N o-cresol Chemical compound CC1=CC=CC=C1O QWVGKYWNOKOFNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- HXITXNWTGFUOAU-UHFFFAOYSA-N phenylboronic acid Chemical compound OB(O)C1=CC=CC=C1 HXITXNWTGFUOAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 238000007373 indentation Methods 0.000 claims description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 claims description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- QSAWQNUELGIYBC-OLQVQODUSA-N (1s,2r)-cyclohexane-1,2-dicarboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1CCCC[C@H]1C(O)=O QSAWQNUELGIYBC-OLQVQODUSA-N 0.000 claims description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- IBTSWKLSEOGJGJ-UHFFFAOYSA-N (3-acetamidophenyl)boronic acid Chemical compound CC(=O)NC1=CC=CC(B(O)O)=C1 IBTSWKLSEOGJGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- QBLFZIBJXUQVRF-UHFFFAOYSA-N (4-bromophenyl)boronic acid Chemical compound OB(O)C1=CC=C(Br)C=C1 QBLFZIBJXUQVRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- GTPQXTSQORFWTG-UHFFFAOYSA-N 1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-4-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1NCNC=C1 GTPQXTSQORFWTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- PWMWNFMRSKOCEY-UHFFFAOYSA-N 1-Phenyl-1,2-ethanediol Chemical compound OCC(O)C1=CC=CC=C1 PWMWNFMRSKOCEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 claims description 2
- 206010003827 Autoimmune hepatitis Diseases 0.000 claims description 2
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 claims description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 claims description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 claims description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 claims description 2
- GSNUFIFRDBKVIE-UHFFFAOYSA-N DMF Natural products CC1=CC=C(C)O1 GSNUFIFRDBKVIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 2
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 claims description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 claims description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 claims description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 2
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 2
- KGUHOFWIXKIURA-VQXBOQCVSA-N [(2r,3s,4s,5r,6r)-6-[(2s,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]methyl dodecanoate Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COC(=O)CCCCCCCCCCC)O[C@@H]1O[C@@]1(CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 KGUHOFWIXKIURA-VQXBOQCVSA-N 0.000 claims description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000013566 allergen Substances 0.000 claims description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000001448 anilines Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 claims description 2
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 claims description 2
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 claims description 2
- 229940099352 cholate Drugs 0.000 claims description 2
- KVZJLSYJROEPSQ-UHFFFAOYSA-N cis-DMCH Natural products CC1CCCCC1C KVZJLSYJROEPSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 claims description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 2
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- WQXNXVUDBPYKBA-YFKPBYRVSA-N ectoine Chemical compound CC1=[NH+][C@H](C([O-])=O)CCN1 WQXNXVUDBPYKBA-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000005417 food ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 claims description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 2
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 claims description 2
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 claims description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 2
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 2
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 claims description 2
- HUMMCEUVDBVXTQ-UHFFFAOYSA-N naphthalen-1-ylboronic acid Chemical compound C1=CC=C2C(B(O)O)=CC=CC2=C1 HUMMCEUVDBVXTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 claims description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 claims description 2
- BHAAPTBBJKJZER-UHFFFAOYSA-N p-anisidine Chemical compound COC1=CC=C(N)C=C1 BHAAPTBBJKJZER-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- IWDCLRJOBJJRNH-UHFFFAOYSA-N p-cresol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1 IWDCLRJOBJJRNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 2
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 claims description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 claims description 2
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000009597 pregnancy test Methods 0.000 claims description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 claims description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims description 2
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229940032085 sucrose monolaurate Drugs 0.000 claims description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 2
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 claims description 2
- PFURGBBHAOXLIO-PHDIDXHHSA-N trans-cyclohexane-1,2-diol Chemical compound O[C@@H]1CCCC[C@H]1O PFURGBBHAOXLIO-PHDIDXHHSA-N 0.000 claims description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 claims description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 2
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- LHGVFZTZFXWLCP-UHFFFAOYSA-N guaiacol Chemical compound COC1=CC=CC=C1O LHGVFZTZFXWLCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 claims 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 claims 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 34
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 28
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 21
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 13
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 13
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 9
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 8
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 7
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 6
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 6
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 6
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 5
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 4
- 239000012897 dilution medium Substances 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 4
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 4
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 101001033233 Homo sapiens Interleukin-10 Proteins 0.000 description 2
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 102000052620 human IL10 Human genes 0.000 description 2
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 239000010421 standard material Substances 0.000 description 2
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N (+/-)-DABA Natural products NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101000599852 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 229960004050 aminobenzoic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 102000043559 human ICAM1 Human genes 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010944 pre-mature reactiony Methods 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)
Description
Vynález sa týka súpravy pre imunologický test na kvalitatívne a kvantitatívne stanovenie vzorky pomocou špecifických väzbových partnerov, ako napríklad protilátok, antigénov, receptorov a ligandov, s nosnou, resp. mikrotitrovacou platňou s viacerými prehĺbeniami, pričom tento nosič, resp. mikrotitrovacia platňa sa vopred potiahne vrstvou primárneho väzbového partnera a tento väzbový partner je fixovaný ako lyofilizát.
Doterajší stav techniky
Imunologické testy, s enzýmami spojené imunologické testy, s fluorescenčným značkovaním spojené imunologické testy, s luminiscenčným značkovaním spojené imunologické testy alebo iným spôsobom značkované imunologické testy sa používajú v rutinnej diagnostike a výskumnej diagnostike na detekciu a kvantifikovanie proteínov, napríklad antigénov, ligandov, receptorov, protilátok, ako aj chemických zlúčenín. Doterajší stav techniky je taký, že v takýchto testovacích súpravách sa jeden z väzbových partnerov naviaže na tuhý nosič, napríklad na polystyrolovú platňu, a ďalšie reagencie, potrebné na uskutočnenie pokusu, sa priložia ako oddelené komponenty testovacej súpravy. Týmito reagenciami sú obyčajne proteín, ktorý sa má dokázať, v kvantifikovanej forme ako koncentrát alebo lyofilizát (porovnávací štandard), médium na zriedenie štandardu a vzorky, druhý špecifický väzbový partner v konjugovanej forme (konjugát) ako koncentrát alebo pracovný roztok, ak treba, sekundárny detekčný systém, ako aj v prípade enzýmovej značkovacej látky substrátová reagencia, potrebná na dôkaz. Na zastavenie enzymatickej reakcie sa pridáva zastavovací roztok, na prípravu pracovných roztokov pre druhého špecifického väzbového partnera, ako aj pre sekundárnu reagenciu je k dispozícii testovací pufer, ktorý je najčastejšie vo forme koncentrátu. Pretože medzi pracovnými krokmi sú potrebné premývacie kroky, bežná súprava pre imunologické testy obsahuje premývací pufer, obyčajne v koncentrovanej forme.
Komerčné ELISA súpravy ponúkajú užívateľovi uznané testovacie systémy. Tieto produkty obsahujú všetky reagencie, potrebné na uskutočnenie testu, v optimalizovaných
-2koncentráciách a množstvách, ako aj podrobný postup na uskutočnenie testu. Jednotlivé reakčné kroky sa obyčajne uskutočňujú postupne. Spoločné uchovávanie stanovovaných zložiek (štandard, vzorka) a sekundárnych protilátok s tuhou fázou (koktail) je pre mnohé testovacie systémy možné.
Typickým príkladom imunologického testu je Sandwich ELISA (Enzýme linked immunosorbent assay).
Takéto ELISA súpravy typicky obsahujú nasledujúce komponenty:
- mikrotitrovacia platňa s 96 prehĺbeniami, ktorá je vopred potiahnutá primárnou protilátkou, blokovanou, fixovanou;
- porovnávací materiál: stanovovaná látka (štandard) v definovanej koncentrácii na vytvorenie štandardného radu;
- enzýmom (chrenová peroxidáza) alebo biotínom spojená sekundárna protilátka;
- ak je to potrebné, streptavidínový enzým (chrenová peroxidáza);
- substrátový roztok (tetrametylén-benzidín);
- premývací pufer: soľný roztok na premytie platní pred inkubáciou vzoriek a medzi reakčnými krokmi;
- testovací pufer: soľný roztok na zriedenie sekundárnej protilátky a koncentrátu streptavidínového enzýmu (príprava pracovných roztokov);
- médium na zriedenie vzoriek: špecifické tekuté médium na zriedenie porovnávacieho materiálu, ako aj neznámych vzoriek;
- zastavovací roztok na skončenie enzymatickej reakcie.
Na uskutočnenie testu má užívateľ vykonať nasledujúce pracovné kroky:
- príprava pracovných roztokov;
- vytvorenie štandardného radu zriedením porovnávacieho materiálu;
- premytie mikrotitrovacej platne;
- vloženie média na zriedenie vzoriek;
- nanesenie jednotlivých porovnávacích zriedených roztokov (štandardný rad);
- nanesenie neznámych vzoriek;
- pridanie enzýmom alebo biotínom spojenej sekundárnej protilátky;
- premytie mikrotitrovacej platne;
-3- voliteľné pridanie streptavidínového enzýmu:
- premytie mikrotitrovacej platne;
- pridanie substrátu;
- pridanie zastavovacieho roztoku;
- meranie optickej hustoty.
Vynález sa zameriava na to, aby sa zjednodušila manipulácia s takýmito testovacími súpravami a aby sa popri kvalitatívnej výpovedi umožnili aj kvantitatívne výpovede. Okrem toho sa vynález zameriava popri znížení množstva vynaloženej práce a skrátení času, potrebného na uskutočnenie testu, na to, aby sa znížila pravdepodobnosť chýb pre užívateľa minimalizáciou pracovných krokov, ktoré sa musia uskutočniť. Nakoniec je cieľom predloženého vynálezu znížiť objem balenia, ako aj náklady na balenie a poštovné náklady zreteľným znížením hmotnosti a objemu súprav a poskytnúť logistické zjednodušenie, pri ktorom sa dajú k dispozícii štandardizované základné súpravy so zlepšenou skladovateľnosťou produktu.
Podstata vynálezu
Túto úlohu rieši súprava pre imunologický test v podstate v tom, že v jednej časti prehĺbení mikrotitrovacej platne sa naviac nachádza porovnávací štandardný rad vzorky, ktorá sa má stanoviť, so vzrastajúcim zriedením v lyofilizovanej forme. Tým, že nosič, resp. mikrotitrovacia platňa obsahuje naviac už porovnávací štandardný rad vzorky, ktorá sa má stanoviť, sa vytvorí možnosť uskutočniť popri čisto kvalitatívnej analýze aj kvantitatívny odhad a kvantitatívne stanovenie interpoláciou medzi definovanými výsledkami testu v oblasti medzi prírastkovo susediacimi štandardami, pričom náročný krok prípravy pracovného roztoku porovnávacieho materiálu a prípravy zodpovedajúceho radu zriedení pri laboratórnom stanovení odpadá. Pri takomto vyhotovení súpravy pre imunologický test, pri ktorom odpadá príprava pracovného roztoku porovnávacieho materiálu a nanášanie média na zriedenie štandardov do prehĺbení mikrotitrovacej platne, vytvorených pre štandardný rad, sa dá dosiahnuť podstatná racionalizácia a zjednodušenie postupu a predovšetkým vytvoriť presne reprodukovateľný štandardný rad, v dôsledku čoho sa pravdepodobnosť chýb podstatne zníži.
-4Zvlášť výhodným spôsobom sa však predpríprava súpravy pre imunologický test dá posunúť ešte podstatne ďalej a nevyhnutné kroky stanovenia vzorky sa dajú ešte zredukovať. Na tento účel sa výhodne použije také vyhotovenie, že prehĺbenia mikrotitrovacej platne budú naviac obsahovať enzýmom alebo biotínom spojený konjugát sekundárneho väzbového partnera, najmä protilátky, a v prípade biotínom spojeného konjugátu enzým v lyofilizovanej forme. Týmto spôsobom sa popri štandardnom rade na kvantifikovanie proteínu, ktorý sa má dokázať, v definovaných proteínových koncentráciách vnesie aj druhý, špecifický, jednou z vyššie uvedených značkovacích látok spojený väzbový partner (konjugát s titrovanou koncentráciou, ako aj prípadne sekundárna reagencia) pre dôkaz spolu s primárnym väzbovým partnerom, viazaným pevne na fázy, už v lyofilizovanej forme v tuhej fáze, pričom poskytnutie týchto zložiek v lyofilizovanej forme, t. j. takto pri nízkych teplotách asi -30 °C v dehydratovanej forme, zmrazí reakčnú kinetiku do tej miery, že sa netreba obávať predčasného zreagovania porovnávacieho materiálu. Pretože vysokozriedené pracovné roztoky sa práve tak ako obmedzene stále roztoky nemôžu udržiavať v zásobe, ale musia sa vytvoriť až bezprostredne pred začiatkom testu pridaním riedidla, resp. rehydratáciou na nosiči, vylúčia sa ďalšie možné zdroje chýb.
V ďalšom zlepšení a na ďalšie zníženie počtu potrebných pracovných krokov pri analýze sa riešenie usporiada tak. že prehĺbenia mikrotitrovacej platne budú obsahovať médium na zriedenie vzoriek v lyofilizovanej forme. Špecifické médium na zriedenie vzoriek sa pritom môže vniesť do zodpovedajúcich prehĺbení v mikrotitrovacej platni v potrebnom množstve pri napríklad 2 °C, pričom konjugát sekundárnej protilátky-enzýmu, resp. zmes sekundárnej protilátky-biotínového konjugátu sa môže vniesť pri rovnakej teplote do všetkých prehĺbení mikrotitrovacej platne, po čom sa takto potiahnutá mikrotitrovacia platňa podrobí procesu sušenia vymrazovaním, napríklad v zariadení na sušenie vymrazovaním, predchladenom na -30 °C, lyofilizácii.
Takýto vopred upravený nosič, resp. takáto vopred upravená mikrotitrovacia platňa vyžaduje na kompletizáciu testovacej súpravy už len malý počet dodatočných komponentov, pričom testovacia súprava s výhodou obsahuje okrem vopred potiahnutej mikrotitrovacej platne len premývací pufer, substrátový roztok a zastavovací roztok. Na
-5stanovenie vzorky je takto už len potrebné rehydratovať mikrotitrovaciu platňu pridaním definovaných objemov destilovanej vody do prehĺbení pre štandardný rad, prípadne nulové vzorky do prehĺbení pre vzorky, po čom sa pridá a inkubuje neznáma vzorka. Po premytí mikrotitrovacej platne a nanesení substrátu do všetkých prehĺbení mikrotitrovacej platne, použitých na test, sa po určitom čase pridá zastavovací roztok a bezprostredne sa môže uskutočniť vyhodnotenie testu.
Výhodne sa pritom toto riešenie realizuje tak, že v prípade konjugátu s biotínom spojenej sekundárnej protilátky sa ako sekundárna reagencia použije streptavidín-chrenová peroxidáza (HRP).
Celkove sa uskutočnením tohto vynálezu uskutočnenie testu zredukuje pre užívateľa na pridanie neznámej vzorky, ako aj na enzymatickú reakciu, pričom všetky ďalšie kroky urobí predtým výrobca ELISA súpravy. Na mikrotitrovaciu platňu sa takto u výrobcu nanesie, zablokuje a fixuje špecifická primárna protilátka, po čom sa platňa ochladí napríklad na -20 °C a u výrobcu sa uskutočnia vyššie opísané ďalšie kroky na vnesenie štandardného radu prostriedku na zriedenie vzoriek, ako aj konjugátu sekundárnej protilátky-enzýmu, resp. zmesi sekundárnej protilátky-biotínového konjugátu a streptavidínového enzýmu definovaným spôsobom. Uskutočnenie testu sa takto redukuje na pridanie vzoriek, ktoré sa majú analyzovať, ako aj na vyhodnotenie testu na základe sfarbenia substrátu.
Zvlášť výhodným spôsobom je súprava pre imunologický test podľa tohto vynálezu vybavená tak, že obsahuje stabilizátory testovacej súpravy pre peroxidázu, resp. všeobecné lyoprotektanty, ako sú proteíny (napríklad albumín (napríklad BSA), proteínový hydrolyzát (peptón, želatína, ...,kazeín), polyméry (napríklad dextrán, PVA, PVP), sacharidy (napríklad sacharózu, trehalózu, laktózu, xylit, sorbit, manit, maltózu, glukózu, inozit), bakteriostatické prostriedky (napríklad timerozal, proklín), fenolové látky a anilíny aj so substituentami (malé alkylové zvyšky alebo Cl, Br, ...) (napríklad ometoxyfenol, o-metylfenol, p-metylfenol, o-aminofenol, kyselinu o-hydroxybenzoovú, (o-, m- alebo p)-hydroxybenzylalkohol, anilín, kyselinu p-aminobenzoovú, p-metoxyanilín, benzylalkohol, kyselinu benzoovú, p-nitrofenol, benzylamín, 1 -fenyl- 1,2-etándiol, trans1,2-cyklohexándiol, kyselinu cis-l,2-cyklohexándikarboxylovú, cyklohexylamín);
-6hydrofóbne zlúčeniny a rozpúšťadlá (napríklad DMF, etylénglykol, DMSO); detergenty (napríklad Tween-20); zlúčeniny kyselín arylboritých (napríklad kyselinu fenylboritú, kyselinu 4-bróm-fenylboritú, kyselinu 3-acetamidofenylboritú, kyselinu 1-naftylboritú); substrátové analógy (napríklad TMB, luminol); polyhydroxyzlúčeniny (napríklad polyoly, polyetylénglykol, glycerín); ektoíny (napríklad kyselinu (S)-2-metyl-l,4,5,6tetrahydropyrimidín-4-karboxylovú [THP(B)j, kyselinu (S,S)-p-2-metyl-5-hydroxyl,2,4,5,6-tetrahydropyrimidín-4-karboxylovú [THP(A)]); ióny, resp. viacmocné ióny (napríklad ióny kovov (Al, Zn, Mg, Fe, Cu, ...)), komplexotvorné činidlá (napríklad EDTA); aminokyseliny (napríklad glycín, prolín, 4-hydroxyprolín, serín, glutáman, alanin, lyzín, sarkozín, kyselina y-aminobutánová, fenylalanín) a/alebo látky, ako sú TRIS, soli, amíny, Na-choláty, monolaurát sacharózy, 2-O-P-manozylglycerát.
S ohľadom na zvlášť jednoduchý postup je predložená súprava pre imunologický test vhodná pre množstvo možných použití. Zvlášť výhodným spôsobom je takáto súprava pre imunologický test vhodná na nasadenie vo výskumnej diagnostike a in-vitro diagnostike, na použitie v sérológii pôvodcov chorôb, ako napríklad na dôkaz infekcii, spôsobených Hl V, HepV, EBV, CMV atď., na použitie v diagnostike tumorov, ako napríklad na dôkaz tumorových markérov alebo s tumormi asociovaných proteínov, vaskularizačných markérov, markérov metastázovania atď., na nasadenie v alergológii, ako napríklad na dôkaz zvieracích alergénov, rastlinných peľov, zložiek potravy atď., na nasadenie v autoimunitnej diagnostike, ako napríklad na dôkaz autoantigénov v oblasti ANA/ENA, diabetes mellitus/IDDM, antigénov Štítnej žľazy, autoimunitnej hepatitídy, APS atď., na dôkaz imunologických porúch v dôsledku zápalových procesov alebo infekcií, ako napríklad na dôkaz cytokinov, adhéznych molekúl, chemokínov atď., na dôkaz zmien v hospodárení s hormónmi, ako napríklad ovulačnými testami, tehotenskými testami atď., na nasadenie na sledovanie terapie, napríklad na dôkaz terapeutických protilátok a antigénov, organických a anorganických zlúčenín, na dôkaz odumretia buniek v dôsledku apoptózy alebo nekrózy a/alebo na dôkaz genetických zmien, genetických ochorení.
Vynález v ďalšom bližšie objasníme pomocou porovnania s doterajším stavom techniky, pričom doterajší stav techniky označíme ako štandardná súprava.
-Ί 1. Komponenty ELISA súprav:
a) priamo enzýmom spojený konjugát
| Štandardná súprava | Jednostupňová súprava podľa tohto vynálezu | ||
| 1 | Protilátkou potiahnutá mikrotitrovacia platňa | 1 | Protilátkou potiahnutá mikrotitrovacia platňa vrátane Štandardného radu, média na zriedenie vzorky, protilátky konjugátu |
| 2 | Štandardný materiál | ||
| Λ J | Testovací pufer | ||
| 4 | Protilátka konjugátu | ||
| 5 | Médium na zriedenie vzorky | ||
| 6 | Premývací pufer | 2 | Premývaci pufer |
| 7 | Substrátový roztok | o J | Substrátový roztok |
| 8 | Zastavovací roztok | 4 | Zastavovací roztok |
b) druhá protilátka, viazaná na biotín, sekundárna reagencia streptavidín-chrenová peroxidáza (HRP) alebo podobne
| Štandardná súprava | Jednostupňová súprava podľa tohto vynálezu | ||
| 1 | Protilátkou potiahnutá mikrotitrovacia platňa | 1 | Protilátkou potiahnutá mikrotitrovacia platňa vrátane štandardného radu, média na zriedenie vzorky, biotínovanej protilátky, streptavidín-HRP alebo podobne |
| 2 | Štandardný materiál | ||
| J | Testovací pufer | ||
| 4 | Biotínovaná protilátka | ||
| 5 | Streptavidin-(HRP) alebo podobne | ||
| 6 | Médium na zriedenie vzorky | ||
| 7 | Premývací pufer | 2 | Premývací pufer |
| 8 | Substrátový roztok | 3 | Substrátový roztok |
| 9 | Zastavovací roztok | 4 | Zastavovací roztok |
2. Pracovné kroky na uskutočnenie testu
a) priamo enzýmom spojený konjugát
| Štandardná súprava | Jednostupňová súprava podľa tohto vynálezu | ||
| 1 | Premytie mikrotitrovacej platne, potiahnutej protilátkou | ||
| 2 | Príprava pracovného roztoku porovnávacieho materiálu (štandard) | ||
| J | Nanesenie média na zriedenie štandardov do prehĺbení mikrotitrovacej platne, určených pre Štandardný rad | ||
| 4 | Externé alebo interné (na platni) zriedenie pracovného roztoku štandardu na definované koncentrácie (štandardný rad) | 1 | |
| 4a | Prípadne vnesenie štandardných | i i |
| zriedených roztokov do zodpovedajúcich prehĺbení mikrotitrovacej platne | |||
| 5 | Nanesenie média na zriedenie vzoriek ako nulovej hodnoty (blank) do zodpovedajúcich prehĺbení mikrotitrovacej platne | ||
| 6 | Vnesenie potrebných objemov média na zriedenie vzorky do zodpovedajúcich prehĺbení mikrotitrovacej platne | 1 | Rehydratácia mikrotitrovacej platne (pridanie potrebných objemov destilovanej vody do prehĺbení Štandardného radu, nulovej vzorky a prehĺbení pre vzorky) |
| 7 | Nanesenie neznámych vzoriek | 2 | Nanesenie neznámych vzoriek |
| 8 | Príprava pracovného roztoku HRP- konjugátu alebo podobne | ||
| 9 | Nanesenie HRP-konjugátu (alebo podobne) do všetkých prehĺbení mikrotitrovacej platne, použitých pre test | ||
| 10 | Inkubácia | 3 | Inkubácia |
| 11 | Premytie mikrotitrovacej platne | 4 | Premytie mikrotitrovacej platne |
| 12 | Nenesenie substrátu do všetkých prehĺbení mikrotitrovacej platne, použitých pre test | Nanesenie substrátu do všetkých prehĺbení mikrotitrovacej platne, použitých pre test | |
| 13 | Pridanie zastavovacieho roztoku | 5 | Pridanie zastavovacieho roztoku |
| 14 | Vyhodnotenie testu | 6 | Vyhodnotenie testu |
b) druhá protilátka, spojená biotínom, sekundárna reagencia streptavidín-chrenová peroxidáza (HRP) alebo podobne
| Štandardná súprava | Jednostupňová súprava podľa tohto vynálezu | ||
| 1 | Premytie mikrotitrovacej platne, potiahnutej protilátkou | ||
| 2 | Príprava pracovného roztoku porovnávacieho materiálu (štandard) | ||
| -> J | Nanesenie média na zriedenie štandardov do prehĺbení mikrotitrovacej platne, určených pre štandardný rad | ||
| 4 | Externé alebo interné (na platni) zriedenie pracovného roztoku štandardu na definované koncentrácie (štandardný rad) | ||
| 4a | Prípadne vnesenie štandardných zriedených roztokov do zodpovedajúcich prehĺbení mikrotitrovacej platne | ||
| 5 | Nanesenie média na zriedenie vzoriek ako nulovej hodnoty (biank) do zodpovedajúcich prehĺbení mikrotitrovacej platne | ||
| 6 | Vnesenie potrebných objemov média na zriedenie vzoriek do zodpovedajúcich prehĺbení mikrotitrovacej platne | 1 | Rehydratácia mikrotitrovacej platne (pridanie definovaných objemov destilovanej vody do prehĺbení štandardného radu, nulovej vzorky a prehĺbení pre vzorky) |
| 7 | Nanesenie neznámych vzoriek | 2 | Nanesenie neznámych vzoriek |
| 8 | Príprava pracovného roztoku biotínovanej protilátky |
| 9 | Nanesenie biotínového konjugátu do všetkých prehĺbení mikrotitrovacej platne, použitých pre test | ||
| 10 | Inkubácia | ||
| 11 | Premytie mikrotitrovacej platne | ||
| 12 | Príprava streptavidín-HRP alebo podobne pracovného roztoku | ||
| 13 | Nanesenie streptavidín-HRP alebo podobne roztoku do všetkých prehĺbení mikrotitrovacej platne, použitých pre test | ||
| 14 | Inkubácia | 3 | Inkubácia |
| 15 | Premytie mikrotitrovacej platne | 4 | Premytie mikrotitrovacej platne |
| 16 | Nanesenie substrátu do všetkých prehĺbení mikrotitrovacej platne, použitých pre test | Nanesenie substrátu do všetkých prehĺbení mikrotitrovacej platne, použitých pre test | |
| 17 | Pridanie zastavovacieho roztoku | 5 | Pridanie zastavovacieho roztoku |
| 18 | Vyhodnotenie testu | 6 | Vyhodnotenie testu |
Vynález pritom môže nájsť uplatnenie pri detekcii antigénov pomocou páru protilátok (Sandwich ELISA). Práve tak je možný dôkaz protilátok zodpovedajúcim antigénom. Detekcia receptorov, resp. ligandov príslušným väzbovým partnerom je ďalšou možnosťou použitia tohto vynálezu, takže je k dispozícii veľký počet testovacích formátov. Tento test sa dá použiť najmä na dôkaz proteínov, steroidov, chemických zlúčenín, liekov, nukleových kyselín a podobných látok.
Detekcia reakčného komplexu sa dá uskutočniť pomocou priamo viazaného enzýmu (napríklad chrenovej peroxidázy, alkalickej fosfatázy a podobne), cez enzymatickú reakciu, ktorá sa uskutoční sekundárnym krokom (biotín-streptavidín-HRP, enzýmom viazaná protilátka proti detekčnej protilátke a podobne). Práve tak sa dá použiť každá ďalšia značkujúca látka, ktorá je vhodná na uskutočnenie imunologického testu, ako sú
- 12 fluorochrómy, chemiluminiscenčné značkujúce látky, rádioaktívne značkujúce látky a podobne.
Nosičom na imobilizovanie primárneho väzbového partnera je výhodne polystyrolová 96-jamková mikrotitrovacia platňa, pričom sa však pre tento vynález dá použiť akýkoľvek iný nosič, ktorý je vhodný na uskutočnenie imunologického testu.
Vzorkami, použitými na meranie, môžu byť všetky kvapalné vzorky, ktoré obsahujú stanovované zložky, v špeciálnych telových tekutinách, ako sú séra, plazmové preparáty, lokálne telové tekutiny, plná krv a podobne, ako aj prežívajúce bunkové kultúiy’, pufrované roztoky stanovovaných látok a podobne.
Vynález v ďalšom bližšie objasníme pomocou špecifických príkladov použitia.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad použitia 1
Sandwich ELISA na dôkaz ľudskej 1CAM-1
A) Príprava platní v spojení s médiom na zriedenie vzoriek, štandardným radom, HRPkonjugátom
Krok 1:
Poťahovanie:
96-jamkové mikrotitrovacie platne sa podľa doterajšieho stavu techniky potiahnu 2,5 pg/ml anti-ICAM-1 v PBS pufri (100 μΐ na jamku, inkubácia cez noc pri 4 °C)
Krok 2:
Blokovanie:
Poťahovací roztok sa odsaje, platňa sa raz premyje premývacím pufrom (PBS/Tween). Na nasýtenie polystyrolového povrchu (na zabránenie nešpecifickému viazaniu) sa platňa blokuje 300 μΐ PBS/2% BSA na jamku (2 h, teplota okolia).
Krok 3:
Fixovanie:
- 13 Blokujúci roztok sa odsaje, platňa sa dvakrát premyje, na jamku sa pridá 150 μΐ PBS/15% sacharózy. Po jednej hodine inkubácie pri teplote okolia sa fixačný roztok dekantuje Platňa sa suší asi 20 hodín pri 28 °C v sušiarni s cirkulujúcim vzduchom. Platňa sa zmrazí na -20 °C.
Krok 4:
Vnesenie média na zriedenie vzoriek:
Potiahnutá platňa sa použije v zmrazenom stave. Médium na zriedenie vzoriek sa ochladí na 2 °C. Na vytvorenie štandardného radu sa do prvých dvoch radov mikrotitrovacej platne vloží do každého prehĺbenia 100 μΐ média na zriedenie vzorky. Na stanovenie nulovej vzorky sa do zodpovedajúcich prehĺbení vloží 100 μΐ média na zriedenie vzorky. Na stanovenie neznámych vzoriek sa do každého zodpovedajúceho prehĺbenia vloží 90 μΐ média na zriedenie vzoriek.
Krok 5:
Vytvorenie štandardného radu:
Pracovný roztok (20 ng/ml) porovnávacieho materiálu (rekombinantná ľudská ICAM-1) (2 °C) sa na dvojité stanovenie vnesie do oboch najvyšších prehĺbení na ľavej strane mikrotitrovacej platne (100 μΙ/jamku). Sériovým zried’ovaním 1 : 2 na platni sa pripraví Štandardný rad (10 ng/ml; 5 ng/ml; 2,5 ng/ml; 1,25 ng/ml; 0,63 ng/ml).
Krok 6:
Vnesenie HRP-konjugátu:
Pracovný roztok HRP-konjugátu (anti-ICAM-l-HRP) sa ochladí na 2 °C a rýchlo sa vnesie do všetkých prehĺbení mikrotitrovacej platne (50 μΙ/jamku).
Krok 7:
Lyofilizácia:
Mikrotitrovacia platňa sa bezprostredne po doplnení všetkými komponentami zakryje fóliou a vloží sa do zariadenia na sušenie vymrazovaním, predchladeného na -30
- 14°C. Lyofilizácia sa uskutočňuje asi 20 hodín pri -30 °C. Vysušená platňa sa bezprostredne po vybratí zo zariadenia na sušenie vymrazovaním zataví spolu so sušidlom do hliníkového vrecka.
B) Uskutočnenie testu:
Platňa sa vyberie z hliníkového vrecka.
Štandardný rad, ako aj nulové vzorky sa rehydratujú pridaním 150 μί destilovanej vody na prehĺbenie, prehĺbenia pre vzorky pridaním 140 μί H2O. Do prehĺbení pre vzorky sa pridá po 10 μί neznámej vzorky. Platňa sa zakryje fóliou a 1 hodinu sa inkubuje pri teplote okolia. Platňa sa 3-krát premyje, do každého prehĺbenia platne sa pridá 100 μί substrátového roztoku. Reakcia enzýmu sa po 15 minútach preruší pridaním zastavovacieho roztoku (100 μί) a intenzita farby v jednotlivých prehĺbeniach sa vyhodnotí fotometrický.
Príklad použitia 2
Sandwich ELISA na dôkaz ľudského interleukínu 10 (IL-10)
A) Príprava platni v spojení s médiom na zriedenie vzoriek, štandardným radom, biotínovým konjugátom, streptavidínom-HRP
Krok 1:
Poťahovarú*:
96-jarnkové mikrotitrovacie platne sa podľa doterajšieho sta/u techniky potiahnu 5 pg/ml anti-IL-10 v PBS pufri (100 μί na jamku, inkubácia cez noc pri 4 °C).
Krok 2:
Blokovanie:
Poťahovací roztok sa odsaje, platňa sa raz premyje premývacim pufrom (PBS/Tween). Na nasýtenie polystyrolového povrchu (na zabránenie nešpecifickému viazaniu) sa platňa blokuje 300 μί PBS/2% BSA na jamku (2 h, teplota okolia).
- 15Krok 3:
Fixovanie:
Blokujúci roztok sa odsaje, platňa sa dvakrát premyje, na jamku sa pridá 150 μΐ PBS/15% sacharózy. Po jednej hodine inkubácie pri teplote okolia sa fixačný roztok dekantuje. Platňa sa suší asi 20 hodín pri 28 °C v sušiarni s cirkulujúcim vzduchom. Platňa sa zmrazí na -20 °C.
Krok 4:
Vnesenie média na zriedenie vzoriek:
Potiahnutá platňa sa použije v zmrazenom stave. Médium na zriedenie vzoriek sa ochladí na 2 °C. Na vytvorenie štandardného radu sa do prvých dvoch radov mikrotitrovacej platne vloží do každého prehĺbenia 100 μΐ média na zriedenie vzorky. Na stanovenie nulovej vzorky sa do zodpovedajúcich prehĺbení vloží 100 μΐ média na zriedenie vzorky. Na stanovenie neznámych vzoriek sa do každého zodpovedajúceho prehĺbenia vloží 50 μΐ média na zriedenie vzoriek.
Krok 5:
Vytvorenie štandardného radu:
Pracovný roztok (400 pg/ml) porovnávacieho materiálu (rekombinantný ľudský IL-10) (2 °C) sa na dvojité stanovenie vnesie do oboch najvyšších prehĺbení na ľavej strane mikrotitrovacej platne (100 μΐ/jamku). Sériovým zried’ovaním 1 : 2 na platni sa pripraví štandardný rad (200 - 3,1 pg/ml).
Krok 6:
Vnesenie biotínového konjugátu a streptavidínu-HRP:
Pracovný roztok zmesi biotínového konjugátu (anti-IL-10-ΒΤ) a streptavidínuHRP sa ochladí na 2 °C a rýchlo sa vnesie do všetkých prehĺbení mikrotitrovacej platne (50 μΐ/jamku).
- 16 Krok 7.
Lyofílizácia:
Mikrotitrovacia platňa sa bezprostredne po doplnení všetkými komponentami zakryje fóliou a vloží sa do zariadenia na sušenie vymrazovaním, predchladeného na -30 °C. Lyofílizácia sa uskutočňuje asi 20 hodín pri -30 °C. Vysušená platňa sa bezprostredne po vybratí zo zariadenia na sušenie vymrazovaním zataví spolu so sušidlom do hliníkového vrecka.
B) Uskutočnenie testu:
Platňa sa vyberie z hliníkového vrecka.
Štandardný rad, ako aj nulové vzorky sa rehydratujú pridaním 150 μΐ destilovanej vody na prehĺbenie, prehĺbenia pre vzorky pridaním 100 μΐ H2O. Do prehĺbení pre vzorky sa nanesie po 50 μΐ neznámej vzorky. Platňa sa zakryje fóliou a 3 hodiny sa inkubuje pri teplote okolia. Platňa sa 3-krát premyje, do každého prehĺbenia platne sa pridá 100 μΐ substrátového roztoku. Reakcia enzýmu sa po 15 minútach preruší pridaním zastavovacieho roztoku (100 μΐ) a intenzita farby v jednotlivých prehĺbeniach sa vyhodnotí fotometrický.
Príklad použitia 3
Inverzný Sandwich ELISA na dôkaz ľudských protilátok proti interferónu alfa (IFNa)
A) Príprava platní v spojení s médiom na zriedenie vzoriek, štandardným radom, HRPkoňjugátom
Krok 1:
Poťahovanie:
96-jamkové mikrotitrovacie platne sa podľa doterajšieho stavu techniky potiahnu 10 pg/ml streptavidínu v PBS pufri (100 μΐ na jamku, inkubácia cez noc pri 4 °C).
- 17Krok 2:
Špecifické poťahovanie/blokovanie:
Streptavidinový poťahovací roztok sa odsaje, platňa sa raz premyje premývacím pufrom (PBS/Tween). Na špecifické potiahnutie platne, ako aj na nasýtenie polystyrolového povrchu (na zabránenie nešpecifickému viazaniu) sa platňa potiahne, resp. blokuje 300 μί IFNa-biotínového konjugátu, 1 pg/ml v PBS/2% BSA, na jamku (2 h, 37 °C).
Krok 3:
Fixovanie:
Poťahovací/blokujúci roztok sa odsaje, platňa sa dvakrát premyje, na jamku sa pridá 150 μΐ PBS/15% sacharózy. Po jednej hodine inkubácie pri teplote okolia sa fixačný roztok dekantuje. Platňa sa suší asi 20 hodín pri 28 °C v sušiarni s cirkulujúcim vzduchom. Platňa sa zmrazí na -20 °C.
Krok 4:
Vnesenie média na zriedenie vzoriek:
Potiahnutá platňa sa použije v zmrazenom stave. Médium na zriedenie vzoriek sa ochladí na 2 °C. Na vytvorenie štandardného radu sa do prvých dvoch radov mikrotitrovacej platne vloží do každého prehĺbenia 100 μΐ média na zriedenie vzoriek. Na stanovenie nulovej vzorky sa do zodpovedajúcich prehĺbení vloží 100 μί média na zriedenie vzoriek. Na stanovenie neznámych vzoriek sa do každého prehĺbenia vloží 75 μί média na zriedenie vzoriek.
Krok 5:
Vytvorenie štandardného radu:
Pracovný roztok (200 ng/ml) porovnávacieho materiálu (antihumánna IFNa protilátka) (2 °C) sa na dvojité stanovenie vnesie do oboch najvyšších prehĺbení na ľavej strane mikrotitrovacej platne (100 μΐ/jamku). Sériovým zrieďovaním 1 : 2 na platni sa pripraví štandardný rad (100 -1,6 ng/ml).
- 18Krok 6:
Vnesenie HRP-konjugátu:
Pracovný roztok HRP viazaného IFNa proteínu sa ochladí na 2 °C a rýchlo sa vnesie do všetkých prehĺbení mikrotitrovacej platne (50 μΐ/jamku).
Krok 7:
Lyofilizácia:
Mikrotitrovacia platňa sa bezprostredne po doplnení všetkými komponentami zakryje fóliou a vloží sa do zariadenia na sušenie vymrazovaním, predchladeného na -30 °C. Lyofilizácia sa uskutočňuje asi 20 hodín pri -30 °C. Vysušená platňa sa bezprostredne po vybratí zo zariadenia na sušenie vymrazovaním zataví spolu so sušidlom do hliníkového vrecka.
B) Uskutočnenie testu:
Platňa sa vyberie z hliníkového vrecka.
Štandardný rad, ako aj nulové vzorky sa rehydratujú pridaním 150 μΐ destilovanej vody na prehĺbenie, prehĺbenia pre vzorky pridaním 125 μΐ H2O. Do prehĺbení pre vzorky sa nanesie po 25 μΐ neznámej vzorky. Platňa sa zakryje fóliou a 2 hodiny sa inkubuje pri teplote okolia. Platňa sa 3-krát premyje, do každého prehĺbenia platne sa pridá 100 μΐ substrátového roztoku. Reakcia enzýmu sa po 15 minútach preruší pridaním zastavovaného roztoku (100 μΐ) a intenzita farby v jednotlivým., p .hĺbeniach sa vyhodnotí fotometrický.
Príklad y v ri.itia 4
BioLISA nť. dôkaz ľudského tumor nekrotizujúceho faktora alfa (TNFa) (väzba receptorligandy)
- 19A) Príprava platní v spojení s médiom na zriedenie vzoriek, štandardným radom, biotínovým konjugátom, streptavidínom-HRP
Krok 1:
Poť ahovanie:
96-jamkové mikrotitrovacie pi?.':.z st podľa doterajšieho stavu techniky potiahnu 1 pg/ml rekombinantným TNF-receptorom v PBS pufri (100 μΐ na jamku, inkubácia cez noc pri 4 °C).
Krok 2:
Blokovanie:
Poťahovací roztok sa odsaje, platňa sa raz premyje premývacím pufrom (PBS/Tween). Na nasýtenie polystyrolového povrchu (na zabránenie nešpecifickému viazaniu) sa platňa blokuje 300 μΐ PBS/2% BSA na jamku (2 h, teplota okolia).
Krok 3:
Fixovanie:
Blokujúci roztok sa odsaje, platňa sa dvakrát premyje, na jamku sa pridá 150 μΐ PBS/15% sacharózy. Po jednej hodine inkubácie pri teplote okolia sa fixačný roztok dekantuje. Platňa sa suší asi 20 hodín pri 28 °C v sušiarni s cirkulujúcim vzduchom. Platňa sa zmrazí na -20 °C.
Krok 4:
Vnesenie n édia na zriedenie vzoriek:
Potiahnutá platňa sa použije v zmrazenom stave. Médium na zriedenie vzoriek sa ochlad: n?. 2 °C. Na vytvorenie štandardného radu sa do prvých dvoch radov mikrctÍGOVacej platne vloží do každého prehĺbenia 100 μΐ média na zriedenie vzorky. Na stanovenie n Jovej vzorky sa do zodpovedajúcich prehĺbení vloží 100 ul média na zriedenie vzorky. Na stanovenie neznámych vzoriek sa do každého prehĺbenia vloží 50 μΐ média m zriedenie vzoriek.
-20Krok 5:
Vytvorenie štandardného radu;
Pracovný roztok (2000 pg/ml) porovnávacieho materiálu (rekombinantný ľudský TNFa) (2 °C) sa na dvojité stanovenie vnesie do oboch najvyšších prehĺbení na ľavej strane mikrotitrovacej platne (100 μΐ/jamku). Sériovým zrieďovanim 1 ; 2 na platni sa pripraví štandardný rad (1000 - 16 pg/ml).
Krok 6:
Vnesenie biotínového konjugátu a streptavidínu-HRP:
Pracovný roztok zmesi biotínového konjugátu (anti-TNFa-BT) a streptavidínuHRP sa ochladí na 2 °C a rýchlo sa vnesie do všetkých prehĺbení mikrotitrovacej platne (50 μΐ/jamku).
Krok 7:
Lyofilizácia:
Mikrotitrovacia platňa sa bezprostredne po doplnení všetkými komponentami zakryje fóliou a vloží sa do zariadenia na sušenie vymrazovaním, predchladeného na -30 °C. Lyofilizácia sa uskutočňuje asi 20 hodín pri -30 °C. Vysušená platňa sa bezprostredne po vybratí zo zariadenia na sušenie vymrazovaním zataví spolu so sušidlom do hliníkových vreciek.
B) Uskutočnenie testu:
Platňa sa vyberie z hliníkového vrecka.
Štandardný rad, ako aj nulové vzorky sa rehydratujú pridaním 150 μΐ destilovanej vody na prehĺbenie, prehĺbenia pre vzorky pridaním 100 μΐ H2O. Do prehĺbení pre vzorky sa nanesie po 50 μΐ neznámej vzorky. Platňa sa zakryje fóliou a cez noc sa inkubuje pri 4 °C. Platňa sa 3-krát premyje, do každého prehĺbenia platne sa pridá 100 μΐ substrátového roztoku. Reakcia enzýmu sa po 15 minútach preruší pridaním zastavovacieho roztoku (100 μΐ) a intenzita farby v jednotlivých prehĺbeniach sa vyhodnotí fotometrický.
Claims (7)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Súprava pre imunologický test na kvalitatívne a kvantitatívne stanovenie vzorky pomocou Špecifických väzbových partnerov, ako napríklad protilátok, antigénov, receptorov a ligandov, s nosnou, resp. mikrotitrovacou platňou s viacerými prehĺbeniami, pričom nosič, resp. mikrotitrovacia platňa je vopred potiahnutá primárnym väzbovým partnerom a tento väzbový partner je fixovaný ako lyofilizát, vyznačujúca sa t ý m, že v časti prehĺbení mikrotitrovacej platne sa naviac nachádza porovnávací štandardný rad vzorky, ktorá sa má stanoviť, so vzrastajúcim zriedením v lyofilizovanej forme.
- 2. Súprava pre imunologický test podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že prehĺbenia mikrotitrovacej platne obsahujú naviac enzýmom alebo biotínom spojený konjugát sekundárneho väzbového partnera, najmä protilátky, a v prípade biotínom spojeného konjugátu enzým v lyofilizovanej forme.
- 3. Súprava pre imunologický test podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúca sa t ý m, že prehĺbenia mikrotitrovacej platne obsahujú médium na zriedenie vzoriek v lyofilizovanej forme.
- 4. Súprava pre imunologický test podľa nároku 1, 2 alebo 3, vyznačujúca sa t ý m, že testovacia súprava, oásahuje okrem vopred potiahnutej mikrotitrovacej platne len premývací pufer, substrátový roztok a zastavovací roztok.
- 5. Súprava pre imunologický test podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúca sa tým, že v prípade biotínom spojeného sekundárneho protilátkového konjugátu sa ako sekundárna reagencia použije streptavidín-chrenová peroxidáza (HRP).-22
- 6. Súprava pre imunologický test podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, vyznačujúca sa tým, že testovacia súprava obsahuje stabilizátory pre peroxidázu, resp. všeobecné lyoprotektanty, ako sú proteíny (napríklad albumín (napríklad BSA), proteínový hydrolyzát (peptón, želatína, ...), kazeín) a/alebo polyméry (napríklad dextrán, PVA, PVP), sacharidy (napríklad sacharózu, trehalózu, laktózu, xylit, sorbit, manit, mal :ózu, glukózu, inozit) a/alebo bakteriostatické prostriedKy (napríklad timerozal, proklín) a/alebo fenolové látky a anilíny aj so substituentami (malé alkylové zvyšky alebo Cl, Br, ...) (napríklad o-metoxyfenol, o-metylfenol, p-metylfenol, o-aminofenol, kyselinu o-hydroxybenzoovú, (o-, m- alebo p)-hydroxybenzylalkohol, anilín, kyselinu paminobenzoovú, p-metoxyanilín, benzylalkohol, kyselinu benzoovú, p-nitrofenol, benzylamín, 1-fenyl-1,2-etándiol, trans-1,2-cyklohexándiol, kyselinu cis-1,2cyklohexándikarboxylovú, cyklohexylamín) a/alebo hydrofóbne zlúčeniny a/alebo rozpúšťadlá (napríklad DMF, etylénglykol, DMSO) a/alebo detergenty (napríklad Tween20) a/alebo zlúčeniny kyselín arylboritých (napríklad kyselinu fenylboritú, kyselinu 4bróm-fenylboritú, kyselinu 3-acetamidofenylboritú, kyselinu 1-naftylboritú) a/alebo substrátové analógy (napríklad TMB, luminol) a/alebo polyhydroxyzlúčeniny (napríklad polyoly, polyetylénglykol, glycerín) a/alebo ektoíny (napríklad kyselinu (S)-2-metyll,4,5,6-tetrahydropyrimidín-4-karboxylovú [THP(B)j, kyselinu (S,S)-P-2-metyl-5hydroxy-l,2,4,5,6-tetrahydropyrimidín-4-karboxylovú [THP(A)]) a/alebo ióny, resp. viacmocné ióny (napríklad ióny kovov (Al, Zn, Mg, Fe, Cu, ...)) a/alebo komplexotvorné činidlá (napríklad EDTA) a/alebo aminokyseliny (napríklad glycín, prolín, 4hydroxyprolín, serín, glutáman, alanín, lyzín, sarkozín, kyselinu y-aminobutánovú, fenylalanín) a/alebo látky, ako s«.'. ikíS, soli, amíny, Na-choláty, monolaurát sacharózy, z O - β-manozylglycerát.
- 7. Použitie súpravy pre imunologický test podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6 na nasadenie vo výskumnej diagnostike a in-vitro diagnostike, na nasadenie v sérológii pôvodcov chorôb, ako napríklad na dôkaz infekcií, spôsobených HIV, HepV, EBV, CM V atď., na nasadenie v diagnostike tumorov, ako napríklad na dôkaz tumorových markerov alebo s tumormi asociovaných proteínov, vaskularizačných markerov, markerov-23metastázovania atď., na nasadenie v alergológii, ako napríklad na dôkaz zvieracích alergénov, rastlinných peľov, zložiek potravy atď., na nasadenie v autoimunitnej diagnostike, ako napríklad na dôkaz autoantigénov v oblasti ANA/ENA, diabetes mellitus/IDDM, antigénov štítnej žľazy, autoimunitnej hepatitídy, APS atď., na dôkaz imunologických porúch v dôsledku zápalových procesov alebo infekcií, ako napríklad na dô?· c;dokinov, adhéznych molekúl, chemokínov atď., a.- .· . z.uíen v hospodárení s hormónmi, ako napríklad v ovulačných testoch, tehotenských testoch atď., na nasadenie na sledovanie terapie, napríklad na dôkaz terapeutických protilátok a antigénov, organických a anorganických zlúčenín, na dôkaz odumretia buniek v dôsledku apoptózy alebo nekrózy a/alebo na dôkaz genetických zmien, genetických ochorení.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT0037001U AT5044U1 (de) | 2001-05-10 | 2001-05-10 | Quantitativer einschritt immuntest in lyophilisierter form |
| PCT/AT2002/000112 WO2002090983A2 (de) | 2001-05-10 | 2002-04-26 | Quantitaver einschritt immuntest in lyophilisierter form |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK13012003A3 true SK13012003A3 (sk) | 2004-04-06 |
Family
ID=3488777
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1301-2003A SK13012003A3 (sk) | 2001-05-10 | 2002-04-26 | Kvantitatívny jednostupňový imunologický test v lyofilizovanej forme |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20040171087A1 (sk) |
| EP (1) | EP1388012A2 (sk) |
| JP (1) | JP2004527758A (sk) |
| CN (1) | CN1507565A (sk) |
| AT (1) | AT5044U1 (sk) |
| CA (1) | CA2446345A1 (sk) |
| CZ (1) | CZ20033209A3 (sk) |
| HU (1) | HUP0400081A3 (sk) |
| IL (1) | IL158393A0 (sk) |
| PL (1) | PL366665A1 (sk) |
| SK (1) | SK13012003A3 (sk) |
| WO (1) | WO2002090983A2 (sk) |
Families Citing this family (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080044928A1 (en) * | 2003-12-23 | 2008-02-21 | Bharat Raghunath Char | Method for the Preparation of Ready-to-Use Support for Rapid Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Elisa) |
| JP4533122B2 (ja) * | 2004-12-16 | 2010-09-01 | キヤノン株式会社 | プローブ担体、ブローブ担体製造用プローブ媒体およびプローブ担体の製造方法 |
| MX338460B (es) | 2005-12-21 | 2016-04-15 | Meso Scale Technologies Llc | Aparatos, metodos y reactivos de ensayo. |
| JP5845156B2 (ja) * | 2005-12-21 | 2016-01-20 | メソ スケール テクノロジーズ エルエルシー | アッセイ試薬を具備するアッセイモジュールとその製造方法およびその使用方法 |
| EP3032257B1 (en) | 2005-12-21 | 2018-10-10 | Meso Scale Technologies, LLC. | Assay modules having assay reagents and methods of making and using same |
| ITMI20061063A1 (it) * | 2006-05-31 | 2007-12-01 | Mindseeds Lab S R L | Metrodo e apparato pe rla selezione e la modifica di singole cellule e loro piccoli aggregati |
| KR100900985B1 (ko) | 2007-08-28 | 2009-06-04 | 한국기계연구원 | 동결 건조를 이용한 미세 구조물 내부의 효소 고정화 방법 |
| DE102007052281A1 (de) | 2007-11-02 | 2009-05-07 | Zenteris Gmbh | Einschritt-Multiplex-Immuntest |
| US8048868B1 (en) * | 2008-09-02 | 2011-11-01 | Scott & White Healthcare | Method of preventing preeclampsia |
| CN101750487B (zh) * | 2008-12-02 | 2013-07-03 | 博阳生物科技（上海）有限公司 | 干法光激化学发光免疫检测试剂盒及其制备与应用 |
| CN101995459A (zh) * | 2009-08-26 | 2011-03-30 | 刘萍 | 包被板封闭液 |
| CN102375056A (zh) * | 2010-08-27 | 2012-03-14 | 烟台赛尔斯生物技术有限公司 | 固定生物大分子的稳定剂及其制备方法和应用 |
| JP4638555B1 (ja) * | 2010-09-08 | 2011-02-23 | 田中貴金属工業株式会社 | 核酸又は免疫クロマトグラフィー用試薬組成物、核酸又は免疫クロマトグラフィー測定方法及び核酸又は免疫クロマトグラフィー測定用キット |
| CN102323403A (zh) * | 2011-07-22 | 2012-01-18 | 武汉科前动物生物制品有限责任公司 | 一种抗原包被板保护剂及制备方法 |
| CN103063829B (zh) * | 2012-12-21 | 2015-01-14 | 杭州茂天赛科技有限公司 | 一种冻存液 |
| CN105628914B (zh) * | 2016-02-04 | 2019-01-08 | 广州科方生物技术股份有限公司 | 一种能使吖啶酯抗原抗体结合物稳定的稀释液及其制备方法 |
| CN106093387A (zh) * | 2016-05-27 | 2016-11-09 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | 一种测定骨源性碱性磷酸酶的试剂盒 |
| CN106093430A (zh) * | 2016-06-06 | 2016-11-09 | 上海阿趣生物科技有限公司 | 可用于检测糖尿病的标志物及其用途 |
| CN106226521B (zh) * | 2016-07-25 | 2018-11-06 | 浙江聚康生物工程有限公司 | 一种检测Lp-PLA2的诊断试剂盒 |
| CN106645454B (zh) * | 2016-10-10 | 2019-04-12 | 南京医科大学 | 精浆中特发性男性不育诊断标志物丝氨酸与山梨醇及其检测方法和应用 |
| US10246732B2 (en) * | 2016-11-01 | 2019-04-02 | Precision Laboratories, Inc. | Stabilized test strip for the detection of hydrogen peroxide |
| CN108107210B (zh) * | 2017-12-18 | 2019-01-04 | 广州市进德生物科技有限公司 | 一种髓过氧化物酶冻干校准品的制备方法及冻干保护液 |
| CN108196047A (zh) * | 2017-12-28 | 2018-06-22 | 广东希格生物科技有限公司 | 一种固相抗体双夹心免疫反应体系及其试剂盒与应用 |
| LU100716B1 (en) * | 2018-02-26 | 2019-08-28 | Stratec Biomedical Ag | Assay components for diagnostic in vitro applications |
| CN108469519B (zh) * | 2018-03-07 | 2020-03-24 | 深圳市伯劳特生物制品有限公司 | 一种用于酶联免疫试剂盒的组合物以及糖尿病抗体谱检测试剂盒及其制备方法 |
| CN108398550B (zh) * | 2018-03-07 | 2022-07-26 | 深圳市伯劳特生物制品有限公司 | 一种组合物、芯片及其制备方法和包含有该芯片的检测装置 |
| CN108822204A (zh) * | 2018-06-13 | 2018-11-16 | 广东工业大学 | 一种烷基酚类化合物人工抗原的制备方法及其应用 |
| CN109917134B (zh) * | 2018-12-21 | 2020-07-14 | 广州市进德生物科技有限公司 | 一种校准品稳定剂、测定c肽的检测试剂盒及检测方法 |
| CN109870579B (zh) * | 2019-02-03 | 2022-02-11 | 辽宁迈迪生物科技股份有限公司 | 单克隆抗体保护液及制备方法和应用、应用单克隆抗体保护液的试剂与免疫组化试剂盒 |
| KR102020184B1 (ko) * | 2019-06-27 | 2019-09-09 | 가천대학교 산학협력단 | 화학발광 신호의 증폭 방법 |
| CN111118222B (zh) * | 2020-02-26 | 2023-04-07 | 珠海丽珠试剂股份有限公司 | Hbv检测试剂盒及其使用方法和应用 |
| CN111896730B (zh) * | 2020-04-15 | 2023-09-15 | 青岛汉唐生物科技有限公司 | 一种干式免疫荧光定量法肝素结合蛋白（hbp）检测试剂盒 |
| CN111638375B (zh) * | 2020-06-08 | 2022-12-13 | 深圳市国赛生物技术有限公司 | 一种用于测定活化部分凝血活酶时间的体外诊断试剂盒 |
| JP2022045047A (ja) * | 2020-09-08 | 2022-03-18 | デンカ株式会社 | 偽陰性の抑制により特異性を改善した検査試薬 |
| JP2022045189A (ja) * | 2020-09-08 | 2022-03-18 | デンカ株式会社 | 偽陽性の抑制により特異性を改善した検査キット |
| CN112098654B (zh) * | 2020-09-15 | 2023-07-18 | 武汉生之源生物科技股份有限公司 | 一种胃蛋白酶原i/ii测定试剂盒及其制备方法 |
| CN114324882B (zh) * | 2020-10-12 | 2022-12-27 | 广东菲鹏生物有限公司 | 蛋白稳定剂及其应用 |
| EP4330675A1 (en) * | 2021-04-26 | 2024-03-06 | Stark Sarl | Patient side in vitro screening kit for rapid diagnosis of a pathology |
| WO2023142130A1 (zh) * | 2022-01-30 | 2023-08-03 | 皮乐迪有限公司 | 改进的酶小球在目标核酸检测中的应用 |
| CN116087503A (zh) * | 2023-01-08 | 2023-05-09 | 杭州联科生物技术股份有限公司 | 一种实现elisa简易操作的方法 |
| CN117741138A (zh) * | 2023-12-01 | 2024-03-22 | 深圳市迈科龙生物技术有限公司 | 一种基质液、质控品及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3663374A (en) * | 1970-08-14 | 1972-05-16 | Geomet | Method and apparatus for quantitating enzyme activity |
| CA983358A (en) * | 1971-09-08 | 1976-02-10 | Kenneth D. Bagshawe | Performance of chemical or biological reactions |
| DE3071693D1 (en) * | 1979-06-28 | 1986-09-18 | Pasteur Institut | Reagent for detecting parasitoses and allergies, detection process using this reagent and test kit therefor |
| US4351158A (en) * | 1980-01-22 | 1982-09-28 | American Home Products Corporation | Method of producing multicomponent lyophilized product |
| US4446232A (en) * | 1981-10-13 | 1984-05-01 | Liotta Lance A | Enzyme immunoassay with two-zoned device having bound antigens |
| US4828986A (en) * | 1986-09-29 | 1989-05-09 | Scripps Clinic And Research Foundation | Assay method and diagnostic system for determining the ratio of APO B-100 to APO A-I in a blood sample |
| JPS63111467A (ja) * | 1986-10-30 | 1988-05-16 | Tosoh Corp | 免疫測定方法 |
| GB8701432D0 (en) * | 1987-01-22 | 1987-02-25 | Unilever Plc | Assays |
| US5759774A (en) * | 1988-05-18 | 1998-06-02 | Cobe Laboratories, Inc. | Method of detecting circulating antibody types using dried or lyophilized cells |
| US5102788A (en) * | 1988-11-21 | 1992-04-07 | Hygeia Sciences, Inc. | Immunoassay including lyophilized reactant mixture |
| US5200321A (en) * | 1990-09-07 | 1993-04-06 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Microassay on a card |
| WO1993007461A2 (en) * | 1991-10-11 | 1993-04-15 | Abbott Laboratories | Unit-of-use reagent composition for specific binding assays |
| US7141436B2 (en) * | 1999-11-03 | 2006-11-28 | Science And Technology Corp. | Immunoassay and reagents and kits for performing the same |
| FR2814239B1 (fr) * | 2000-09-21 | 2003-01-03 | Biopep Sa Soc | Test de dosage enzymatique a visee diagnostique a lecture optique |
-
2001
- 2001-05-10 AT AT0037001U patent/AT5044U1/de not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-04-26 CZ CZ20033209A patent/CZ20033209A3/cs unknown
- 2002-04-26 IL IL15839302A patent/IL158393A0/xx unknown
- 2002-04-26 SK SK1301-2003A patent/SK13012003A3/sk unknown
- 2002-04-26 WO PCT/AT2002/000112 patent/WO2002090983A2/de not_active Application Discontinuation
- 2002-04-26 CA CA002446345A patent/CA2446345A1/en not_active Abandoned
- 2002-04-26 JP JP2002588189A patent/JP2004527758A/ja active Pending
- 2002-04-26 US US10/476,993 patent/US20040171087A1/en not_active Abandoned
- 2002-04-26 PL PL02366665A patent/PL366665A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2002-04-26 CN CNA028095553A patent/CN1507565A/zh active Pending
- 2002-04-26 HU HU0400081A patent/HUP0400081A3/hu unknown
- 2002-04-26 EP EP02769103A patent/EP1388012A2/de not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1507565A (zh) | 2004-06-23 |
| CA2446345A1 (en) | 2002-11-14 |
| IL158393A0 (en) | 2004-05-12 |
| PL366665A1 (en) | 2005-02-07 |
| AT5044U1 (de) | 2002-02-25 |
| WO2002090983A3 (de) | 2003-09-12 |
| HUP0400081A3 (en) | 2004-05-28 |
| US20040171087A1 (en) | 2004-09-02 |
| JP2004527758A (ja) | 2004-09-09 |
| EP1388012A2 (de) | 2004-02-11 |
| HUP0400081A2 (hu) | 2004-04-28 |
| CZ20033209A3 (en) | 2004-04-14 |
| WO2002090983A2 (de) | 2002-11-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK13012003A3 (sk) | Kvantitatívny jednostupňový imunologický test v lyofilizovanej forme | |
| US9476874B2 (en) | Analyte detection | |
| JP5240945B2 (ja) | アッセイ膜およびその使用法 | |
| KR101233837B1 (ko) | 비특이 반응이 억제된 면역 측정 방법 및 시약 | |
| CN110632297A (zh) | 一种免疫检测试剂盒及其测定方法和制备方法 | |
| US20170138937A1 (en) | Detection of analytes | |
| CN111381025A (zh) | 用于多重检测的免疫检测试剂盒、应用以及多重检测方法 | |
| CN108398554B (zh) | 一种抗torch-IgM型抗体谱芯片及其制备方法与TORCH检测的试剂盒 | |
| JP3284016B2 (ja) | 非特異的反応抑制剤 | |
| KR102390761B1 (ko) | HBsAg의 정량적 검출을 위한 키트 및 방법 | |
| US20080227111A1 (en) | Reagent kit and method for measuring hcv antibody | |
| JP4830114B2 (ja) | 汎用的高感度ｅｌｉｓａ法およびその試薬キット | |
| US20090317919A1 (en) | Method for Assaying Antigens | |
| EP0943919A1 (en) | An assay surface that permits an analyte releasing step | |
| JP2017173113A (ja) | ＴＲＡｂ測定試薬およびその製造方法 | |
| ES2268874T3 (es) | Mejora de ensayos de fijacion mediante analisis multiepitopico. | |
| US6664070B1 (en) | Washing solution for solid-phase immunometric methods which contains stabilizers for the labeling system, and the use thereof | |
| TIP | ELISA technical guide and protocols | |
| Jeggo | Diagnosis of viral diseases using ELISA techniques | |
| TH18192A3 (th) | น้ำยาสำหรับใช้ร่วมกับชุดตรวจหาโมเลกุลเป้าหมาย | |
| TH18192C3 (th) | น้ำยาสำหรับใช้ร่วมกับชุดตรวจหาโมเลกุลเป้าหมาย | |
| WO2003060519A1 (fr) | Procede permettant de tester une reaction d'agglutination | |
| JPH04213058A (ja) | 免疫アッセイ用希釈剤 | |
| JPS63282660A (ja) | ＨＩＶｇｐ１６０エイズウイルス鞘蛋白質含有帯片およびエイズ抗体の検出のための該帯片の使用 | |
| JPH11341997A (ja) | 化学発光酵素免疫測定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FB9A | Suspension of patent application procedure |